Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEANProgramul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013Axa Prioritară: 1. Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii

Domeniul Major de Intervenţie: 1.5. Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetăriiTitlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecvenţă prin acordarea de burse doctorale"

Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8

Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE DIN CRAIOVA

Teză de doctoratRezumat

Rolul VEGF în angiogeneza din leziunile maligne și premaligne gastrice

Conducător doctorat " " " " DoctorandProf. univ. dr. Mihai Cruce " " Maria-Cristina Soare " " " " " " " " (Angelescu)

" " " " " " " "" " " " "" " " " " " " " "

Craiova, 2011

Introducere

În ciuda scăderii ratelor de incidență și mortalitate a can-cerului gastric obsevate în ultimele decenii, cancerul gastric reprezintă la nivel mondial cea de-a patra cauză de cancer și cea de-a doua cauză de deces prin cancer. Helicobacter pylori (H. pylori), bacil Gram-negativ clasi-ficat de Organizația Mondială a Sănătății drept carcinogen de tip 1, declanșează invazia tumorilor maligne gastrice prin mai multe mecanisme, unul dintre acestea fiind inducerea angioge-nezei, prin modularea expresiei unor factori angiogenetici. În plus, infecția cronică cu H. pylori stimulează angiogeneza în leziunile non-maligne sau premaligne gastrice, precum ulcerele gastrice, gastrita cronică, metaplazia și displazia gastrică (IARC, 1994; Kidatai et al., 2003; Papetti and Herman, 2002). Infecția cronică cu H. pylori este adesea asociată cu o hipergastrinemie moderată, ce a fost propusă ca un factor im-portant în promovarea carcinogenezei gastrice. Asocierea între infecția cu Helicobacter, hipergastrinemie și carcinogeneza gastrică a fost demonstrată, dar mecanismele exacte al inter-acțiunilor între infecția cu Helicobacter și hipergastrinemie nu au fost clarificate (Takaishi et al, 2009).

Cuvinte cheie: cancer gastric, angiogeneză , Helicobacter, hipergastrinemie

1

I. STADIUL CUNOAȘTERII

Capitolul 1, intitulat “Carcinogeneza gastrică”, descrie epidemiologia cancerului gastric, factorii de risc implicați în carcinogeneza gastrică, accentuând importanța infecției cu H. pylori și a hipergastrinemiei, precum și utilitatea modelelor animale pentru studierea carcinogenezei gastrice.

Capitolul 2, intitulat “Angiogeneza tumorală - particu-larități în leziunile maligne și premaligne gastro-esofagiene”, descrie procesul de angiogeneză tumorală, principalii factori pro-angiogenetici și receptorii acestora, analizând apoi fe-nomenul de angiogeneză la nivelul leziunilor maligne și prema-ligne esofagiene și gastrice și utilizarea terapiei anti-angiogenetice în aceste patologii.

II. CONTRIBUȚII PERSONALE

Capitolul 3. Analiza expresiei VEGF-A, VEGF-B și EGFR în cancerul gastro-esofagian În acest studiu ne-am propus cuantificarea expresiei geni- ce a VEGF-A, unor izoforme specifice ale VEGF-A, VEGF-B și EGFR în cancerele gastro-esofagiene umane, precum și ana-liza corelațiilor între nivelurile expresiei și caracteristicile clinico-patologice tumorale.

2

Material și Metodă Pacienți și probe utilizate. Au fost prelevate biopsii din formațiuni tumorale gastro-esofagiene de la 43 de pacienți su-puși endoscopiei digestive superioare și ecoendoscopiei la Cen-trul de Cercetare în Gastroenterologie și Hepatologie din Craiova, România. Toți pacienții incluși în studiu au prezentat infecție cu H. pylori. De la fiecare pacient au fost prelevate probe pereche, atât din țesutul tumoral, cât și din țesutul peri-tumoral. Izolarea ARN total. Am utilizat kit-ul SV Total RNA Iso-lation System (Promega) pentru izolarea și purificarea ARN-ului total din biopsiile din formațiunile tumorale și mucoasa peritumorală. Gradul de fragmentare al ARN-ului a fost evaluat prin electroforeză în gel denaturant de agaroză, iar concentrația și puritatea au fost măsurate spectrofotometric. qRT-PCR. În vederea cuantificării expresiei genice am utilizat tehnologia Real-Time PCR cantitativ în două etape. În prima etapă, 1µg de ARN a fost revers-transcris în ADN com-plementar monocatenar (ADNc) utilizând kit-ul High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). În cea de-a doua etapă am realizat reacția Real-Time PCR utilizând TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) cu primeri și sonde TaqMan® pentru genele țintă și pentru gena de referință (VEGF-A - Hs00900054_m1, VEGF121 - Hs03929005_m1, VEGF148, VEGF165 și VEGF165b - Hs00900057_m1, VEGF-B - Hs00173634_m1, EGFR - Hs01076092_m1 și GAPDH - Hs99999905_m1). Reacțiile de

3

amplificare au fost realizate în volume de 20 µl, în triplicat, utilizând un sistem Mastercycler®ep realplex (Eppendorf). Nivelurile expresiei genelor țintă au fost normalizate la nivelul expresiei genei de referință GAPDH, iar diferențele între ex-presia genică în probele pereche au fost calculate utilizând me-toda 2-ΔΔCt. Statistica. Diferențele expresiei între probele pereche au fost considerate semnificative atunci când nivelurile de ARNm au variat de cel puțin 1.8 ori. Teste statistice non-parametrice (Wilcoxon matched-pairs signed rank test, Wilcoxon Signed Rank Test, Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, Spearman correlation test) au fost utilizate atunci când valorile nu au fost distribuite gaussian. Valorile p<0.05 au fost considerate semni-ficative statistic.

