INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA

INFORME TECNICO PARCIAL 2006

MEDICIÓN DEL GRADO DE DENSIDAD ÓSEA EN HUESO DE RATA OVARIECTOMIZADA SOMETIDA A RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA CLAVE CGPI: 20060681

PRESENTAN

M. en C. MARIA DE LOURDES CORTES IBARRA

M. en C. RIGOBERTO GARIBAY SANCHEZ

ING. DANIEL PARADA TAPIA

MÉXICO, D.F. ENERO 2006

Resumen En este trabajo se presenta un modo alternativo de tratamiento para prevenir

la progresión de la osteoporosis. La estimulación electromagnética es un

método no invasivo que a bajas frecuencias ha demostrado resultados

satisfactorios. Se plantea aplicar radiación no ionizante con el objetivo de

frenar la resorción ósea y así evitar las tan temidas fracturas.

El uso de un equipo de radiación electromagnética a bajas frecuencias se

justifica por el hecho de que es posible estimular células específicas, aplicando

la cantidad de radiación adecuada.

La metodología propuesta se aplica en un modelo animal experimental el cual

es de fácil adquisición y manipulación; con el cual se logra tener una muestra

representativa para realizar un análisis estadístico con el que se validaran los

datos obtenidos.

El proceso experimental planteado se desarrolla en tres partes fundamentales:

En primer lugar se efectúa una ovariectomización en un grupo de ratas, a las

cuales se les programan tiempos que permitan desarrollar la perdida de masa

ósea, se forman 2 grupos, un grupo será tratado y el otro continuará con el

proceso de pérdida de masa ósea.

En segundo lugar se programan tiempos de tratamiento con radiación

electromagnética de baja frecuencia a los grupos ya establecidos.

Finalmente se procede a obtener muestras de los grupos de ratas para realizar

pruebas en el material óseo y realizar una comparación entre todos los ellos.

Introducción Para explicar el efecto del electromagnetismo sobre el crecimiento y reparación

del hueso y el cartílago, hay que revisar primeramente tres conceptos físicos,

como la ley de Wolff, el efecto piezoeléctrico y el concepto de potenciales de

corriente.

La ley de Wolff de la reorganización afirma que el equilibrio entre la formación

y resorción ósea está controlada principalmente por la tensión mecánica.

Cuando se comprime un hueso largo, provocamos formación ósea en la

superficie perióstica del lado comprimido, mientras que en el lado donde se

aplicó tensión se observa resorción ósea. No es una coincidencia que exista

una carga negativa en el lado comprimido, donde se produce formación ósea

Figura 1 . De hecho, la aplicación externa de una corriente semejante también

produce crecimiento óseo [27]. La ley de Wolff ha sido explicada por la

transducción eléctrica de una deformación mecánica, la cual promueve la

diferenciación ósea.

En el tejido conectivo denso, el potencial eléctrico generado por el esfuerzo

mecánico es debido a el efecto piezoeléctrico, descrito por primera vez en

1957, que establece que si uno deforma una estructura cristalina (como el

hueso), los electrones migran hacia el lado comprimido, creando un potencial

negativo que rápidamente desaparece si la compresión se mantiene.

Conforme se libera la compresión, sin embargo, aparece un polo positivo

similar y opuesto conforme los electrones rebotan y vuelven a su lugar. La

hidroxiapatita y el colágeno son piezoeléctricos por naturaleza y su

deformación crea un potencial eléctrico.

Figura 1 A) Una fuerza compresiva sobre el fémur. B) Existe un efecto piezoeléctrico tras la

compresión. C) La ley de Wolff es la transducción de un esfuerzo mecánico al crecimiento y

remodelamiento óseo dirigido por la electricidad.

La ley de Wolff y los beneficios del ejercicio en carga para preservar la

densidad ósea se aplican también al cartílago. Los efectos beneficiosos del

ejercicio en carga in vitro con tasas de carga cíclica de unos pocos hertzios

sobre la síntesis de proteoglicanos han sido confirmados, tanto en cultivos

orgánicos [9], como en modelos animales [7].

Además de los potenciales eléctricos generados por estructuras cristalinas en

el hueso, se desarrolla otro “potencial de corriente” en otros tejidos conectivos

densos, especialmente en el cartílago cuando el desplazamiento de los iones

móviles dentro de la corriente líquida pasa a través de las cargas negativas de

la matriz de proteoglicanos sulfatados en respuesta a la compresión o la

deformación mecánica Figura 2. Con cada ciclo compresivo se genera una

corriente eléctrica por el potencial de corriente que puede suponer una señal

importante para el condrocito.

