INTERACCIONES DE HORMONA JUVENIL-I CON PROTEINAS DEHEMOLINFA DE INSECTOS.*

ANGEL ST,OKA í-2 y GUILLERMO REBOREDO 2

INTRODUCCION

Las hormonas juvenfles de insectos son moléculas únicas en dos aspectos: químicay fisiológicamente. Qui'micamente (Fig.1 ) son las únicas hormonas animáles que posee-nuna función epóxido; fisiológicamente tienen la capacidad para desempeñar un doble pa-pel: 1) Duante el crecimiento y desanollo ejercen una función moduladora. 2) En lashembras adultas son un factor necesario para la nomál síntesis del vitelo en los ovoci-tos. Las actividades relativas de las tres hormonasjuveniles conocidas HJ-I (C.18), HJ-II(C.17) y HJ-III (C.16) poseen diferentes acciones. Dichas acciones han sido medidasempleando tres diferentes tipos de ensayos.

a) Ensayo de acción juvenilizante, b) Ensayo del crecimiento ovárico, c) Ensayode vitelogenina. (Luscher and Lanzrein, 1976).

Los resultados de los ensayos indicaron que Para el ensayo de acción juvenilizanteHJ-I y HJ-Il poseen aproximadamente la misma actividad mientras que HJ-IIl fue 20 ve-ces menos activa. Para el ensayo de crecimiento ovárico HJ-IIl posee alta actividad se-guida con leve diferencia por HJ-Il y la menos activa fue HJ-I que a igual concentracióntuvo 1/3 de la actividad de HJ-III. Similares resultados fueron obtenidos en el .ensayodie vitelogenina en donde HJ-I fue la menos activa, mientras que HJ-Il muestra dta acti-vidad y HJ-IIl fue significativamente más potente que HJ-I y HJ-II.

Resultados obtenidos por otros investigadores (Gilbert and Chino,1974) sugierenque el transporte de lípidos neutros, esteroles y un número de compuestos lipofíncoscomo las hormonas juveniles son transportados por fipoprotei'nas. Varios investigadoreshan comunicado la unión de HJ y HJ análogos a lipoprotei'nas de alto peso molecular endiferentes especies de insectos por ej.: pupas y adultos de HyaJophom gJouerz., H. cecJio-

* Contribución NO 38 CEPAVE.

1 Miembro de la CaLrrera'del lnvestigador Científico del Consejo Nacioml de lnvestigaciones Científi-cas y TécricaLs. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Ciencias Médicas, La Plata, Argentina.

2 Cátedra 'de Fisiología Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Museo de La Plata. CEP.AVE. LaPlata. Argentina.

REV. SOC. ENT. ARGENTINA, Tomo 40 (1-4) :41-47

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A. STTOXA ¥ G. REB0REDO,` Intenacciones de horrnona juuenil-I

HJ-I

HJH,

Fígum 1 : Eshictums de hormonas juveniles.

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SUSTANCIA

PTHJ HJ-1+ A PROBAR ifücu€Acioai sEPAR^Cim ME"c4onF

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44 Reuista de la sociedad Entomológica Argentina 40(14),198±

Medición de la capacidad de unión.

Se midió utilizando la técrica de adsorción de la hormona fibre con una soluciónde carbón: dextrano (0,3 -0,66 °/o) en buffer Tris{lH 15 mN, CNa 0,1 M, azida sódi-ca 0,02 °/o, pH 7,3. El ensayo se describe en la Fig. 2.

El agregado de carbón dextrano se rea]izó al finalizar el período de incubación ( 16horas) a 4°C, en un volumen igual al de incubación (250/il). Luego de 10 mhutos dereposo se centrifugó a 2500 rpm a 4°C. La radiactividad presente en el sobrenadante corresponde a la hormona unida al transportador; la homona libre es absorbida por el car-.bón-dextrano. Los dosajes de proteínas se realizaron por el método de Lowry y col.( 1951). El registro de la radiactividad presente en los sobrenadantes fue realizado en uncontador de centeueo li'quido Beckman LS-3133, utifizando como mezcla centeuantesolución de Bray (Bray,1960).

Aislc[mien±o de lipoproteínas de hemolinfa.