Rezultate și Discuții

Analiza expresiei genice a relevat faptul că genele VEGF-A, inclusiv variantele studiate, VEGF-B și EGFR au fost ex-primate atât în tumoră, cât și an mucoasa peritumorală. Mode-lul expresiei transcripților analizați este ilustrat în Figura 1.

4

Fig. 1. Modelul expresiei transcripților analizați în probele anali-zate (n=39)

Nivelurile ARNm pentru VEGF-A total, VEGF121, VEGF148, VEGF165 și VEGF165b au fost superioare în țesu-tul tumoral comparativ cu mucoasa peritumorală neinvadată malign. Diferențele între nivelurile expresiei VEGF-A și a vari-antelor studiate între probele pereche au fost semnificative sta-tistic (p=0.007; p=0.002; și respectiv p=0.014, Wilcoxon matched-pairs signed rank test) Expresia proteică a VEGF-A este superioară în cancerele gastrice și a fost corelată cu densitatea microvasculară în ma-joritatea studiilor (Zhao et al., 2006; Kolev et al., 2007). Într-un

VEGF-A

VEGF121

VEGF148 V

EGF165 V

EGF165b

VEGF-BEGFR

0

20

40

60

80

100

Perc

ent o

f the

cas

es

Higher expression in TIrrelevant differenceHigher expression in PT

5

studiu de microarray, Jubb și colab. au demonstrat că gena VEGF-A este sub-exprimată la nivelul tumorilor gastrice (Jubb et al., 2004). În studiul nostru expresia ARNm pentru VEGF-A a fost superioară în țesutul tumoral în 38.46% din cazuri și su-perioară în țesutul peritumoral în 7.69% din cazuri; în restul de 53.85% din cazuri diferența între probele pereche a fost nesem-nificativă. O posibilă explicație pentru discrepanțele dintre dif-eritele studii este metodologia utilizată. În timp ce majoritatea studiilor au analizat expresia imunohistochimică a VEGF-A, în studiul de față am analizat expresia VEGF-A la nivelul ARNm. Nivelurile ARNm nu reflectă întotdeauna nivelurile proteinei, datorită reglării post-transcripționale. Pe de altă parte, VEGF-A poate fi supra-exprimat în țesutul peritumoral gastric ca urmare a infecției cu H. pylori, iar analiza diferențelor expresiei între probele pereche poate să nu reflecte o supra-exprimare a ARNm pentru VEGF-A. Datorită caracteristicilor particulare și a variațiilor inten-sității efectelor angiogenetice, elucidarea mecanismelor care conduc la splicing-ul alternativ și caracterizarea nivelurilor de expresie ale acestor variante în diferitele afecțiuni sunt de o importanță majoră. În studiul nostru atât VEGF121, cât și izo-formele care conțin doar exonul 7, au fost exprimate atât în țe-sutul tumoral, cât și mucoasa peritumorală, iar în majoritatea cazurilor expresia acestor variante a fost superioară în tumoră sau diferența între probele pereche a fost nesemnificativă; ex-presia variantelor rezultate prin splicing-ul alternativ a urmat același model ca expresia VEGF-A total. În plus, raportul izo-

6

formelor care conțin doar exonul 7 între exonul 5 și exonul 8 (VEGF148, VEGF165 și VEGF165b) și izoformele care nu conțin nici exonul 6 nici exonul 7 (VEGF121) a fost de 1:1 atât la nivelul tumorii, cât și la nivel peritumoral. Nu am observat nicio diferență semnificativă între ex-presia VEGF-B sau EGFR între probele pereche. În continuare, transcripții analizați au fost corelați cu di-feriți parametri clinico-patologici: stadiul tumorii, localizarea tumorii și tipul histologic tumoral. VEGF-A total și izoformele analizate au prezentat același model de asociere cu parametrii studiați. Nivelurile ARNm au fost similare între stadiile T2 și T3, având tendința de a crește în stadiul T4; această diferență a fost la limita de semnificație statistică. Deși diferența între nivelurile expresiei genice în re-lație cu stadiul tumorii nu a fost semnificativă statistic, VEGF-A ar putea fi utilizat împreună cu alți parametri clinico-patologici, ca un indicator al progresiei cancerului gastric. În studiul nostru nu am constatat nicio diferență între nivelurile expresiei VEGF-A sau a variantelor analizate între adenocarci-noame și carcinoame scuamoase. Nivelurile ARNm pentru transcripții analizați au avut tendința de supraactivare în corpus comparativ cu tumorile localizate în antrum sau esofagul infe-rior, joncțiunea eso-gastrică sau cardia. În majoritatea probelor pereche, nivelurile ARNm pentru VEGF-B au fost similare între tumorile T2, T3 și T4. Expresia VEGF-B a variat ușor între tipul histologic de adenocarci-noame și carcinoame scuamoase. Expresia VEGF-B în esofagul

