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Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins
01.03.2010 Matthias Weißkopf
1
Sequence relationships between putative T-cell receptor polypeptides and immunoglobulins
Mark M. Davis, et al.Nature Vol. 308, March 1984
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Gliederung
• Ausgangspunkt• Ziel des Versuchs• Methoden• Ergebnis / Zusammenfassung• Heutiger Stand
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Stand der Dinge (1984)
• T-Zellen erkennen Antigene anders als B-Zellen und in einem anderen Zusammenhang
• Struktur von Immunglobulinen bekannt
• Identifikation des T-Zell Rezeptor Proteins, u.a. von Jim Allison• Heterodimer über Disulfidbrücken verbunden• Besteht aus konstanten und variablen Regionen
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Ziel des Versuchs• Isolierung der Gene, die für den T-Zell Antigen Rezeptor kodieren
• Vier Annahmen zur Identifikation wurden aufgestellt. Die Gene müssen:• ausschließlich in T- und nicht in B Zellen exprimiert werden• membrangebunden sein• von Genen kodiert werden die sich neu anordnen, wie jene bei
Immunglobulinen• aus konstanten und variablen Bereichen bestehen.
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• Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA
Methoden
5
T-Zelle
Isolierung der mRNA von membrangebunden Polysomen
cDNA erstellen
5‘ 3‘
5‘3‘
3‘5‘
d
ba
c
a
bc
d
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Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA
6
B-Zelle
b
a
c
d
a
b
c
e
e
f
Hybridisierung mit Überschuss an B-Zell mRNA
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• Trennung von Einzel- und Doppelsträngen per Hydroxyapatit Säule• Weitere Eingrenzung durch Hybridisierung mit ähnlich hergestellter T-Zell
cDNA Probe• cDNA Fragmente wie „d“ und „f“ mögliche Kandidaten für T-Zell Rezeptor
• Einklonieren der cDNA in Plasmide-> etwa 30 TM Klone
Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA
7
d f
d
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• Hybridisierung an genomische DNA aus Leber- und T-Zellen• Radioaktiv markierte Inserts aus den Klonen als Sonde• Verdau mit Pvu II
-> Southern Blot
Überprüfen von somatischer Rekombination
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• Insert aus TM86 besitzt anderes Muster• Somatische Rekombination findet statt
• Annahme: Rekombination des Rezeptorgens unterscheidet sich bei T-Zellen unterschiedlicher Antigenspezifität• Überprüfung durch Hybridisierung mit Insert
von TM86
Überprüfen von somatischer Rekombination
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Überprüfen von somatischer Rekombination
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• Unterschiedliche Bindemuster in allen untersuchten T-Zelllinien
• B-Zellen besitzen selbes Muster wie Leberzellen
-> Diese Art von Rekombination findet nur in T-Zellen statt
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• Screening von Thymozyten mit TM86 für weitere gleichartige Klone• 86T1, 86T3 und 86T5
• Sequenzierung der Thymusklone zeigt Genstruktur mit variablen und konstanten Bereich
• Starke Ähnlichkeit zu Immunglobulinen• Variable, Konstante und Joining Regionen
• Strukturanalyse zeigt Transmembran Abschnitt
Sequenzierung des Gens
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Sequenzanalyse
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• TM86 ähnliche mRNAs kodieren für eine Kette des T-Zell Rezeptors (β-Kette)• Unterschiedliche Anordnung von Genen je nach Antigenspezifität
-> somatische Rekombination auf DNA Ebene• Ähnlichkeit im Aufbau zu Immunglobulinen• Vorausgesagte Struktur der Kette:
Ergebnis / Zusammenfassung
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Heutiger Stand
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Quelle: Janeway
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Vielen Dank für die Aufmerksamkeit !
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