APUNTES DEL SEMESTRE - 2º de MEDICINA

Inmunología médica

Cristóbal Muñoz Pérez

UNIVERSITAT de BARCELONA

TEMARIO

CAMPUS de BELLVITGE

1. La respuesta inmunitaria (1) 10. Expresión y regulación del MHC (59)

2. Células del sistema inmunitario (7) 11. Procesamiento/presentación del Ag. (62)

3. Receptores/actv. inmunidad innata (18) 12. Linfocito T: receptor y ontogenia (66)

4. Antígenos de la inm. adaptativa (25) 13. Moléculas de adhesión (72)

5. Inmunoglobulinas (I) (30) 14. Activación de los linfocitos T (75)

6. Inmunoglobulina (II) (38) 15. Activación de los linfocitos B (80)

7. Inmunoglobulinas (III) (46) 16. Citocinas (86)

8. Ontogenia de los linfocitos B (49) 17. Citotoxicidad (96)

9. C. mayor de histocompatibilidad (54) 18. Sistema del complemento (100)

INMUNOLOGÍA MÉDICA

1. LA RESPUESTA INMUNITARIA

Introducción

La inmunología es la ciencia que estudia la inmunidad o, lo que es lo mismo: la capacidad de responder a sustancias extrañas, incluyendo microorganismos y moléculas no infecciosas, además de las reacciones fisiológicas y patológicas que se generan. A diferencia de otros siste-mas, el sistema inmunitario no queda adscrito a una estructura concreta, si no que está for-mado por el conjunto de moléculas, células, tejidos y órganos que proporcionan inmunidad. El sistema inmunológico se caracteriza por su elevada especificidad (ya que puede dis-cernir entre lo propio y lo ajeno), una gran capacidad de respuesta (neutraliza y/o elimina un número ilimitado de elementos extraños), y su memoria1.

Perspectiva histórica

La inmunología es una ciencia con bastante historia. Nace a partir de la observación de cier-tos individuos que, al padecer unas determinadas infecciones, ya no las volvían a sufrir más (quedaban inmunizados). El término inmunidad viene del latín inmunis, que era un privilegio que tenían los senadores gracias al cual quedaban exentos de obligaciones civiles y proce-samientos legales. En 1796 Edward Jenner efectuó la primera vacunación a partir de pústulas de vaca infectada con viruela (viruela vacuna). Gracias a que esta clase de viruela es mucho menos virulenta que la humana, el individuo al que se le inoculaba el preparado quedaba inmuni-zado. No sería hasta un siglo más adelante (1885) cuando Louis Pasteur crea la primera va-

cuna (vaccina; vacca = vaca) a partir de la forma atenuada de un patógeno. Actualmente, la va-cunación es uno de los tratamientos más efectivos que hay, con un coste muy bajo. A finales del siglo XIX, von Behring descubre que el suero2 confiere inmunidad, y más concretamente las gamma-globulinas (de ahí el término inmunoglobulina). Con estos resultados se habla de una inmunidad humoral (humor = fluido corporal). Paralelamente, Metchnikoff descubre que las células de la línea blanca (macrófagos y neutrófilos) proporcionan también inmunidad. La transferencia de inmunidad a la tuberculosis a través de células de la línea blanca en 1940 hace que se acuñe un nuevo término: la inmunidad celular. En un inicio se consideró que la inmunidad humoral y la celular no podían coexistir. No fue hasta 1950 que se asumió que las dos estaban interrelacionadas: los linfocitos T son los responsables de la in-munidad celular y los linfocitos B de la humoral. Finalmente, se empezó hablar sobre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa o adquirida. Ambas actúan ante un antígeno y emplean sistemas humorales y celulares.

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1 La memoria es una característica única de los sistemas inmunitarios más avanzados (mamíferos).

2 Parte de la sangre que permanece líquida tras haberse producido la coagulación.

Inmunidad innata y adaptativa

Antes de describir qué es cada una, veamos qué componentes forman cada una de las dos inmunidades (tanto celulares como humorales):

En referencia a la especificidad de estas dos clases de inmunidad, la inmunidad innata se ca-racteriza porque se reconocen moléculas o patrones comunes de los patógenos o de células dañadas (p. ej., RNA en los virus o lipopolisacáridos en las bacterias Gram negativas). Por el otro lado, la inmunidad adaptativa es mucho más específica: hay una reacción específica para antígenos concretos (sean de patógenos o no). Si nos fijamos en la diversidad (capacidad para reconocer toda una serie de agentes), la inmunidad innata presenta una diversidad limitada (presente en la línea germinal), mientras que en la inmunidad adaptativa la diversidad es muy elevada por el mecanismo de recombi-

nación somática. Finalmente, comentar que la memoria es una característica de algunos sistemas inmu-nológicos. Únicamente la inmunidad adaptativa tiene memoria.

Inmunidad innata

La inmunidad innata (también llamada natural o espontánea) aporta la primera línea de defen-

sa frente a los elementos extraños. Es preexistente, bastante rápida, tiene una diversidad li-mitada, reconoce patrones comunes y no tiene memoria. A pesar de que a primera vista po-damos pensar que la inmunidad innata es más sencilla que la adaptativa por su menor espe-cificidad, es más grave una deficiencia en la inmunidad innata que en la adaptativa. Existen varios elementos que conforman la inmunidad innata (cuadro inferior).

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Componentes Inmunidad innata Inmunidad adaptativaCelulares Macrófagos, neutrófilos, NK, céls. dendríticas, ... Linfocitos T y BHumorales Sistema del complemento, citocinas, moléculas microbicidas, ... Anticuerpos, citocinas

Componentes de la inmunidad innataComponentes de la inmunidad innataBarreras anatómicasBarreras anatómicasPiel La piel es una barrera mecánica que impide el paso de microorganismos hacia el

interior del organismo (siempre que no esté dañada y con algunas excepciones). Tie-ne un pH ácido (3-5) y unas glándulas asociadas (p. ej., sebáceas) que la protegen con sus secreciones. La propia descamación de la piel (y su continua renovación) es también un mecanismo de defensa.

Mucosas En las mucosas podemos encontrar una flora endógena que impida la proliferación de bacterias patógenas (p. ej., intestino grueso). Destacar el papel del moco y de los cilios.

Barreras fisiológicasBarreras fisiológicasTemperatura FiebrepH bajo AcidezMediadores Lisozima, interferones, sistema del complemento, defensinas...CélulasCélulasMacrófagos, neutrófilos Se encargan de fagocitar microorganismos.Otras Céls. dendríticas, céls. NK, mastocitos, basófilos, eosinófilos (importantes para lu-

char contra los parásitos).

