interactions des protéines gra avec des vésicules unilamellaires
DESCRIPTION
Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii :. Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires. Thèse de Doctorat en Physique soutenue par Pauline RUFFIOT Sous la direction de Marie-France CESBRON-DELAUW et Antoine DELON. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii :
Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires
Thèse de Doctorat en Physique soutenue parPauline RUFFIOT
Sous la direction de Marie-France CESBRON-DELAUW et Antoine DELON
Contexte biologique: T. gondii
• Pathogène responsable de la toxoplasmose:
50% de la population mondiale infectée;Formes graves chez les fœtus et les
sujets immunodéprimés.
• Proche de Plasmodium falciparum, responsable de la malaria
Hôtes définitifs:Félidés
Mérozoïte Sporozoïte
Bradyzoïte Tachyzoïte
Hôtes intermédiaires:Mammifères et oiseaux
Environnement
Forme proliférativeForme dormante
Reproduction sexuée
Transmissionverticale au foetus
Réactivation chez les sujets immunodéprimés
EncéphaliteToxoplasmose
congénitale
Toxoplasma gondii est un protozoaire eucaryote, appartenant au phylum des Apicomplexa: c’est un parasite intracellulaire obligatoire.
La vacuole parasitophore (VP) de T. gondiiUn compartiment spécialisé au sein de la cellule-hôte,
formé activement par le parasite
Sécrétion des micronèmes
1. Attachement
Sécrétion des rhoptries
2. Invasion
4. Prolifération des
parasites
[Lebrun et al.,2007]1µm
Sécrétion des granules denses
3. Maturation de la VP
Les systèmes membranaires de la VP
[Magno et al., 2005a]
RNM: Réseau de nanotubes
membranaires
HOSTs: Tubules séquestrant des
organites de la cellule-hôte
[Coppens et al., 2006]
PVM: Membrane
délimitant la VP
PVM
PV
Cellule-hôte
Parasite
Tubules de diamètre 30-50nm
Tubules de diamètre ~50nmsous-tendus par un microtubule
de la cellule-hôte
La famille des protéines GRAProtéines de granules denses
GRA1GRA2GRA3GRA4GRA5
GRA6GRA7GRA8GRA9
Domaine transmembranaire
Hélice amphipathique
La plupart des protéines GRA contiennent un segment hydrophobe ou amphipathique, susceptibles d’interagir avec des membranes.
Associées aux structures membranaires de la vacuole mature
Stockées dans lesgranules denses
Libérées lors de la maturation de la vacuole
Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Associées aux structures membranaires de la vacuole mature
Stockées dans lesgranules denses
Libérées lors de la maturation de la vacuole
Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Associées aux structures membranaires de la vacuole mature
Stockées dans lesgranules denses
Libérées lors de la maturation de la vacuole
Toutes GRALumen
RNMGRA2,4,6,9
HOSTsGRA7 PVM
GRA3,5,7
Trafic post-sécrétoire des protéines GRA
Stockées dans lesgranules denses
Libérées lors de la maturation de la vacuole
Associées aux structures membranaires de la PV mature
PVMHOSTs RNM
LumenGRA7Toutes GRA GRA3,5,7
GRA2,4,6,9
Bien que contenant pour la plupart des domaines hydrophobes, les protéines GRA existent en partie sous des formes solubles tout au long de leur trafic post-sécrétoire.
Partiellement solubles Essentiellement solubles Fraction luminale soluble
Interactions des protéines avec les membranes de la VP• Rôle de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM [Mercier et al., 2002]
En parasite sauvage:Tubules homogènes
En l’absence de GRA2:Matériel granulaire, non structuré
En l’absence de GRA6:Vésicules
RNM
[Coppens et al., 2006]• Rôle de GRA7 dans la formation des HOSTs ?
HOST
GRA7 participe à un manteau cylindrique formé autour des
membranes des HOSTs
GRA2 et GRA6 sont nécessaires à la mise en place du RNM
Problématiques abordées
Trafic post-sécrétoire
Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles ?
Association membranaire
Quels sont les paramètres nécessaires pour l’association des protéines GRA aux membranes de la vacuole ?
Formation de tubules membranaires
De quelle manière les protéines sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs?
Stratégie:
Microscopie de fluorescence (LSP)
Biochimie (LAPM)
Un modèle pour la VP
Physique des vésicules géantes(LSP)
Etude de la VP(LAPM)
Exploration des interactions membranaires et des fonctions
des protéines GRA
Protéines GRA
+
Modèle de la VP
Membranesmodèles
Contraintes du système
Pas de protéines GRA purifiées -> Travail à partir de:• 3 fractions ultrasolubles riches en protéines• des anticorps spécifiques de chacune des protéines GRA.
