Pracownia studencka

Zakładu Analizy Środowiska

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

UNIWERSYTET GDAOSKI WYDZIAŁ CHEMII

Ćwiczenie nr 1

IZOLACJA WIELOPIERŚCIENIOWYCH

WĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCH

(WWA) Z GLEBY

CHROMATOGRAFIA

Gdańsk, 2013

1. Wstęp

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to obszerna grupa związków chemicznych

o budowie pierścieniowej, charakteryzujących się zbliżonymi własnościami fizykochemicznymi.

Chociaż znanych jest ponad 100 różnych WWA najczęściej w środowisku występuje około

17 związków chemicznych.

WWA nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków – zawsze tworzą mieszaniny

wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy od rodzaju materiału

spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania i jest dowodem na źródło emisji.

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne należą do grupy najpowszechniej występujących,

trwałych zanieczyszczeń organicznych. Głównymi źródłami WWA są: produkty niepełnego

spalania paliw kopalnych, lotne pyły i popioły powstające ze spalania paliw lub utylizacji odpadów

oraz przemysł ciężki związany z przetwarzaniem węgla i ropy naftowej (koksownie, rafinerie, huty

żelaza, aluminium i miedzi, produkcja i wykorzystanie smoły i kreozotu). Szacuje się,

iż szczególnie w okresie zimowym, poważnym źródłem WWA w środowisku jest tzw. niska emisja,

pochodząca z indywidualnych źródeł ciepła. Jednak najpoważniejszy udział w emisji WWA

na terenach zurbanizowanych ma transport samochodowy.

Wśród źródeł naturalnych wymienia się pożary lasów i wybuchy wulkanów oraz procesy przemiany

materii bakterii, glonów i roślin wyższych. Biosynteza WWA prowadzi do tworzenia tych

najbardziej groźnych dla zdrowia człowieka ale w aspekcie ogólnego skażenia, ilości WWA

pochodzące ze źródeł naturalnych i stanowiące "naturalne tło" są niewielkie w porównaniu

z ilościami będącymi wynikiem działalności człowieka. WWA pochodzące ze źródeł

antropogenicznych nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków – zawsze

tworzą mieszaniny wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy

od rodzaju materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania.

Najistotniejszym ze zdrowotnego punktu widzenia skutkiem oddziaływania WWA na organizm jest

zdolność niektórych z nich do wywoływania zmian nowotworowych. Z tego względu WWA

podzielono na nieaktywne, mniej aktywne i bardzo aktywne. Liczne badania dostarczyły

dostatecznej ilości danych, by WWA o ilości pierścieni powyżej 3 uznać za rakotwórcze

i mutagenne. Do tych związków należą m.in.: benzo(a)piren, dibenzo(a,h)antracen,

benzo(a)antracen, benzo(b)fluoranten, czy dibenzo(a,e)piren (Rysunek 1). WWA są metabolizowane

przez mikrosomalne enzymy cytochromu P 450 do związków mogących tworzyć trwałe połączenia

z DNA (np. epoksydy), co w konsekwencji może prowadzić do wysoce prawdopodobnego procesu

nowotworzenia. W celu systematycznej oceny toksyczności wszystkich rakotwórczych WWA,

wprowadzono tzw. względny współczynnik rakotwórczości (k), odnoszący się do rakotwórczości

benzo(a)pirenu (BaP), dla którego przyjęto wartość równą 1.

Obecnie jako miarę narażenia na wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne przyjmuje się

wskaźnik będący sumą iloczynów stężeń 9 WWA i ich względnych współczynników

rakotwórczości. WWA emitowane z różnych źródeł ulegają stopniowej dystrybucji w środowisku,

gdzie ostatecznie deponowane są w glebach (90%) oraz, ze względu na bardzo słabą

rozpuszczalność w wodzie, w osadach dennych (9%). Oprócz mokrej i suchej depozycji WWA,

związki te trafiają do gleby razem z wodami spływnymi. Wody spływne wymywają

np. nawierzchnię dróg, na których znajdują się duże ilości WWA pochodzące: ze spalin

samochodowych, ze ścierania opon gumowych przy hamowaniu i z samego asfaltu bogatego

we frakcje węglowodorów aromatycznych. Dodatkowym źródłem są także niekontrolowane zrzuty

ścieków przemysłowych i bytowo-gospodarczych, a także odcieki ze składowisk odpadów.

Przykładowe struktury WWA przedstawia Rysunek 1.