7

distal, joncțiunea eso-gastrică și cardia a fost similară cu ex-presia în corpus; la nivelul antrumului VEGF-B a avut o expre-sie inferioară comparativ cu celelalte localizări. Niciuna dintre aceste diferențe nu a atins nivelul de semnificație statistică. Pentru EGFR nu am observat o diferență semnificativă a expresiei între diferitele stadii tumorale, localizări, sau tip his-tologic tumoral. Asocierea expresiei diferitelor gene a fost analizată prin generarea cluster-ului ierarhic și calcularea coeficienților de corelație Spearman (Figura 2).

Fig. 2. Clusterul ierarhic (GenexPro 4.4.2.308©)

Concluzii 1. Expresia VEGF-A a fost semnificativ crescută în tesu-tul tumoral comparativ cu mucoasa peritumorală.

8

2. Nivelurile ARNm pentru VEGF-A au avut tendința de a fi superioare în tumorile care invadează seroasa (T4), precum și în tumorile localizate la nivelul corpusului. 3. Variantele alternative ale VEGF-A (varianta tran-scripțională 6, și variantele 4, 5, 7) au urmat același model al expresiei ca și VEGF-A total în toate cazurile studiate. 4. VEGF121 și VEGF148, VEGF165, VEGF165b au avut același nivel al expresiei în fiecare probă individuală; acest fapt sugerează că nicio variantă transcripțională nu este predomi-nantă în tumorile gastro-esofagiene sau mucoasa peritumorală. 5. VEGF-B a avut același nivel al expresiei în tumoră și mucoasa peritumorală în grupul studiat, fără o diferență semni-ficativă între probele pereche. 6. ARNm pentru EGFR s-a exprimat în toate probele, fără o tendință de supra- sau sub-exprimare. Nicio corelație semni-ficativă nu a fost înregistrată între expresia EGFR și caracteris-ticile clinico-patologice tumorale. 7. VEGF-A, VEGF-B și EGFR sunt supra-exprimate în mucoasa peritumorală invadată malign în comparație cu țesutul tumoral pereche, sugerând faptul că expresia acestor factori este un eveniment precoce în carcinogeneza gastrică. 8. Prin utilizarea tehnologiei qRT-PCR în două etape, am generat o arhivă de ADNc specifică patologiei maligne gastro-esofagiene. 9. Studii de expresie proteică ale acelorași probe sunt ne-cesare pentru a elucida implicarea unor mecanisme de reglare post-transcripțională sau post-translațională a expresiei.

9

Capitolul 4. Infecția cu Helicobacter felis și hipergas-trinemia induc angiogeneza la șoareci infectați pentru pe-rioade scurte

Ipoteza acestui studiu a fost aceea că angiogeneza este modulată de infecția cu Helicobacter și/sau de hipergastrine-mie. Ne-am propus evaluarea densității microvasculare și ex-presiei VEGF-A (la nivelul ARNm și la nivel proteic) la șoareci wild-type și hipergastrinemici infectați cu Helicobacter felis (H. felis) pentru o perioadă de 6 săptămâni.

Material și Metodă Animale. Șoarecii transgenici INS-GAS prezintă o trans-genă himerică în care gena pentru gastrină umană este tran-scrisă de la promotorul genei pentru insulină de șobolan (Wang et al., 1993). În acest studiu am infectat cu H. felis (ATCC 49179) 12 șoareci INS-GAS și 11 șoareci wild type FVB/N cu vârsta de 4 săptămâni, prin efectuarea a 3 gavaje în decurs de o săptămână. Am inclus în studiu și 12 șoareci INS-GAS ne-infectați și 12 șoareci neinfectați FVB/N. La 6 săptămâni post-infectare, șoarecii au fost sacrificați prin gazare cu CO2 și apoi exsanguinați; stomacul a fost prelevat pentru studii histologice, imunohistochimice, expresie proteică și expresie genică. Ex-perimentele pe animale au fost derulate cu aprobarea UK Home Office. Imunohistochimie. Am utilizat protocoalele standard de imunohistochimie. Expunerea antigenului s-a realizat cu acid