Milieu de culture complémenté de
serum de veau foetal
Protéines de parasitesextracellulaires
Protéines sécrétées in vitro
Protéines de cellules infectées
Formes solubles obtenues par ultracentrifugation (100 000g; 1h)
Membranes-modèles
LipidesHeLa
Les SUVs et GUVs ont été formées à partir d’un extrait lipidique total de cellules HeLa (cellules humaines), afin d’approcher la composition lipidique des membranes
rencontrées dans la vacuole.
Présentation des résultats
Formes de solubilisation
Association membranaire Déformations membranaires
Travail surSUVs Travail sur GUVs
Biochimie (LAPM)
Microscopie de fluorescence
(LSP)
En solution
Comparaison des différentes formes ultrasolubles des protéines GRA
Association spontanéeAssociation spontanéeRépartition des protéines GRAImplication des protéines GRA dans des déformations membranaires?
Protéines GRA suivies
Contrôle: hydrophile
2 hélices amphipathiques
1 TMD
1 TMD
GRA1
GRA2
GRA6
GRA3
GRA7
RNM
PVM
PVM+ HOSTs
1 TMD
PVMHOSTs RNM
LumenGRA7Ttes GRA GRA3,5,7
GRA2,4,6,9
Biochimie
- Analyse des formes solubles des protéines GRA par séparation isopycnique
- Détermination des capacités d’association des protéines GRA avec des SUVs
d=1.13
d=1.01
Protéines à analyser
Gradient linéaire de glycérol
Centrifugation jusqu’à l’équilibre(100 000g; 17h)
Analyse des formes solubles des protéines GRA
Chaque protéine sédimente jusqu’à une densité isopycnique spécifique.
Détection des protéines GRA par immunoblot à l’aide d’anticorps spécifiques
Bottom
Top
1 2 3
Séparation isopycnique
Analyse des protéines sécrétées in vitro
GRA1
GRA2
GRA3
GRA6
GRA7
1.011.021.031.041.051.061.071.12 1.101.11Signature des protéines sécrétées in vitro
Analyse des protéines GRA des différentes fractions
GRA1
GRA2
GRA3
GRA6
GRA7
Prot. parasiteProt. sécrétéesProt. cell. infectée
Soluble
Protéines à domainesTransmembranaires:Formes plus agrégéesdans le parasite
?
Signatures des fractions de protéines: références pour les expériences d’association membranaire
Association membranaire
SUVs+
Protéines
Agitation douce1h, 20°C
Séparation isopycnique
Protéines sécrétées in vitro + SUVs HeLa
SUVs
Les protéines GRA s’associent aux membranes HeLa
GRA1
GRA2
GRA3
GRA6
GRA7
Prot. parasiteProt. sécrétéesProt. cell. infectée
Les protéines GRA2,3,6,7, quelles qu soient leurs formes de solubilisation, sont capables de s’associer aux membranes HeLa
L’association de GRA2 et GRA6 aux SUVs dépend de leur composition
Incubation1h, 20°C
Ultracentrifugation différentielle(100 000g, 1h)
P S
SUVs EPC+
Protéines
SUVs HeLa+
Protéines
P S
Partenaires lipidiques de GRA2
-> GRA2 lie les phosphoinositides
Les protéines GRA2 et GRA6 sont capables de s’associer aux SUVs HeLa, mais pas aux SUVs EPC. -> Interactions spécifiques avec certains lipides?
* EPC: phosphatidylcholine d’œuf* HeLa: extrait lipidique total de cellules HeLa
Validation du système-modèle
Les protéines GRA sécrétées contenant des séquences hydrophobes ou amphipathiques sont capables de s’associer spontanément à des membranes.
Associées: GRA2, GRA3, GRA7
SUVs HeLa
GRA6
Solubles: GRA1
Microscopie de fluorescence
Détection des protéines GRA par ImmunoFluorescence indirecte
Electroformation
GUVs HeLa
Lavage
Incubation AC primaire Incubation AC secondaire
Lavage Lavage
Mode opératoire
Incubation protéines1h, t° amb
Association des protéines aux GUVsFormation des GUVs
Marquage des protéines par immunofluorescenceRéalisation d’une chambred’électroformation à flux:
Les protéines GRA s’associent aux GUVs HeLaGRA2 GRA7
GRA3
GRA6
25µm 25µm 25µm
25µm
• GRA2,6,7 se rassemblent en microdomaines protéiques à la surface. • GRA3 est répartie de manière beaucoup plus diffuse, bien que non homogène.
Observation de GUVs groupées
GRA2 et GRA7 sont particulièrement concentrées aux zones de contact entre GUVs -> Rôle dans jonctions membranaires?