Si el patógeno atraviesa esta primera línea de defensa, debe entrar en juego la inmunidad adap-

tativa (que está muy bien relacionada con la innata). En clase se destacó el papel de las céls. dendríticas en la interrelación entre las dos clases de inmunidades, y también se habló de un subtipo de éstas, los plasmocitoides, que son importantes en el enfrentamiento con virus. Las céls. de la inmunidad innata se caracterizan por tener numerosos inputs (tienen varias clases de receptores) y puede provocar toda una serie de respuestas. Entre los recepto-res que tienen en su membrana encontramos los receptores de citocinas y quimiocinas3 (impor-tantes para la comunicación intercelular), los receptores para la Fc4 de las Ig (relación entre las dos inmunidades), los receptores para el sistema del complemento, y los receptores de recono-

cimiento de patrones (y aquí hay diferentes subfamilias).

Inflamación. Una infección generalmente es acompañada por una inflamación. Supongamos que un

astilla atraviesa nuestra piel (se rompe la barrera anatómica) y entran algunas bacterias a través de la pe-queña fisura. El daño tisular es detectado, por lo que habrá una vasodilatación y aumentará la permeabi-lidad capilar. Las bacterias serán captadas por las células del epitelio, los macrófagos y las células den-

dríticas y producirán la extravasación de monocitos (que es transformarán en macrófagos), y neutrófilos, así como pasará un exudado desde la sangre hasta el tejido. El exudado está formado por el sistema del

complemento, anticuerpos y proteína C reactiva.

Inmunidad adaptativa

La inmunidad adaptativa, como ya hemos dicho antes, se caracteriza principalmente por su elevada especificidad antigénica (gracias a su gran diversidad). Además, dispone de memoria. La inmunidad adaptativa ejerce su función de reconocimiento y eliminación selectiva de mi-croorganismo y moléculas extrañas gracias a un sistema celular y otro humoral. El linfocito B (LB) es el responsable de la inmunidad adaptativa humoral, ya que forma anticuerpos. El receptor del linfocito B es el BCR (Eng: B-cell receptor), y es específico para un antígeno. Por el otro lado, el linfocito T (LT) es el responsable de la inmunidad adaptativa ce-lular (forma citocinas), y su receptor es el TCR (Eng: T-cell receptor). Tanto el TCR como el BCR tienen una parte constante y otra variable. Los LB y los LT reconocen el antígeno de forma distinta:

(a) Linfocito B. El BCR se une directamente al antígeno. Por interacción directa entre el BCR y el antígeno, el LB se activa y empieza la producción de Ig.

(b) Linfocito T. Existen dos poblaciones de linfocitos T, los helpers (TH) y los citotóxicos (TC). Los primeros se caracterizan por tener la proteína CD4 en su membrana, y los segundos por tener la CD8. Los TCD4+ reconocen el antígeno cuando está unido al

MHC II, mientras que los TCD8+ lo reconocen cuando está unido al MHC I. → Los TH produce citocinas que activan a otras céls. para así eliminar a los mi-croorganismos. Se les podría considerar como los directores y reguladores de la respuesta inmunitaria. Los TH activan a los LB, las CPA y los TC.

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3 Las quimiocinas atraen a diferentes tipos celulares al lugar donde se produce la infección.

4 Fc: fracción constante.

Interacción entre MHC y antígeno

El proceso por el cual se produce el complejo MHC-Ag depende de la clase del complejo

principal de histocompatibilidad (MHC; Eng: major histocompatibility complex). - MHC de clase I-Ag. Como sabemos, las proteínas intracelulares se van degradando en

una estructura denominada proteosoma, transformándolas en péptidos. Estos péptidos interaccionan con el MHC de clase I en el interior del retículo endoplasmático rugo-so. A continuación se formarán unas vesículas que irán a parar a la membrana y así la célula puede exponer un MHC de clase I con un péptido que, normalmente, será de

una proteína propia. Aquí lo interesante viene cuando un virus infecta a una célula y empieza a producir proteínas (p. ej., combina su material genético con el nuclear): esa célula expondrá MHC de clase I con péptidos de proteínas extrañas.

- MHC de clase II-Ag. Las células presentadoras de antígeno (CPA; macrófagos, céls. den-dríticas) son las únicas que disponen de MHC de clase II. Cuando una CPA fagocita un elemento extraño, éste se encuentra en un endosoma y será degradado por la ac-ción de los lisosomas. Los productos de la digestión del elemento extraño serán ex-puestos en la membrana de la CPA por medio del MHC de clase II. El MHC de clase I se encuentra en casi todas las células mientras que el MHC II únicamente en algunas.

Ejemplo. Supongamos que una CPA ha sido infectada mientras va fagocitando elementos extraños. Muestra un antígeno a través del MHC II y otro a través del MHC I. El reconocimiento de antígenos por parte de los LT y de

los LH se puede dar simultáneamente. La activación del TC, no obstante, depende del TH (que también activará al LB).

Etapas de la respuesta inmunitaria adaptativa

La respuesta inmunitaria adaptativa se divide en cinco grandes etapas sucesivas, siendo la primera el reconocimiento del antígeno y la última el mantenimiento de algunos linfocitos es-pecíficos para ese antígeno a modo de memoria.

(1) Reconocimiento de antígenos. Ya sea directa o indirectamente, los linfocitos recono-cen los antígenos.

(2) Activación de los linfocitos. Aquellos linfocitos que reconozcan específicamente al an-tígeno en cuestión, irán proliferando de manera exponencial (expansión/selección

clonal).(3) Fase efectora. Se destruyen los antígenos por medio de una respuesta humoral y ce-

lular. (4) Homeostasis (contracción). El exceso de linfocitos que se han formado entra en

apoptosis (volvemos a los valores originales).(5) Memoria. Algunos de los linfocitos (B, TH, TC) cambian algunas de sus características

internas para convertirse en linfocitos de memoria, los cuales sobreviven de meses a años. Gracias a la memoria, la exposición de nuevo al mismo antígeno hace que la respuesta inmunitaria sea más rápida y fulminante (respuesta secundaria).

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Antígeno exógeno → MHC II Antígeno endógeno → MHC I

Entendemos por respuesta primaria ésta que acabamos de explicar, es la primera vez que el organismo se enfrenta a un determinado antígeno. La respuesta secundaria es aquella que se da gracias a la memoria y ocurre cuando el organismo se vuelve a enfrentar a un antígeno con el que ya se ha encontrado previamente. La respuesta secundaria es muchísimo más rá-pida y efectiva (tanto a nivel humoral como celular).

