introdução a biologia celular - leitura complementar

1 Uma Visão Geral das Células e da PesquisaCelular

2 A Química das Células3 Fundamentos de Biologia Molecular

Parte I Introdução

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A COMPREENSÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR DAS CÉLULAS é uma área dinâ-mica de pesquisa que é fundamental para todas as ciências biológicas. Isto éverdade não somente do ponto de vista da pesquisa básica, mas também em

relação a um número crescente de aplicações práticas na medicina, agricultura ebiotecnologia. Especialmente com a conclusão da seqüência do genoma humano, oprogresso na biologia celular e molecular está abrindo novos horizontes na prática damedicina. Exemplos notáveis incluem o desenvolvimento de novas drogas especifi-camente direcionadas a interferir no crescimento de células cancerosas e no uso po-tencial de células-tronco para substituir os tecidos danificados e tratar pacientes quesofrem de doenças como diabetes, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, lesõesna coluna vertebral e doenças cardíacas.

Em virtude de a biologia celular e molecular ser uma área de pesquisa de rápidodesenvolvimento, é relevante compreender sua base experimental, assim como o es-tado atual do nosso conhecimento. Por essa razão, este capítulo abordará a maneiracomo as células são estudadas e revisará algumas das suas propriedades básicas. Aapreciação das semelhanças e diferenças entre as células é de vital importância para acompreensão da biologia celular. Portanto, a primeira parte deste capítulo discutetanto a uniformidade quanto a diversidade das células atuais em termos da evoluçãoa partir de um ancestral comum. Por um lado, todas as células compartilham pro-priedades fundamentais únicas que têm sido conservadas durante a evolução. Porexemplo, todas as células utilizam o DNA como material genético, são circundadaspor membranas plasmáticas e usam os mesmos mecanismos básicos para o metabo-lismo energético. Por outro lado, as células atuais desenvolveram uma grande varie-dade de modos de vida. Muitos organismos, como bactérias, amebas e leveduras, sãoconstituídos de células isoladas que são capazes de se replicar independentemente.Organismos mais complexos são compostos de uma coleção de células que funcio-nam de uma maneira coordenada, com diferentes células especializadas para realizaruma função determinada. O corpo humano, por exemplo, é composto por mais de200 tipos de células diferentes, cada uma especializada para funções distintas, comomemória, visão, movimento e digestão. A diversidade exibida por esses vários dife-rentes tipos de células é surpreendente; considere, por exemplo, as diferenças entre asbactérias e as células do cérebro humano.

As semelhanças fundamentais entre diferentes tipos de células fornecemum tópico único para a biologia celular, permitindo que os princípios básicos

A Origem e a Evolução dasCélulas 4

Células como ModelosExperimentais 15

Ferramentas da BiologiaCelular 20

EXPERIMENTO-CHAVE: Cultura deCélulas Animais 32

MEDICINA MOLECULAR: Vírus eCâncer 35

Uma Visão Geral das Célulase da Pesquisa Celular

Capítulo 1

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4 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN

aprendidos a partir de experimentos com um tipo de célula sejam extrapolados egeneralizados para outros tipos de células. Vários tipos de células e organismossão amplamente usados para estudar diferentes aspectos da biologia celular emolecular. A segunda parte do capítulo discute algumas das propriedades dessascélulas, que as fazem particularmente valiosas como modelos experimentais. Fi-nalmente, é importante reconhecer que os progressos em biologia celular depen-dem fortemente da disponibilidade de ferramentas experimentais que permitemque os cientistas façam novas observações ou conduzam novos tipos de experi-mentos. Este capítulo introdutório, portanto, é concluído com uma discussão dealguns métodos experimentais usados para estudar as células, bem como comuma revisão de alguns dos principais desenvolvimentos históricos que permiti-ram a compreensão atual da estrutura e função celular.

A Origem e a Evolução das Células

As células são dividas em dois tipos principais, definidos pela presença ou não deum núcleo. As células procarióticas (bactérias) não apresentam um envelopenuclear; as células eucarióticas têm um núcleo, no qual o material genético estáseparado do citoplasma. As células procarióticas geralmente são menores e maissimples do que as células eucarióticas; além da ausência de núcleo, seus genomassão menos complexos e elas não apresentam organelas citoplasmáticas ou umcitoesqueleto (Tabela 1.1). Apesar dessas diferenças, os mesmos mecanismosmoleculares básicos controlam a vida de ambas, procarióticas e eucarióticas, in-dicando que todas as células atuais descendem de um ancestral primordial co-mum. Como essa primeira célula se desenvolveu? Como evoluíram a complexi-dade e a diversidade exibidas pelas células atuais?

A Primeira Célula

Provavelmente, a vida apareceu há pelo menos 3,8 bilhões de anos, aproximadamen-te 750 milhões de anos após a Terra ter sido formada (Figura 1.1). Como a vidaoriginou-se e como a primeira célula surgiu são assuntos de especulação, uma vezque esses eventos não podem ser reproduzidos em laboratório. Contudo, diversostipos de experimentos fornecem evidências importantes da direção de algumas eta-pas do processo.

Foi por volta de 1920 que, pela primeira vez, sugeriu-se que moléculas orgâni-cas simples, sob as condições que se imagina que existiam na atmosfera da Terraprimitiva, poderiam formar-se e espontaneamente polimerizar-se em macromolécu-las. Supõe-se que, quando a vida se originou, a atmosfera da Terra tivesse pouco ounenhum oxigênio livre e, em vez disso, consistisse principalmente em CO2 e N2 equantidades menores de gases como H2, H2S e CO. Semelhante atmosfera fornececondições redutoras nas quais moléculas orgânicas, dada uma fonte de energia como

TABELA 1.1 Células Procarióticas e Eucarióticas

Característica Procariotos Eucariotos

Núcleo Ausente Presente

Diâmetro de uma célula típica ≅ 1 µm 10-100 µm

Citoesqueleto Ausente Presente

Organelas citoplasmáticas Ausente Presente

Conteúdo de DNA (pares de bases) 1 × 106 a 5 × 106 1,5 × 107 a 5 × 109

Cromossomos Uma única molécula de Múltiplas moléculas deDNA circular DNA linear

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A CÉLULA / 5

a luz solar ou descargas elétricas, podem ser formadas espontaneamente. A formaçãoespontânea de moléculas orgânicas foi pela primeira vez demonstrada experimental-mente na década de 1950, quando Stanley Miller (então um estudante de gradua-ção) mostrou que a descarga de faíscas elétricas em uma mistura de H2, CH4 e NH3,na presença de água, levava à formação de uma grande variedade de moléculasorgânicas, inclusive de vários aminoácidos (Figura 1.2). Embora os experimen-tos de Miller não tenham repetido precisamente as condições da Terra primitiva,eles demonstraram claramente a possibilidade da síntese espontânea de molécu-las orgânicas, fornecendo o material básico a partir do qual se originaram osprimeiros organismos vivos.

A próxima etapa na evolução foi a formação de macromoléculas. Tem sidodemonstrado que, sob as prováveis condições pré-bióticas, os blocos monoméricos

Bilhões de anos atrás

4

4,6

3

2

1

0

5

Presente

Organismos multicelulares

Primeiros eucariotos

Primeiras células

Formação da Terra

FotossínteseMetabolismo oxidativo

Figura 1.1 Escala de tempo daevoluçãoA escala indica o tempo aproximado noqual supõe-se que alguns dos principaiseventos na evolução das células tenhamocorrido.

Resfria-mento

Calor

Água

Moléculas orgânicas

AlaninaÁcido aspárticoÁcido glutâmicoGlicinaUréiaÁcido láticoÁcido acéticoÁcido fórmico

H2OH2O

H2

H2 CH4

CH4

NH3

NH3Descarga elétrica

Eletrodo

Figura 1.2 Formação espontânea de moléculas orgânicasO vapor de água circulou através de uma atmosfera composta de CH4, NH3 e H2, dentro daqual faíscas elétricas foram liberadas. A análise dos produtos da reação revelou a formação deuma variedade de moléculas orgânicas, incluindo os aminoácidos alanina, ácido aspártico, ácidoglutâmico e glicina.

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formam, por polimerização espontânea, as macromoléculas. Por exemplo, o aqueci-mento de misturas secas de aminoácidos resulta na polimerização para formar poli-peptídeos. Contudo, a característica essencial da macromolécula a partir da qual avida evoluiu deve ter sido a capacidade de auto-replicação. Somente uma macromo-lécula capaz de controlar a síntese de novas cópias de si própria poderia ser capaz dereprodução e posterior evolução.

Dos dois tipos principais de macromoléculas informativas presentes atualmen-te (ácidos nucléicos e proteínas), somente os ácidos nucléicos são capazes de contro-lar sua auto-replicação. Os ácidos nucléicos podem servir de moldes para sua própriasíntese como resultado do pareamento específico de bases entre nucleotídeos com-plementares (Figura 1.3). A etapa essencial no entendimento da evolução molecularfoi alcançada no início da década de 1980, quando foi descoberto nos laboratóriosde Sid Altman e Tom Cech que o RNA é capaz de catalisar várias reações químicas,incluindo a polimerização de nucleotídeos. Estudos mais avançados ampliaram asatividades catalíticas conhecidas do RNA, incluindo a descrição de moléculas deRNA que controlam a síntese de uma nova fita de RNA a partir de um RNA-molde.O RNA é, assim, tanto capaz de servir como molde quanto capaz de catalisar suaprópria replicação. Conseqüentemente, em geral é aceito que o RNA tenha sido osistema genético inicial, e supõe-se que a fase inicial da evolução química tenha sidobaseada nas moléculas de RNA auto-replicativas – um período da evolução conheci-do como mundo de RNA. Então, interações ordenadas entre RNA e aminoácidosevoluíram para o código genético atual, e o DNA finalmente substituiu o RNAcomo material genético.

Presume-se que a primeira célula tenha originado-se da inclusão de RNAs auto-replicativos em uma membrana composta de fosfolipídeos (Figura 1.4). Como dis-cutido em detalhes no próximo capítulo, os fosfolipídeos são os componentes bási-cos de todas as membranas biológicas atuais, incluindo as membranas plasmáticas decélulas procarióticas e eucarióticas. A característica-chave dos fosfolipídeos que for-mam as membranas é que eles são moléculas anfipáticas, significando que uma por-ção da molécula é solúvel em água e a outra porção é insolúvel. Os fosfolipídeos têmlongas caudas de hidrocarbonetos insolúveis em água (hidrofóbica) ligadas a umacabeça com grupos fosfato solúvel em água (hidrofílica). Quando colocados na água,os fosfolipídeos agregam-se espontaneamente em uma bicamada, com suas cabeçascom grupos fosfato na porção exterior em contato com a água e suas caudas dehidrocarbonetos no interior em contato umas com as outras. Tais bicamadas de fos-folipídeos formam uma barreira estável entre dois compartimentos aquosos – porexemplo, separando o interior de uma célula do meio externo.

A inclusão do RNA auto-replicativo e de moléculas associadas em uma mem-brana de fosfolipídeos poderia tê-los mantido, assim, como uma unidade, capaz deauto-replicação e posterior evolução. A síntese de proteína controlada por RNA já

A

U

A

A

U

G

C

G

A

G

C

AU

A U

A

U

G C

GC

G C

A

U

G C

G

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U A

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U A

G C

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G C

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G C

GCG

U

G

A

Figura 1.3 Auto-replicação do RNAO pareamento complementar entre nucleo-tídeos (adenina [A] com uracil [U] e guani-na [G] com citosina [C]) permite que umafita de RNA sirva como molde para a sínte-se de uma nova fita com a seqüência com-plementar.

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A CÉLULA / 7

poderia ter sido desenvolvida neste tempo, no qual a primeira célula poderia serconstituída de um RNA auto-replicativo e das proteínas por ele codificadas.

A Evolução do Metabolismo

Em razão de as células terem originado-se em um mar de moléculas orgânicas, elaseram capazes de obter alimento e energia diretamente do ambiente. Todavia, essasituação é autolimitante, e por isso as células precisaram desenvolver seus própriosmecanismos para geração de energia e síntese de moléculas necessárias para sua repli-cação. A geração e a utilização controlada da energia metabólica são essenciais paratodas as atividades celulares, e as principais vias do metabolismo energético (discuti-do em detalhes no Capítulo 2) são bastante conservadas nas células atuais. Todas ascélulas usam adenosina 5´-trifosfato (ATP) como fonte de energia metabólica paracontrolar a síntese dos constituintes celulares e realizar outras atividades que exigemenergia, como o movimento (por exemplo, contração muscular). Presume-se que omecanismo usado pelas células para geração de ATP evoluiu em três etapas, corres-pondentes à evolução da glicólise, fotossíntese e metabolismo oxidativo (Figura 1.5).O desenvolvimento dessas vias metabólicas mudou a atmosfera da Terra, dessa formaalterando o futuro curso da evolução.

Presume-se que na atmosfera anaeróbica da Terra primitiva as primeiras reaçõesde geração de energia envolviam a quebra de moléculas orgânicas na ausência de

Glicólise

Glicose Ácido lático

C6H12O6 2 C3H6O3 Geração de 2 ATP

Fotossíntese

Glicose

6 CO2 + 6 H2O

C6H12O6 + 6 O2

C6H12O6 + 6 O2

Metabolismo oxidativo

Glicose

6 CO2 + 6 H2O Geração de 36-38 ATP

Figura 1.5 Geração do metabolismoenergéticoA glicólise é a hidrólise anaeróbica daglicose para ácido lático. A fotossínteseutiliza a energia da luz solar para fazer asíntese de glicose a partir de CO2 e H2O,com a liberação de O2 como subproduto. OO2 liberado pela fotossíntese é usado nometabolismo oxidativo, no qual a glicose équebrada em CO2 e H2O, liberando muitomais energia que a obtida pela glicólise.