Se rea]izó depositando sobre una solución de NaBr (2,5 ml, J = 1,31 g/ml) 1,6ml de hemolinfa pura, luego se centrifugó a 178.000 g (45000 rpm) durante 24 hs a8°C, en una Ultra-centn'fug'a MSE. Fueron incubadas tres bandas correspondientes a:

1) Lipoproteínas de alta densidad (HDL) J = 1,12 g/ml de color anaranjado.2) Lipoproteínas de muy alta densidad (HDL) J = 1,21 g/ml de color marrón

claro .3) Lipoproteínas de muy alta densidad (VHDL) J = 1,29 g/ml de color amariuo.Luego de aislar las banda§ fueron dializadas contra buffer Tris 15 mM EDTA 1,5

mM, CINa 0,1 M azida sódica 0,02 °/o pH 7,3 duante 24 hs. y posteriomente uti`ü-zadas en diferentes ensayos.

Para la medición de las densidades en todos los casos se utifizó un refractrómetroBausch & Lomb.

RESULTADOS Y DISCUSION

Estudios preüminares sobre el metabolismo de HJ-I-3H en ninfas del quinto esta-dio de T. paJJi.dz.pem!.s indicaron la transformación de la HJ-I al ácido conespondientepor acción de esteras.as presentes en hemolinfa y tejidos. Para poder reafizar estudios so-bre el transporte de HJ-I fue necesario tratar la hemolinfa con paroxon 10-6 M durante10 min. a 4°C. Luego de este tratamiento se comprobó, utiüzando la técnica para mediractividad hidrolítica, que las esterasas estaban inhibidas. La Fig. 2 indica los diferentestipos de ensayo que se realizaron para medir la capacidad de unión. En la primera se-cuencia se describe una incubación de hemoljnfa pura (20/il = 1300+g de proteínas)que contiene el posible transportador de hormona juvenil (PTHJ), con HJ-I-3H(10.000 cpm). La segunda secuencia difiere de la primera en.que se agrega una sustantiaa probcr, por ejemplo HJ-I`o HJ-IH no radiactivas. Estas hormonas no radiactivas pue-den actuar como competidoras de la HJ-I-3H respecto de los sitios de unión del PTHJ.

En la tercera secuencia se observa el efecto al agregar una sustancia que no com-

::t:tip£rol=:itdi:ascá:d=Éórne:ei::t:J:nEeT|tsoodb::::i=i:Síel;:gs:ndteal|aaffÉ5:|d-3ÉeL:¥d:?:;existe competencia por los sitios de unión del PTHJ se visualizará en una curva de des-plazamiento como la de la Fig. 3 para el caso de HJ-I o HJ-III. Se observa en dicha .f_igu-.ra que tiene mayor afinida¢ por la HJ-I dado que con 42 pmoles se conrigue el 50 °/ode desplazamiento, mientras que .con HJ-IIl es necesario 84 pmoles. Si no exSte com-petencia por los sitios de unión la curva de desplazamiento es igual a la de Fig. 3 para elcaso de ácido palmítico ( 16:0) o para el ácido de HJ-I, donde se observa que a elevadasconcentraciones de estos compuestos, el desplazamiento es mínimo. De la Fig. 3 tam-

A. STOKA y Q. RBBOFLBDO, Interacciones de hormona juuenil-I

100 !r-=-£:P-!!±:±L!,=1=,

F````i```¡,¡,=,¿\¡,t\`

`\`i`-------HJH\\

------------------------------------------

+ HJ_I T--=------```

45

p moles

Figura 3 : Curvas de competición entre HJ-I radiactiva y los siguientes compuestos no ra-diactivos: a) HJ-I, b) HJ-III, c) ácido palmítico (16:0) y HJ-I ácido. En las abscisasse representan las concentraciones de los compuestos no radiactivos utilizados.

Figura 4 : Representación de Scatchard que señala la presencia de dos tranportadores dehormona juveril-I en la hemolinfa del 50 estadio ninfál de T.paJ7Ídz.pennz.s.

ff6 Reuista de la sociedad En tomológica Argentina 40{14},198±

`bién se ,`deduce que existen dos especíes moleculaDes con difemnte capacidad de unión.`Una` dc euas es saturable (parte más verticd de la curva) o sea que posee un númeio dis+

j=ieto de -sitios de unión y la otm insaturable con las ooncentraciones utiHzadas {parte;horizontal de la curva).

;Rcalízamdo un gráfico de ScatchaDd (Scatchard, 1949) como el que se observa enLk Fíg. 4 `se comprueba la existencia de ambas especies moleculares. I.a h'nea más hori

:opTm¥e=t:r:ast£tnas:o=t:tá:s£eabaaáao:¥nd:dd:r:::a=goaf-dkaad,-y±pseiüstffiat:ad:ol=c=:~~,

de disociación {Kd). El de mayor intérés es el componente de alta afinidad y baja capaL`cidad `pues es el especi'fico y según la Fíg. 4 posce una constante de disociacíón Kd =0;-5`~5 x 'IÚ7 M. Dicho válor está indicando una fuerte afinidad entre la HJ-I y PTHJ.