GRA2 GRA7
25µm 25µm
GRA3
25µm
GRA6
25µm
Les protéines GRA2 et GRA7 s’associent à des fils membranaires
GRA2 et GRA7 sont associées à des fils membranaires.-> Rôle dans leur formation?
25µm 25µm
Bilan
GUVs HeLa
Membranes des GUVs:GRA3
Zones de contact:GRA2, GRA7
Micro-domaines protéiques: GRA2,GRA6,GRA7
Réseau de fils ponctués:
GRA7
Fils membranaires:GRA2
GRA2 et GRA7 présentent des caractéristiques particulières: elles sont concentrées aux zones de contact entre GUVs
et présentes sur des fils membranaires.
Discussion des résultats
Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Ciblage des protéines GRA aux membranes de la vacuole Rôles des protéines GRA dans la formation des HOSTs et du RNM
Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles?
1.07 1.011.031.05 1.021.041.06
Protéinesultrasolublesparasitaires
Protéinesultrasolubles
sécrétéesin vitro
Protéinesultrasolublesde cellulesinfectées
Densité isopycniqueen gradient de glycérol
GRA2
GRA2
GRA2
GRA3GRA6
GRA7
GRA3GRA6
GRA7
GRA6GRA3
GRA7
GRA1
GRA1
GRA1
Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles?
1.07 1.011.031.05 1.021.041.06
Protéinesultrasolublesparasitaires
Protéinesultrasolubles
sécrétéesin vitro
Protéinesultrasolublesde cellulesinfectées
Densité isopycniqueen gradient de glycérol
GRA2
GRA2
GRA2
GRA3GRA6
GRA7
GRA3GRA6
GRA7
GRA6GRA3
GRA7
GRA1
GRA1
GRA1
Formes plus agrégées
Formes transitoires
Formes plus solubles
GRA2
GRA2
GRA2Identification des protéines partenaires des protéines à domaine transmembranaire(GRA3,6,7)-> Braun et al., 2007
Quels sont les paramètres nécessaires pour l’association des protéines GRA à des membranes ?
Associées: GRA2, GRA3, GRA7
GRA6SUVs HeLa
Paramètre suffisants:(in vitro)
Fractions solublesDe parasiteSécrétéeDe cellule infectée
SUVs HeLa+
Paramètres nécessaires:
Mécanisme de ciblage auxmembranes de la vacuole
Interactions spécifiquesprotéine-lipide ?
De quelle manière les protéines GRA sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs?
Formation du
RNM:
Fusion de petites vésicules
Rôle de GRA2?
Courbure spontanée locale - hél. amphipathique GRA2, - épingle TM GRA6
Stabilisation de la courbure
Formation des
HOSTs:
Poussée des microtubules
de la cellule-hôte
Initiation de la déformation Stabilisation de la courbure
Charpentagepar GRA7
Protéine vacuolaire ?
GRA2 suffit à déformer des SUVs en tubules!
[Travail de Amina Bittame, Stage M2 2007]
SUVs HeLa + GRA2 + GTP
Très récemment au LAPM, GRA2 a pu être purifiée.
Bilan
• Mise en œuvre de méthodes permettant l’analyse des protéines GRA sous forme solubles
• Validation du système-modèle:Les protéines GRA, sous forme soluble, sont capables
de s’associer spontanément à des membranes (SUVs ou GUVs) de composition lipidique adaptée.
• Développement d’une méthode pour le marquage par immunofluorescence sur GUVs:
– Détection des protéines GRA associées aux GUVs.-> Possibilité d’application de techniques de
spectroscopie de fluorescence
Remerciements
• Marie-France Cesbron-Delauw et Antoine Delon qui ont dirigé ma thèse,
• Patricia Bassereau et Jean-François Dubremetz qui m’ont fait l’honneur d’être rapporteurs de ma thèse,
• Annie Viallat qui a accepté de participer au jury de soutenance en tant qu’examinatrice,
• Bertrand Fourcade qui a accepté de présider ce jury,
• Toutes les personnes avec qui j’ai eu l’occasion de travailler et qui m’ont apporté leur aide, au LSP et au LAPM, mais également au Laboratoire de Génétique Moléculaire des Plantes,
• Et particulièrement Corinne Mercier, qui m’a suivie tout au long de mon travail de thèse.
Ouvertures:Etudes in vitro à partir de protéines GRA purifiées
En solution
Etude des cinétiques d’association des protéines GRA
En membrane
Etude des associations protéiques au sein de la membrane
Spectroscopie de fluorescence
Dichroïsme circulaire
BiochimieMode d’association membranaireIdentification des protéines
partenaires
(FCS) (FCS, FRET)
*FCS: Spectroscopie à corrélation de fluorescence
Etude des changements de conformation