RNA

Caudahidrofóbica

Cabeça com grupo hidrofílico

Molécula de fosfolipídeo

Água

Água

Membrana de fosfolipídeo

Figura 1.4 Inclusão do RNA auto-replicativo em uma membrana defosfolipídeosSupõe-se que a primeira célula tenha sidocriada pela inclusão de RNA auto-replicati-vo e moléculas associadas em uma membra-na composta de fosfolipídeos. Cada molécu-la de fosfolipídeo tem duas longas caudashidrofóbicas ligadas a uma cabeça hidrofíli-ca. As caudas hidrofóbicas estão inseridas nabicamada lipídica; as cabeças hidrofílicas es-tão expostas à água em ambos os lados damembrana.

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oxigênio. Essas reações eram provavelmente reações semelhantes à glicólise atual – aquebra anaeróbica da glicose para ácido lático com o ganho energético líquido deduas moléculas de ATP. Além do uso do ATP como fonte de energia química intra-celular, todas as células atuais realizam glicólise, o que é compatível com a noção deque essas reações surgiram muito cedo na evolução.

A glicólise forneceu o mecanismo pelo qual a energia de moléculas orgânicaspré-formadas (por exemplo, glicose) poderia ser convertida em ATP, o qual podiaentão ser usado como fonte de energia para direcionar outras reações metabólicas.Presume-se que a seguinte etapa evolutiva importante tenha sido o desenvolvimentoda fotossíntese, que permitiu às células captar energia da luz solar e forneceu a inde-pendência da utilização de moléculas orgânicas pré-formadas. A primeira bactériafotossintética, que surgiu há mais de 3 bilhões de anos, provavelmente utilizavaH2S para converter CO2 em moléculas orgânicas – uma via de fotossíntese aindautilizada por algumas bactérias. O uso de H2O como doador de elétrons e hidro-gênio para a conversão do CO2 em componentes orgânicos evoluiu mais tarde eteve a importante conseqüência de mudar a atmosfera da Terra. O uso de H2Onas reações de fotossíntese origina, como produto secundário, o O2 livre; presu-me-se que esse mecanismo tenha sido o responsável por tornar o O2 abundantena atmosfera da Terra.

A liberação do O2, como conseqüência da fotossíntese, mudou o ambiente noqual as células estavam em desenvolvimento, e presume-se que tenha levado ao de-senvolvimento do metabolismo oxidativo. Alternativamente, o metabolismo oxida-tivo pode ter evoluído antes da fotossíntese, com o aumento do O2 atmosférico,fornecendo, então, uma forte vantagem evolutiva para os organismos capazes de usarO2 nas reações produtoras de energia. Em ambos os casos, o O2 é uma moléculaaltamente reativa, e o metabolismo oxidativo, usando esta reatividade, forneceu ummecanismo para geração de energia a partir de moléculas orgânicas que é muito maiseficiente que a glicólise anaeróbica. Por exemplo, a hidrólise completa da glicose emCO2 e H2O rende energia equivalente a 36-38 moléculas de ATP, em contraste comas 2 moléculas de ATP formadas pela glicólise anaeróbica. Com poucas exceções, ascélulas atuais usam reações oxidativas como principal fonte de energia.

Procariotos Atuais

Os procariotos atuais, que incluem todos os diversos tipos de bactérias, são divididosem dois grupos – as arqueobactérias e as eubactérias – que divergiram precocementena evolução. Algumas arqueobactérias vivem em ambientes extremos, que atualmen-te são raros, mas que poderiam ter sido predominantes na Terra primitiva. Por exem-plo, os termoacidófilos vivem em fontes térmicas sulfurosas com temperaturas tãoaltas quanto 80oC e pH tão baixo quanto 2. As eubactérias incluem as formas co-muns das bactérias atuais – um grande grupo de organismos que vive em uma amplavariedade de ambientes, incluindo solo, água e outros organismos (por exemplo,patógenos humanos).

Muitas células bacterianas são esféricas, em forma de bastonete ou espirais,com diâmetros de 1 a 10 µm. O conteúdo de DNA varia entre 0,6 milhão e 5milhões de pares de bases, uma quantidade suficiente para codificar aproximada-mente 5.000 proteínas diferentes. As cianobactérias são os maiores e mais comple-xos procariotos, bactérias que desenvolveram a fotossíntese.

A estrutura de uma célula procariótica típica é ilustrada pela Escherichia coli(E. coli), uma bactéria comum, habitante do trato intestinal dos humanos (Figura1.6). A célula é um bastonete, com aproximadamente 1 µm de diâmetro e 2 µm decomprimento. Como a maioria dos outros procariotos, a E. coli é circundada poruma parede celular rígida composta de polissacarídeos e peptídeos. Dentro daparede celular está a membrana plasmática, que é uma bicamada de fosfolipíde-os e proteínas associadas. Enquanto a parede celular é porosa e facilmente pene-trada por uma variedade de moléculas, a membrana plasmática fornece a separa-

Figura 1.6 Micrografia eletrônica deE. coliA célula é circundada pela parede celular,dentro da qual está a membrana plasmática.O DNA está localizado no nucleóide.(Menge and Wurtz/Biozentrum, Universityof Basel/Science Photo Library/Photo Rese-archers, Inc.)

Membranaplasmática

Paredecelular

Nucleóide

0,5 µ m

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A CÉLULA / 9

ção funcional entre o interior da célula e o ambiente externo. O DNA da E. coli éuma molécula circular única no nucleóide, o qual, em contraste com o núcleo doseucariotos, não é circundado por uma membrana que o separa do citoplasma. Ocitoplasma contém aproximadamente 30.000 ribossomos (o local da síntese protéi-ca), que contribuem para sua aparência granular.

Células Eucarióticas

Como as células procarióticas, todas as células eucarióticas são circundadas pela mem-brana plasmática e contêm ribossomos. Entretanto, as células eucarióticas são muitomais complexas e apresentam um núcleo, organelas citoplasmáticas e um citoesque-leto (Figura 1.7). A maior e mais proeminente organela das células eucarióticas é onúcleo, com um diâmetro de aproximadamente 5 µm. O núcleo contém a informa-ção genética da célula, que nos eucariotos é organizada como uma molécula de DNAlinear, em vez de circular. O núcleo é o local da replicação do DNA e da síntese doRNA; a tradução do RNA em proteínas ocorre em ribossomos no citoplasma.

Além do núcleo, as células eucarióticas apresentam no citoplasma uma varieda-de de organelas circundadas por membranas. Essas organelas formam compartimen-tos nos quais se localizam as diferentes atividades metabólicas. Em geral, as célulaseucarióticas são muito maiores que as células procarióticas, freqüentemente tendoum volume celular de, no mínimo, mil vezes maior. A compartimentalização causa-da pelas organelas citoplasmáticas é que permite o funcionamento eficiente das célu-las eucarióticas. Duas dessas organelas, as mitocôndrias e os cloroplastos, exercempapel fundamental no metabolismo energético. As mitocôndrias, que são encontra-das em quase todas as células eucarióticas, são os locais do metabolismo oxidativo esão responsáveis pela geração da maior parte do ATP derivado da quebra de molécu-las orgânicas. Os cloroplastos são os locais da fotossíntese e são encontrados somentenas células de plantas e algas verdes. Os lisossomos e os peroxissomos também for-necem compartimentos metabólicos especializados para a digestão de macromolécu-las e várias reações oxidativas, respectivamente. Além disso, a maioria das célulasvegetais contém grandes vacúolos que executam uma variedade de funções, incluin-do a digestão de macromoléculas e a estocagem de produtos de excreção e nutrientes.

Devido ao tamanho e à complexidade das células eucarióticas, o transporte deproteínas para seus destinos corretos é uma tarefa extremamente complexa. Duasorganelas citoplasmáticas, o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi, sãodedicadas especificamente para a organização e o transporte de proteínas destinadasà secreção, à incorporação à membrana plasmática e à incorporação aos lisossomos.O retículo endoplasmático é uma extensa rede de membranas intracelulares, esten-dendo-se a partir da membrana nuclear por todo o citoplasma. Ele funciona nãosomente no processamento e transporte de proteínas, mas também na síntese delipídeos. As proteínas são transportadas em pequenas vesículas a partir do retículoendoplasmático para o complexo de Golgi, onde são processadas e organizadas parao transporte ao destino final. Além do papel no transporte de proteínas, o complexode Golgi serve como local da síntese de lipídeos e (em células vegetais) como local desíntese de alguns polissacarídeos que formam a parede celular.

As células eucarióticas têm outro nível de organização interna: o citoesqueleto,uma rede de filamentos protéicos que se estende por todo o citoplasma. O citoesque-leto fornece a estrutura da célula, determinando o formato celular e gerando a orga-nização do citoplasma. Além disso, o citoesqueleto é responsável pelos movimentosda célula inteira (por exemplo, a contração das células musculares), pelo transporteintracelular e pelo posicionamento das organelas e outras estruturas, incluindo omovimento dos cromossomos durante a divisão celular.

Os eucariotos surgiram há pelo menos 2,7 bilhões de anos, seguindo em 1 a 1,5bilhão de anos a evolução dos procariotos. Estudos das seqüências de DNA indicamque as arqueobactérias e eubactérias são tão diferentes entre si quanto são dos euca-riotos atuais. Portanto, um evento muito precoce na evolução parece ter sido a diver-

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gência dos três grupos de descendentes a partir de um ancestral comum, originandoas atuais arqueobactérias, as eubactérias e os eucariotos. De forma interessante, mui-tos genes de arqueobactérias são mais parecidos com os de eucariotos que com os deeubactérias, indicando que as arqueobactérias e os eucariotos compartilham umalinha evolutiva em comum e são mais proximamente relacionados um ao outro doque qualquer um dos dois às eubactérias (Figura 1.8).

Uma etapa crítica na evolução das células eucarióticas foi a aquisição das organelassubcelulares circundadas por membranas, permitindo o desenvolvimento das caracterís-ticas complexas dessas células. Supõe-se que as organelas tenham sido adquiridas como oresultado de uma associação de células procarióticas com eucariotos ancestrais.

A hipótese de que células eucarióticas evoluíram a partir de uma associação de sim-biose com procariotos – endossimbiose – é bem sustentada pelos estudos de mitocôndri-as e cloroplastos, os quais supõe-se terem evoluído a partir de bactérias que viviam emcélulas maiores. Ambos, mitocôndrias e cloroplastos, são similares às bactérias em tama-nho, e como bactérias, reproduzem-se por divisão binária. E o mais importante, ambos,mitocôndrias e cloroplastos, contêm seu próprio DNA, o qual codifica alguns dos seuscomponentes. Os DNAs de mitocôndrias e cloroplastos são replicados cada vez que aorganela se divide, e os genes que eles codificam são transcritos dentro da organela etraduzidos no ribossomo da organela. A mitocôndria e o cloroplasto contêm seus pró-prios sistemas genéticos, que são diferentes do usado no genoma nuclear da célula. Alémdisso, o ribossomo e o RNA ribossomal dessas organelas são mais proximamente relacio-nados com os de bactérias do que com os codificados pelo genoma nuclear dos eucariotos.

Retículo endoplasmáticoliso

Retículo endoplasmáticorugoso

Lisossomo

Célula animal

Mitocôndria

Núcleo

Nucléolo

Membrana plasmática

Complexo de Golgi

Centríolo

Citoesqueleto

Peroxissomo

Ribossomos

Figura 1.7 Estruturas das célulasanimais e vegetaisTanto as células animais como as vegetaissão circundadas pela membrana plasmáticae contêm um núcleo, um citoesqueleto emuitas organelas citoplasmáticas. As célulasvegetais são também circundadas pela pare-de celular e contêm cloroplastos e vacúolosgrandes.

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A CÉLULA / 11

Mitocôndrias

Cloroplastos

ArqueobactériasCianobactériasOutras

eubactérias Plantas Animais ProtistasFungos

(leveduras)

Figura 1.8 Evolução das célulasAs células atuais evoluíram de um ancestral procarioto co-mum por três linhas de descendência, dando origem às ar-queobactérias, às eubactérias e aos eucariotos. As mitocôn-drias e os cloroplastos originaram-se da associação por en-dossimbiose de bactérias aeróbicas e cianobactérias com oancestral dos eucariotos, respectivamente.

Célula vegetal

Retículo endoplasmáticoliso

Ribossomo

Retículo endoplasmáticorugoso

Núcleo

Nucléolo

Mitocôndria

Vacúolo

Citoesqueleto

Peroxissomo

Cloroplastos

Complexo de GolgiMembrana plasmática

Parede celular

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A origem dessas organelas por endossimbiose é amplamente aceita, e supõe-seque a mitocôndria tenha evoluído de bactérias aeróbicas e o cloroplasto, de bactériasfotossintéticas, como as cianobactérias. A aquisição de bactérias aeróbicas poderia terfornecido a uma célula anaeróbica a capacidade de realizar reações de metabolismooxidativo. A aquisição de bactérias fotossintéticas poderia ter fornecido a indepen-dência nutricional proporcionada pela habilidade de efetuar a fotossíntese. Dessamaneira, essas associações por endossimbiose foram altamente vantajosas e forampositivamente selecionadas pela evolução. Ao longo do tempo, a maioria dos genesoriginalmente presentes nas bactérias foi, aparentemente, incorporada no genomanuclear da célula, e somente poucos componentes da mitocôndria e do cloroplastoainda são codificados pelos genomas das organelas.

O Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares

Muitos eucariotos são organismos unicelulares que, como as bactérias, consistem emsomente uma única célula capaz de auto-replicação. Os eucariotos mais simples são asleveduras. As leveduras são mais complexas que as bactérias, porém menores e mais sim-ples que as células de animais e plantas. Por exemplo, a comumente estudada leveduraSaccharomyces cerevisiae tem aproximadamente 6 µm de diâmetro e seu DNA contém12 milhões de pares de bases (Figura 1.9). Entretanto, outros eucariotos unicelulares sãocélulas muito mais complexas, algumas contendo tanto DNA quanto as células humanas(Tabela 1.2). Eles incluem organismos especializados para realizar uma grande variedadede ações, incluindo a fotossíntese, o movimento e a captura e ingestão, como alimento, deoutros organismos. Por exemplo, a Amoeba proteus é uma célula grande e complexa. Seuvolume é de mais de 100.000 vezes o de uma E. coli e seu comprimento excede 1 mm,quando a célula está totalmente estendida (Figura 1.10). As amebas são organismos comalta mobilidade que usam extensões citoplasmáticas, chamadas de pseudópodos, paramover e para englobar outros organismos, incluindo bactérias e leveduras, como alimen-tos. Outros organismos eucariotos unicelulares (como algas verdes) contêm cloroplastos esão capazes de realizar fotossíntese.

Os organismos multicelulares evoluíram a partir de eucariotos unicelulares há,pelo menos, 1,7 bilhão de anos. Alguns eucariotos unicelulares formam agregadosmulticelulares que parecem representar uma transição evolutiva entre células indivi-duais e organismos multicelulares. Por exemplo, as células de muitas algas (como aalga verde Volvox) associam-se umas com as outras para formarem colônias multice-

TABELA 1.2 Conteúdo de DNA

das Células

Organismo Conteúdo haplóide

de DNA

(milhões de pares de bases)

Bactérias

Mycoplasma 0,6

E. coli 4,6

Eucariotos unicelulares

Saccharomyces cerevisiae 12

(Levedura)

Dictyostelium discoideum 70

Euglena 3.000

Plantas

Arabidopsis thaliana 125

Zea mays (milho) 5.000

Animais

Caenorhabditis elegans 97

(nematóide)

Drosophila melanogaster 180

(mosca-da-fruta)

Galinha 1.200

“Zebrafish”* 1.700

Camundongo 3.000

Humano 3.000

* N. de R.T. Zebrafish é um peixe usado comomodelo experimental e recebe o nome comumno Brasil de “paulistinha”. Ver página 19.

Figura 1.9 Micrografia eletrônica de varredura do Saccharomyces cerevisiaeCor artificial foi adicionada à micrografia. (Andrew Syed/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)

5 µm

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A CÉLULA / 13

Figura 1.10 Micrografia ótica deAmoeba proteus(M.I. Walker/Photo Researchers, Inc.)

0,2 mm

lulares (Figura 1.11), que se supõe terem sido os precursores evolutivos das plantasatuais. O aumento da especialização celular direcionou a transição de agregados co-loniais para verdadeiros organismos multicelulares. A contínua especialização celulare a divisão de tarefas entre as células do organismo levaram à complexidade e diver-sidade observadas entre os diferentes tipos de células que compõem as plantas e osanimais atuais, incluindo os seres humanos.

As plantas são compostas por uma menor variedade de tipos celulares que osanimais, mas cada tipo diferente de célula vegetal é especializado para realizar umafunção específica necessária para o organismo como um todo (Figura 1.12). As célu-las das plantas são organizadas em três principais sistemas de tecidos: tecido de sus-tentação, tecido dérmico e tecido vascular. O tecido de sustentação contém as célulasdo parênquima, que realizam a maioria das reações metabólicas das plantas, incluin-do a fotossíntese. O tecido de sustentação também contém dois tipos de célulasespecializadas (célula do colênquima e célula do esclerênquima), que são caracteriza-das pelas grossas paredes celulares e fornecem o suporte estrutural para a planta. Otecido dérmico cobre a superfície da planta e é composto de células epidérmicas,formando uma camada de proteção e permitindo a absorção de nutrientes. Final-mente, diversos tipos de células alongadas formam o sistema vascular (o xilema e ofloema), que é responsável pelo transporte de água e nutrientes por toda a planta.

As células encontradas nos animais são consideravelmente mais diversificadasque as das plantas. O corpo humano, por exemplo, é composto por mais de 200tipos diferentes de células que geralmente são consideradas os componentes de cincotipos principais de tecidos: tecido epitelial, tecido conectivo, sangue, tecido nervoso

Figura 1.11 Colônia de alga verdeCélulas individuais de Volvox formam colô-nias, nas quais centenas ou milhares de cé-lulas estão incorporadas em uma matriz ge-latinosa. (Cabisco/Visuals Unlimited.)

Figura 1.12 Micrografias óticas decélulas representativas de plantas(A) Células do parênquima, que são respon-sáveis pela fotossíntese e por outras reaçõesmetabólicas. (B) Células do colênquima,que são responsáveis pela sustentação eapresentam paredes celulares espessas. (C)Células da epiderme na superfície de umafolha. Poros pequenos (estômatos) são flan-queados por células especializadas chamadasde células-vigia. (D) Elementos dos vasos etraqueídeos são células alongadas que sãoorganizadas uma de ponta para a outra paraformar os vasos do xilema. (A, Jack M.Bastsack/Visuals Unlimited; B, A. J. Karpo-ff/Visuals Unlimited; C, Alfred Owczarzak/Biological Photo Service; D, Biophoto Associ-ates/Science Source/Photo Researchers Inc.)

(B)(A)

50 mm

(D)(C)

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e músculo (Figura 1.13). As células epiteliais formam camadas que cobrem a super-fície do corpo e recobrem os órgãos internos. Há muitos tipos diferentes de célulasepiteliais, cada um especializado para uma função específica, incluindo proteção (apele), absorção (por exemplo, as células da mucosa do intestino delgado) e secreção(por exemplo, as células da glândula salivar). O tecido conectivo inclui ossos, cartila-gens e tecido adiposo, cada um formado por diferentes tipos de células (respectiva-mente, osteoblastos, condrócitos e adipócitos). O tecido conectivo frouxo, que intercala

Figura 1.13 Micrografias óticas decélulas animais representativas(A) Células do epitélio da boca (uma grossacamada multicelular), do ducto biliar e dointestino. (B) Fibroblastos são células do te-cido conectivo, caracterizados por sua for-ma alongada. (C) Eritrócitos, granulócitos,linfócitos e monócitos no sangue humano.([A]i e [A]ii, G. W. Willis/Biological PhotoService; [A]iii, Biophoto Associates/PhotoResearchers, Inc.; B, Don W. Fawcett/Visu-als Unlimited; C. G. W. Willis/BiologicalPhoto Service.)

(A)i Boca

Eritrócito

(B)

(A)ii Ducto biliar (A)iii Intestino

(C)

Granulócito

Linfócito Monócito

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A CÉLULA / 15

as camadas epiteliais e preenche os espaços entre órgãos e tecidos do corpo, é forma-do por outro tipo de célula, o fibroblasto. O sangue contém vários tipos diferentesde células, que funcionam no transporte do oxigênio (células vermelhas ou eritróci-tos), nas reações inflamatórias (granulócitos, monócitos e macrófagos) e na respostaimunológica (linfócitos). O tecido nervoso é composto pelas células nervosas, ou neu-rônios, que são altamente especializadas para transmitir sinais através do corpo. Váriostipos de células sensoriais, como as células dos olhos e dos ouvidos, são mais especializa-dos para receberem sinais externos do ambiente. Finalmente, vários diferentes tipos decélulas musculares são responsáveis pela produção da força e do movimento.

Claramente, a evolução dos animais envolveu o desenvolvimento de uma con-siderável diversidade e especialização no nível celular. A compreensão dos mecanis-mos de controle do crescimento e de diferenciação em tal grupo complexo de célulasespecializadas, originadas a partir de um único ovo fertilizado, é um dos principaisdesafios que se apresentam à biologia celular e molecular contemporânea.

Células como Modelos Experimentais

A evolução das células atuais a partir de um ancestral comum tem importantes im-plicações para a biologia celular e molecular como uma ciência experimental. Já queas propriedades fundamentais de todas as células foram conservadas durante a evolu-ção, os princípios básicos aprendidos com experimentos feitos com um tipo de célulasão geralmente aplicáveis para outras células. Por outro lado, em razão da diversidadedas células atuais, muitos tipos de experimentos podem ser mais facilmente realiza-dos em um tipo de célula do que em outro. Vários tipos diferentes de células eorganismos são comumente usados como modelos experimentais para estudar diver-sos aspectos da biologia celular e molecular. As características de algumas dessas célu-las que as tornam de particular utilidade como modelos experimentais são discutidasnas seções seguintes.

E. coli

Em virtude da sua simplicidade relativa, células procarióticas (bactérias) são modelosideais para o estudo de diversos aspectos fundamentais da bioquímica e da biologiamolecular. A espécie de bactéria mais amplamente estudada é a E. coli, que tem sido,há muito tempo, o organismo favorito para pesquisa dos mecanismos básicos dagenética molecular. A maioria dos nossos conceitos atuais de biologia molecular –incluindo nossa compreensão da replicação do DNA, do código genético, da expres-são gênica e da síntese protéica – deriva dos estudos com essa modesta bactéria.

A E. coli tem sido especialmente útil para os biólogos moleculares, tanto porsua relativa simplicidade, como pela facilidade com que pode ser reproduzida e estu-dada em laboratório. O genoma da E. coli, por exemplo, consiste em aproximada-mente 4,6 milhões de pares de bases e contém cerca de 4.000 genes. O genomahumano é quase mil vezes maior (aproximadamente 3 bilhões de pares de bases) epensa-se que contenha 30-40.000 genes (ver Tabela 1.2). O pequeno tamanho dogenoma da E. coli (que foi completamente seqüenciado em 1997) fornece óbviavantagem para a análise genética.

Experimentos de genética molecular são facilitados pela rápida multiplicaçãoda E. coli em condições laboratoriais bem definidas. Em condições ótimas de cultu-ra, a cada 20 minutos a E. coli divide-se. Além disso, uma população clonal de E. coli,na qual todas as células derivam da multiplicação de uma única célula, pode serfacilmente isolada como uma colônia crescendo em meio semi-sólido contendo ágar(Figura 1.14). Uma vez que colônias de bactérias contendo 108 células podem sercultivadas em apenas uma noite, a seleção de variantes genéticas de uma cepa de E.coli – por exemplo, mutantes que são resistentes a um antibiótico como a penicilina – éfácil e rápida. A facilidade com que esses mutantes podem ser selecionados e analisa-dos foi essencial para o sucesso dos experimentos que definiram os princípios básicosda genética molecular, discutidos no Capítulo 3.

Figura 1.14 Colônias de bactériasFotografia de colônias de E. coli crescendona superfície de um meio contendo ágar.(A. M. Siegelman/Visuals Unlimited.)

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A mistura de nutrientes na qual a E. coli divide-se mais rapidamente incluiglicose, sais e vários compostos orgânicos, como aminoácidos, vitaminas e precurso-res de ácidos nucléicos. Entretanto, a E. coli também pode crescer em um meiomuito mais simples, contendo somente sais, uma fonte de nitrogênio (como a amô-nia) e uma fonte de carbono e energia (como a glicose). Nesse meio, a bactéria cresceum pouco mais lentamente (com o tempo de divisão de aproximadamente 40 minu-tos), pois ela deve sintetizar todos os seus aminoácidos, nucleotídeos e outros com-postos orgânicos. A habilidade da E. coli de realizar estas reações de biossíntese emum meio definido simples tornou-a extremamente útil para a elucidação das viasbioquímicas envolvidas nestes processos. Assim, o rápido crescimento e as exigênciasnutritivas simples da E. coli têm facilitado muito os experimentos fundamentais embiologia molecular e bioquímica.

Leveduras

Embora as bactérias sejam um inestimável modelo para o estudo de muitas proprie-dades conservadas das células, elas, obviamente, não podem ser utilizadas para estu-dar aspectos da estrutura celular e funções que sejam exclusivas dos eucariotos. Asleveduras, os eucariotos mais simples, apresentam diversas vantagens experimentaissemelhantes às da E. coli. Conseqüentemente, as leveduras têm sido um modelo essencialpara estudos de muitos aspectos fundamentais da biologia celular de eucariotos.

O genoma da levedura mais freqüentemente estudada, Saccharomyces cere-visiae, consiste em 12 milhões de pares de bases de DNA e contém aproximada-mente 6.000 genes. Apesar do genoma da levedura ser cerca de três vezes maiordo que o da E. coli, ele é muito mais manejável do que o genoma dos eucariotosmais complexos, como o dos humanos. Mesmo com sua simplicidade, a célulada levedura apresenta as características típicas das células eucarióticas (Figura1.15): ela contém o núcleo isolado pela membrana nuclear, seu DNA genômicoé organizado em 16 cromossomos lineares e seu citoplasma contém um citoes-queleto e organelas subcelulares.

As leveduras podem ser facilmente cultivadas em laboratório e podem ser estu-dadas por muitas das técnicas de genética molecular que são utilizadas com a E. coli.Apesar das leveduras não se replicarem tão rapidamente quanto as bactérias, elasdividem-se freqüentemente, a cada 2 horas, e podem ser facilmente cultivadas emcolônias a partir de células isoladas. Conseqüentemente, as leveduras podem ser uti-lizadas para uma variedade de manipulações genéticas semelhantes àquelas que po-dem ser feitas com bactérias.

Essas características têm feito da célula de levedura a célula eucarionte maisabordável pelo ponto de vista da biologia molecular. Leveduras mutantes têm sidoimportantes para o entendimento de muitos processos fundamentais em eucariotos,incluindo a replicação do DNA, a transcrição, o processamento do RNA, a organiza-ção protéica e a regulação da divisão celular, que serão discutidos nos capítulos se-guintes. A unidade da biologia celular e molecular tem ficado mais clara pelo fato deque os princípios gerais da estrutura e função celular, que têm sido revelados pelosestudos das leveduras, aplicam-se a todas as células eucarióticas.