Podemos enfrentarnos simultáneamente a varios antígenos gracias a la existencia de clones

de linfocitos con diferentes especificidades. Tenemos un repertorio de linfocitos de entre 109 a 1011 (o lo que es lo mismo, esa misma cantidad de especificidades antigénicas). Este repertorio o diversidad de linfocitos se realiza gracias a la recombinación somática de los genes TCR y BCR (reordenamiento al azar de fragmentos génicos).

Postulados de la teoría de la selección clonal

Como ya se ha dejado entrever antes, la selección clonal es la activación de los linfocitos con

especificidad para el antígeno. Además, nos permite generar memoria. Existen cuatro postula-dos que explican la selección clonal.

- Cada linfocito tiene una sóla clase de receptor con especificidad única.- La interacción entre una molécula de antígeno extraña y el receptor específico provo-

ca la activación del linfocito.- Las céls. efectoras diferenciadas derivadas del linfocito activado tienen receptores con

una especificidad idéntica a la cél. parental.- Los linfocitos que tienen receptores específicos para moléculas propias son elimina-

dos a lo largo del desarrollo y por ende no forman parte del repetorio de linfocitos.

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Etapas de la respuesta inmunitaria adaptativa.

Inmunidad activa y pasiva

Hemos estado hablando de inmunidad celulas y humoral, de innata o adquirida... A conti-nuación introducimos una nueva clasificación: activa o pasiva. La inmunidad activa es aquel-la que se da cuando un individuo se enfrenta a un patógeno, lo reconoce, genera linfocitos y después se recupera y tiene una memoria. La inmunidad pasiva es aquella en que al indivi-duo infectado le damos suero con anticuerpos específicos5 que hacen que la persona se recu-pere y quede inmunizada durante un cierto tiempo (no se genera memoria).

Alteración del sistema inmunitario

El sistema inmunitario no siempre funciona correctamente, hay situaciones en las que no es lo suficientemente efectivo o que ataca a un elemento que es inocuo y nos genera un proce-so que conocemos como reacción alérgica. Veamos algunas de las situaciones:

- Antígeno infeccioso. Ante un antígeno infeccioso, el sistema inmunológico debe prote-gernos y atacarlo. Una respuesta alterada sería aquella en la que la destrucción del antígeno no es completa y por tanto se dan episodios recurrentes de infección.

- Tumor. En condiciones normales podemos eliminar las céls. tumorales (inmunidad anti-

tumoral). Cuando el sistema inmulógico fracasa es cuando aparece el cáncer.- Sustancia inocua. El sistema inmunitario no debe actuar ante sustancias inocuas. Si lo

hace entonces nos encontramos con una alergia.- Órgano propio. Ante los órganos propios, el sistema inmunitario no hace absolutamen-

te nada (los tolera). La respuesta alterada sería la autoinmunidad.- Órgano transplantado. Como un órgano transplantado es ajeno, lo normal es que se de

un rechazo. La respuesta alterada del sistema inmunitario (y que nosotros producimos y preferimos) es la aceptación.

Resumen final

Por tanto, por sistema inmunitario entendemos un sistema de defensa versátil y complejo for-mado por una red dinámica de moléculas, células y tejidos. Para cumplir su función, consta de una inmunidad innata (preexistente y rápida) y otra adaptativa (lenta y más específica). La res-

puesta inmunitaria discierne entre aquello ajeno de lo propio, dispone de una diversidad6 ce-lular que le permite responder específicamente a un antígeno (p. ej., LT y LB que aumentan su número por selección clonal) y finalmente da una respuesta efectora y de memoria.

Datos. En los animales vertebrados se ha demostrado que tienen una inmunidad innata y otra adaptativa. En los invertebrados se conoce la innata pero se sabe que no tienen adaptativa (no se han encontrado LT

o LB ni anticuerpos).

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5 Suero de alguien que haya pasado ya la enfermedad.

6 Es difícil que dos personas tengan el mismo repertorio de linfocitos (principalmente porque sus receptores se generan por recombinación al azar de fragmentos génicos).

2. CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO

Hematopoyesis

Todas las células del sistema inmunitario se originan a partir de una célula madre hematopoyé-

tica o HSC (Eng: hematopoietic stem cell). La HSC da lugar al progenitor mieloide y al progeni-

tor linfoide. Las HSC se caracterizan por dos rasgos principales:(a) Capacidad de autorrenovación. Existen unas pocas céls. madre hematopoyéticas en la

médula ósea, aproximadamente 5·104. Además, son células con una gran capacidad proliferativa.

(b) Pluripotencia. Las HSC dan lugar a todas las céls. sanguíneas y del sist. inmunitario. Presenta una elevada capacidad de diferenciación. Las dos células que proceden di-rectamente de la HSC (los progenitores mieloides y linfoides) pierden la capacidad de autorrenovación y además, al estar determinadas hacia la formación de unos ti-pos celulares concretos, pierden (parte de) la capacidad de diferenciación (commit-ment).

El progenitor linfoide da lugar a los linfocitos B y T (inm. adaptativa), a las céls. dendríticas lin-

foides (inm. innata) y a las células NK (inm. innata). Por el otro lado, el progenitor mieloide da lugar a muchos tipos celulares: céls. dendríticas, monocitos (y éstos a macrófagos), neutrófi-los, eosinófilos, basófilos, eritrocitos y plaquetas. Es decir, que el progenitor mieloide da lu-gar a todas las céls. de la línea blanca. Existen toda una serie de factores que regulan la proliferación y diferenciación de las HSC y de los precursores. A menudo se habla de un microambiente en la médula ósea (HIM; Eng: hematopoietic inducing microenvirontment) formado por factores de crecimiento, citoci-

nas7 y células estromales (adipocitos, fibroblastos, céls. endoteliales, macrófagos, LT). Hay to-da una serie de factores de transcripción (TF) esenciales para el desarrollo de los diferentes li-najes hematopoyéticos. Es interesante conocerlos para comprender algunas patologías o ma-nipularlos desde el punto de vista terapéutico.

Homeostasis hematopoyética

Por homeostasis hematopoyética (o stady-state) entendemos el conjunto de mecanismos que logran que la producción de nuevas células iguale a la pérdida. Esto es complicado porque cada célula tiene tiempos vitales distintos (p. ej., eritrocito = 120 días; neutrófilos = pocos-días; LT de memoria = 20-30 años). Para lograr este equilibrio deben haber una serie de me-canismos que regulen la proliferación, la diferenciación y la muerte de las céls. hematopoyéti-cas:

- Tipos y niveles de citocinas producidas por las céls. estromales.- Producción de citocinas por macrófagos y LT (inflamación).- Regulación de la expresión de receptores para citocinas y TF.- Eliminación celular (apoptosis) de las céls. diferenciadas y progenitores.