Figura 2 Potenciales de corriente. La compresión dinámica del cartílago genera cargas positivas

en la fase líquida para pasar la matriz de proteoglicanos sulfatados cargados negativamente. Ello

genera un voltaje que constituye un estímulo para el condrocito.

También se acepta en las leyes físicas que los campos eléctricos exógenos

pueden inducir corrientes a través de las soluciones iónicas que afectan el

comportamiento celular. Hay que recordar que un campo electromagnético

pulsado (CEMP) externo de frecuencia variable induce una corriente eléctrica a

la que las células responden. Los condrocitos parecen tener una respuesta

óptima a frecuencias bajas de menos de 15 Hz [15], que han demostrado en

varios estudios al aumentar la producción de glucosaminoglicanos. De hecho,

el estímulo de la condrogenésis es una de las formas en las que los CEMP

influencian los estadios precoces de la reparación ósea, lo cual puede tener

importantes implicaciones en el tratamiento de la artrosis.

Métodos y materiales.

Las investigaciones para aplicar campos magnéticos en la consolidación ósea,

comenzaron en 1970[29], con el objetivo de conocer, si campos

electromagnéticos inducen corrientes en hueso. Para este fin, se construyeron

bobinas, que permitían inducir corrientes al hueso, desde el exterior Figura 3.

Después de múltiples aplicaciones en animales, se tiene confianza al usarlo en

humanos. Es un método que ofrece grandes beneficios y pocos riesgos:

1. Es un método no invasivo

2. Puede ser usado en pacientes que tengan algún tipo de implante, o

alguna aleación de cromo-cobalto. Debido a la permeabilidad de estos

materiales al magnetismo, no se modifica el campo.

3. Se puede usar en pacientes con dificultad para la consolidación, en

forma natural (Por ejemplo speudoartrosis).

4. No es critica la colocación del campo en el sitio exacto del trazo de la

fractura.

5. Son pocos los pacientes a los que no se les recomienda la aplicación,

de este método, entre ellos, personas con marca pasos.

Basset [22]fue uno de los pioneros al estudiar los efectos de aplicar campos

magnéticos, que cruzan osteotomías de peroné en perros. Para este fin utilizó

bobinas, con núcleo de aire. Formó dos grupos, a unos les aplicó campos, con

1Hz, y una duración de 1.5 ms, y al segundo 0.15 Hz, una duración de 0.15

ms. De este experimento se tuvieron las siguientes observaciones:

1.- Al aplicar esta segunda frecuencia, se notó una mayor resistencia a

la flexión, con respecto al grupo control.

2.- Poca formación de la masa del callo, en el peroné estimulado,

comparado con el grupo control.

Tales observaciones parecen ser contradictorias, con respecto a lo que sucede

al estimular el hueso eléctricamente. Pero esto sugiere que la acción se lleva a

cabo por diferentes mecanismos. Mientras la actividad osteoblástica, puede ser

estimulada cerca de los electrodos, sin embargo la aplicación de campos

magnéticos, que varían en el tiempo, o sus corrientes inducidas, resulta en una

organización de los tejidos, en lugar de una respuesta estimulatoría.

Los niveles de corriente aplicados a las bobinas de tratamiento, fueron tales

que el pico del campo magnético, en el sitio de la no unión, fue de únicamente

unos cuantos Gauss, y el tiempo de tratamiento va de 10 a 16 horas diarias. El

diámetro de las bobinas y su colocación es de alguna manera crítico, por lo que

se construye un par de bobinas de Helmholtz, las cuales actuarán como si

fuese una sola bobina. Después de esto resultó menos problemático la

colocación del sitio de la fractura.

Figura 3 Campo magnético aplicado, y campo eléctrico inducido[22].

Basset y su grupo de investigadores [22], encuentran que el campo inducido,

en la fractura es aproximadamente de 1.2 a 1.6 V/cm.

No hay efectos adversos reportados, al aplicar campos magnéticos, por lo que

el Centro de Aceleración Lineal de Stanford, estableció como limite para

periodos prolongados 2000 Gauss.

Los mecanismos por los cuales suceden cambios favorables, en el proceso de

la consolidación de la fractura ósea, no son totalmente conocidos, y

actualmente son tema de investigación desde varios puntos de vista. Se sabe

que los campos magnéticos:

1.- Estimulan la síntesis de ADN. Lo que se ha demostrado de estudios en

fibroblástos humanos.

2.- Se altera el metabolismo de cAMP, a través de la activación de

adenilata ciclasa, y fosfodiestrasa, lo cual soporta la hipótesis de que los

niveles de calcio en la célula, son influenciados.