10

citric 10mM pH6 mediată de căldură pentru VEGF-A și prin expunere la proteinază K 20µg/ml la 37° pentru factorul von Willebrand. Anticorpul monoclonal de șoarece anti VEGF-A, clona VG-1 (ab1316, Abcam, Cambridge, UK) și anticorpul policlonal de iepure anti factor von Willebrand (ab6994, Ab-cam, Cambridge, UK) au fost utilizați ca anticorpi primari. Western blot. După extracția proteinelor din piesele recol-tate în soluție tampon RIPA, am determinat concentrația protei-nelor prin metoda Bradford. 100µg de proteine au fost migrate într-un gel de acrilamidă 10%, cu grosimea de 1.5 mm. Pentru vizualizarea și cuantificarea proteinei VEGF-A am utilizat anti-corpul monoclonal de șoarece anti VEGF-A, clona VG-1 (ab1316, Abcam, Cambridge, UK). Analiza expresiei genice. După izolarea și purificarea ARN total, expresia VEGF-A a fost analizată utilizând tehnica Real-Time PCR cantitativ în două etape utilizând primeri și sonde specifice pentru VEGF-A și ARN18S utilizat drept refer-ință. Nivelurile relative ale VEGF-A au fost calculate pentru fiecare animal din fiecare lot. Statistica. Pentru a determina dacă valorile obținute au fost distribuite gaussian, am aplicat testul Kolmogorov-Smirnov. Pentru a analiza diferențele în expresia genică între loturi, am utilizat testul Kruskal-Wallis. Valorile p<0.05 au fost considerate semnificative statistic.

11

Rezultate și discuții

În corpus, am observat o creștere semnificativă a număru-lui de vase la șoarecii hipergastrinemici INS-GAS infectați cu H. felis. În antrum, creșterea densității microvasculare a fost similară la șoarecii INS-GAS și FVB/N infectați cu H. felis (Figura 3, 4, 5).

Fig. 3. Microvase în corpusul șoarecilor FVB/N infectați cu H. felis (a) și ne-infectați (b); 400x.

Fig. 4. Microvase în corpusul șoarecilor INS-GAS infectați cu H. felis (a) și ne-infectați (b); 400x.

12

Modelul variației densității microvasculare în loturile studiate este prezentat în Figura 5.

corpus antrum

Fig. 5. MVD în corpus, respectiv antrum în loturile studiate. *** = p<0.001, ** = p<0.01, Kruskal-Wallis test

Imunomarcarea cu anticorpul VEGF-A, clona VG-1, a evidențiat un pattern citoplasmatic omogen cu distribuție omo-genă. Atât corpusul cât și antrumul (FVB/N și INS-GAS) șoarecilor infectați cu H. felis a prezentat o reacție intens pozitivă pentru VEGF-A (Fig. 6). Procentul celulelor pozitive a fost superior atât în corpus-ul cât și în antrum-ul șoarecilor INS-GAS infectați cu H. pylori comparativ cu șoarecii FVB/N, dar intensitatea imunoreacției a fost mai mare la grupul FVB/N.

13

FVB INS-GAS FVB INS-GAS 3

4

5

6

7

MVD

H. felis + no H. felis

****

corpus antrum Fig. 6. Imunoexpresia VEGF-A în corpus, respectiv antrum în loturile studiate. ** = p<0.01, Kruskal-Wallis test

Atât în corpus cât și în antrum am observat o creștere a intensității imunoreacției în compartimentul glandular al mu-coasei la șoarecii infectați cu H. felis (atât FVB/N cât și INS-GAS) în comparație cu șoarecii wild-type sau hipergastrinemici neinfectați. Această observație a fost făcută și de alți autori în studii de imunohistochimie la pacienți infectați cu H. pylori (Tuccillo et al., 2005) (Figura 7, 8). Am observat o corelație foarte puternică între imunoex-presia VEGF-A și densitatea microvasculară, susținută atât prin analiza regresiei liniare cât și de coeficientul Spearman.

14

FVB INS-GAS FVB INS-GAS 0

1

2

3

4

5

VEG

F-A

imm

unos

tain

ing

scor

e

H. felis + no H. felis

**

Fig. 7. VEGF-A în corpusul șoarecilor FVB/N infectați cu H. felis (a) și ne-infectați (b); 400x.

Fig. 8. VEGF-A în corpusul șoarecilor INS-GAS infectați cu H. felis (a - suprafața mucoasei, b - baza glandei) și ne-infectați (c - supra-fața mucoasei, d - baza glandei); 400x. La analiza Western Blot, prin utilizarea anticorpului pri-mar anti-VEGF-A, clona VG1, am identificat prezența unei benzi corespunzătoare greutății moleculare de 60kDa (dimerul) și a unei benzi la 30 kDa, corespunzătoare monomerului VEGF-A (Figura 9).

15

Fig. 9. Analiza VEGF-A prin Western blot pentru corpus și an-trum, la toate loturile de șoareci studiate. Anticorpul anti-pan-actin a fost utilizat drept control al încărcării godeurilor, pentru calculul densi-tometric al nivelului proteinei VEGF-A.