Benzo(a)piren

Dibenzo(a,h)antracen

Benzo(a)antracen

Benzo(b)fluoranten

Chryzen

Perylen

Piren

Antracen

Naftalen

Rysunek 1. Przykładowe struktury WWA

2. Wydzielanie WWA z próbek gleby

We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na poziomie ppm

i ppb. Aby oznaczyć tak małe ilości substancji chemicznych w skomplikowanej matrycy, jaką są próbki

środowiskowe, niezbędne jest przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów:

pobieranie próbki,

przechowywanie,

wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie z matrycy, zatężanie czy

przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną dla końcowego

oznaczania,

analiza właściwa,

obróbka danych.

2.1. Chromatografia

Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania, identyfikacji

i oznaczania substancji, czyli badania składu mieszanin związków chemicznych. Podstawy techniki

chromatograficznej powstały na początku XX wieku w Warszawie w wyniku badań rosyjskiego

chemika i biologa Michaiła Cwieta. Zajmował się on badaniem barwników roślinnych. Podczas

przepuszczania roztworu zielonych barwników roślinnych przez kolumnę (rurkę szklaną)

wypełnioną kredą (węglan wapnia), Cwiet uzyskał rozdział barwników w postaci szeregu

poziomych barwnych pasm o barwie zielonej i żółtej. Ponieważ Cwiet rozpoznał i prawidłowo

zinterpretował proces rozdziału, jest on powszechnie uważany za wynalazcę tej techniki. Terminu

chromatografia użył dla określenia barwnych stref obserwowanych na kolumnie kredowej podczas

rozdziałów (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze).

Układ chromatograficzny składa się z trzech zasadniczych elementów:

fazy stacjonarnej – nieruchoma warstwa substancji o rozwiniętej powierzchni,

fazy ruchomej zwanej eluentem – przepływający przez fazę stacjonarną strumień

rozpuszczalników lub gazu,

substancji rozdzielanej.

Podstawą rozdziału chromatograficznego, niezależnie od techniki chromatograficznej jest proces

podziału składników rozdzielanej mieszaniny, pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy:

stacjonarną i ruchomą. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej

mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną.

Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące właściwości sorpcyjne w stosunku do substancji

przepływających. Jednocześnie podczas przepływu fazy ruchomej – eluentu, przez fazę rozdzielczą

następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) składników badanej substancji

(rozdzielanej). Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny.

Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować

ich rozdział. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji

Tr i jest podstawowym parametrem umożliwiającym identyfikację (analizę jakościową).

2.2. Chromatografia adsorpcyjna

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne wydziela się z gleby najczęściej poprzez ekstrakcję

niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym. Proces ten nie jest selektywny. W ekstrakcie, poza

węglowodorami, znajdują się inne grupy związków, poza tym węglowodorów alifatycznych jest

zdecydowanie więcej niż aromatycznych, co w zdecydowanej większości przypadków,

uniemożliwia wykorzystanie ekstraktu do analizy właściwej.

Skuteczną i często stosowaną na skalę preparatywną metodą rozdzielania mieszanin związków

organicznych jest cieczowa chromatografia adsorpcyjna. Rozdział następuje w wyniku

wielokrotnych, selektywnych procesów adsorpcji zachodzących na aktywnych powierzchniach

sorbentów. Szczególnie cenne usługi oddaje kolumnowa chromatografia adsorpcyjna w przypadku

złożonych mieszanin stosunkowo niewielkich ilości substancji, których rozdzielenie za pomocą

krystalizacji czy destylacji jest praktycznie nieosiągalne, zwłaszcza gdy chodzi o związki

wysokowrzące i wrażliwe na działanie temperatury. Z tych samych powodów metodę kolumnowej

chromatografii adsorpcyjna stosuje się do rozdzielania szczególnie złożonych mieszanin związków

pochodzących ze źródeł naturalnych.

W chromatografii cieczowej występują konkurencyjne oddziaływania między próbką (analit

i matryca) a fazą stacjonarną (adsorbent), między próbką a fazą ruchomą (rozpuszczalnik

wymywający próbkę z adsorbentu) i między fazą ruchomą a stacjonarną. Mechanizm adsorpcyjny

polega na zatrzymywaniu cząsteczek substancji na powierzchni adsorbentu (zwykle porowatego).