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7 Por ejemplo, cuando se da una inflamación aumenta el número de neutrófilos (se incrementa su formación).

La apoptosis es un mecanismo clave para regular la homeostasis hematopoyética. Como ya sabemos, la muerte celular programada no produce una inflamación ya que los cuerpos apoptó-ticos son fagocitados por los macrófagos sin que su contenido se exponga (todo lo contrario que con la necrosis). Los genes reguladores de la apoptosis (p. ej., bcl-2, bax, fas8) serán impor-tantes para que ésta se produzca y para entender aquellas enfermedades en que se produce una acumulación celular por falta de apoptosis (cáncer).

Células dendríticas

Las células dendríticas reciben este nombre porque tienen unas prolongaciones membrana-rias largas que recuerdan a las dendritas de las neuronas. Encontramos tres grandes familias de células dendríticas: (a) dendrítica plasmacitoide, (b) dendrítica convencional y (c) dendrítica

linfoide. Las dos primeras provienen del progenitor mieloide mientras que la última procede del linfoide. La familia de las céls. dendríticas linfoides está formada por un único miembro: la cél. dendrítica folicular. En cambio, la familia de las céls. dendríticas convencionales consta de tres componentes: cél. de Langerhans + cél. intersticial + cél. mieloide9. Las células dendríti-cas se caracterizan principalmente porque se consideran células presentadoras de antígeno (CPA); es decir, que pueden incorporar un antígeno y mostrarlo.

Célula dendrítica mieloides

Como acabamos de decir, forma parte de la familia de las céls. dendríticas convencionales (por tanto, proviene del progenitor mieloide). Está presente en epitelios, tejido conectivo y lin-

foide. Puede capturar antígenos y madurará y migrará hacia los ganglios. Presenta niveles elevados (sobre todo cuando han madurado) de MHC I, MHC II (presentación de antígeno a los LT), y de CD80 y CD86 (coestimuladores de los LT). Expresan receptores de la inmunidad innata (PRR). En cuanto a sus funciones, presentan el antígeno a los LT y activa a los LT vírgenes (naive), que son aquellos que nunca han entrado en contacto con un antígeno y que están tanto en los órganos linfoides primarios (médula ósea y timo) así como en los ganglios linfá-ticos. Como estas células pueden migrar hacia los ganglios, serán esenciales para la interac-ción entre la inmunidad innata y la adaptativa. Son las CPA por antonomasia10.

Célula dendrítica plasmacitoide

Las características que se han comentado antes son rasgos comunes de todas las céls. dendrí-ticas convencionales. Las plasmacitoides se caracterizan porque intervienen en la respuesta

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8 Fas es el encargado de inducir la apoptosis por parte de los LT.

9 La cél. mioide procede de un monocito (que viene del progenitor mieloide) y éste puede dar lugar a un ma-crófago o a la susodicha cél. mieloide.

10 Los macrófagos también son CPA pero no pueden migrar hacia los ganglios linfáticos, por lo que no pueden activar a los linfocitos naive (a los otros sí).

inicial a virus. Expresan una gran canidad de receptores de inmunidad innata (PRR) para áci-

dos nucleicos de virus intracelulares (RNA). Atención, los RNAs víricos presentan rasgos que los diferencian de los RNA endógenos. Las céls. dendríticas plasmacitoides también produ-cen una gran cantidad de interferón de tipo I (IFNα/β), que es una citocina antiviral (la célula la secreta para avisar a las céls. cercanas que ha sido infectada por un virus y así se promue-va la expresión de genes antivirales).

Célula dendrítica linfoide

La célula dendrítica folicular (linfoide) se encuentra en los centros germinales de los folículos linfoides de los ganglios linfáticos y del bazo, y en el tejido linfoide asociado a muscosas (MALT). A diferencia de las células dendríticas que proceden del progenitor mieloide, las que provienen del progenitor linfoide no expresan MHC II y por tanto no presentan antígenos a los

LT. En su lugar, lo que hacen es expresar una gran candidad de receptores de anticuerpos y receptores del complemento. Por tanto, podrán captar anticuerpos o fracciones del comple-mento que a su vez capten al antígeno. En otras palabras, son células que “presentan” el an-tígeno a linfocitos B y seleccionan a aquellos LB con mayor afinidad por el antígeno.

Macrófago

El macrófago es una célula que procede del monocito. En función del tejido al que se extra-vase este monocito, pasará a diferenciarse a una clase de macrófago u otro (céls. de Kuppfer, microglía, céls. mesangiales, histocitos, macrófagos alveolares u osteoclastos). Esta diferenciación se da por el cóctel de sustancias con las que se encuentra el monocito al migrar a un tejido determinado (que no tiene por qué darse únicamente cuando hay una infección). Los macrófagos pueden estar en una forma inactiva o activa, y para llegar a este estado activo pueden activarse de dos maneras distintas, la M1 (activación clásica) y la M2 (activa-ción alternativa). Comentar también que un macrófago puede proliferar y también entrar en

apoptosis.

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Ciclo de vida delas céls. dendríticas. (Fainboim pág. 16) El ciclo de vida de las céls. dendríticas transcurre a través de diferentes etapas. (a) Las céls. dendríticas se originan a partir de precursores hematopoyéticos pluripo-tenciales presentes en la médula ósea que darán lugar, en última instancia, a precursores inmediatos de las céls. dendríticas que alcanzan la circulación. Entre estos precursores inmediatos se destacan los monocitos. (b) Pre-cursores de las céls. dendríticas y céls. dendríticas provenientes de la circulación extravasan en la piel y las mu-cosas, donde conforman una extensa e intrincada red celular. (c) Al activarse, en respuesta a un proceso infec-cioso, las céls. dendríticasm igran a los ganglios linfáticos drenantes del sitio de infección y completan su pro-ceso madurativo. (d) Ya en el ganglio linfático, las céls. dendríticas maduras activan a los LT vírgenes (naive) e inducen su expansión clonal y su diferenciación en distintos perfiles efectores.

Diferencias principales entre monocito y macrófagoDiferencias principales entre monocito y macrófagoDiferencias principales entre monocito y macrófagoTipo celular Monocito MacrófagoTamaño 10-15 µm 50-150 µmOrgánulos Lisosomas, fagoso-

mas...Aumento en nº y complejidad de lisosomas, fagoso-mas...