Dictyostelium discoideum

O Dictyostelium discoideum é um fungo aquático que, como as leveduras, é umeucarionte unicelular relativamente simples. O genoma do Dictyostelium é aproxi-madamente dez vezes maior que o da E. coli – mais complexo que o genoma dasleveduras, porém consideravelmente mais simples que o genoma dos eucariotos su-periores. Além disso, o Dictyostelium pode ser facilmente cultivado em laboratório eé suscetível a uma variedade de manipulações genéticas.

Sob condições de alimentação farta, o Dictyostelium vive como uma amebaunicelular, alimentando-se de bactérias e leveduras. Ele é uma célula com grandemobilidade, e essa propriedade tem feito do Dictyostelium um importante modelo

Figura 1.15 Micrografia eletrônica deSaccharomyces cerevisiae(David Scharf/Peter Arnold, Inc.)

2 µ m

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A CÉLULA / 17

para estudos dos mecanismos moleculares responsáveis pelo movimento das célulasanimais (Figura 1.16). Por exemplo, a introdução no Dictyostelium de mutações es-pecíficas tem revelado o papel de vários genes envolvidos na mobilidade celular.

Uma característica interessante adicional do Dictyostelium é a habilidade decélulas isoladas agregarem-se em estruturas multicelulares. Se um suplemento ade-quado de alimento não é fornecido, as células associam-se para formar uma estruturavermiforme chamada de lesma, cada uma contendo até 100.000 células que funcio-nam como um indivíduo. Por esse motivo o Dictyostelium parece estar no limiteentre organismos unicelulares e multicelulares, e fornece um importante modelopara estudos de sinalização celular e interação célula-célula.

Caenorhabditis elegans

Os eucariotos unicelulares Saccharomyces e Dictyostelium são importantes modelospara estudos de células eucarióticas, mas a compreensão do desenvolvimento de or-ganismos multicelulares requer a análise experimental de plantas e animais, organis-mos que são muito mais complexos. O nematóide Caenorhabditis elegans (Figura1.17) possui várias características importantes que o transformam em um dos mode-los mais usados para estudos de desenvolvimento e diferenciação celular dos animais.

Embora o genoma do C. elegans (aproximadamente 100 milhões de pares debases) seja maior que o dos eucariotos unicelulares, ele é mais simples e mais mani-pulável que o genoma da maioria dos animais. A seqüência completa já foi determi-nada, revelando que o genoma do C. elegans contém aproximadamente 19.000 genes– quase três vezes o número de genes das leveduras, e a metade do número de genesdos humanos. Biologicamente, o C. elegans é um organismo multicelular relativa-mente simples: os vermes adultos são compostos de somente 959 células somáticas e1.000 a 2.000 células germinativas. Além disso, o C. elegans pode ser facilmentecultivado e submetido a manipulações genéticas em laboratório.

A simplicidade do C. elegans tem permitido que o curso do seu desenvolvimen-to seja observado em detalhes por observação microscópica. Essas análises definirama origem embrionária e a linhagem de todas as células de um verme adulto. Estudosgenéticos também têm identificado várias das mutações responsáveis por anormali-dades do desenvolvimento, permitindo o isolamento e a caracterização de genes es-senciais que controlam o desenvolvimento e a diferenciação do nematóide. De gran-de importância, genes similares também têm sido encontrados em animais comple-xos (incluindo humanos), fazendo do C. elegans um importante modelo para estudosdo desenvolvimento animal.

Drosophila melanogaster

Como o C. elegans, a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster (Figura 1.18) tem sido umorganismo-modelo essencial em biologia do desenvolvimento. O genoma da Drosophilaé de tamanho similar ao do C. elegans, embora o genoma da Drosophila contenha apenas

Intestino

OvosFaringe Reto Ânus

Ovário

Vulva

1 mm

Figura 1.16 Dictyostelium discoideumEstas fotografias mostram o movimento deduas amebas durante o tempo de 40 segun-dos. (Cortesia de David Knecht, Universityof Connecticut.)

Figura 1.17 Caenorhabditis elegans(De J. E. Sulston e H. R. Horvitz, 1977.Dev. Biol. 56:110.)

10 µm

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cerca de 14.000 genes. Além disso, a Drosophila pode ser facilmente mantida e reprodu-zida em laboratório, e o seu curto ciclo reprodutivo (aproximadamente 2 semanas) atransformou em um organismo extremamente útil para experimentos genéticos. Muitosconceitos fundamentais da genética – como a relação entre genes e cromossomos – foramderivados de estudos com Drosophila no início do século XX (ver Capítulo 3).

Extensas análises genéticas da Drosophila têm revelado muitos genes que con-trolam o desenvolvimento e a diferenciação, e os atuais métodos de biologia molecu-lar têm permitido que as funções desses genes sejam analisadas em detalhes. Conse-qüentemente, os estudos em Drosophila têm levado a surpreendentes avanços nacompreensão dos mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento ani-mal, particularmente com respeito à formação do plano do corpo de organismosmulticelulares complexos. Como com o C. elegans, existem genes e mecanismos si-milares em vertebrados, validando o uso da Drosophila como um importante modeloexperimental na biologia do desenvolvimento contemporânea.

Arabidopsis thaliana

O estudo da biologia molecular e do desenvolvimento em plantas é uma área ativa eem expansão de considerável importância econômica, bem como de interesse inte-lectual. Uma vez que os genomas de plantas apresentam uma complexidade compa-rável com a dos genomas dos animais (ver Tabela 1.2), um modelo ideal para estudoscom plantas deveria ser um organismo relativamente simples com algumas das carac-terísticas vantajosas do C. elegans e da Drosophila. A pequena planta com flor Arabi-dopsis thaliana (Figura 1.19) atende a esse critério, sendo amplamente usada comoum modelo para o estudo da biologia molecular das plantas.

A Arabidopsis é notável pelo seu genoma de somente cerca de 120 milhões depares de bases, que contém aproximadamente 15.000 genes diferentes – uma com-plexidade semelhante à do C. elegans e da Drosophila. Além disso, a Arabidopsis érelativamente fácil de ser cultivada em laboratório, e métodos para manipulaçõesgenéticas moleculares dessa planta já foram desenvolvidos. Esses estudos têm permi-tido a identificação dos genes envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento emplantas, como o desenvolvimento das flores. A análise desses genes aponta para mui-tas similaridades, mas também diferenças notáveis, entre os mecanismos que contro-lam o desenvolvimento das plantas e dos animais.

Vertebrados

Os animais mais complexos são os vertebrados, incluindo o homem e outros mamíferos.O genoma humano tem aproximadamente 3 bilhões de pares de bases – cerca de 30 vezesmaior que o genoma do C. elegans, da Drosophila e da Arabidopsis – e contém 30-40.000genes. Além disso, o corpo humano é composto de mais de 200 diferentes tipos de célulasespecializadas. Essa complexidade torna difícil estudar os vertebrados pela perspectiva dabiologia celular e molecular, mas muito do interesse das ciências biológicas origina-se dodesejo da compreensão do organismo humano. Além disso, o entendimento de muitasquestões de importância prática imediata (por exemplo, na medicina) deve ser baseadodiretamente em estudos sobre tipos celulares humanos (ou proximamente relacionados).

Um importante meio de estudar células humanas e de outros mamíferos é cultivarcélulas isoladas, de forma que possam ser manipuladas em condições laboratoriais contro-ladas. O uso de cultura celular tem permitido o estudo de muitos aspectos da biologiacelular de mamíferos, incluindo experimentos que têm elucidado os mecanismos da re-plicação do DNA, da expressão gênica, da síntese e do processamento protéico e dadivisão celular. Além disso, a habilidade de cultivar células em meios quimicamente defi-nidos tem permitido o estudo dos mecanismos de sinalização que controlam o cresci-mento e a diferenciação normal dentro do organismo inteiro.

As propriedades especializadas de algumas células altamente diferenciadas têmfeito delas modelos importantes para estudos de aspectos específicos da biologia ce-lular. Células musculares, por exemplo, são altamente especializadas para suportar

Figura 1.18 Drosophila melanogaster(Darwin Dale/Photo Researchers, Inc.)

Figura 1.19 Arabidopsis thaliana(Jeremy Burgess/Photo Researchers, Inc.)

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A CÉLULA / 19

contração, produzindo força e movimento. Em virtude dessa especialização, as célu-las musculares são um modelo essencial para o estudo de movimento celular no nívelmolecular. Outro exemplo é fornecido pelas células nervosas (neurônios), que sãoespecializadas para conduzir sinais eletroquímicos a grandes distâncias. Em huma-nos, os axônios das células nervosas podem ter mais de um metro de comprimento,e alguns invertebrados, como a lula, têm neurônios gigantes com axônios com maisde 1 mm de diâmetro em largura. Em razão de suas estruturas e funções altamenteespecializadas, esses neurônios gigantes têm sido um modelo importante para estu-dos sobre o transporte de íons através da membrana plasmática e sobre o papel docitoesqueleto no transporte das organelas citoplasmáticas.

O sapo Xenopus laevis é um modelo importante para estudos do desenvolvi-mento inicial dos vertebrados. Os ovos do Xenopus são células extraordinariamentegrandes, com o diâmetro de aproximadamente 1 mm (Figura 1.20). Já que os ovos sedesenvolvem fora do corpo materno, todos os estágios do desenvolvimento a partir doovo até o girino podem ser facilmente estudados no laboratório. Além disso, os ovos deXenopus podem ser obtidos em grande número, facilitando as análises bio-químicas. Por causa dessas vantagens técnicas, o Xenopus tem sido ampla-mente utilizado em estudos da biologia do desenvolvimento e tem propor-cionado descobertas importantes dos mecanismos moleculares que contro-lam o desenvolvimento, a diferenciação e a divisão celular em embriões.

O “zebrafish” (paulistinha) (Figura 1.21) possui numerosas vanta-gens para estudos genéticos do desenvolvimento de vertebrados. Essepequeno peixe é facilmente mantido em laboratório e reproduz-se rapi-damente. Além disso, o embrião desenvolve-se fora da mãe e é transpa-rente, fazendo com que os estágios iniciais do desenvolvimento possamser observados facilmente. Métodos poderosos têm sido desenvolvidospara facilitar o isolamento de mutações que afetem o desenvolvimentodo “zebrafish”, e vários milhares dessas mutações têm sido identificados.Por ser um vertebrado de fácil estudo, o “zebrafish” é um promissor pon-to de conexão para a análise das diferenças entre os humanos e os siste-mas invertebrados mais simples, como o C. elegans e a Drosophila.

Dentre os mamíferos, o camundongo é o mais adequado para análisesgenéticas, que serão facilitadas pela conclusão recente da seqüência genômi-ca deste organismo. Apesar das dificuldades técnicas em estudar a genética do camundon-go (comparada, por exemplo, com a genética da levedura ou Drosophila) serem grandes,muitas mutações que afetam o desenvolvimento do camundongo têm sido identifi-

Figura 1.20 Ovos do sapo Xenopuslaevis(Cortesia de Michael Danilchik e KimberlyRay.)

1 mm

(A)

(B)

Figura 1.21 “Zebrafish”(A) Um embrião com 24 horas. (B) Umpeixe adulto. (A, cortesia de Charles Kim-mel, University of Oregon; B, cortesia de S.Kondo.)

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cadas. Mais importante, avanços recentes na biologia molecular têm permitido aprodução de camundongos transgênicos, nos quais genes mutantes específicos sãointroduzidos nas linhagens germinativas do camundongo, fazendo com que seusefeitos no desenvolvimento ou em outros aspectos da função celular possam ser estu-dados no contexto do animal completo. A adequação do camundongo como modelopara o estudo do desenvolvimento humano é indicada não apenas pelas similarida-des dos genomas humanos e de camundongo, mas também pelo fato de que mutaçõesem genes homólogos resultam em defeitos semelhantes no desenvolvimento de ambas asespécies (Figura 1.22); um defeito de pigmentação fornece excelente exemplo.

Ferramentas da Biologia Celular

Como em todas as ciências experimentais, a pesquisa em biologia celular depende detécnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e a função celular.Avanços muito importantes na compreensão das células têm sucedido diretamente odesenvolvimento de novas técnicas, que permitiram novos meios de investigação. O exa-me das metodologias experimentais disponíveis para a biologia celular é essencial para acompreensão tanto da situação atual como do direcionamento futuro dessa área de avan-ço rápido da ciência. Algumas das importantes técnicas de uso comum da biologia celularsão descritas nas seções seguintes. Outros métodos experimentais, incluindo os métodosbioquímicos e de biologia molecular, serão discutidos em capítulos posteriores.

Microscopia Ótica

Já que a maioria das células é muito pequena para ser vista a olho nu, o estudo das célulasdepende fortemente do uso de microscópios. Na realidade, a descoberta das células resul-tou do desenvolvimento do microscópio: Robert Hooke inventou o termo “célula” apóssuas observações de um pedaço de cortiça com um microscópio ótico simples, em 1665(Figura 1.23). Usando um microscópio que aumentava os objetos cerca de 300 vezes seutamanho real, Antony van Leeuwenhoek, por volta de 1670, foi capaz de observar umagrande variedade de tipos celulares diferentes, incluindo espermatozóides, glóbulos ver-melhos e bactérias. A proposta da teoria celular por Matthias Schleiden e Theodor Schwann,em 1838, pode ser vista como o nascimento da biologia celular contemporânea. Estudosmicroscópicos de tecidos de plantas por Schleiden e de tecidos animais por Schwann

Figura 1.22 O camundongo comomodelo para o desenvolvimento dohomemUma criança e um camundongo apresen-tam defeitos de pigmentação semelhantescomo resultado de mutações no gene neces-sário para a migração normal dos melanóci-tos (as células responsáveis pela pigmenta-ção da pele) durante o desenvolvimento doembrião. (Cortesia de R. A. Fleischman, Ma-rkey Cancer Center, University of Kentucky.)

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A CÉLULA / 21

levaram às mesmas conclusões: todos os organismos são compostos por células. Poucotempo após, foi reconhecido que as células não são formadas de novo, mas originam-sesomente por divisão de células preexistentes. Conseqüentemente, em razão das observa-ções feitas com o microscópio ótico, a célula foi reconhecida como a unidade fundamen-tal de todos os organismos vivos.