W procesie tym biorą udział następujące oddziaływania międzycząsteczkowe:

siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi trwały moment dipolowy

(oddziaływania dipol-dipol),

siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi dipol i cząsteczkami,

w których dipol jest indukowany przez sąsiadujące cząsteczki (oddziaływanie dipol-dipol

indukowany),

oddziaływania związane z tworzeniem wiązań wodorowych, specjalny rodzaj oddziaływania

dipol-dipol między wodorem a atomem elektroujemnym, np. O, N, F.

Oddziaływania międzycząsteczkowe powodują, że rozdzielane substancje w niejednakowym

stopniu zatrzymują się na adsorbencie. Im większe powinowactwo analitu do fazy stacjonarnej tym

analit jest silniej przez nią zatrzymywany. Analit z adsorbentu wymywany jest fazą ruchomą. Im

silniej zatrzymywany analit, tym później opuszcza kolumnę (większa retencja czyli opóźnienie w

stosunku do przepływu fazy ruchomej). Objętość fazy ruchomej potrzebna do jego wymycia

nazywa się objętością retencji, a czas, w jakim analit zostaje wymyty z kolumny - czasem

retencji. Objętość retencji i czas retencji określa się precyzyjnie, licząc od momentu naniesienia na

kolumnę do momentu opuszczenia kolumny (maksimum stężenia analitu) przez analit o najwyższej

wartości stężenia.

Na Rysunku 2 przedstawiono schemat oddziaływań między cząsteczkami analitów Z i X, a powierzchnią

adsorbentu – żelu krzemionkowego. Linią przerywaną oznaczono siły wynikające z różnego rodzaju

oddziaływań występujących w chromatografii adsorpcyjnej i powodujących retencję. Przedstawiona

substancja Z silniej oddziałuje z powierzchnią adsorbentu niż substancja X.

W stanie równowagi, stosunek stężenia Z w fazie stacjonarnej (3 x Z) do stężenia Z w fazie ruchomej

(1 x Z) jest większy {(3 x Z)/(1 x Z) = 3} niż analogiczny stosunek dla X

{(3 x X)/(2 x X)=1,5}. Skoro substancji X jest relatywnie więcej w fazie ruchomej niż substancji Z,

pierwsza opuści kolumnę substancja X (objętość retencji X, czas retencji X mniejsze niż objętość

retencji Z, czas retencji Z).

O

H

X

O

H

Z

O

H

X

O

H

Z

O

H

S

O

H

Z

O

H

X

XZ X

ŻEL KRZEMIONKOWY

Rysunek 2. Schemat mechanizmu adsorpcji na żelu krzemionkowym. Strzałką oznaczono przepływ fazy

ruchomej „S”, kwadracikami substancje rozdzielane ”Z” (k=3) i „X” (k=1,5), k=ns/nm, ns -liczba moli substancji

rozdzielanej w fazie stacjonarnej, nm – liczba moli substancji rozdzielanej w fazie ruchomej, k - współczynnik

retencji

2.3. Adsorbenty

W chromatografii cieczowej używa się adsorbentów porowatych o powierzchniach od setek

do tysiąca m2/g. Adsorbenty dzieli się na polarne i niepolarne:

niepolarne – węgiel aktywny, węglowodory nasycone, polimery;

polarne – żel krzemionkowy, krzemian magnezu, tlenek glinu.

Żel krzemionkowy o ogólnym wzorze SiO2 . nH2O jest najczęściej stosowanym adsorbentem.

O jego szerokim zastosowaniu decyduje łatwość otrzymywania przez polikondensację kwasu

krzemowego, jak również możliwość łatwej modyfikacji jego właściwości powierzchniowych,

takich jak struktura geometryczna porów czy modyfikacja chemiczna. Na powierzchni żelu

krzemionkowego występują grupy -OH (silanolowe) o różnych właściwościach, w zależności od

wzajemnej odległości i przestrzennego rozmieszczenia oraz grupy siloksanowe (Rysunek 3).

Rysunek 3. Grupy silanolowe aktywne, bliźniacze, swobodne i związane (a) i siloksanowa (b), występujące

na powierzchni żelu krzemionkowego

(a)

(b)

Grupy silanolowe swobodne oraz aktywne stanowią centra silnie protonodonorowe, grupy

silanolowe bliźniacze są centrami o słabych właściwościach protonodonorowych, a grupy związane,

połączone ze sobą wiązaniem wodorowym mają właściwości protonoakceptorowe. Uważa się,

że największą rolę w procesie adsorpcji odgrywają grupy swobodne i aktywne. Udział

poszczególnych form występowania grup wodorotlenowych na powierzchni żelu krzemionkowego

zależy od struktury geometrycznej porów. Żele szerokoporowate zawierają więcej swobodnych

grup -OH, natomiast na powierzchni wąskoporowatych żeli więcej jest aktywnych i związanych

grup -OH.