Capacidad fagocítica + +++Producción enzimas hidrolíticos + +++Secreción de factores solubles + +++

De las características que aparecen en el cuadro anterior, comentar que en el caso de un macrófago activado, su capacidad fagocítica, de producción de enzimas hidrolíticas (bacteri-cidas) y su secreción de factores solubles (p. ej., citocinas) aumentra drásticamente. Como todas las céls. del sistema inmune, los macrófagos disponen de toda una serie de marcadores de superficie. Para identificar a cada una de las poblaciones del sistema inmu-ne se escogieron marcadores de membrana específicos para cada tipo celular. A pesar de que estos marcadores puedan no ser exclusivos de un tipo celular, su combinatoria es completa-mente única para cada población celular. Estos marcadores son los CD, del inglés cluster of differentiation. Ejemplos: CD4 = LT helper (colaborador); CD8 = LT citotóxico. Los marcado-res de superficie que tienen los macrófagos son los siguientes:

- Receptores de la inmunidad innata. Estos receptores reconocen patrones comunes a va-rios patógenos, como por ejemplo los mucopolisacáridos de la pared bacteriana. Dentro de esta categoría están los TLRs (toll-like receptor), el receptor de manosa (CD68) y los receptores carroñeros (scavenger receptors).

- Receptores de componentes del sistema del complemento. Esto permite la fagocitosis de elementos opsonizados. Encontramos el CD35 (receptor para C3b; CR1), el CD11b/CD18 (CR3) y el CD11c/CD18 (CR4).

- Receptores para las inmunoglobulinas. Favorecen la fagocitosis. En la diapositiva se co-mentan el CD64 (FcγRI), el CD32 (FcγRII) y el CD16 (FcγRIII).

- Moléculas del MHC I y II.- Moléculas coestimuladores. Como el CD80 y el CD86, que son necesarias para la acti-

vación de los LT naive.

Todas estas proteínas de membrana además de la arquitectura interna de la célula permiten que el macrófago pueda: (a) reconocer microorganismos y activarse; (b) fagocitar; (c) ejercer una

actividad antimicrobiana y citotóxica; (d) ingerir céls. apoptóticas y muertas; (e) presentar antíge-

nos; (f) producir citocinas y otros factores; (g) participar en la reparación tisular. Son células con un papel importante en la relación entre la inmunidad innata y adaptativa. Atención, en clase se dijo que el macrófago puede activar a LT. No obstante, como no puede migrar a los ganglios, su capacidad de activación es bastante reducida. Únicamente po-drá activar aquellos LT naive que se encuentren en el mismo tejido y que tengan especifici-dad por el antígeno que presenta el macrófago.

Granulocitos

Los granulocitos son un tipo de leucocitos. Dentro de los granulocitos encontramos tres tipos celulares: los neutrófilos, que son los más importantes cuantitativamente, los eosinófilos y los basófilos.

Neutrófilos

Los neutrófilos forman gran parte de la fórmula leucocitaria; entre el 50 y el 70% de los leuco-

citos son neutrófilos. Experimentan además un pico durante la respuesta inflamatoria. Son ge-

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neralmente los primeros en llegar al lugar donde se ha originado la infección (extravasación, quimiotaxis), en gran número para hacer frente a los microorganismos que están proliferando exponencialmente. En su membrana presentan receptores para la IgG (CD64) y receptores del

complemento (CR1, CR2, CR3 y CR4) que sirven para que la fagocitosis que realizan estas cé-

lulas sea eficiente.

También en su membrana hay receptores de quimioquinas que hacen que el neutrófilo pueda extravasarse a aquellos tejidos donde hay una infección. Una vez en el tejido, los neutrófilos forman agentes quimioatractantes. En su citoplasma encontramos enzimas líticos y agentes mi-

crobicidas que reposan en los gránulos primarios y secundarios. El fracaso de los neutrófilos es sinónimo de que tiene que actuar la segunda línea de defensa (inmunidad adaptativa).

Eosinófilos

Los eosinófilos representan un pequeño porcentaje de los leucocitos en sangre (del 1 al 3%). Son células que migrarán a los tejidos en respuesta a infecciones y que están especializados en fagocitar parásitos. En su interior hallamos gránulos con factores tóxicos para parásitos. En su membrana hay receptores de baja afinidad para las IgE (FcεRII: CD23); en otras palabras, que se unirá a las IgE cuando éstas estén muy concentradas (p. ej., cuando se opsoniza con IgE un parásito). El número de eosinófilos aumentará en parasitosis y en reacciones alérgicas.

Basófilos

Los basófilos son los leucocitos más minoritarios (< 1%). Son equivalentes a los mastocitos tisulares. En su membrana expresan receptores de alta afinidad para las IgE, por lo que pueden reconocer IgE que estén libres (a concentraciones muy bajas). Precisamente por esta baja

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NEUTRÒFILS

• 50 – 70 % leucòcits a la sang. Augment durant la resposta inflamatòria.• Generalment els primers d’arribar al lloc de la infecció (quimiotàxis, extravasació) • Receptors per IgG (CD64) i receptors del complement (CR1,CR2,CR3, CR4)• Activitat fagocítica• Enzims lítics i agents bactericides dins grànuls primaris i secundaris• Mecanismes microbidides dependent i independents d’oxígen. Activitat de respiratory burst i nivells de defensines més elevades que els MØ

• Paper clau en la fase inicial Immunitat Innata

Peroxidasa, lisozimaenzims hidrolítics

Col.lagenasa, lisozimalactoferrina

Neutrófilo. Los neutrófilos tienen mecanismos microbicidas dependientes o no de oxígeno. Presentan más de-fensinas y una mayor actividad de explosión respiratoria que los macrófagos (se verá más adelante). Se dijo en clase que mientras que un macrófago tenía que formar de novo todos los enzimas y agentes microbicidas, el neutrófilo ya los tiene desde un principio.