Para obtener mayor información sobre la natualeza qu'mica del transportador de{HJLl se separaron proteínas de hemolinfa por ultraG:ntrifugación de acüerio a su den-sidad de liidratación. Ia Fig. 5 indica el proc£dimiento utilizado para scpaB:aLr las lip®•.proteí"E; .ia bamda que posee una densidad de á = i ,io g/mi es Ea que oomsponde a iaímayor j=apacidad de unión. Por lo tanto son fipoproteínas de dta densidad las re§ponsa!blcs d€l `tmnsporte de HJ-I en hemolinfa. La presencia de dos clases de transportadoies,Luno iespecíñco y de bÉa -capacidad y otro inespeciTico y de rita capacidad prescrita una`ritu-ación `simílar a lo que suc€de en vertebrados donde albúmína y varias üpoproteínas•r?pmsgiitan el componente de baja afinidad, baja especificidad y gran capacidad paEra im-tEmctuar con hormonas fipofíücas. A su vez proteínas espeG'ficas poseen alta afinidad,alta _especíñcidad y baja capacidad p.ara asociarse con las hormonas.

:Pese a la divergcncia evolutiva que existe entre vertebrados e Ínsectos, ambos ham\ desarrólhdo un sistema binario de tTanporte paüra hormonas Epofíficas.

Centrifugacl®n & 8±

1

2.hs 17eooog (t5000pm}

tt-tidfa= vHDL 2

VHDL 325ml 8, m$2e=.Fg/fnl

vLDL 1.eoe-1.Oü8/miLDL t.m®-,.®®q'mlHDL 1.O®3 -IJZI./miVHDL 1.2W.2Sg/mt

E=±i`zz, :Ípm:rbrib J±29 3Ími

H§ñFm ,-5 : moceso de firacciommíento de lipoEnroteínas de hemolriñ deB 5® eg±adb dri!ñl :de T. psmfper]rris por uümcentifiigación. VLD¿ : lípopoteíhas de nmqr h3jáídmridad; LDL : Hpppmteíms de bÉ-dmsidad; H"L.: HpqpDteñBas de alta deEri€dad; `VHD¿.- lípopmt€Íhas de muy dta denÉdad.

iA. EEEEEEEÉALw é`E. EFEEEüñEEEEEX®. Hnti5e"riiDmes3±íhe Hmmnrm®§.Íwenil±I -uffi

H2mdl~¿]ezm¢Íb±iHmHmnEjjmzriiks¿Íbzr.ÁZErií¿ffigpgnnísilarneEÉ2sifladLüeip`csgenHostÉÍHEsdbtGEamEp"piHHB¢ffihHiEBaummHriísm(mermiilaGiómm~LélúLEál!h¡piot€.ímffiHFHffiím±cEmmHZHítgEñümritmikB¢ÍÉtÉmsEEs\ftih€mDIífi`fiL,c€ritmffo!kri-rriiüaiim"iHariíridEBihHm-jj"Briil.H3lttEHHPHtEümiimffriíñco:\ytü€égmiii.qpaü{Hafltmm]riffiía2IaffuiriíñndlcüEHHHiEEEtHifisEas`süstmÉÍEEsllipoííüms,¿aüEnÉásid€"JH.

H±l ¡pm"B tffijD ürinüa ila EPHsthíffiEfl cüb iimÉhmtar Lun riétQüo !pm idosaje&HHm-jji»riikB¡HHBffigsd=mEadEHstm¿H£fflHmblriñtort£jidns.EEamüuo`ssm&cesariíD gpEBíriíEimiíft piri± dl €btEmHEfftaHH ffigpHn'Ílim ¢& EHil \-.éfiriimnüo r¿l i:tian§porti-ühnirigHHriffim.HHm5üzHEñlizaüDff±lkTp©íücip]rifiiEarián,`üüm¿LB-stufliamellasicon-{fiíriím"üpóimasEpmHfflÉHLksr\cürijEs{flÉm-nimjjuüriile`s:'pmmi€üimüeá`cLmasiüeúEEHíhzan±miimihíftllaHjg.3..Eris¢EstuüíEEGffin.ügsaDrolíánd®se`flctrilmentemmuEÉÉmllɱ.

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