Aktywność żelu krzemionkowego jak i innych adsorbentów nieorganicznych zwiększa się przez

ogrzewanie w temperaturze 120-150ºC, aby częściowo usunąć zaadsorbowaną wodę. Wyższa

temperatura w przypadku żelu krzemionkowego może powodować usuwanie grup

wodorotlenowych z jego powierzchni.

Siła adsorpcji związków organicznych na żelu krzemionkowym jest większa im większa jest ich

polarność i rośnie w szeregu:

węglowodory < halogenki alkilowe, arylowe < etery (ROR) < aldehydy (RCHO) < ketony (R2CO)

< estry (RCOOR) < alkohole (ROH) < fenole (ArOH) < zasady azotowe (np. C5H5N, C6H5NH2)

< aminy III-rz. (R3N) < aminy II-rz. i amidy < kwasy karboksylowe.

2.4. Fazy ruchome w chromatografii adsorpcyjnej

Zdolność rozpuszczalnika do wymywania substancji z adsorbentu zależy od jego siły

oddziaływania z powierzchnią adsorbentu i zwana jest mocą elucyjną rozpuszczalnika (eluentu).

Mechanizm tego oddziaływania jest taki sam jak przedstawiony wyżej dla substancji i adsorbentu.

Silniejsza adsorpcja rozpuszczalnika na fazie stacjonarnej zmniejsza adsorpcję analitu.

Rozpuszczalniki klasyfikuje się zgodnie ze wzrastającą zdolnością wymywania zaadsorbowanych

substancji z adsorbentu (czyli zgodnie ze wzrastającą ich mocą elucyjną) zestawiając je w tzw.

szereg eluotropowy. W chromatografii z fazą stacjonarną polarną (np. z żelem krzemionkowym)

o sile elucji decyduje polarność i polaryzowalność eluentu, więc szereg eluotropowy

rozpuszczalników dla tej chromatografii adsorpcyjnej jest jednocześnie szeregiem o wzrastającej

ich polarności.

Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do rozdziału wybranej mieszaniny związków nie jest łatwy.

Zwykle stosuje się najpierw rozpuszczalnik o średniej mocy elucyjnej, następnie dla uzyskania

właściwego rozdziału zmienia się rozpuszczalnik na taki, który ma większą lub mniejszą moc

elucyjną. Można mieszać dwa lub więcej rozpuszczalników dla uzyskania odpowiedniej siły elucji i

selektywności rozdziału.

Szereg eluotropowy rozpuszczalników wg wzrastającej mocy elucyjnej, dla adsorbentów polarnych

przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Rozpuszczalniki uszeregowane zgodnie ze wzrastającą mocą elucyjną w chromatografii adsorpcyjnej

na żelu krzemionkowym

L.p. Rozpuszczalnik L.p. Rozpuszczalnik L.p. Rozpuszczalnik

1. n-Pentan 7. Eter dietylowy 13. Acetonitryl

2. Eter naftowy 8. Chloroform 14. Pirydyna

3. n-Heksan 9. Dichlorometan 15. Etanol

4. Cykloheksan 10. Tetrahydrofuran 16. Metanol

5. Tetrachlorek węgla 11. Aceton 17. Woda (b. duża siła elucji)

6. Toluen 12. Octan etylu 18. Kwas octowy (b. duża siła elucji)

Rozpuszczalniki stosowane w chromatografii cieczowej oprócz odpowiednich właściwości

chemicznych muszą spełniać kilka wymogów: powinny być dostępne w handlu, niedrogie, czyste,

bezpieczne w użyciu, mało reaktywne (nie niszczyć próbki, wypełnienia kolumny i przyrządu),

umożliwiać detekcję próbki i być o odpowiedniej lepkości i lotności.

Rozpuszczalniki niżej wrzące mają tendencję do tworzenia baniek, mogą odparowywać w czasie

rozdziału i zmieniać niekontrolowanie skład fazy ruchomej.

Rozpuszczalniki wyżej wrzące mają zwykle dużą lepkość i wymagają stosowania wysokich ciśnień

dla uzyskania odpowiedniej szybkości przepływu, a po rozdziale, przy odparowywaniu eluatu,

mogą powodować straty analitu.