EOSINÒFILS

• 1 – 3 % dels leucòcits a sang. Migració de la sang als teixits en resposta ainfeccions• Activitat fagocítica versus paràsits• Grànuls amb factors tòxics per paràsits• Receptors de baixa afinitat per IgE (FcHRII: CD23). Destrucció de partículesrecobertes d’IgE• Participen en reaccions al.lèrgiques: inflamació i lesió de teixits• Augmenta el seu nombre en al.lèrgies i parasitosi

Eosinófilo. Se indica la presencia de un gránulo con cristaloide.

afinidad de sus receptores de IgE, los basófilos partici-pan en las reacciones alérgicas, que además cursan con una gran inflamación por culpa de los gránulos de his-

tamina que tienen estas células (y que liberan cuando se activan). A diferencia de los neutrófilos y eosinófilos, los basófilos no tienen actividad fagocítica. Los mastocitos son células muy parecidas a los basófilos. Su precursor es liberado a la sangre y se dife-rencian en los tejidos (piel, tejido conectivo y epitelio de las mucosas). Expresan receptores de la IgE, IgG y del complemento. Presentan gránulos citoplasmáticos con histamina y son importantes en las alergias y en las defensas contra helmintos (gusanos que parasitan).

En una de las diapositivas aparece una tabla donde se resumen las principales características funcionales de las células que acabamos de explicar en este capítulo. Se comentó que los neutrófilos tienen una mayor capacidad antigénica que los macrófagos, que los macrófagos son CPA y que las céls. dendríticas son CPA y además tienen la clara ventaja de poder migrar hacia los ganglios y activar a los LT naive.

Células linfoides

Las células linfoides proceden del progenitor linfoide que su vez es descendiente directo de la célula madre pluripotencial (HSC). Las diferentes poblaciones de linfocitos se identifican gracias al reconocimiento de unos marcadores de superficie (CD), que no son más que unas moléculas que el linfocito expresa en su membrana y que pueden cumplir diferentes funcio-nes biológicas en la célula (su cometido no es identificar a la célula, nosotros nos aprove-chamos de esas moléculas para nuestro interés). La identificación de estos marcadores se realizó por medio de anticuerpos monoclonales. Los CD no son exclusivos de una población celular, pero su combinatoria suele serlo. El CD4 se encuentra en los linfocitos T helpers, aunque también lo podemos encontrar en algunos linfocitos NK. De igual manera, el CD8 está en los LT citotóxicos y también puede ser hallado en linfocitos NK. Un marcador específico de LT es el CD3, y un marcador especí-fico de los linfocitos T y B es el CD5. El CD28 es necesario para el funcionamiento de los LT.

Linfocito T

Los linfocitos T maduran en el timo. En su membrana expresan el receptor para el antígeno (TCR) y toda una serie de marcadores de superficie: CD3 y CD28 en todos, y despues CD4 en los colaboradores y CD8 en los citotóxicos. La expresión de CD4 limita al LT a que pueda reconocer un antígeno únicamente acoplado a una molécula de MHC II, mientras que la ex-presión de CD8 limita al LT a que pueda reconocer un antígeno unido a un MHC I. A pesar de que la interacción entre el antígeno y el LT se dé a través del TCR (complejo TCR-Ag), el CD4 (o el CD8) actuarían a modo de correceptores que estabilizan la interacción. Para que el

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BASÒFILS

• Menys de l’1 % dels leucòcits a la sang. Equivalents als mastòcits tissulars• Expressió receptors d’alta afinitat per la IgE (FcHRI) que reconeixen IgE lliure • Contenen grànuls d’histamina• NO tenen activitat fagocítica• Participació en reaccions al.lèrgiques (Hipersensibilitat inmediata mediada per IgE)

Histamina

Basófilo. Los gránulos que se indican contienen histamina.

TCR pueda reconocer el Ag necesitará, a parte del CD4 (o CD8), al CD3 y al CD28. Existen dos grandes poblaciones de linfocitos T: (a) TCRγδ, y (b) TCRαβ; las dos tienen dos subunida-des que son necesarias para el reconocimiento del antígeno.

- TCRγδ. CD3+, CD4+ (variable), CD8+. Se encuentran en una baja proporción en la sangre (5-10% de los LT sanguíneos). Se suelen encontrar en las mucosas. Cuando re-conocen al antígeno realizan una actividad microbicida y forman citocinas.

- TCRαβ. Son el 90-95% de los LT sanguíneos y se dividen en tres subpoblaciones.- T colaborador. CD3+, CD4+. También pueden ser denominados helpers (Th). Par-

ticipan el control de la activación de los macrófagos, la diferenciación de LB y en la inflamación.

- T citotóxico. CD3+, CD8+. También pueden ser de-nominados CTL (Eng: cytotoxic T limphocyte) o Tc. Se encargan de hacer la lisis de céls. infectadas, tumorales y de los aloinjertos. Hay aproximada-mente el doble de TH que de TC (tanto en sangre como fuera de ella).

- T reguladores. CD3+, CD4+, CD25+, FoxP3+. Hay bastante pocos. Se encargan de regular la respuesta inmunitaria, de promover la auto-tolerancia (impedir que ser reconozcan antígenos propios) y suprimen a los LT.

Activación de los linfocitos

Los linfocitos naive se encuentra en un estado de quiescencia (Go) porque no interesa que prolifere hasta que entre en contacto con un antígeno. El contacto del antígeno con el linfo-cito hace que este último entre en el ciclo celular y se divida. En último término, el linfocito puede diferenciarse a célula de memoria o a célula efectora (p. ej., cél. plasmática).

Migración y circulación de los linfocitos

Los LT naive deben ir desde el timo a los ganglios linfáticos empleando la circulación sanguí-nea. Estos LT volverán a la circulación a través del conducto torácico (no se deben quedar permanentemente en el ganglio para así aumentar las posibilidades de contactar con un el Ag). Las céls. dendríticas migrarán hacia los ganglios cercanos para presentar el Ag a los LT naive. Una vez el antígeno ha sido presentado al LT naive, madurará y migrará hacia el tejido infectado, donde realizará una respuesta u otra en función de la clase de T que sea. Los T

efectores (activados) tendrán en su membrana moléculas que interaccionarán con moléculas

de adhesión en el endotelio. Se destacó que los LT naive presentaban en su membrana una gran cantidad de L-selectina (molécula de adhesión). Como veremos en el cuadro de la pági-na siguiente, hay toda una serie de características que diferencian a los LT naive de los efec-tores y de los de memoria.

Nota. Con el tiempo el timo va degenerando, aunque esto no supondrá un problema porque tenemos linfocitos de memoria. Con lo que resta de timo ya es suficiente para la formación de T naive.

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Tejido Th Tc

Sangre 50-60% 20-25%G. linfático 50-60% 15-20%Bazo 50-60% 10-15%

Distribución de TH y TC.