Nivelurile expresiei proteice a VEGF-A au crescut de 3.1 ori în corpusul șoarecilor FVB/N infectați cu H. felis (p<0.01, Kruskal-Wallis test) și de 2.3 ori în corpusul șoarecilor INS-GAS infectați (p<0.01, Kruskal-Wallis test), comparativ cu lo-tul de șoareci wild type neinfectați. Același model a fost observat și în antrum, cu o creștere de 3.8 ori a nivelului VEGF-A la șoarecii FVB/N infectați (p<0.01, Kruskal-Wallis test) și de 2.2 ori la șoarecii INS-GAS infectați cu H. felis. Consistent cu rezultatele cuantificării proteică pentru VEGF-A, nivelurile ARNm au crescut la șoarecii FVB/N și INS-GAS infectați cu H. felis și la șoarecii INS-GAS neinfec-tați, comparativ cu lotul de control FVB/N neinfectați. În studiul nostru expresia VEGF-A a fost crescută atât la nivel proteic, cât și ARNm, la șoarecii wild type cât și la soare-

16

cii transgenici INS-GAS infectați cu H. felis. Expresia VEGF-A, evaluată imunohistochimic, prin Western blot și qRT-PCR, a fost superioară în stomacul șoarecilor FVB/N comparativ cu soarecii hipergastrinemici INS-GAS în urma infectării cu H. felis pentru 6 săptămâni. În plus, VEGF-A a avut tendința de supraexprimare la șoarecii hipergastrinemici neinfectați com-parativ cu lotul de șoareci wild type neinfectați, fapt ce sugerează că gastrina per se modulează expresia VEGF-A atât la nivelul transcripției cât al translației. Această acțiune a gas-trinei asupra expresiei VEGF-A poate explica creșterea mai re-dusă a expresiei VEGF-A la șoarecii hipergastrinemici com-parativ cu șoarecii wild type în urma infecției cu H. felis. La șoarecii INS-GAS, infecția cu H. felis survine într-un stomac cu hipergastrinemie moderată, număr crescut de celule parie-tale, expresie VEGF-A și a altor factori pro-angiogenetici deja crescută, și densitate microvasculară crescută. La acești șoareci necesitatea dezvoltării unor noi vase de sânge ca răspuns la in-fecția cu H. felis este mai redusă decât la șoarecii wild type. Acest fapt este evidențiat în studiul nostru de creșterea den-sității microvasculare la șoarecii INS-GAS infectați comparativ cu șoarecii FVB/N infectați, în ciuda raportului invers în ceea ce privește expresia VEGF-A. În plus, hipergastrinemia mod-ulează și expresia altor molecule pro-angiogenetice (Takaishi and Wang, 2007).

17

Concluzii 1. Există o corelație foarte puternică între expresia VEGF-A și MVD la toate loturile de șoareci incluși în studiu. 2. Infecția cu Helicobacter stimulează expresia VEGF-A și formarea neo-vaselor sanguine atât în corpus cât și în antrum-ul șoarecilor infectați pentru o perioadă scurtă. 3. Hipergastrinemia stimulează expresia VEGF-A și stimulează angiogeneza în corpus și antrum. Infecția cu H. felis accelerează aceste acțiuni. 4. Infecția cu H. felis conduce la o expresie crescută a VEGF-A în compartimentul glandular al glandelor gastrice, atât la nivelul corpusului cât și la nivelul antrumului. 5. Reglarea expresiei VEGF-A de către hipergastrinemie poate avea loc la nivel post-transcriptional. 6. Supraexprimarea VEGF-A dirijată de gastrină sau in-fecția cu Helicobacter implică mecanisme distincte ce trebuie elucidate.

Capitolul 5. Efectele infecției prelungite cu Helicobacter felis în modularea angiogenezei - studiu pre-liminar

Ultimul capitol din această teză este reprezentat de un studiu preliminar în care am avut drept scop evaluarea angio-genezei în relație cu infecția cu H. felis de lungă durată. C57BL/6, cei mai comuni șoareci de laborator, au fost utilizați în acest studiu. 14 șoareci C57BL/6 cu vârsta de 4

18

săptămâni, au fost infectați cu H. felis (ATCC 49179), prin efectuarea a 3 gavaje în decurs de o săptămână. 5 șoareci nein-fectați au fost utilizați drept control. Șoarecii infectați au fost sacrificați dupa 6 saptamâni sau 9 luni post-infecție. Experi-mentele pe animale au fost derulate cu aprobarea UK Home Office.

Rezultate și Discuții În corpusul șoarecilor infectați cu H. felis pentru am ob-servat o creștere a densității microvasculare. Creșterea a fost de 1.54 ori la șoarecii infectați pentru 6 săptămâni și de 6.05 ori la șoarecii infectați pentru 9 luni (p<0.001, Kruskal-Wallis test) comparativ cu șoarecii neinfectați. Expresia VEGF-A în corpusul șoarecilor infectați pentru 9 luni afost de 4.59 ori comparativ cu lotul control (p<0.001, Kruskal-Wallis test), comparativ cu o creștere de numai 2.02 ori înregistrată la șoarecii infectați pentru 6 săptămâni. Am observat o corelație foarte puternică între imunoex-presia VEGF-A și densitatea microvasculară, susținută atât prin analiza regresiei liniare cât și de coeficientul Spearman. Completarea acestui studiu cu tehnici cantitative de evaluare a expresiei genice și proteice atât la șoareci infectați pentru perioade scurte cât și la șoareci infectați pentru perioade lungi, la șoareci hipergastrinemici și deficienți pentru gena gas-trinei este necesară pentur elucidarea mecanismului prin care Helicobacter și gastrina modulează angiogeneza.