O microscópio ótico permanece como um instrumento básico dos biólogos celula-res, com aperfeiçoamentos técnicos permitindo a crescente visualização de detalhes daestrutura celular. Os microscópios óticos atuais são capazes de ampliar objetos até milvezes. Já que a maioria das células tem entre 1 e 100 µm de diâmetro, elas podem serobservadas por microscopia ótica, como também o podem algumas das organelas subce-lulares maiores, como núcleo, cloroplastos e mitocôndrias. Entretanto, o microscópioótico não é suficientemente poderoso para revelar detalhes finos da estrutura celular, jáque a resolução – a habilidade de um microscópio de distinguir objetos separados pordistâncias pequenas – é mais importante do que a ampliação. Imagens podem ser amplia-das tanto quanto desejado (por exemplo, por projeção em uma tela grande), mas a ampli-ação não aumenta o nível dos detalhes que podem ser observados.

O limite da resolução do microscópio ótico é de aproximadamente 0,2 µm;dois objetos separados por uma distância menor que essa aparecem como uma únicaimagem, em vez de serem distinguidos um do outro. Esse limite teórico da microsco-pia ótica é determinado por dois fatores – o comprimento de onda (λ) da luz visívele a convergência ótica das lentes microscópicas (abertura numérica, NA) – de acordocom a seguinte equação:

Resolução = 0,61λ NA

O comprimento de onda da luz visível é de 0,4 a 0,7 µm, de modo que o valor de λé fixado em aproximadamente 0,5 µm para o microscópio ótico. A abertura numéri-ca pode ser considerada como o tamanho do cone de luz que entra nas lentes domicroscópio após passar através da amostra (Figura 1.24). Isto é dado pela equação:

NA= η sen α

onde η é o índice de refração do meio através do qual a luz passa entre a amostra e alente. O valor de η para o ar é de 1,0, mas pode ser aumentado para um máximo de

Figura 1.23 A estrutura celular dacortiçaUma reprodução do desenho de RobertHooke de uma fina lâmina de cortiça obser-vada em um microscópio ótico. As “células”que Hooke observou eram na verdade so-mente as paredes celulares remanescentesdas células que já tinham morrido.

Figura 1.24 Abertura numéricaA luz é focalizada na amostra pelas lentes docondensador e então coletada pelas lentesda objetiva do microscópio. A abertura nu-mérica é determinada pelo ângulo do cone deluz que entra nas lentes da objetiva (α) e peloíndice de refração do meio (geralmente ar ouóleo) entre as lentes e a amostra.

Amostraα

Luz

Lentes do condensador

Lentes da objetiva

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aproximadamente 1,4 pelo uso de uma lente para óleo de imersão, quando a amostraé vista através de uma gota de óleo. O ângulo α corresponde à metade do compri-mento do cone de luz recebido pela lente. O valor máximo de α é 90o, sendo senoα = 1, de modo que o maior valor possível para a abertura numérica é 1,4.

Portanto, o limite teórico para a resolução do microscópio ótico pode ser calcu-lado como segue:

Resolução = 0,61 x 0,5 = 0,22 µm 1,4

Microscópios capazes de atingir esse nível de resolução já podiam ser feitos nofim do século XIX; portanto, aprimoramentos nesse aspecto da microscopia óticanão devem ser esperados.

Vários tipos diferentes de microscopia ótica são rotineiramente usados parao estudo de vários aspectos da estrutura celular. O mais simples é a microscopiade campo claro, no qual a luz passa diretamente através da célula e a capacidadede distinguir diferentes partes da célula depende do contraste resultante da ab-sorção da luz visível pelos componentes celulares. Em muitos casos, células sãocoradas com corantes que reagem com proteínas e ácidos nucléicos com o obje-tivo de aumentar o contraste entre as diferentes partes da célula. Antes da colo-ração, as amostras em geral são tratadas com fixadores (como álcool, ácido acéti-co ou formaldeído) para estabilizar e preservar suas estruturas. A análise de teci-dos fixados e corados pela microscopia de campo claro é o método-padrão para aanálise de amostras de tecidos em laboratórios de histologia (Figura 1.25). En-tretanto, esses procedimentos de coloração matam as células e, portanto, não sãoadequados para muitos experimentos, nos quais a observação de células vivas édesejável.

Sem coloração, a passagem direta da luz não fornece contraste suficientepara distinguir muitas partes da célula, limitando a utilização da microscopia decampo claro. Entretanto, variações do microscópio ótico podem ser usadas paraaumentar o contraste entre as ondas de luz que passam através de regiões dacélula de densidades diferentes. Dois dos métodos mais comuns para visualiza-ção de células vivas são a microscopia de contraste de fase e a microscopia decontraste de interferência diferencial (Figura 1.26). Ambos os tipos de micros-copia usam sistemas óticos que convertem variações de densidade ou espessura

Figura 1.25 Micrografia de campoclaro de tecido coradoSecção de um tumor benigno de rim. (G.W. Willis/Biological Photo Service.)

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entre partes diferentes da célula em diferenças no contraste que podem ser vistasna imagem final. Na microscopia de campo claro, estruturas transparentes (comoo núcleo) têm pouco contraste porque absorvem pouca luz. Entretanto, a luztem a velocidade reduzida pela passagem nessas estruturas de tal forma que suafase é alterada, comparada à luz que passa através do citoplasma que circunda onúcleo. A microscopia de contraste de fase e a de contraste de interferência dife-rencial convertem essas diferenças na fase para diferenças no contraste, dessemodo produzindo melhores imagens de células vivas não-coradas.

O poder do microscópio ótico foi consideravelmente expandido pelo usode câmaras digitais e computadores para análise e processamento das imagens.Os sistemas eletrônicos de análise e processamento de imagens podem melhorarsubstancialmente o contraste das imagens obtidas com o microscópio ótico, per-mitindo a visualização de pequenos objetos que de outro modo não seriam de-tectados. Por exemplo, a microscopia de contraste de interferência diferencialintensificada por vídeo permite a visualização do movimento das organelas atra-vés dos microtúbulos, que são filamentos protéicos do citoesqueleto com umdiâmetro de apenas 0,025 µm (Figura 1.27). Entretanto, esta amplificação nãoultrapassa o limite teórico da resolução do microscópio ótico, de aproximada-mente 0,2 µm. Então, embora o realce pelo vídeo permita a visualização dosmicrotúbulos, eles aparecem como imagens borradas de pelo menos 0,2 µm dediâmetro e um microtúbulo individual não pode ser distinguido de um feixe deestruturas adjacentes.

A microscopia ótica tem sido usada no nível de análise molecular por méto-dos de marcação de moléculas específicas, e assim elas podem ser visualizadas nointerior das células. Genes ou RNA transcritos específicos podem ser detectadospor hibridização com sondas de ácidos nucléicos com seqüências complementa-res, e proteínas podem ser detectadas pelo uso de anticorpos apropriados (verCapítulo 3). Tanto sondas de ácidos nucléicos como anticorpos podem ser mar-cados com uma variedade de substâncias que permitem sua visualização no mi-croscópio ótico, tornando possível determinar a localização de moléculas especí-ficas dentro de células individuais.

A microscopia de fluorescência é um método muito sensível e amplamenteusado para o estudo da distribuição intracelular de moléculas (Figura 1.28). Umcorante fluorescente é usado para marcar a molécula de interesse dentro de célulasfixadas ou vivas. O corante fluorescente é uma molécula que absorve luz em umcomprimento de onda e emite luz em um segundo comprimento de onda. Essafluorescência é detectada pela iluminação da amostra com luz no comprimento deonda que excita o corante fluorescente, seguida do uso de filtros adequados paradetectar o comprimento de onda específico que o corante emite. A microscopia defluorescência pode ser usada para estudar diferentes moléculas dentro das células.Uma aplicação freqüente é a marcação direta de anticorpos contra uma proteínaespecífica com corante fluorescente, fazendo com que a distribuição intracelular daproteína possa ser determinada.

Um avanço importante e recente na microscopia de fluorescência foi o uso daproteína fluorescente verde (GFP), do inglês Green Fluorescent Protein, de uma me-dusa para visualizar proteínas dentro de células vivas. A GFP pode ser fusionada a

2,5 µm

Figura 1.26 Observação microscópica de células vivasMicrografias de células humanas obtidas com microscopia de (A) campo claro, (B) contraste de fase e (C)contraste de interferência diferencial. (Cortesia de Mort Abramowitz, Olympus, America, Inc.)

Figura 1.27 Microscopia de contraste de interferência diferencial intensificada por vídeoO processamento eletrônico de imagem permite a visualização de microtúbulos individuais. (Corte-sia de E. D. Salmon, University of North Carolina, Chapel Hill.)

50 µm

(A)

(B)

(C)

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qualquer proteína de interesse, pelo uso de técnicas-padrão de DNA recombinante,e então a proteína ligada à GFP pode ser introduzida nas células e detectada pormicroscopia de fluorescência, sem necessidade de fixar e corar a célula, como seriapreciso para a detecção de proteínas com anticorpos. Devido à sua versatilidade, ouso de GFP se tornou extremamente difundido em biologia celular e tem sido em-pregado para acompanhar a localização e os movimentos de uma ampla variedade deproteínas dentro de células vivas (Figura 1.29).

A microscopia confocal combina a microscopia de fluorescência com a aná-lise eletrônica de imagens para obter imagens com contraste e detalhes aumenta-dos. Um pequeno ponto de luz, usualmente emitido por um laser, é focado naamostra, em uma profundidade específica. A luz fluorescente emitida é coletadapor um detector com uma câmera de vídeo. Entretanto, antes da luz emitidaalcançar o detector, ela deve passar através de uma abertura capilar (chamada deabertura confocal) precisamente colocada no ponto onde a luz emitida, a partirda profundidade escolhida na amostra, aproxima-se do foco (Figura 1.30). Con-seqüentemente, somente a luz emitida a partir do plano de foco é capaz de atin-gir o detector. Uma varredura da amostra gera uma imagem bidimensional do

Figura 1.28 Microscopia defluorescência(A) A luz passa através de um filtro excita-tório para selecionar o comprimento deonda da luz (por exemplo, azul) que excitao corante fluorescente. Um espelho dicróicoreflete a luz excitada para baixo para atingira amostra. A luz fluorescente emitida pelaamostra (por exemplo, verde) passa atravésdo espelho dicróico e por um segundo filtro(o filtro barreira) para selecionar o compri-mento de onda da luz emitida pelo corante.(B) Microscopia fluorescente de uma célulade pulmão na qual o DNA é corado emazul e os microtúbulos no citoplasma sãocorados em verde. (Conly S. Rieder/Biolo-gical Photo Service.)

(A) (B)

Amostra 10 µm

Lentes da objetivaFiltro excitatório

Ocular

Filtro barreira

Espelho dicróico

Luz fluorescente

Figura 1.29 Microscopia defluorescência de uma proteínamarcada com GFPUma proteína mitocondrial fusionada àGFP foi introduzida em células humanasem cultura e visualizada por meio da mi-croscopia de fluorescência. (Courtesy of BDBiosciences Clontech.)

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plano de foco, uma imagem muito mais precisa que a obtida com a microscopia defluorescência padrão (Figura 1.31). Além do mais, uma série de imagens obtidas dediferentes profundidades pode ser usada para a construção de uma imagem tridi-mensional da amostra.

A microscopia de excitação multifóton é uma alternativa para a microscopiaconfocal que pode ser usada em células vivas. A amostra é iluminada com um com-primento de onda de luz que, para excitar o corante fluorescente, necessita da absor-ção simultânea de dois ou mais fótons (Figura 1.32). A probabilidade de dois oumais fótons simultaneamente excitarem o corante fluorescente só é significativa noponto da amostra acima do qual o feixe do laser é focado, de modo que a fluorescên-cia só é emitida a partir do plano de foco da luz emitida. Essa excitação altamentelocalizada fornece automaticamente uma resolução tridimensional, sem a necessida-de da passagem da luz emitida através de uma abertura capilar, como na microscopiaconfocal. Além do mais, a excitação localizada minimiza os danos à amostra, permi-tindo imagens tridimensionais de células vivas.

Microscopia Eletrônica

Em razão do limite da resolução do microscópio ótico, a análise de detalhes da estru-tura celular requer o uso de técnicas microscópicas mais potentes – por exemplo, amicroscopia eletrônica, que foi desenvolvida na década de 1930 e foi usada pelaprimeira vez para análise de amostras biológicas por Albert Claude, Keith Porter eGeorge Palade durante os anos de 1940 e 1950. O microscópio eletrônico pode

Figura 1.31 Micrografia confocal decélulas humanasMicrotúbulos e filamentos de actina são co-rados com corantes fluorescentes vermelhoe verde, respectivamente. (K.G Murti/Vi-suals Unlimited.)

Detector

Em foco

Amostra

Fora de foco

Luz fora defoco é impe-dida de al-cançar odetector

Luz fluorescenteemitida

Luz em focoalcança odetector

Aberturaconfocal

Figura 1.30 Microscopia confocalUm fino feixe de luz é focado na amostra em uma profundidade específica, e a luz fluorescente emi-tida é coletada por um detector. Antes de atingir o detector, a luz fluorescente emitida pela amostrapassa através de uma abertura confocal colocada no ponto onde a luz emitida a partir da profundi-dade escolhida da amostra entra em foco. Como resultado, somente a luz emitida no foco da pro-fundidade escolhida da amostra é detectada.