2.5. Rozdział metodą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej

W adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej analizowane substancje w postaci roztworu nanosimy

na adsorbent wypełniający kolumnę. Wybór rozpuszczalnika zależy przede wszystkim

od rozpuszczalności substancji chromatografowanych. Związek organiczny jest zawsze silniej

adsorbowany z rozpuszczalnika niepolarnego niż polarnego. Natomiast już zaadsorbowany będzie

tym silniej wypierany im bardziej polarny jest dany rozpuszczalnik. Następnie przemywając złoże

(adsorbent w kolumnie) rozpuszczalnikiem rozwijamy chromatogram, czyli dzielimy mieszaninę

na grupy związków lub poszczególne związki chemiczne i wymywamy je (eluujemy) z kolumny

zbierając kolejne frakcje eluatu (rozpuszczalnika z eluującymi się związkami). Wymywanie można

prowadzić jednym rozpuszczalnikiem (elucja izokratyczna) lub kilkoma kolejno, albo mieszaniną

rozpuszczalników o wzrastającej polarności (elucja gradientowa). Spływające z kolumny frakcje

zbiera się oddzielnie. W ten sposób uzyskuje się rozdział badanej mieszaniny na składniki

nieadsorbowane i adsorbowane coraz silniej przez adsorbent. Poszczególne frakcje odparowuje

się i bada innymi metodami.

Rozdzielając mieszaniny związków organicznych, a szczególnie substancji pochodzenia

naturalnego, mimo wielu wskazówek, jakie można znaleźć w literaturze, zawsze wskazane jest

wykonanie próby na wzorcach oznaczanych substancji, a następnie próby z małą ilością materiału.

Poza tym, jak w przypadku innych metod empirycznych, potrzebna jest zawsze pewna doza

inwencji eksperymentatora. Niejednokrotnie selektywny rozdział składników mieszaniny udaje się

bardzo dobrze dopiero po uzyskaniu pewnego doświadczenia.

Zasadniczą częścią każdego zestawu do chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szkła

obojętnego, której wymiary są dostosowane do skali przeprowadzanego rozdziału. Najczęściej

mieszczą one od 10 do 100 g adsorbentu, co wystarcza do adsorpcji od 0,1 do kilku gramów

substancji. Dla przyspieszenia elucji stosuje się słabe ssanie (pompka wodna) lub słabe tłoczenie.

Napełnianie kolumny adsorbentem można przeprowadzać na sucho i na mokro. W metodzie

na sucho adsorbent wsypuje się małymi porcjami do kolumny i ubija bagietką szklaną. Następnie

przemywa się adsorbent rozpuszczalnikiem, w którym nanosi się badaną mieszaninę. Metoda

na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny adsorbentu w rozpuszczalniku użytym

do rozpuszczania substancji.

W obu metodach napełnianie należy wykonać tak, by złoże adsorbentu było jednorodne,

pozbawione pęcherzyków powietrza i tak ułożone, by nie zmieniało objętości w czasie

rozdziału. Powierzchnia adsorbentu powinna być stale pokryta płynem od chwili nalania

pierwszych porcji rozpuszczalnika do zakończenia procesu.

W przeciwnym razie złoże na kolumnie może łatwo wyschnąć, co uniemożliwi prowadzenie

prawidłowej adsorpcji i może spowodować utlenianie się niektórych substancji. Na Rysunku 4

przedstawiono zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia.

Rysunek 4. Zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia

2.6. Cienkowarstwowa chromatografia adsorpcyjna (TLC)

Chromatografia cieczowa, polegająca na rozdziale mieszaniny substancji na fazie stacjonarnej

w postaci płaszczyzny, nazywa się chromatografią planarną. Fazą stacjonarną może być bibuła

(chromatografia bibułowa) lub cienka, równomierna warstwa adsorbentu umieszczona na podłożu

szklanym, metalowym czy z tworzywa sztucznego zwana płytką chromatograficzną

(chromatografia cienkowarstwowa). Po zanurzeniu brzegu bibuły czy płytki chromatograficznej

w fazie ruchomej, następuje przepływ fazy ruchomej wymuszony przez siły kapilarne. Substancje

naniesione na płytkę będą przesuwały się wraz z fazą ruchomą (rozwijanie chromatogramu)

lub pozostaną na miejscu naniesienia, jeśli moc elucyjna zastosowanej fazy ruchomej będzie

niewystarczająca. Prędkość, z jaką substancje będą przesuwały się z fazą ruchomą, zależy

od ich wzajemnego oddziaływania z fazą stacjonarną i fazą ruchomą oraz oddziaływania fazy

ruchomej z fazą stacjonarną. Jeśli różnice w prędkości poruszania się poszczególnych substancji

będą wystarczające, po pewnym czasie każda z substancji znajdzie się w innym miejscu płytki

chromatograficznej – nastąpi rozdział.

