INSTRUMENTALNE METODE

Spektroskopske metode

Elektroanalitske

metode

Separacijske metode

Ekstrakcija

Kromatografija

(Masna spektrometrija)

Elektroforeza

STACIONARNA FAZA

1. KOLONSKAMOBILNA FAZA

2. PLANARNAVZOREC

1. PLINSKA

2. TEKOČINSKA

3. SUPERKRITIČNA-TEKOČINSKAKROMATOGRAFIJA

KROMATOGRAFIJA

KROMATOGRAFIJAGC

LC

SFC

ADSORPCIJSKA

ADSORPCIJSKA(GSC)

(LSC)

PORAZDELITVENA PORAZDELITVENA

PORAZDELITVENA(GLC)

(LLC)

IONSKO-IZMENJALNA(IEC)

IZKLJUČITVENA(SEC)

MF

SF

SEPARACIJSKE METODE

a) Separacije s transformacijob) Separacije brez transformacije

Značilnost molekul kot osnova separacijskih metodPolarnost

-

Tekočinska kromatografija-

Plinska kromatografijaIonski značaj

-

Ionsko-izmenjevalna kromatografija-

Elektroforeza-

Masna spektrometrijaVelikost (masa)

-

Dializa in ultrafiltracija-

Izključitvena kromatografija-

UltracentrifugacijaOblika

-

Afinitetna

kromatografija-

Imunokemične

metode-

Encimske metode

EKSTRAKCIJA

ELEKTROFOREZA

conska izotahoforeza

izoelektričnoelektroforeza

fokusiranje

DIALIZA

ULTRACENTRIFUGACIJA

conska ultracentrifugacija

IMUNOKEMIČNE METODE

ENCIMSKE METODE

k-1

PEESES kk 21 +⎯→⎯⎯→←+ kkkk

1

21m

+= −

Figure 1: The

two-site assayemploying

two

monoclonalantibodies

directed

againsttwo

distinct

epitopes.

KROMATOGRAFIJA

ZgodovinaTekočinska kromatografija na koloni (Cvet 1903)Papirna in tankoslojna kromatografija (Izmailov, Shraiber 1938)Tekočinska porazdelitvena kromatografija (Martin, Synge 1941)Plinska kromatografija (petdeseta leta)Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (šestdeseta leta)

Klasifikacija kromatografskih

metod1. Plinska kromatografija (GC)

a) plin-trdno (GSC)b) plin-tekočina (GLC)

2. Tekočinska kromatografija (LC)

a) tekoče-trdno (LSC)b) tekoče-tekoče (LLC)c) ionsko izmenjevalna k. (IEC)d) izključitvena k. (SEC)e) afinitetna

k. (AC)3. Superkritično-tekočinska kromatografija (SFC)

Elucija

spojin skozi kolono

Kromatogram

Amob

↔ Astac

K = cS/cM

(konst. v širšem conc. območju → linearna kromatografija)tR

–

RETENCIJSKI ČASpovprečna (linearna) hitrost spojine

u = L / tM

povprečna (linearna) hitrost MF (mobilne faze)

f = moli spojine v MF/celokupno št. molov

RETENCIJSKI FAKTOR: k’

= K·VS / VM

v = u ·

1/(1+k’) → L/tR

= (L/tM) ·

1/(1+k’)k’

= (tR

– tM)/tm

optimalno: 1 <

k’

<

5

tLv R=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛×=

nnfuv

t

m

VVK1

1u

VcVc1

1uVcVc

Vcuv

M

S

MM

SSSSMM

MM

+×=

+×=

+×=

( ) dxe xNdN σμ

πσ2 22

21 −−=

Enačba Gauss-ove

krivulje:

Selektivnostni

faktor:

α

= KB

/KA

;

α

> 1

Uporabimo izraz: k’

= K·VS

/ VM

α

= k’B/k’A oz.

α

= (tR(B)

– tM

)/ (tR(A)

– tM

)

oz.

dzzNdN e 2

21 2−=πσ

H [cm]: dolžina kolone, ki vsebuje frakcijo spojine, ki se nahaja med L-σin L (34 % celokupne spojine); L ±

σ ≈ 68 %

[

sek2]

–

varianca “peak-a”

( 96 %, x ±

2σ

oziroma 2 )

in ker je H = σ2

/ L →

H = LW2

/ 16tR2

in ker je N = L / H →

oziroma N = 5,54 ( tR

/ W1/2 )2

τ2

( )tLv Rσ=σ=τ

τ= 4W τ

t4LW

R

=σ

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

Wt16N R

2

RS

= ( tB

– tA

)/ W (predpostavka WA

= WB

≈

W; oba tR

dovolj blizu)

(ker je )

4N

tttR

B

ABS ×

−=

4N

k1kkR '

B

'A

'B

S ×+−

=

(ker je )

(ker je )

Nt4W R=

tttk

M

MR' −=

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛+

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

α−α

=k1

k14N

R 'B

'B

S

kk

'A

'B=α

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

−αα

=kk1

1R16N 'B

'B

222S

Modificirana van

Deemter-jeva enačba:H = B/u + cS

· u + cm

· u

Resolucija RS

( )WWtt2R

BA

ABS +

−⋅=

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛+

⋅⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

α−α

⋅=k1

k14N

R 'B

'B

S

Diagram tekočinskega kromatografa

Figure 2: Concentration

profilesof

analyte

bands

A and

B at twodifferent

times

in their

migrationdown

the

column.

Figure 3: Definition

of

plateheight

H = δ2

/ L.

Figure 4: Two

component

chromatograms

illustrating

two

methods

ofimproving

separations: (a)boriginal

chromatogram

with

overlapping

peaks, improvements

brought

about

by

(b) an

increase

in band separation, and

(c) a decrease

in band spread.

Figure 5: Determination

of

the

standard deviation

τ

from

a chromatographicpeak: W = 4τ.

Figure 6: Effect

of

mobile-phase

flowrate

on plate

height

for

(a) liqiudchromatography

and

(b) gaschromatography.

Table 1: Variables

That

Affect

Column

Efficiency

*Increases

as temperature increases

and

viscosity

decreases.

Variable Symbol Usual Units

Linear velocity of mobile phase u cm/s

Diffusion coefficient in mobile phase* DM cm2/s

Diffusion coefficient in stationary phase* DS cm2/s

Capacity factor (Equation 24-8) k’ unitless

Diameter of packing particle dp cm

Thickness of liquid coating on stationary phase

df cm

Table 2: Kinetic

Processes

That

Contribute

to Peak

Broadening

u, DM, DS, df, dp, k’

are as defined

in Table 1 f: function

ofkD, q: constantstd: average

desorption

time of

analyte

from

surface; td

= 1/kd, where

kd

is first-order

rate

constantfor

desorptiondc: column

diameterB: coefficients

of

mass

transfer in stationary

and

mobile

phase, respectively†

Stationary

phase

is an

immobilized

immiscible

liquid‡

Stationary

phase

is a solid

surface

at which

adsorption

takes

place

Process Term in Equation 24-19

Relation ship to Column*

and Analyte Properties

Longitudinal diffusion B/u

Mass transfer to and from liquid stationary phase†

CSu

Mass transfer to and from solid stationary phase‡

CSu

Mass transfer in mobile phase

CMu

uDk2

uB MD=

( ) Dk1udqkuC

S2

2f

'

S '+=

( )k1ukt2uC ' 2

'd

S+

=

( )u

Du,d,df

uCM

2c

2p

M =

FIgure

7: Separations

at three

resolutions. Here, RS

= 2ΔZ / (WA

+ WB)