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alcançar uma resolução muito maior que a obtida pelo microscópio ótico porque ocomprimento de ondas dos elétrons é menor do que o da luz. O comprimento deonda dos elétrons em um microscópio eletrônico pode ser tão curto quanto 0,004nm – cerca de 100.000 vezes menor que o comprimento de onda da luz visível.Teoricamente, esse comprimento de onda poderia permitir uma resolução de 0,002nm, mas tal resolução não pode ser obtida na prática, porque a resolução é determi-nada não somente pelo comprimento de onda, mas também pela abertura numéricadas lentes microscópicas. A abertura numérica é um fator limitante para a microsco-pia eletrônica porque as propriedades inerentes das lentes eletromagnéticas limitamseu ângulo de abertura em cerca de 0,5 grau, correspondente a aberturas numéricasde cerca de 0,01. Então, sob condições ótimas, a capacidade de resolução do micros-cópio eletrônico é de aproximadamente 0,2 nm. Além do mais, a resolução que podeser obtida com amostras biológicas é também limitada pela perda inerente de con-traste da amostra. Conseqüentemente, para amostras biológicas, o limite prático daresolução do microscópio eletrônico é de 1 a 2 nm. Embora essa resolução seja muitomenor que a predita simplesmente pelo comprimento de onda dos elétrons, ela represen-ta um aumento de mais cem vezes na capacidade de resolução do microscópio ótico.

Dois tipos de microscopia eletrônica – transmissão e varredura – são amplamenteutilizados para estudar as células. Em princípio, a microscopia eletrônica de transmissãoé similar à observação de células coradas com o microscópio de campo claro. As amostrassão fixadas e coradas com sais de metais pesados, que fornecem contraste através da dis-persão de elétrons. Um feixe de elétrons é passado através da amostra e focado para formaruma imagem em uma tela fluorescente. Elétrons que encontram um íon de metal pesadoquando passam através da amostra são defletidos e não contribuem para a imagem final,de maneira que áreas coradas da amostra aparecem escuras.

Amostras para serem examinadas por microscopia eletrônica de transmissãopodem ser preparadas por coloração negativa ou positiva. Na coloração positiva, ostecidos da amostra são cortados em secções finas e corados com sais de metais pesa-dos (como tetraóxido de ósmio, acetato de urânio e citrato de chumbo) que reagemcom lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos. Esses íons de metais pesados ligam-se auma variedade de estruturas celulares, que conseqüentemente aparecem escuras naimagem final (Figura 1.33). Um procedimento alternativo da coloração positiva podeser usado também para identificar macromoléculas específicas dentro da célula. Porexemplo, anticorpos marcados com metais pesados eletrodensos (como partículas deouro) são freqüentemente usados para determinar a localização subcelular de proteí-nas específicas com o microscópio eletrônico. Esse método é similar ao uso de anti-corpos marcados com corantes fluorescentes na microscopia de fluorescência.

A coloração negativa é útil para a visualização de estruturas biológicas intactas,como uma bactéria, organelas subcelulares isoladas e macromoléculas (Figura 1.34).Nesse método, a amostra biológica é depositada sobre um filme de suporte, e um

Excitação de dois fótons Fóton

Amostracontendofluoróforos

Fluoróforo

Fluoróforoexcitado

Pulso de laser

Figura 1.32 Microscopia de excitaçãode dois fótonsA absorção simultânea de dois fótons é ne-cessária para excitar o corante fluorescente.Isso somente ocorre no ponto da amostrano qual a luz é focada, de modo que a luzfluorescente é emitida apenas a partir deuma profundidade escolhida da amostra.

5 µm

Figura 1.33 Coloração positivaMicrografia eletrônica de transmissão deum polimorfonuclear corado positivamen-te. (Don W. Fawcett/Visuals Unlimited.)

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corante de metal pesado é seco ao redor da sua superfície. A amostra não-corada écoberta por um filme de corante eletrodenso, produzindo uma imagem na qual aamostra aparece clara contra um fundo escuro corado.

O sombreamento metálico é outra técnica usada para visualizar a superfície deestruturas subcelulares isoladas ou macromoléculas com o microscópio eletrônico detransmissão (Figura 1.35). A amostra é coberta com uma fina camada de um metalvaporizado, como a platina. O metal é borrifado sobre a amostra em um ângulo tal queas superfícies da amostra em frente da fonte das moléculas de metal vaporizado são maiscobertas do que as outras. Esse revestimento diferencial cria um efeito de sombra,dando à amostra uma aparência tridimensional nas micrografias eletrônicas.

A preparação de amostras por criofratura, em combinação com o sombrea-mento metálico, tem sido particularmente importante nos estudos da estrutura demembranas. Amostras são congeladas em nitrogênio líquido (a -196ºC) e então que-bradas com uma lâmina não-cortante. Freqüentemente, esse processo divide a bica-mada de lipídeos, revelando a face interior da membrana celular (Figura 1.36). Aamostra é então recoberta com platina, e o material biológico é dissolvido com áci-do, produzindo uma réplica metálica da superfície da amostra. O exame dessas répli-cas no microscópio eletrônico revela muitas alterações na superfície, corresponden-do às proteínas que atravessam a bicamada de lipídeos. Uma variação da criofraturaé chamada de esboço por congelamento, que permite, além das faces internas, avisualização das superfícies externas das membranas celulares.

O segundo tipo de microscopia eletrônica, a microscopia eletrônica de varredura,é usado para dar uma imagem tridimensional das células (Figura 1.37). Na microscopiaeletrônica de varredura, o feixe de elétrons não passa através da amostra. Em vez disso, a

Figura 1.34 Coloração negativaMicrografia eletrônica de transmissão de fi-lamentos de actina corados negativamente.(Cortesia de Roger Craig, University ofMassachusetts Medical Center.)

Figura 1.35 Sombreamento metálicoMicrografia eletrônica de filamentos de ac-tina/miosina do citoesqueleto preparadospor sombreamento metálico. (Don W. Fa-wcett, J. Heuser/Photo Researchers, Inc.)

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Fosfolipídeos

Proteínas

(A) (B)

superfície da célula é coberta com um metal pesado, e um feixe de elétrons é usado paravarrer a superfície da amostra. Elétrons que são dispersos ou emitidos a partir da superfí-cie da amostra são detectados para gerarem uma imagem tridimensional conforme o feixede elétrons move-se através da célula. Uma vez que a resolução da microscopia eletrônicade varredura é de somente 10 nm, seu uso é geralmente restrito ao estudo de célulasinteiras em vez de organelas subcelulares ou macromoléculas.

Fracionamento Subcelular

Embora o microscópio eletrônico permita visualização detalhada da estrutura celular, amicroscopia sozinha não é suficiente para definir as funções dos vários componentes decélulas eucarióticas. Para responder a muitas das questões concernentes às funções dasorganelas subcelulares, tem sido necessário isolar as organelas de células eucarióticas demodo que possam ser utilizadas para estudos bioquímicos. Isso é geralmente realizadopor centrifugação diferencial – um método desenvolvido primariamente por Albert Clau-de, Christian de Duve e seus colegas nas décadas de 1940 e 1950 para separar componen-tes da célula com base em seus tamanhos e densidades.

A primeira etapa no fracionamento subcelular é a ruptura da membrana plas-mática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos dacélula. Diversos métodos são usados, incluindo sonicação (exposição a sons de altafreqüência), trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com mace-radores de alta velocidade (liquidificadores). Todos esses procedimentos quebram amembrana plasmática e o retículo endoplasmático em pequenos fragmentos, en-quanto deixam intactos outros componentes da célula (como núcleo, lisossomos,peroxissomos, mitocôndrias e cloroplastos).

A suspensão de células rompidas (chamada de lisado ou homogenato) é entãofracionada em seus componentes por uma série de centrifugações em uma ultracen-trífuga, que roda amostras em velocidades muito grandes (acima de 100.000 rpm)para produzir forças até 500.000 vezes maiores que a gravidade. Essa força leva oscomponentes celulares a moverem-se em direção ao fundo do tubo da centrífuga eformarem um sedimento (um processo chamado de sedimentação) em uma veloci-dade que depende do seu tamanho e densidade, com as estruturas maiores e maispesadas sedimentando-se mais rapidamente (Figura 1.38). Geralmente, o homoge-

5 µm

Figura 1.37 Microscopia eletrônica devarreduraMicrografia eletrônica de varredura deum macrófago. (David Phillips/VisualsUnlimited.)

Figura 1.36 Criofratura(A) A criofratura divide a bicamada de lipídeos,deixando as proteínas associadas a uma das duasmetades da membrana. (B) Micrografia de mem-brana plasmática criofragmentada de duas célulasadjacentes. Proteínas que atravessam a bicamadade lipídeos aparecem como partículas dentro dasmembranas (seta). (Don W. Fawcett/Photo Rese-archers, Inc.)

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A CÉLULA / 29

Centrifugara 800 × a gravidade(10 min)

Centrifugar sobrenadantea 15.000 × a gravidade(10 min)

Centrifugar sobrenadantea 100.000 × a gravidade(60 min)

Centrifugar sobrenadantea 200.000 × a gravidade(3 horas)

Citosol

Ribossomos sedimentados

Fragmentos da membranaplasmática e retículoendoplasmáticosedimentados

Mitocôndrias, lisossomos e peroxissomossedimentados

Suspensão decélulas rompidas contendocomponentes subcelulares,como lisossomos, peroxissomose fragmentos da membrana

Núcleos sedimentados

Figura 1.38 Fracionamento subcelularAs células são lisadas e os componentes subcelulares são separa-dos por uma série de centrifugações com velocidades crescentes.Após cada centrifugação, as organelas que se sedimentaram nofundo do tubo são recolhidas. O sobrenadante é novamentecentrifugado em uma velocidade maior para sedimentar as orga-nelas seguintes em tamanho.

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nato celular é primeiro centrifugado a uma baixa velocidade, na qual sedimentamapenas as células não-lisadas e a maior estrutura subcelular – o núcleo. Então, umafração enriquecida de núcleos pode ser recuperada do sedimento da centrifugação auma baixa velocidade enquanto os outros componentes celulares permanecem nosobrenadante (a solução remanescente). O sobrenadante é então centrifugado a umamaior velocidade para sedimentar as mitocôndrias, os cloroplastos, os lisossomos eos peroxissomos. A recentrifugação do sobrenadante em velocidade ainda mais altasedimenta fragmentos da membrana citoplasmática e o retículo endoplasmático. Umaquarta centrifugação, com velocidade ainda mais alta, sedimenta os ribossomos, dei-xando somente a porção solúvel do citoplasma (o citosol) no sobrenadante.

As frações obtidas pela centrifugação diferencial correspondem a preparaçõesenriquecidas, mas ainda não-puras, de organelas. Um grau maior de purificação podeser obtido por centrifugação em gradiente de densidade, na qual as organelas sãoseparadas por sedimentação através de um gradiente de uma substância densa, comoa sacarose. Na centrifugação por velocidade, o material de partida é colocado notopo do gradiente de sacarose (Figura 1.39). Partículas de diferentes tamanhos sedi-mentam através do gradiente em taxas diferentes, movendo-se como bandas defini-das. Após a centrifugação, a coleta das frações individuais do gradiente permite uma

Partículas de sedimentação lenta

Partículas de sedimentação lenta

Gradiente de sacarose

Partículas de sedimentação rápida

Partículas de sedimentação rápida

Centrifugar Partículas de diferentes tamanhos sedimentam como bandas definidas.

A amostra é colocada no topode um gradiente de sacarose.

Coletar as fraçõesdo gradiente.

Figura 1.39 Centrifugação de velocidade em um gradiente de densidadeA amostra é colocada no topo de um gradiente de sacarose e as partículas de tama-nhos diferentes sedimentam através do gradiente como bandas definidas. As partícu-las separadas são coletadas em frações individuais do gradiente, que podem ser obti-das simplesmente furando o fundo do tubo de centrifugação e coletando-se as gotas.

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resolução suficiente para separar organelas de tamanhos semelhantes, como mito-côndrias, lisossomos e peroxissomos.

A centrifugação de equilíbrio em gradientes de densidade pode ser usada paraseparar componentes subcelulares com base nas suas densidades de flutuação, inde-pendentemente de seu tamanho ou forma. Neste processo, a amostra é centrifugadaem um gradiente contendo alta concentração de sacarose ou cloreto de césio. Em vezde serem separadas com base na velocidade de sedimentação, as partículas da amos-tra são centrifugadas até atingirem uma posição de equilíbrio, na qual sua densidadeé igual à da solução de sacarose ou cloreto de césio. Essas centrifugações de equilíbriosão úteis na separação de diferentes tipos de membranas e são suficientemente sensí-veis para separar macromoléculas que são marcadas com diferentes isótopos. Umexemplo clássico, discutido no Capítulo 3, é a análise da replicação do DNA atravésda separação de moléculas de DNA contendo isótopos pesados e leves de nitrogênio(15N e 14N) por centrifugação de equilíbrio em gradiente de cloreto de césio.

Crescimento de Células Animais em Cultura

A habilidade de estudar células depende muito de quão facilmente elas podem sercultivadas e manipuladas em laboratório. Apesar do processo ser tecnicamente maisdifícil do que cultivar bactérias ou leveduras, uma grande variedade de células deanimais e plantas pode ser cultivada e manipulada em cultura. Esses sistemas decultivo de células in vitro têm permitido que os cientistas estudem o crescimento e adiferenciação celular, bem como efetuem manipulações genéticas necessárias para acompreensão da estrutura e função dos genes.

As culturas de células animais são iniciadas pelo isolamento de células a partirde pedaços de tecidos e, a seguir, as células são adicionadas em placas de cultivocontendo meio nutritivo. A maioria dos tipos de células animais, como fibroblastose células epiteliais, adere-se e cresce na superfície plástica das placas usadas para cul-tivo de células (Figura 1.40). Embriões e tumores são freqüentemente usados comomaterial de partida, já que eles contêm células de crescimento rápido. Particular-mente, fibroblastos de embriões crescem muito bem em cultura e como conseqüên-cia são um dos tipos mais amplamente estudados de células animais. Entretanto, sobcondições apropriadas, muitos tipos de células especializadas também podem crescerem cultura, permitindo que suas propriedades diferenciadas possam ser estudadasem um ambiente experimental controlado. As células-tronco embrionárias são umexemplo particularmente interessante. Essas células são estabelecidas em cultura apartir de embriões precoces e mantêm sua capacidade de diferenciar-se em todos ostipos de células presentes em organismos adultos. Conseqüentemente, as células-tronco embrionárias desempenham um papel importante no estudo das funções demuitos genes no desenvolvimento do camundongo, assim como oferecem a possibi-lidade de contribuir para o tratamento de doenças humanas, fornecendo uma fontede tecidos para transplantoterapias.