Miejsce położenia substancji na płytce chromatograficznej określa współczynnik opóźnienia

oznaczany symbolem Rf, a wyrażający stosunek drogi przebytej przez substancję do drogi przebytej

przez fazę ruchomą. Współczynnik Rf jest wielkością charakterystyczną dla danej substancji

i układu chromatograficznego: fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Na Rysunku 5 przedstawiono

komorę chromatograficzną z fazą ruchomą oraz prawidłowy sposób zanurzania w niej płytki

z naniesionymi próbkami. Obok przedstawiono rozwinięty i wywołany chromatogram próbek

x, y oraz z.

Rysunek 5. Komora chromatograficzna z zanurzoną płytką i chromatogram TLC uzyskany dla próbek x, y oraz

z (interpretacja poniżej)

Współczynniki Rf dla poszczególnych substancji wynoszą:

dla substancji 1: Rf = a/F,

dla substancji 2: Rf = b/F,

dla substancji 3: Rf = c/F,

dla substancji 4: Rf = d/F,

dla substancji 5: Rf = e/F.

Dla substancji bezbarwnych istnieje szereg metod wizualizacji ich miejsca położenia na płytce

chromatograficznej (wywoływanie chromatogramu). Metody te zależą od właściwości chemicznych

i fizycznych badanych substancji. Bardzo często wywoływanie chromatogramu polega na

przeprowadzeniu reakcji barwnych. Inną metodą jest zwęglanie substancji, absorpcja par jodu czy

wizualizacja pod lampą UV. Substancje barwne nie wymagają wywoływania. Na chromatogramie

TLC próbek x, y oraz z (Rysunek 5) należy zauważyć, że:

plamy od 1 do 5 odpowiadają prawdopodobnie pojedynczym substancjom 1-5,

substancja 1 znajduje się w próbce x,

substancja 2 i 4 znajduje się w próbce z,

substancja 3 znajduje się w próbce x i z (ta sama wartość Rf),

substancja 5 znajduje się w próbce x i y (ta sama wartość Rf),

pozostałe plamy odpowiadają nierozdzielonym substancjom, identyfikacja nie jest możliwa,

plamy na starcie pochodzą od substancji nieoddziaływających z fazą ruchomą, za to silnie

adsorbowanych przez fazę stacjonarną,

pojedyncza plama nie musi odpowiadać jednej substancji, dopiero gdy plama jest

pojedyncza na chromatogramach TLC uzyskanych w rożnych układach

chromatograficznych, możemy założyć, że odpowiada jednej substancji.

3. Wykonanie ćwiczenia

3.1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest ekstrakcja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)

w próbkach gleby.

Przygotowanie próbki do analizy obejmuje:

ekstrakcję węglowodorów z gleby,

wydzielenie z ekstraktu frakcji węglowodorów alifatycznych i frakcji wielopierścieniowych

węglowodorów aromatycznych (WWA) za pomocą adsorpcyjnej chromatografii cieczowej,

ocenę rozdziału za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.

3.2. Pobór próbek gleby

Próby gleby (głębokość 0-5 cm) pobrano w punktach P-1 do P-6, zaznaczonych na planie podanym

poniżej

Glebę pobrano metalową łopatką i umieszczono w szklanych pojemnikach. Po przyniesieniu

do laboratorium próbki rozłożono cienką warstwą na folii aluminiowej, usuwając duże cząstki

roślinne i kamienie, i pozostawiono do wysuszenia. Tak wysuszona gleba nazywa się glebą

powietrznie suchą. Studenci otrzymują do analizy próbkę gleby pobraną w jednym, z pokazanych

na rysunku, punktów.

3.3. Ekstrakcja gleby i przygotowanie ekstraktu do rozdziału

Powietrznie suchą glebę rozetrzeć w moździerzu. Odważyć próbkę o masie od 10 do 30 g,

w zależności od miejsca poboru. Minimalna masa gleby powietrznie suchej dla P–1 i P–4 wynosi

