Isolation and characterization of organism producing thermo-

stable lipase

報告學生 : 莫曉嬌 宋志潔 報告日期 :2003/12/29

前言 Lipase ( 脂肪分解酵素 ) 可用作分解脂肪

環境中有許多微生物可產生 lipases ，催化 triglycerol 分解成 glycerol 與 fatty acid

微生物所產生的 lipase 多為胞外酵素

Lipase 多為適中溫酵素

Lipase 有許多用途： 1. 食品工業：起士

2. 清潔劑工業3. 油脂工業：甘油4. 廢水處裡5. 醫療：吸收不良病患

Thermostable lipase ： 1. 嗜高溫微生物 2. 一般溫度生長之微生物

目的

從環境中採集樣本，希望能找出並分離﹑ 鑑定能產生 thermostable lipase 的微生物。

實驗架構

Tributyrin agar plate ：分離

不同受質培養基 +Rhodamin B

堆肥：篩菌

生化測試：鑑定

材料 培養基 1.Tributyrin agar plate (per L) ： Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Tributyrin 15.0g 2. 不同受質培養基： Peptone 5.0g Beef extract 3.0g Agar 25.0g Olive oil Corn oil Pig oil Tween20 10.0g/L﹑ ﹑ ﹑ Rhodamin B 10.0ml/L

3. 生化測試培養基： NA+NaCl Nitrate broth SIM MR-VP ﹑ ﹑ ﹑ broth Phenol red+sugar broth MSA ﹑ ﹑ ﹑ Citrate Urea broth﹑

樣本： 木柵動物園之堆肥

0.85% NaCl 無菌生理實驗水

實驗流程培養和分離

1g 樣本 +9mL 0.85% NaCl↓

取 0.1ml之 101 10﹑ 2 10﹑ 3 10﹑ 4 10﹑ 5稀釋度塗抹平板，在 Tributyrin agar plate

↓50℃培養 1-3 天

↓觀察有無生長與透明環產生

↓

選擇有透明環之菌落，在 Tributyrin agar plate上作純培養， 50℃培養 1-3 天

↓

在 Tributyrin agar plate 上作繼代培養，50℃與 60 ℃培養 1-3 天

↓培養於 Tributyrin plate Olive oil plate﹑ ﹑

Corn oil plate Tween20 plate ﹑ ﹑Pig oil plate ， 50℃與 55 ℃培養 1-3 天

↓

觀察有無生長與透明環產生↓

培養於 Tributyrin plate﹑含有 Rhodamin B的 Olive oil plate Corn oil plate ﹑ ﹑

Tween20 plate Pig oil plate﹑ ，50℃與 55 ℃培養 1-3 天

↓觀察有無生長與透明環及螢光產生

↓鑑定

鑑定Gram stain ： G(+) rods(圖二)

Spore stain(圖四, 圖五)

Glucose fermentation

1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A

(Bacillus sp.)

Catalase Catalase

+ -

+ -

+

-

Sporosacina sp.

Clostridium sp.

Desulfotomaculum sp.

+ -

Motile

+ -

Lactobacillus sp.

Erysipelothrix sp.

2D

(Brochothrix)

Listeria sp.

Kurthia sp.

1B, 1C,1D, 1E, 1F, 2A(Bacillus sp.)

60 ℃生長+ -

1C, 1E

(B. stearothermophilus)10%NaCl 生長

+ -

1D

(B. pantothenticus)

1B, 1F, 2A

(B. megaterium)

鑑定 ( 續 )Gram stain: G(+) cocci

Catalase+ -

Oxidase Streptococcus sp.+ -

Micrococcus sp.

Motile+ -

2E

(Planococcus sp.)

Staphylococcus sp.

Stomatococcus sp.

結果

培養基種類 加入Rhodamin B 1B 1C 1D 1E 1F 2A 2D 2ETributyrin plate - G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+Olive oil plate - G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/+Corn oil plate - G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/- G/+Tween20 plate - G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+ G/+Olive oil plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*Corn oil plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*Tween20 plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*Pig oil plate + G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/-* G/+*

註:

菌株編號

1. G/+:有生長且有透明環 G/-:有生長但沒有透明環2. G/+*:有生長且有螢光 G/-*:有生長但沒有螢光

表一､ 不同測試菌株生長於不同受質培養基之結果

鑑定測試項目 1B 1C 1D 1E 1F 2A 2D

Endospore production + + + + + + -Spore shape E E E E E ESpore position C C C C CL CLCatalase + + + + + + +Oxidase - - - - - - -Nitrate reduction + + + + + + +VP - - - - - - -Urease - - - - + - -Citrate + + + - - - +

Fermentation：glucose + + + + + + +mannitol + + + + + + +xylose - - - - - - -fructose (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)lactose - - - - - - -

arabinose - - (+) (+) (+) - -Growth on：

2%NaCl + + + + + + +

5%NaCl + + + + + + +7%NaCl + + + + + + +

10%NaCl - - (+) - - - -Growth on ：

50℃ + + + + + + +

55℃ + + + + + + +

60℃ - + - + - - -註:

2. +:正反應 -:負反應 (+):弱正反應

表二 ､ 革蘭氏陽性桿菌(1B, 1C, 1D, 1E,1F, 2A, 2D)之孢子染色 與生化鑑定測試結果

菌株編號

1. E: C: CL:橢圓形 位於中央 位於中央偏側邊

鑑定測試項目 結果 鑑定測試項目 結果Catalase + Fermentation：Oxidase - glucose +

Nitrate reduction + mannitol -

Motile + xylose -

Indole - fructose (+)

VP - lactose -

Urease - arabinose (+)MSA* - Growth on：Citrate - 2%NaCl +

Growth on ： 5%NaCl (+)

50℃ + 7%NaCl -

55℃ + 10%NaCl -

60℃ - 15%NaCl -

註:

2. MSA反應: -表示沒有生長

菌株編號-2E

1. +:正反應 -:負反應 (+):弱正反應

表三､ 革蘭氏陽性球菌(2E)之生化測試結果

討論 鑑定的結果之正確性，原因是 :

1. 有很多生化測試是 d 或 ND

2. 所作的生化測試並不完全 3. 測得的結果很類似 4. 部分菌株特性 Bergey’s manual 中没列

改善上述缺點的方法 :

1. 操作技術純熟 2. 用 Biolog 分析

生化測試之糖類發酵 :

糖類改為過濾滅菌應可改善結果之判讀

培養條件 :

1. 培養基受質選擇 :

(1) 受質結構的不同 (2) 受質濃度用量 2. 培養溫度之選擇

參考文獻Rohit Sharma, and Yusuf Chisti. 2001. Production, purification, characterization, and applications of lipase. Biotechnol Advances.19:627-662.

Yougxiang Wang. 1995. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus Strain A30-1 (ATCC 53841). J Fermen Bioeng. 79:433-438.

謝汎擎 . 2001 . 耐熱脂肪分解酵素分離與特性測定 .

Bergey’s manual. Vol. 2.

圖一､木柵動物園堆肥樣本

圖二､革蘭氏陽性桿菌 (1B)

圖三､革蘭氏陽性球菌 (2E)

圖四､孢子染色結果 (1D)

圖五､孢子染色結果 (1F)

圖六 . 2D 菌在 Tributyrin plate 產生的透明環

圖七､ 2E 菌在 olive oil plate 上產生的透明環

圖八､ 2E 菌在 Pig oil plate 上產生螢光