Os meios de cultura necessários para a propagação de células animais são muitomais complexos que o meio mínimo suficiente para sustentar o crescimento de bac-térias e leveduras. Os primeiros estudos de cultura celular utilizavam meios compos-tos de componentes indefinidos, como plasma, soro e extratos de embrião. Um im-portante avanço foi feito em 1955, quando Harry Eagle descreveu o primeiro meiodefinido que sustentava o crescimento de células animais. Além de sais e glicose, osmeios usados para cultivo de células animais contêm vários aminoácidos e vitaminas,que as células não podem sintetizar. O meio de crescimento para a maioria das célu-las animais em cultura também inclui soro, que serve como fonte de fatores de cres-cimento necessários para estimular a divisão celular. Vários fatores de crescimentotêm sido identificados. Eles servem como reguladores essenciais para o crescimento ea diferenciação de células em organismos multicelulares, fornecendo sinais pelos quaiscélulas diferentes comunicam-se entre si. Por exemplo, uma importante funçãodos fibroblastos da pele no animal intacto é a proliferação quando for necessário

10 µm

Figura 1.40 Células animais em culturaMicrografia eletrônica de varredura de fi-broblastos humanos aderidos à superfície deuma placa de cultura. (David M. Phillips/Visuals Unlimited.)

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EXPERIMENTO-CHAVE

Cultura de Células Animais

O ContextoAs primeiras culturas de células envol-veram o crescimento de células a partirde fragmentos de tecidos que foramapoiados em coágulos de plasma – umsistema de cultura que estava muito dis-tante do necessário para análises experi-mentais. No final da década de 1940,um grande avanço foi o estabelecimen-to de linhagens celulares que cresciam apartir de células isoladas aderidas à su-perfície de placas de cultura. Mas essascélulas eram ainda cultivadas em meiosindefinidos que consistiam em umacombinação variada de soro e extratosembrionários. Por exemplo, uma linha-gem de célula de câncer humano am-plamente usada (chamada de célulasHeLa) foi estabelecida inicialmente em1952 pelo crescimento em um meiocontendo plasma de galinha, extrato deembrião bovino e soro de cordão umbi-lical humano. O uso desse meio de cul-tura complexo e indefinido torna im-possível a análise das necessidades es-pecíficas para o crescimento de célulasanimais. Harry Eagle foi o primeiro aresolver esse problema, mediante arealização de uma análise sistemáticados nutrientes necessários para sus-tentar o crescimento de células ani-mais em cultura.

Os ExperimentosEagle estudou o crescimento de duas li-nhagens de células estabelecidas: célulasHeLa e uma linhagem de fibroblasto decamundongo chamada de células L. Elefoi capaz de cultivar essas células emum meio contendo uma mistura desais, carboidratos, aminoácidos e vita-minas, suplementado com proteínas desoro. Variando sistematicamente os

componentes desse meio, Eagle foi ca-paz de determinar os nutrientes especí-ficos necessários para o crescimento ce-lular. Além dos sais e da glicose, essesnutrientes incluem 13 aminoácidos evárias vitaminas. Também foi necessáriauma pequena quantidade de proteínasde soro. O meio básico desenvolvidopor Eagle está descrito na tabela anexa,uma cópia do seu artigo de 1955*.

O ImpactoO meio desenvolvido por Eagle é ain-da o meio básico usado para culturade células animais. Seu uso tem per-mitido aos cientistas o cultivo de uma

ampla variedade de células sob condi-ções experimentais definidas, que temsido essencial para estudos do cresci-mento e da diferenciação de célulasanimais, incluindo a identificação dosfatores de crescimento presentes nosoro – atualmente sabe-se que inclu-em polipeptídeos que controlam ocomportamento das células indivi-duais no animal intacto.

Harry Eagle

Nutrition Needs of Mammalian Cells in Tissue CultureHarry EagleNational Institutes of Health, Bethesda, MDScience, Volume 122, 1955, pages 501-504

Table 4. Basal media for cultivation of the HeLa cell and mouse fibroblast (10 )

L-Amino acids* Vitamins‡

Miscellaneous(mM ) (mM )

Arginine 0.1 Biotin 10-3 Glucose 5mM§Cystine 0.05 (0.02)† Choline 10-3 Penicillin 0.005%#Glutamine 2.0 (1.0)|| Folic acid 10-3 Streptomycin 0.005%#Histidine 0.05 (00.2)† Nicotinamide 10-3 Phenol red 0.0005%#Isoleucine 0.2 Pantothemic acid 10-3 ________________________

Leucine 0.2 (0.1)† Pyridoxal 10-3

Lysine 0.2 (0.1)† Thiamine 10-3 For studies of cell nutritionMethionine 0.05 Riboflavin 10-4 Dialyzed horse serum, 1%†

Phenylalanine 0.1 (0.05)† ____________________ Dialyzed human serum, 5%Threonine 0.2 (0.1)† Salts§ ________________________

Tryptophan 0.02 (0.01)† (mM ) For stock culturesTyrosine 0.1 ____________________ Whole horse serum, 5%†

Valine 0.2 (0.1)† NaCl 100 Whole human serum, 10%KCl 5NaH2PO4 . H2O 1NaHCO3 20CaCl2 1MgCl2 0.5

* Conveniently stored in the refrigerator as a single stock solution containing 20 times the indicated concentration ofeach amino acid.† For mouse fibroblast.‡ Conveniently stored as a single stock solution containing 100 or 1000 times the indicated concentration of each vitamin;kept frozen.§ Conveniently stored in the refrigerator in two stock solutions, one containing NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, and glucoseat 10 times the indicated concentration of each, and the second containing CaCl2 and MgCl2 at 20 times the indicatedconcentration.|| Conveniently stored as a 100mM stock solution; frozen when not in use.# Conveniently stored as a single stock solution containing 100 times the indicated concentrations of penicillin, streptomycin,and phenol red.

*N. de T. Esta tabela foi mantida em inglês em função de seu valor histórico.

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reparar danos resultantes de um corte ou ferimento. A divisão é induzida por umfator de crescimento liberado por plaquetas durante a coagulação sangüínea, es-timulando, desse modo, a proliferação de fibroblastos na região próxima ao teci-do lesado. A identificação de fatores de crescimento específicos tem tornado pos-sível a cultura de uma variedade de células em meio sem soro (meio no qual osoro é substituído por fatores de crescimento específicos necessários para a pro-liferação das células em questão).

As primeiras culturas celulares estabelecidas a partir de um tecido são chamadasde culturas primárias (Figura 1.41). As células em uma cultura primária geralmentecrescem até cobrirem a superfície da placa de cultura. Então, elas devem ser removi-das da placa e colocadas em uma nova placa com menor concentração de células paraformar uma cultura secundária. Este processo pode ser repetido muitas vezes, mas amaioria das células normais não pode ser crescida em cultura indefinidamente. Porexemplo, fibroblastos humanos normais geralmente podem ser cultivados por 50 a100 duplicações da população, após o que eles param de crescer e morrem. Emcontraste, células-tronco embrionárias e células deriva-das de tumores com freqüência proliferam indefinida-mente em cultura e são chamadas de linhagens de célu-las imortalizadas ou permanentes. Além disso, uma va-riedade de linhagens de células imortalizadas de roedo-res tem sido isolada a partir de culturas de fibroblastosnormais. Em vez de morrerem, como a maioria das suascompanheiras, algumas poucas células dessas culturascontinuam a proliferar indefinidamente, formando li-nhagens celulares como as derivadas de tumores. Essaslinhagens de células permanentes têm sido muito úteispara vários tipos de experimentos porque fornecem umafonte contínua e uniforme de células que podem sermanipuladas, clonadas e indefinidamente propagadasem laboratório.

Mesmo sob condições ótimas, o tempo de divi-são das células animais com maior capacidade de cres-cimento é ao redor de 20 horas – dez vezes maior queo tempo de divisão das leveduras. Conseqüentemen-te, experimentos com células animais cultivadas sãomais difíceis e mais demorados que os com bactériase leveduras. Por exemplo, o crescimento de uma co-lônia visível de células animais a partir de uma únicacélula demora uma semana ou mais, ao passo quecolônias de E. coli ou leveduras demoram uma noitepara crescerem a partir de uma única célula. Contu-do, manipulações genéticas de células de animais emcultura têm sido indispensáveis para a compreensãoda estrutura e função celular.

Cultura de Células Vegetais

Células vegetais também podem ser cultivadas em meioscontendo moléculas reguladoras de crescimento adequa-das. Em contraste com os fatores de crescimento poli-peptídicos que regulam a proliferação da maioria dascélulas animais, os reguladores de crescimento das células vegetais são moléculaspequenas que podem passar através da parede da célula vegetal. Quando providos demisturas adequadas dessas moléculas reguladoras do crescimento, muitos tipos de célulasvegetais proliferam em cultura, produzindo uma massa de células indiferenciadas, cha-mada de calo (Figura 1.42). Figura 1.41 Cultura de células animais

Tecido

Suspensão decélulas

Meio líquido

Cultura primária

Um pedaço de tecido é dissociado em uma suspensãode células individuais.

As células são colocadasem uma placa de culturacom meio nutritivo.

As células da cultura primária aderem-seà placa e crescem até cobrirem asuperfície da placa de cultura.

Culturasecundária

As células podem ser então removidas da placa de cultura e replaqueadas emuma concentração menor para formaruma cultura secundária.

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É notável que muitas células vegetais sejam capazes deformar qualquer um dos diferentes tipos de células e teci-dos, essencialmente necessários para regenerar uma plantainteira. Conseqüentemente, sob apropriadas manipulaçõesde nutrientes e de moléculas reguladoras de crescimento,células vegetais indiferenciadas em cultura podem ser indu-zidas a formar uma variedade de tecidos da planta, incluí-das raízes, troncos e folhas. Em muitos casos, até uma plan-ta inteira pode ser regenerada a partir de uma única célulaem cultura. Além do interesse teórico, a capacidade de pro-duzir uma nova planta a partir de uma única célula que te-nha sido manipulada em cultura torna fácil a introdução dealterações genéticas em plantas, fornecendo importantes pos-sibilidades para a engenharia genética na agricultura.

Vírus

Vírus são parasitas intracelulares que não podem replicar por si próprios. Elesreproduzem-se pela infecção de uma célula hospedeira e pela usurpação da ma-quinaria celular para produzir mais partículas virais. Nas formas mais simples, osvírus são compostos somente do ácido nucléico genômico (ou DNA ou RNA)circundado por uma capa protéica (Figura 1.43). Os vírus são importantes nabiologia celular e molecular porque fornecem sistemas simples que podem serusados para investigar as funções das células. Pelo fato de a replicação viral de-pender do metabolismo da célula infectada, estudos dos vírus têm revelado mui-tos aspectos fundamentais da biologia celular. Estudos de vírus que infectambactérias contribuíram substancialmente para nossa compreensão acerca dos me-canismos básicos da genética molecular, e experimentos com vírus de vegetais(vírus do mosaico do tabaco) foram os primeiros a demonstrarem o potencialgenético do RNA. Vírus de animais têm fornecido sondas especialmente úteispara a investigação de várias atividades das células eucarióticas.

O crescimento rápido e o genoma de pequeno tamanho tornam as bactériasexcelentes alvos para experimentos na biologia molecular, e os vírus bacterianos (bac-teriófagos) simplificam ainda mais o estudo da genética bacteriana. Um dos maisimportantes bacteriófagos é o T4, que infecta e replica em E. coli. A infecção comuma única partícula de T4 leva à formação de aproximadamente 200 partículas vi-rais filhas em um período de 20 a 30 minutos. A célula inicialmente infectada rompe(lise), liberando as partículas virais no meio, onde elas podem infectar novas células.

Figura 1.42 Cultura de células vegetaisUma massa indiferenciada de células vegetais(um calo) crescendo em um meio sólido.(John N. A. Lott/Biological Photo Service.)

(B)(A)

50 nmDNA Proteínas do capsídeo

Figura 1.43 Estrutura de um vírus deanimal(A) A partícula do papilomavírus contémuma pequena molécula de DNA circular re-coberta por uma capa protéica (o capsídeo).(B) Micrografia eletrônica de partículas depapilomavírus humano. Foi adicionada colo-ração artificial. (B, Linda Stannard/SciencePhoto Library/Photo Researchers, Inc.)

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A CÉLULA / 35

MEDICINA MOLECULAR

Vírus e CâncerA DoençaO câncer é um grupo de doenças ca-racterizado pela proliferação descon-trolada de células. O crescimento decélulas animais normais é cuidadosa-mente regulado para atingir as neces-sidades de um organismo completo.Em contraste, as células cancerosascrescem de um modo não-regulado,acabando por invadir e interferircom a função de tecidos e órgãosnormais. O câncer é a segunda dascausas mais comuns de morte (apósas doenças cardíacas) nos EstadosUnidos. Aproximadamente um emcada três norte-americanos desenvol-verá câncer em algum momento desua vida e, apesar dos grandes avançosno tratamento, aproximadamente umem cada quatro norte-americanosmorrerá dessa doença. O entendi-mento das causas do câncer e o desen-volvimento de métodos mais efetivospara o seu tratamento representamum dos principais objetivos da pes-quisa médica.