30 g, dla P-3 i P–5–20 g, a dla P-2 i P–6 - 10 g. Naważkę gleby umieścić w kolbie stożkowej

o pojemności 100 ml, dodać 50 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu (3:2, v:v). Kolbę

umieścić w łaźni ultradźwiękowej na 15 min. Następnie osad zdekantować, ekstrakt przesączyć

przez bezwodny siarczan sodu umieszczony na sączku z bibuły filtracyjnej do kolbki gruszkowej

o pojemności 100 ml. Do gleby dodać świeżą porcję 25 ml mieszaniny eteru naftowego

i dichlorometanu i ekstrahować w łaźni ultradźwiękowej 10 min, następnie przesączyć przez ten

sam sączek. Do połączonych ekstraktów dodać 0,2 ml toluenu i odparować na wyparce obrotowej,

przy temperaturze łaźni wodnej nie przekraczającej 30ºC, do objętości poniżej 0,5 ml (warstwa

„oleju” na ściankach kolbki). Do ekstraktu dodać 1 ml eteru naftowego. W razie trudności

w rozpuszczeniu ekstraktu można dodać 1-2 krople toluenu i lekko podgrzać zawartość kolbki

w łaźni wodnej, w ostateczności próbkę można nanieść na kolumnę w postaci zawiesiny.

3.4. Przygotowanie kolumny do rozdziału

W kolbce stożkowej o pojemności 25 do 50 ml umieścić 4 do 6 g żelu krzemionkowego (żelu nie

należy ważyć, proszę czekać na wskazówki prowadzącego), zalać go taką ilością eteru naftowego,

aby słup cieczy nad zawiesiną wynosił ok. 1 cm. Zawartość kolbki mieszać ruchem łagodnym, tak

by usunąć pęcherzyki powietrza z zawiesiny.

W kolumnie chromatograficznej umieścić na przegrodzie ze szkła 1 krążek bibuły filtracyjnej.

Następnie przygotować naczynie na rozpuszczalnik z przemywania kolumny. Zawiesinę żelu

krzemionkowego lekko wymieszać i wlać przez lejek do kolumny unikając zbędnego

napowietrzania. Wlać tyle zawiesiny, aby złoże adsorbentu po ułożeniu się w kolumnie miało

wysokość 6 do 8 cm. Po napełnieniu i ułożeniu adsorbentu w kolumnie na wierzch złoża nałożyć

krążek bibuły, następnie przemyć zawartość kolumny 6 ml eteru naftowego (lub więcej

aż do osiągnięcia stałej wysokości złoża w kolumnie) i zamknąć wypływ z kolumny. Należy

pamiętać, by warstwa adsorbentu była stale pokryta rozpuszczalnikiem!

3.5. Nanoszenie ekstraktu na kolumnę

Jeśli ekstrakt był podgrzewany należy go schłodzić do temperatury pokojowej. Wypuścić

z kolumny nadmiar eteru naftowego, tak by wysokość cieczy nad złożem wynosiła 1-2 mm.

Nanieść roztwór analizowany na czoło kolumny, wlewając go powoli pipetą lub strzykawką

najlepiej po ściance kolumny tuż nad powierzchnią żelu.

Od momentu naniesienia ekstraktu na kolumnę rozpoczyna się zbieranie frakcji.

Gdy roztwór znajdzie się w złożu a wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm, wlać

ostrożnie po ściance kolumny 1 ml eteru naftowego i odczekać jak poprzednio (można przyspieszyć

przepływ fazy ruchomej stosując lekkie nadciśnienie). Czynność tę powtórzyć jeszcze raz,

używając następną, 1 ml porcję eteru naftowego. Gdy składniki ekstraktu są zaadsorbowane

na złożu, można dodać pozostałą objętość eteru naftowego, wynikającą z rozmiarów złoża

i warunków rozdziału podanych poniżej i prowadzić wymywanie frakcji węglowodorów

alifatycznych i WWA.

3.6. Warunki rozdziału

Adsorbent - żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm

Wymiary złoża adsorbentu - 1 cm x 6 cm;

Elucja:

I frakcja - 12 ml eteru naftowego, zawiera węglowodory alifatyczne

II frakcja - 25 ml mieszaniny eteru naftowego i toluenu (9:1, v:v), zawiera WWA.

Wartości podane są dla złoża o wysokości 6 cm. Jeśli wysokość złoża jest inna objętości frakcji

należy proporcjonalnie zmienić.

3.7. Ocena jakości rozdziału za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Jeśli stężenie WWA i węglowodorów alifatycznych w glebie jest małe, frakcje można zatężyć

na odparowywaczu obrotowym.

Warunki analizy TLC:

płytki z żelem krzemionkowym 60 na foli aluminiowej (TLC Silica gel 60 firmy Merck),

faza ruchoma – cykloheksan : toluen (67:33,v:v),

wizualizacja pod lampą UV.