Los ganglios linfáticos expresan el receptor para las L-selectinas, lo que permite que los LT nai-ve puedan acceder a su interior. Los linfocitos efectores expresan una menor cantidad de L-selectinas pero expresan una mayor cantidad de ligandos para las selectinas E y P, que son ex-presadas por el endotelio del tejido inflamado. Las citocinas secretadas mejoran la extravasa-ción hacia el tejido infectado (receptores para éstas en las membranas de los LT).

Linfocitos B

Los linfocitos B (LB) se forman en la médula ósea y en la bolsa de Fabricio. Disponen de los siguientes marcadores fenotípicos:

- Receptor para el antígeno (BCR). Se trata de una inmunoglobulina de membrana que puede unirse directamente a un antígeno. Hay unas 1,5 · 105 moléculas/célula.

- Marcadores específicos. Tales como el CD19 y el B220.- Receptores del complemento. Como el CR2 y el CR1.- MHC de clase II.- Receptores para la Fc de IgG. FcγRII.- Moléculas coestimuladoras. Tales como CD80, CD86 y CD40.

Dentro de los linfocitos B podemos distinguir dos poblaciones: B1 y B2. El principal elemen-to diferencial de estas dos poblaciones es la expresión (o no) del CD5. Únicamente el 5% de los linfocitos B sanguíneos son del tipo B1 (CD5+) mientras que el 95% restante de los LB sanguíneos son del tipo B2 (CD5-).

- B1. Su BCR es capaz de reconocer estructuras comunes de patógenos (antígenos co-munes), lo cual es una característica típica de los receptores de patrones comunes que encontramos en las células de la inmunidad innata. No es un PRR de la innata porque se genera por recombinación. Atención, esta población está implicada en la formación

de anti-anticuerpos, por lo que están muy implicados en los procesos de autoinmuni-dad. Son abundantes en el peritoneo.

- B2. Es la población mayoritaria de LB. La principal función de los LB (B1 y B2) es la producción de anticuerpos (inmunidad humoral).

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Características Linfocitos naive Linfocitos activados/efectores Linfocitos de memoria

Freq. respuesta Ag Muy baja Alta BajaFunciones efectoras Ninguna Secreción de citocinas, actividad citolítica NingunaCiclo celular No Sí +/-R. alta afinidad IL-2 Baja Alta BajaHoming receptors Baja Alta BajaL-selectina Alta Baja Baja o variableLigando E- y P-se-lectina

Baja Alta Alta

Integrinas Baja Alta AltaCD45 CD45RA CD45RO CD45RO; variableMorfología Pequeño Grande Pequeño

Los LB no se encuentran distribuidos uniformemente por todos los tejidos: en la sangre están entre el 10 y el 15%; en los ganglios entre el 20 y el 25% y en el bazo entre el 40 y el 45%.

Los diferentes linfocitos (naive, activados y de memoria) pueden identificarse en el laborato-rio fijándonos en toda una serie de características diferenciales.

La afinidad de la Ig aumenta en los linfocitos efectores y de memoria por un proceso deno-minado hipermutación somática (se explicará más adelante). Ésta consiste en el proceso por el cual aumenta el número de mutaciones (no se sabe cómo) que tienen lugar en la región gé-nica que codifica para la fracción variable de las Ig, de manera que acabamos teniendo un receptor del LB distinto al de la célula parental (con afinidad distinta). Como el antígeno es el limitante, se realizaría una selección sesgada en factor de los LB que tengan un receptor con mayor afinidad. En cuanto a los receptores de quimiocinas, se expresarán más o menos en un tipo de linfocito en función de la clase de receptor que sea. Por ejemplo, si es un receptor que retie-

ne al linfocito al ganglio, estará más expresado en los naive.

Células NK

Las células NK (o asesinas naturales) pertenecen a la inmunidad innata. Se definen como linfo-citos grandes con gránulos con enzimas y elementos con gran capacidad citotóxica. Se enfren-

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LIMFÒCITS B: ACTIVACIÓ, DIFERENCIACIÓ I APOPTOSI

Linfocitos B. Únicamente aquellos LB que entren en contacto con el antígeno se activarán, abandonará la fase Go (aunque no únicamente por la interacción con el Ag, se precisarán más señales). A partir de ese momento, proliferará y podrá diferenciarse a: (a) célula efectora (plasmática), (b) cél. B de memoria. No obstante, la gran mayoría de las células que han proliferado en el marco de una reacción inmunitaria, entrarán en apoptosis.

Característica Linfocito naive Linfocito activado/efector Linfocito de memoria

Inmunoglobulina (Ig) IgM e IgD Además de los dos isotipos existentes en el naive, IgG, IgA e IgE

Además de los dos isotipos existentes en el naive, IgG, IgA e IgE

Afinidad de la Ig Baja Aumenta AltaFunción efectora Ninguna Formación de anticuerpos NingunaMorfología Pequeños Grandes (cél. plasmática) PequeñosReceptor quimiocinas (CXR5) Elevada Poca ?

tan sobre todo a células tumorales y a células infectadas por determinados virus. Represen-tan entre el 5 y el 10% de los linfocitos sanguíneos y del bazo. En su membrana tienen los siguientes marcadores fenotípicos:

- No expresan receptores específicos para el antígeno. Como los que encontramos en los linfocitos T y B.

- CD16. Se trata de un receptor para la fracción constante de las Ig (FcγRIII). Estos re-ceptores tienen una clara función: facilitar la interacción entre la respuesta innata y en la adaptativa.

- Otros receptores. Similares a lectina tipo C, KIR, LILR, LAIR, NKp, etc.

Hay más de una población de linfocitos NK. En clase se destacó una particular, la población NK1-T. Esta población se caracteriza por presentar características de la célula T y de la NK: expresan un TCR que interactúa preferentemente con el CD1. El CD1 (MHC-like) es una molécula que suele mostrar lípidos. Al igual que el TCR presente en el linaje T, el TCR de las NK1-T se forma por recombinación somática, aunque mucho más limitada en cuanto a su di-versidad. Esta población también presenta el CD16 y los otros receptores observados antes. Las células NK tienen una función citotóxica y de secreción de citocinas.

Nota 1. En la penúltima diapositiva del tema 2 aparece una pequeña tabla del Abbas en el que se resumen las

principales funciones de los diferentes tipos de linfocitos:- LB: reconoce el antígeno directamente. Forma anticuerpos y activa al complemento.

- TH: reconoce el antígeno a través de una CPA (MHC II). Su principal mecanismo efector son las citoci-nas. Controla la inflamación, activa a los macrófagos y activa (proliferación y diferenciación) de los LT y LB.