19

Concluzii 1. Există o corelație foarte puternică între imunoexpresia VEGF-A și densitatea microvasculară atât la șoarecii infectați pe termen scurt, cât și la șoarecii infectați pe termen lung. 2. Infecția cu H. felis reglează expresia de VEGF-A și modulează formarea noilor vase sanguine în corpusul șoare-cilor infectați, iar aceste efecte depind de durata infecției.

Concluzii finale

1. VEGF-A este exprimat atât în tumoră cât și în mu-coasa peritumorală la pacienții diagnosticați cu cancer gastric, în prezența infecției cu H. pylori. Expresia VEGF-A este sem-nificativ crescută în tumoră comparativ cu țesutul peritumoral și are tendința de a fi superioară în tumorile care invadează se-roasa. 2. VEGF-B și EGFR sunt exprimate atât în tumoră cât și în mucoasa peritumorală la pacienții diagnosticați cu cancer gastric, în prezența infecției cu H. pylori. Nicio diferență sem-nificativă a expresiei VEGF-B sau EGFR nu a fost observată între probele pereche și nici în relație cu parametrii patologici analizați. 3. Infecția cu Helicobacter modulează supra-exprimarea VEGF-A și formarea neo-vaselor sanguine atât în corpus cât și în antrum-ul șoarecilor infectați pentru o perioadă scurtă.

20

4. Hipergastrinemia stimulează expresia VEGF-A și stimulează angiogeneza în corpus și antrum. Infecția cu H. felis accelerează aceste acțiuni, dar efectele nu ajung la amplitudi-nea celor întâlnite în urma infecției cu H. felis la șoarecii wild typt. 5. VEGF-A este o importantă moleculă pro-angiogenică implicată în carcinogeneza gastrică. VEGF-A este exprimată în mucoasa gastrică încă din leziunile inflamatorii și premaligne gastrice până în stadiile avansate de cancer. Bibliografie selectivă

Burkitt MD, Varro A, Pritchard DM. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors. World J Gastroenterol. 2009 Jan 7;15(1):1-16 Caputo R, Tuccillo C, Manzo BA, et al. Helicobacter pylori VacA toxin up-regulates vascular endothelial growth factor expression in MKN 28 gastric cells through an epidermal growth factor receptor-, cyclooxygenase-2-dependent mechanism. Clin Cancer Res. 2003 Jun;9(6):2015-21. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285:1182-6 Fondevila C, Metges JP, Fuster J, et al. p53 and VEGF expression are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative resection of gastric cancer. Br J Cancer. 2004 Jan 12;90(1):206-15 International Agency for Research on Cancer Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Schistosomes, Liver Flukes, and Helicobacter pylori. Lyon. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241 Jubb AM, Pham TQ, Hanby AM, et al.. Expression of vascular en-dothelial growth factor, hypoxia inducible factor 1alpha, and carbonic anhy-drase IX in human tumours. J Clin Pathol. 2004 May;57(5):504-12. Kitadai Y, Sasaki A, Ito M, et al. Helicobacter pylori infection in-fluences expression of genes related to angiogenesis and invasion in human gastric carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun. 2003 Nov 28;311(4):809-14 Kolev Y, Uetake H, Iida S, et al. Prognostic significance of VEGF expression in correlation with COX-2, microvessel density, and clinicopa-

21

thological characteristics in human gastric carcinoma. Ann Surg Oncol. 2007 Oct;14(10):2738-47 Mangia A, Chiriatti A, Ranieri G, et al. H pylori status and angio-genesis factors in human gastric carcinoma. World J Gastroenterol. 2006 Sep 14;12(34):5465-72 Nikiteas NI, Tzanakis N, Theodoropoulos G, et al. Vascular endo-thelial growth factor and endoglin (CD-105) in gastric cancer. Gastric Cancer. 2007;10(1):12-7 Papetti M, Herman IM. Mechanisms of normal and tumor-derived angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 2002 May;282(5):C947-70. Pritchard DM, Przemeck SM. Review article: How useful are the rodent animal models of gastric adenocarcinoma? Aliment Pharmacol Ther. 2004 Apr 15;19(8):841-59. Review. Silvestre JS, Tamarat R, Ebrahimian TG, et al. Vascular endothelial growth factor-B promotes in vivo angiogenesis. Circ Res. 2003 Jul 25;93(2):114-23 Strowski MZ, Cramer T, Schäfer G, et al. Helicobacter pylori stimulates host vascular endothelial growth factor-A (vegf-A) gene expres-sion via MEK/ERK-dependent activation of Sp1 and Sp3. FASEB J. 2004 Jan;18(1):218-20. Takaishi S, Tu S, Dubeykovskaya ZA, et al. Gastrin is an essential cofactor for helicobacter-associated gastric corpus carcinogenesis in C57BL/6 mice. Am J Pathol. 2009 Jul;175(1):365-75 Takaishi S, Wang TC. Gene expression profiling in a mouse model of Helicobacter-induced gastric cancer. Cancer Sci. 2007 Mar;98(3):284-93. Takaishi S, Tu S, Dubeykovskaya ZA, et al. Gastrin is an essential cofactor for helicobacter-associated gastric corpus carcinogenesis in C57BL/6 mice. Am J Pathol. 2009 Jul;175(1):365-75 Tuccillo C, Cuomo A, Rocco A, et al. Vascular endothelial growth factor and neo-angiogenesis in H. pylori gastritis in humans. J Pathol. 2005 Nov;207(3):277-84. Wang TC, Dangler CA, Chen D, et al. Synergistic interaction be-tween hypergastrinemia and Helicobacter infection in a mouse model of gastric cancer. Gastroenterology. 2000 Jan;118(1):36-47. Zhao HC, Qin R, Chen XX, et al. Microvessel density is a prognos-tic marker of human gastric cancer. World J Gastroenterol. 2006 Dec 21;12(47):7598-603