Bases Celulares e MolecularesSabe-se que o câncer resulta de mu-tações nos genes que normalmentecontrolam a proliferação celular. Osprincipais indícios que levaram àidentificação desses genes surgiramde estudos de vírus que causam cân-cer em animais, o protótipo dosquais foi isolado por Peyton Rousem 1911. Rous descobriu que sarco-mas (cânceres dos tecidos conjunti-vos) em galinhas poderiam sertransmitidos por um vírus, agoraconhecido por vírus do sarcoma deRous, ou RSV. Uma vez que o RSVé um retrovírus com um genoma desomente 10.000 pares de bases, elepode ser alvo de análises molecula-res com muito mais facilidade que ogenoma complexo das galinhas oude células de animais. Finalmente,esses estudos levaram à identificação

de um gene causador de câncer (on-cogene) carregado pelo vírus, e àdescoberta de genes relacionados emcélulas normais de todas as espéciesde vertebrados, inclusive humanos.Agora, sabe-se que alguns câncereshumanos são causados por vírus;outros resultam de mutações em ge-nes celulares normais semelhantesao primeiro oncogene identificadono RSV.

Prevenção e TratamentoOs cânceres humanos que são causa-dos por vírus incluem o cervical e ou-tros cânceres anogenitais (papilomaví-rus), câncer hepático (vírus das hepa-tites B e C) e alguns tipos de linfomas(vírus de Epstein-Barr e vírus linfo-trópico das células T humanas). Jun-tos, esses cânceres induzidos por vírusrepresentam cerca de 20% da inci-dência mundial de câncer. Em princí-pio, esses cânceres poderiam ser pre-venidos por vacinação contra os vírusresponsáveis, e um considerável avan-ço nessa área foi feito pelo desenvolvi-mento de uma vacina eficaz contra ovírus da hepatite B.

Outros cânceres humanos são cau-sados por mutações em genes de célulasnormais, a maioria delas ocorrendo du-rante a vida do indivíduo, em vez de se-rem herdadas. Estudos em vírus causa-dores de câncer têm levado à identifica-ção de muitos dos genes responsáveispor cânceres não-induzidos por vírus eà compreensão dos mecanismos mole-culares responsáveis pelo desenvolvi-mento de câncer. Os principais esforçosatuais são direcionados para o uso detais informações sobre a biologia celulare molecular dos cânceres no desenvolvi-mento de novos métodos para o seutratamento.

Realmente, a primeira droga re-sultante de engenharia genética eficazno tratamento de um câncer humano(a droga STI-571, discutida no capí-tulo 15) foi desenvolvida contra umgene muito semelhante ao oncogenedo RSV.

ReferênciaRous, P. 1911. A sarcoma of the fowltransmissible by an agent separablefrom the tumor cells. J. Exp. Med.13:397-411.

O tumor transplantável de onde foi isolado o vírus do sarcoma de Rous.

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Em uma cultura de bactérias crescendo em meio com ágar, a replicação do T4 leva àformação de uma área clara de células lisadas (uma placa) na camada de bactérias(Figura 1.44). Justamente pelo fato de as partículas virais infecciosas serem fáceis decultivar e testar, mutantes virais – por exemplo, vírus que crescerão em uma cepa deE. coli, mas não em outra – são facilmente isolados. Assim, o T4 é manipulado muitomais facilmente que a E. coli para estudos de genética molecular. Além do mais, ogenoma do T4 é 20 vezes menor que o da E. coli – aproximadamente 0,2 milhão depares de bases – facilitando ainda mais as análises genéticas. Outros bacteriófagostêm genomas ainda menores – o mais simples consiste em moléculas de RNA desomente 3.600 nucleotídeos. Por isso, os vírus bacterianos têm fornecido sistemasexperimentais extremamente práticos para a genética molecular. São basicamente osestudos desses vírus que têm levado à elucidação de muitos princípios fundamentaisda biologia molecular.

Por causa da grande complexidade do genoma das células animais, os vírus têmsido mais importantes nos estudos das células animais do que nos estudos das bacté-rias. Muitos vírus de animais replicam-se e podem ser observados pela formação deplacas em culturas de células, parecido com o que fazem os bacteriófagos. Além domais, os genomas dos vírus de animais são similares em complexidade aos dos vírusbacterianos (variando aproximadamente de 3.000 a 300.000 pares de bases), de modoque os vírus de animais são mais manipuláveis que suas células hospedeiras.

Existe muita diversidade nos vírus de animais, cada um contendo ou DNA ouRNA como material genético (Tabela 1.3). A maioria dos vírus com genomas de RNAreplica-se mediante síntese de novas cópias do RNA de seus genomas, a partir de moldesde RNA nas células infectadas. Contudo, uma família de vírus de animais – os retrovírus– contém genoma de RNA nas suas partículas virais, mas sintetiza uma cópia de DNA doseu próprio genoma nas células infectadas. Esses vírus fornecem um bom exemplo daimportância dos vírus como modelos, porque os estudos dos retrovírus foram os primei-ros a demonstrarem a síntese de DNA a partir de RNA – um modo fundamental detransferir informações genéticas e que agora se sabe ocorrer em todas as células eucarióti-cas. Outros exemplos nos quais os vírus de animais forneceram importantes modelos parainvestigação de suas células hospedeiras incluem estudos de replicação de DNA, transcri-ção, processamento do RNA e transporte e secreção de proteínas.

É particularmente notável que infecções de alguns vírus de animais, em vez dematarem as células hospedeiras, convertem uma célula normal em uma célula cancerosa.Estudos desses vírus carcinogênicos, primeiramente descritos por Peyton Rous em 1911,não somente têm fornecido bases para nossa atual compreensão do câncer no nível dabiologia celular e molecular, mas também têm levado à elucidação de muitos mecanismosmoleculares que controlam o crescimento e a diferenciação das células animais.

Figura 1.44 Placas de bacteriófagosPlacas de T4 são visíveis na camada de E.coli. Cada placa surge pela replicação deuma única partícula viral. (E.C.S. Chen/Vi-suals Unlimited.)

TABELA 1.3 Exemplos de Vírus de Animais

Tamanho do genoma (mi-Família de vírus Membro representativo lhares de pares de bases)

Genoma de RNA

Picornavírus Vírus da poliomielite 7-8Togavírus Vírus da rubéola 12Flavivírus Vírus da febre amarela 10Paramixovírus Vírus do sarampo 16-20Ortomixovírus Vírus da gripe 14Retrovírus Vírus da imunodeficiência humana 9

Genoma de DNAHepadnavírus Vírus da hepatite B 3,2Papovavírus Vírus do papiloma humano 5-8Adenovírus Adenovírus 36Herpesvírus Vírus herpes simples 120-200Poxvírus Vírus da varíola 130-280

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RESUMO

A ORIGEM E A EVOLUÇÃO DAS CÉLULAS

A Primeira Célula: Todas as células atuais, tanto procarióticas como eucarióti-cas, são descendentes de um único antepassado. Supõe-se que a primeira célulatenha surgido há pelo menos 3,8 bilhões de anos, como resultado da inclusão deum RNA auto-replicativo em uma membrana de fosfolipídeos.

A Evolução do Metabolismo: As primeiras reações para a geração de energia me-tabólica foram uma forma de glicólise anaeróbica. A fotossíntese então evoluiu,seguida pelo metabolismo oxidativo.

Procariotos Atuais: Os procariotos atuais são divididos em dois grupos, as ar-queobactérias e as eubactérias, que divergiram cedo na evolução.

Células Eucarióticas: As células eucarióticas, que são maiores e mais complexasque as células procarióticas, contêm um núcleo, organelas citoplasmáticas e umcitoesqueleto. Supõe-se que elas tenham surgido a partir da associação simbióti-ca de procariotos.

O Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares: Os eucariotos mais simplessão organismos unicelulares, como as leveduras e as amebas. Os organismos mul-ticelulares evoluíram a partir da associação entre eucariotos unicelulares, e a divi-são das funções levou ao desenvolvimento dos muitos tipos de células especiali-zadas que formam os animais e vegetais atuais.

CÉLULAS COMO MODELOS EXPERIMENTAIS

E. coli : Em razão da sua simplicidade genética e facilidade de estudo, bactériascomo a E. coli são particularmente úteis para a pesquisa de aspectos fundamen-tais da bioquímica e biologia molecular.

Leveduras : Sendo as células eucarióticas mais simples, as leveduras são mo-delos importantes para o estudo de vários aspectos da biologia celular deeucariotos.

Dictyostelium discoideum: O eucarionte unicelular Dictyostelium discoideum éamplamente usado para análises experimentais do movimento celular.

Caenorhabditis elegans: O nematóide Caenorhabditis elegans é um organismomulticelular simples que serve como um modelo importante na biologia do de-senvolvimento.

Drosophila melanogaster: Em virtude da extensa análise genética, estudos damosca-da-fruta Drosophila têm levado a grandes avanços no entendimento dodesenvolvimento animal.

Arabidopsis thaliana: A pequena planta com flor Arabidopsis é amplamente usadacomo modelo para estudos da biologia molecular e do desenvolvimento de plantas.

Vertebrados : Muitos tipos de células de vertebrados podem crescer em cultura,onde podem ser estudados em condições controladas. Tipos de células especiali-

PALAVRAS-CHAVE

células procarióticas, células eu-carióticas, mundo de RNA, fos-folipídeos, anfipática, hidrofóbi-ca, hidrofílica

adenosina 5’-trifosfato (ATP),glicólise, fotossíntese, metabolis-mo oxidativo

arqueobactérias, eubactérias, cia-nobactérias, Escherichia coli (E.coli), parede celular, membranaplasmática, ribossomo

núcleo, mitocôndria, cloroplasto,lisossomo, peroxissomo, vacúolo,retículo endoplasmático, comple-xo de Golgi, citoesqueleto, en-dossimbiose

levedura, Saccharomyces cerevisi-ae, pseudópodo, célula epitelial,fibroblasto, eritrócito, granulóci-to, monócito, macrófago, linfóci-to, neurônio

Dictyostelium discoideum

Caenorhabditis elegans

Drosophila melanogaster

Arabidopsis thaliana

Xenopus laevis, “zebrafish”, ca-mundongo transgênico

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Perguntas

1. Quais são as características fundamen-tais que todas as células vivas comparti-lham na terra? Cite pelo menos três.

2. O que os experimentos de StanleyMiller mostraram sobre a formação demoléculas orgânicas?

3. Que tipo de macromolécula é capazde controlar sua auto-replicação?

4. Por que se pensa que a evolução dafotossíntese tenha favorecido a evolu-ção subseqüente do metabolismo oxi-dativo?

5. Por que a formação de uma mem-brana plasmática semipermeável ao re-dor de um grupo de macromoléculasque se auto-replicam foi um passo tãoimportante na origem da vida?

6. Discuta as evidências de que as mito-côndrias e os cloroplastos se originaramde bactérias que foram incorporadaspelo precursor das células eucarióticas.

7. Que resolução pode ser obtida comum microscópio óptico, se a amostra forvisualizada através de ar, em vez de atravésde óleo? Considere que o comprimentode onda da luz visível é de 0,5 µm.

zadas, como os neurônios e as células musculares, fornecem modelos úteis parainvestigar aspectos particulares da biologia celular. O sapo Xenopus e o “zebra-fish” são modelos importantes para estudos do desenvolvimento inicial dos ver-tebrados, e o camundongo é uma espécie de mamífero adequada para análisesgenéticas.

FERRAMENTAS DA BIOLOGIA CELULAR

Microscopia Ótica: Uma variedade de métodos é usada para visualizar as célulase estruturas subcelulares e para determinar a localização intracelular de molécu-las específicas pelo uso do microscópio ótico.

Microscopia Eletrônica: A microscopia eletrônica, com uma resolução que é apro-ximadamente cem vezes maior que a da microscopia ótica, é usada para análisede detalhes da estrutura celular.

Fracionamento Subcelular: As organelas das células eucarióticas podem ser isola-das para análises bioquímicas por centrifugação diferencial.

Crescimento de Células Animais em Cultura: A propagação de células animaisem cultura tem permitido estudos dos mecanismos que controlam o crescimentoe a diferenciação celular.

Cultura de Células Vegetais: Células vegetais em cultura podem diferenciar-separa formar células especializadas e, em alguns casos, podem regenerar plantasinteiras.

Vírus: Os vírus fornecem um modelo simples para estudos da função celular.

resolução, microscopia de campoclaro, microscopia de contraste

de fase, microscopia de contrastede interferência diferencial, mi-croscopia de contraste de inter-

ferência diferencial intensificadapor vídeo, microscopia de fluo-

rescência, proteína verde fluores-cente (GFP), microscopia confo-

cal, microscopia de excitaçãomultifóton

microscopia eletrônica detransmissão, sombreamentometálico, criofratura, esboço

por congelamento, microscopiaeletrônica de varredura

centrifugação diferencial, ultra-centrífuga, centrifugação em

gradiente de densidade, centri-fugação por velocidade, centri-

fugação de equilíbrio

células-tronco embrionárias,cultura primária, linhagem de

células imortalizadas

calo

bacteriófago, retrovírus

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8. Que vantagem o uso da proteínaverde fluorescente (GFP) tem sobre ouso de anticorpos marcados com fluo-rescência, no estudo da localização edo movimento de uma proteína nascélulas?

9. Identifique as diferentes característi-cas das propriedades das organelas que

permitem a separação, em um gradien-te de sacarose, pela centrifugação porvelocidade e pela centrifugação de equi-líbrio.

10. As leveduras têm sido usadas comoum modelo para o estudo de muitosaspectos da biologia das células eucarió-ticas. Por que elas não são um modelo

apropriado para a análise dos movimen-tos de células animais?

11. Por que a capacidade de cultivar célu-las-tronco embrionárias é importante?

12. Qual a diferença entre culturas ce-lulares primárias e linhagem de célulasimortalizadas?

Referências e Leituras Adicionais

A Origem e a Evolução das Células

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introdução a biologia celular - leitura complementar

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