Wykonanie analizy TLC:

dopasować rozmiary płytki do komory chromatograficznej,

narysować delikatnie ołówkiem linię startu w odległości ok.1 cm od brzegu płytki

i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia roztworów (punkty opisać delikatnie ołówkiem),

nanieść na płytkę po kilka mikrolitrów roztworu wzorców WWA, frakcji WWA i frakcji

węglowodorów alifatycznych, uważając, by plamka nie miała średnicy większej niż 5 mm;

im mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu,

odparować rozpuszczalnik za pomocą ręcznej suszarki,

wlać do komory chromatograficznej taką objętość fazy ruchomej, by po wstawieniu płytki,

plamki naniesionych substancji nie dotykały lustra cieczy,

delikatnie, przy pomocy pincety, wstawić płytkę chromatograficzną z naniesionymi

substancjami do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory,

komorę zamknąć i rozwijać chromatogram,

płytkę wyjąć z komory, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości mniejszej niż 1 cm

od brzegu,

zaznaczyć ołówkiem czoło fazy ruchomej i odparować fazę ruchomą (do zaniku zapachu

toluenu),

przy pomocy pincety umieścić płytkę pod lampą UV i ołówkiem obrysować widoczne

plamki,

wyznaczyć współczynnik Rf, dla wszystkich plamek, wyznaczyć zakres współczynników

Rf, dla frakcji II,

na podstawie chromatogramu TLC ocenić jakość rozdziału WWA od węglowodorów

alifatycznych na kolumnie z żelem krzemionkowym.

3.8. Sporządzenie sprawozdania

W sprawozdaniu powinno się znajdować:

zwięzły opis technik zastosowanych do izolacji WWA i węglowodorów alifatycznych z

gleby,

opis próbki,

warunki ekstrakcji,

warunki rozdziału na kolumnie,

warunki rozdziału na płytkach TLC,

schemat blokowy, ideowy wykonania oznaczenia,

ocena jakości rozdziału i dyskusja wyników.

4. Odczynniki

· żel krzemionkowy żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm,

odmyty od plastyfikatorów i aktywowany w temp. 150°C przez 10 godzin,

· roztwory wzorcowych WWA,

· eter naftowy destylowany,

· toluen destylowany,

· cykloheksan destylowany,

· dichlorometan destylowany,

· bezwodny siarczan(VI) sodu cz.d.a.,

· rozpuszczalniki do mycia.

5. Sprzęt i szkło laboratoryjne

· kolumna szklana z kranikiem,

· przedłużacz do kolumny,

· kolba stożkowa o poj. 50 ml 2 szt,

· kolba stożkowa o poj. 100 ml 1 szt,

· cylindry miarowe o poj. 10 ml - 1 szt., 25 ml - 1 szt., 50 ml - 1 szt,

· pipeta z tłoczkiem lub strzykawka szklana o poj. 2 ml - 2 szt,

· lejek szklany - 2 szt,

· kolbki okrągłodenne lub gruszkowe poj. 50 ml - 3 szt,

· kolbki gruszkowe poj. 100 ml - 1 szt,

· zestaw do tłoczenia przez kolumnę - 1 szt,

· łyżka metalowa - 2 szt,

· moździerz porcelanowy - 1 szt,

· sączki z bibuły filtracyjnej,

· naczynie szklane na próbkę gleby,

· komora chromatograficzna – 2 szt.,

· płytki TLC,

· strzykawka o poj. 10 μl z płasko zakończoną igłą,

· pinceta,

· odparowywacz obrotowy,

· lampa UV,

· ołówek, linijka,

· suszarka ręczna,

· rękawice ochronne, lateksowe.

Literatura

1. Behnke M., Szymański J. Problemy Ocen Środowiskowych, Nr 3(26), 2004, EKO -

KONSULT, Gdańsk-Oliwa.

2. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 1996.

3. Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna. W-wa, PWN, 1985, tom 3.

4. Kocjan R. Chemia analityczna, podręcznik dla studentów, W-wa, PZWL, 2000, tom 2.

5. Staszewski R. Kontrola chemicznych zanieczyszczeń środowiska, Podstawy teoretyczne z

ćwiczeniami laboratoryjnymi, Politechnika Gdańska, Gdańsk,1990.

6. Jerzmanowska, Z., Preparatyka organicznych związków chemicznych, PZWL,W-wa,1972.

7. Namieśnik J. Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszczeń środowiska. J., Politechnika

Gdańska, Gdańsk,1992.