Actualmente ya se dispone de equipos comerciales, así se tienen algunas

marcas:

- BiOsteogen

- 3M Canada GEN-III

- EBI Medical Systems

Actualmente se han estudiado diversos casos donde se ha aplicado

estimulación electromagnética y en donde se han hecho mediciones con

resultados satisfactorios, pero poco significativos, esto quizás debido a las

técnicas con las que se hace la medición para verificar la disminución de la

resorción ósea.

Selección de los parámetros

Parámetros del equipo electrónico

DATOS BOBINAS: N = 196 l = 10 cm d = 16.5 cm B = 1.5 mgauss L = ? Φ =? A =213.8 cm

N = Número de vueltas l = Longitud d = Diámetro B = Densidad de flujo L = Inductancia Φ = Flujo magnético A = Área

Detalle del armado y montaje de las bobinas de Helmholtz

DATOS TÉCNICOS DEL CIRCUITO

1) Pulsos únicos 0.38 ms y frecuencia 72 A 1.5 mgauss

Parámetros de estimulación

Se ha decidido utilizar los siguientes datos con propósito de diseño de acuerdo

a los datos bibliográficos más relevantes ; se tiene entonces: proporcionar 380

µs y un campo magnético de 1.5mgauss

Parámetros del modelo animal

Se ha elegido trabajar con rata tipo wistar, la cual es de fácil adquisición y

manipulación, lo cual es esencial para el desarrollo del proyecto.

Bioterio

Cuando se trabaja con un modelo vivo, es necesario considerar las normas

existentes para el mejor manejo y disposición de animales experimentales.

Se trabaja con la norma NOM-ZOO-1999.

Se muestra a continuación el proceso de ovariectomización:

Resultados preliminares

A la fecha se tienen 4 ratas hembra de cepa wistar con peso aproximado de

300g +/-20g, a las cuales se les provoco osteoporosis y posteriormente se

radiaron con elequipo que se construyó durante un mes 4h diarias. A la fecha

se están analizando losresultados, los cuales se anexaran en breve.

Análisis fotoacústico

Para las pruebas se utilizará un laser (modelo Compass 415M, coherente), con

longitud de onda de 532 nm, el cual es usado como fuente de excitación. El

haz de excitación puede ser modulado de 5 Hz a 5 kHz por un modulador

acústico-óptico (ISOMET, modelo 232-A). Para tener ambos PACs iluminados

simultáneamente se uso una haz dividido (60/40), la radiación entrante se

dividió en dos rayos separados y cada uno de ellos se enfoco en las celdas PA.

Las señales de salida(amplitud y fase) por un micrófono electret (baja

temperatura) y posteriormente se amplifica (opamTL084); Las señales

amplificadas son enviadas a un amplificador lock-in SR830 por una interfase

GPIB. Una piel seca fue usada para cubrir el sistema fotoacústico diferencial

para evitar fluctuaciones de temperatura que incrementan la relación señal a

ruido.

Para estudiar algunos procesos con dependencia de la temperatura, el sistema

permite cambiar la temperatura del DPC usando un Watlow-96, 1/16 DIN

controlador de temperatura con dos termopares tipo-T (G302986, Watlow)

localizados en el centro del DPC: Los datos son recolectados usando un

multimetro Keithley 200 con interfase GPIB-USB conectado directamente a la

PC. Para temperaturas arriba de 60 ºC es necesario usar un micrófono ACO

pacific 7016 con preamplificador 4016 con respuesta de temperatura de -30º a

140ºC y aire seco dentro de las celdas fotoacusticas.

Pruebas preliminares del hueso diseccionado.

Impacto

En el presente trabajo se ha descrito básicamente el desarrollo de la

metodología para llevar a cabo la radiación electromagnética de baja

frecuencia en hueso con descalcificación que tiene riesgo de fracturas. Se

realiza un trabajo multidisciplinario que requiere de los conocimientos del área

médica y del área de ingeniería, lo que hace que se encuentren variables que

no estaban contempladas en la programación inicial.

Se realizó la investigación bibliográfica, donde se encontró que la técnica

utilizada se ha aplicado con una gama muy diferente de parámetros entre

ellos, y en ningún trabajo se han reportado resultados satisfactorios a la fecha,

de hecho la metodología utilizada por ellos es con un enfoque de medición de

diferentes células, es decir, métodos histomorfométricos.

La originalidad de este trabajo estriba en llevar a cabo técnicas no utilizadas a

la fecha como lo son la medición de esfuerzos y la medición para cuantificación

de calcio de espectroscopia fotoacústica.

Los resultados que se tienen a la fecha son pocos, pero nos dan pauta para

pensar que esta dando resultado la técnica utilizada. Con ellos se ha obtenido

experiencia para trabajar con un modelo animal y contemplar las variables que

esto implica como es la alimentación, conocer la fisiología y anatomía de las

mismas.

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