22

Curriculum Vitae

Nume: AngelescuNume anterior căsătoriei: SoarePrenume: Maria CristinaData și locul nașterii: 11 iunie 1984, Craiova, RomaniaCetățenie: Romanian Stare civilă: CăsătorităEmail: soaremcristina@yahoo.com

Experiența profesională

2009-prezent - Preparator universitar, Disciplina de Biologie Celulară și Moleculară, UMF Craiova2009-prezent - medic rezident specialitatea Genetică Medicală

Studii

2008-Prezent - Doctorand, Disciplina de Biologie Celulară și Moleculară, UMF Craiova2002-2008 - Facultatea de Medicină, UMF Craiova1998-2002 - Colegiul Național “Fratii Buzesti”, Craiova, Romania.

Specializări în străinătate

1 Februarie - 31 Iulie 2011 - Visiting research student la University of Liv-erpool, Department of Gastroenterology, Institute of Translational Medicine, The Henry Wellcome Laboratory.1-30 Septembrie 2006 - Bursă de cercetare IFMSA-SCORElaInstitute of Physiology, 1st Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic. Proiectul de cercetare: The properties of muscarinic receptors.1-30 Septembrie 2005 - Bursă de cercetare IFMSA-SCORE la Department of Physiology, Section of Biochemistry and Molecular Biology, University of Barcelona, Hospital de Bellvitge, Spain. Proiectul de cercetare: Tran-scriptional regulation of glycolytic/gluconeogenic enzymes.

23

1-26 Martie 2004 - Bursă de cercetare IFMSA-SCORE la Department of Cell and Molecular Biology, Section for Medical Inflammation Research, University of Lund, Sweden. Proiectul de cercetare: Effect of increased oxi-dative burst on T cell populations in the acute phase of pristane induced arthritis in rat.

Articole in extenso publicate în reviste ISI în domeniul tezei de doctorat

1. Florin Burada, Theo Plantinga, Mihai Ioana, Diana Rosentul, Cristina Angelescu, Leo Joosten, Mihai Netea, Adrian Saftoiu, IRGM gene poly-morphisms and risk of gastric cancer. Journal of Digestive Diseases, 2011 (accepted) . 2. Florin Burada, Cristina Angelescu, Mihai Ioana , Anca-Lelia Riza, Paul Mitrut , Robert Dinu, Emil Moraru, Francisc Mixich, Mihai Cruce,Adrian Saftoiu. Association of Interleukin 1β Gene and Interleukin 1 Receptor An-tagonist Gene Polymorphisms and Gastric Cancer Risk, Advances in Clini-cal and Experimental Medicine Vol 20, 4, 423–429, 2011.3. Mihai Ioana, Cristina Angelescu, Florin Burada, Francisc Mixich, Anca Riza, Theodor Dumitrescu, Dragos Alexandru, Tudorel Ciurea, Mihai Cruce, Adrian Saftoiu (2010). MMR Gene Expression Pattern in Sporadic Colorectal Cancer. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. Vol.19 No 2, 155-159.

Rezumate publicate în reviste ISI în domeniul tezei de doctorat

1. F. Burada, C. Angelescu, M. Ioana, F. Mixich, P. Mitrut, S. Popa, E. Buteica, M. Cruce. The IL1-RN +2018T>C polymorphism is associated with increased susceptibility to gastric adenocarcinoma. Abstract of Euro-pean Human Genetics Conference Amsterdam 2011, European Journal of Human Genetics, Volume 19, Supplement 2. Page: 209. P.10.56.,209. 2011. 2. Florin Burada, Cristina Angelescu, Mihai Ioana, Elena Cioboată, Fran-cisc Mixich, Mihai Cruce, Adrian Saftoiu. Cytokine gene polymorphisms and risk of gastric adenocarcinoma. Balkan Journal of Medical Genetics, vol 14, supp, 9th BMHG, 28, 2011. 3. Cristina Angelescu, Florin Burada, Mihai Ioana, Radu Angelescu, Fran-cisc Mixich, Mihai Cruce, Adrian Săftoiu. Expression profile of VEGFA and

24

VEGFB genes in human gastric cancer, Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, Abstracts Genetics in Gastrointestinal and Liver Diseases, Cluj Napoca 7-9 April, 2011, Volume 20, Supplement , 26-27, 2011.4. Florin Burada, Cristina Angelescu, Mihai Ioana, Paul Mitrut, Robert Dinu, Emil Moraru, Mihai Cruce, Adrian Saftoiu, Francisc Mixich Genetic. Polymorphism of Interleukin 1β (IL-1B) Gene and Interleukin 1 Receptor Antagonist (IL-1RN) Gene in Gastric Cancer Patients in a Romanian Popu-lation, Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, Abstracts Genetics in Gastrointestinal and Liver Diseases, Cluj Napoca 7-9 April, 2011, Volume 20, Supplement , 25-26, 2011.5. F. Burada, C. Soare, M. Ioana, P. Mitrut, R. Angelescu, A. Riza, A. Dobrescu, E. Buteica, M. Cruce, F. Mixich (2010). Interleukin 1B gene (IL-1B) and Interleukin 1 receptor antagonist gene (IL-1RN) polymorphisms and the risk of gastric cancer. European Journal of Human Genetics. Volume 18, Supplement 1. Page: 176

Articole in extenso publicate în reviste CNCSIS indexate în baze de date internaționale în domeniul tezei de doctorat

1. Cristina Angelescu, F. Burada, M.Ioana, R.Angelescu, Anca Riza, F.Mixich, Doina Voinescu, M.Cruce, A. Saftoiu. Expression profile of VEGF and EGFR mRNA in esophageal and gastric cancers. Annals of the Romanian Society for Cell Biology. 16, 1, 228-233, 2011.2. F. Burada, Cristina Angelescu, Elena Cioboată, M.Ioana, M.Cruce. The IL-23R R381Q gene polymorphism is not associated with risk of gastric cancer. Annals of the Romanian Society for Cell Biology. 16, 1, 267-271, 2011. 3. F. Burada, Cristina Angelescu, M. Ioana, P. Mitrut, E. Moraru, Anca Riza, Alina Preda, M. Cruce. Ll-10 -1082 A/G polymorphism and risk of the gastric cancer. Annals of the Romanian Society for Cell Biology.. Vol. XV, Issue 1. Page: 93-97.4. E. Moraru, Cristina Angelescu, M. Ioana, N.M. Panduru, F. Burada, Alina Preda, Sanda Marchian, M. Cruce (2010). The correlation between three polymorphisms of TP53 gene and gastric cancer. Annals of the Roma-nian Society for Cell Biology. Issue 1. Page: 276-28193-97

25

5. E. Moraru, Cristina Angelescu, M. Ioana, T. Dumitrescu, F. Burada, Alina Preda, Amelia Barca, M. Cruce. (2009). c-ABL gene expression in gastric cancer. Annals of the Romanian Society for Cell Biology. Vol. XIV, Issue 2, pag. 204-211 6. Alina Preda, F. Burada, Cristina Soare, Amelia Birca , E. Moraru, M. Cruce. (2009). Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. Annals of the Romanian Society for Cell Biology. Vol. XIV, Issue 2, pag 212-214 7. Fl. Burada, Mihai Ioana, Cristina Soare, Eugenia Roşculescu, Elena Buteică. (2009). Polimorfismul genelor care codifica citokine si riscul de cancer gastric. Modern Medicine. vol. XVI, issue 3, pag. 160-162

Capitole de carte

Insulinorezistența indusă de obezitate și hepatită cronică virală C. Maria Moţa, Simona Popa. Co-autor - Capitolul 5: Metode Moleculare utilizate în diagnosticul și monitorizarea infecției cu virus hepatitic C., Mihai Ioana, Cristina Soare. Editura Medicală Universitară Craiova, 2009, 197 pages. ISBN: 978-973-106-108-5.

Membru al Societăților Profesionale și Științifice

European Society Human Genetics (ESHG)Societatea Română de Genetică Medicală (SRGM)Societatea Română de Biologie Celulară (SRBC)

Participarea la proiecte de cercetare ca membru al echipei de cercetare

1. Seventh Framework Programme - SPIDIA-RNA Program (Standardiza-tion and Improvement of Generic Pre-analytical Tools and Procedures for In-Vitro Diagnostic). Responsible investigator from the Laboratory of Mo-lecular Genetics, UMF Craiova2. Seventh Framework Programme - SPIDIA-DNA Program (Standardiza-tion and Improvement of Generic Pre-analytical Tools and Procedures for In-Vitro Diagnostic). Responsible investigator from the Laboratory of Mo-lecular Genetics, UMF Craiova

26

3. The Genographic Project: Molecular Genetic Analyses of Western/Central/Eastern European populations. Project finanțat de National Geo-graphic Society and IBM. Coordonator: Dr. Spencer Wells, PhD. Coordona-tor pentru populația balcanică: Mihai Netea, MD, PhD 4. Planul naţional de cercetare, dezvoltare si inovare - PN II. Program 4: “Partnerships in priority research areas” - type PC. “Rolul ecoendoscopiei si ecobronhoscopiei, comparativ cu tehnicile moleculare, in diagnosticul si stadializarea afectiunilor maligne mediastinale”. Coordonator: Prof. univ. dr. T. Ciurea5. Planul naţional de cercetare, dezvoltare si inovare - PN II. Program 4: “Acurateţea diagnostica a videocapsulei endoscopice comparativ cu entero-scopia cu balon in patologia intestinului subtire”. Coordonator: Conff. univ. dr. Cristin Constantin Vere

27

28