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Activación, diferenciación y migración de los linfocitos. Para aquellos antígenos presentes en la sangre, la inte-racción entre el linfocito naive y el antígeno se dará en el bazo. Una vez producida dicha interacción, habrá una expansión clonal. Las células efectoras deberán migrar hacia el sitio de infección).

- TC (CTL: reconoce el antígeno expresado por un MHC I. Destruye a la célula infectada.

- T regulador: es una subpoblación cuantitativamente pequeña pero cualtitavamente importante. Son importantes en la supresión de la respuesta inmunitaria (clave para el tratamiento de enfermedades au-

toinmunes e inflamaciones crónicas).- NK: destruir células tumorales o infectadas.

Nota 2. Se volvieron a comentar (repetido hasta la saciedad) las características funcionales de los linfocitos: (a) reconocer propio/no propio; (b) especificidad; (c) diversidad; (d) memoria; (e) secreción de citocinas. También

se habló de unas células accesorias que secretan citocinas, que capturan y destruyen microorganismos, y que presentan el antígeno.

Apunte sobre las dos clases de macrófagos activados

Como se dijo previamente, los macrófagos pueden activarse de dos maneras distintas: M1 (activación clásica) y M2 (activación alternativa). Que un macrófago inactivo pase a activarse de un modo u otro depende de las citocinas con las que contacte.

- Macrófago M1. Se parece mucho al macrófago clásico. Presenta una gran cantidad de MHC II, capacidad microbicida, presenta PRRs y forma TNFα (una citocina proinflama-

toria).- Macrófago M2. Son antiinflamatorios y están relacionados con la reparación de tejidos.

Forman IL-10 y TGFβ (citocinas antiinflamatorias). Cuando los macrófagos reconocen células apoptóticas, el tipo de diferenciación es el M2 (que no genera tanta inflama-ción como el M1). Los tumores a veces estimulan la formación de macrófagos en su forma M2 para eludir al sistema inmunitario.

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3. RECEPTORES Y ACTIVACIÓN DE LA INMUNIDAD INNATA

Señales y receptores de la inmunidad innata

En las células de la inmunidad innata encontramos los receptores de patrones comunes (PRR). Estrictamente, estos receptores puede reconocer dos grandes agrupaciones de moléculas: (a)

PAMPs, y (b) DAMPs. La primera agrupación (Eng: pathogen associated molecular patterns) son las moléculas que podían ser halladas en varios patógenos a la vez, como por ejemplo los lipopolisacáridos, la flagelina, los peptidoglucanos y material genético. Dentro del material genético se le puso especial énfasis al CpG DNA, que son regiones del DNA ricas en citosi-nas y guaninas no metiladas (en el ser humano estas regiones están metiladas). La segunda agrupación (Eng: damage associated molecular pattens) incluye moléculas que aparecen cuando hay necrosis, como por ejemplo el ácido úrico, las HBPs (high shock proteins), el ATP, la adenosina y la HMGB111. Existen numerosas clases de receptores dentro de la familia de los PRR. Unos se en-contrarán en la membrana y otros serán intracelulares. Sea de la clase que sea y estén donde estén, la interacción entre el PRR y su ligando provocará una respuesta intracelular (activa-ción) que provocará una reacción: p. ej., la formación de citocinas, la fagocitosis, la quimio-taxis, la liberación de enzimas, etc.

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11 Esta proteína se encuentra unida al material genético por lo que si está en el medio extracelular es un claro indicio de necrosis.

Receptores de patrones comunes (PRR). A continuación aparecen algunos de los PRR que se explicarán a con-tinuación. Los TLR ubicados en la membrana reconocen elementos lipoproteicos comunes a distintos patóge-nos. Los TLR endosomales reconocen material genético viral (e incluso DNA bacteriano). Los RLR citosólicos también pueden reconocer RNA viral y los NLR citosólicos harían lo mismo que los TLR de la membrana pero a nivel del citosol. Finalmente, en la imagen se observa un receptor de lecitina.

TLR (toll-like receptors)

Existe una gran cantidad de TLR, cada uno de ellos con una afinidad determinada para un pa-

trón. A continuación se exponen algunos de los más importantes (end: endosomal; membr: membrana; entre paréntesis aquello que reconocen)12: TLR3end (bc-RNA); TLR7end (mc-RNA); TLR9end (DNA rico en CpG); TLR4membr (lipopolisacáridos); TLR5membr (flage-lina); TLR1,2,6membr (diferentes estructuras bac-terianas). En cuanto a la estructura del recep-tor, comentar que tiene un dominio TIR con el que interaccionará directamente con diferen-tes proteínas (inicia la señalización). Los re-ceptores TLR están especialmente presentes en

células dendríticas, y concretamente en los plasmacitoides. Se comentó que los plasma-citoides participan en la respuesta anti-viral, por lo que le interesa tener TLRs endosomales que puedan detectar la presencia de material genético vírico. Una vez reconocido, formará citocinas (como el interferón α/β)13. Además de encontrarse en las céls. dendríticas, los TLRs están en otros elementos de la inmuni-dad innata (macrófagos, neutrófilos), de la adaptativa (LB) y células que estrictamente no forman parte del sistema inmunitario pero que colaboran con él (queratinocitos, céls. epiteliales). El mecanismo de funcionamiento del TLR es el que se expone a continuación. Una vez se produce la interacción receptor-ligando, el dominio TIR, que no tiene actividad enzimá-tica) contactará con un adaptador, que en este caso puede ser la proteína MyD88 o la TRIF. Acto seguido, se activará un factor de transcripción (NF-κB o IRFs) que promoverá la expresión de toda una serie de genes. La activación del NF-κB induce la expresión de citocinas proin-

flamtorias (TNFα, IL-1 e IL-6), mientras que la activación del IRF induce la expresión de IFNα. La cantidad y la duración de la respuesta dependerá del tipo celular y de ligando.

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12 No es la nomenclatura oficial, es un añadido que les pongo yo para aclararme.

13 Recordemos que otra gran familia de interferones es la gamma (γ). Este IFN es formado por células de la in-munidad adaptativa (Th1 y NK).

Mecanismo de acción intracelular de los TLRs. La producción de toda una serie de sustancias de la ma-no del factor de transcripción NF-κB genera una in-flamación y la estimulación de la inmunidad adapta-tiva. De igual manera, los IRFs favorecen un estado antiviral.

NLR (NOD-like receptors)

Los NLR reconocen estructuras lipoproteicas

que se encuentran en el citosol. El rol de es-tos receptores es clave para que algunas citocinas sean activas. Por ejemplo, supon-gamos que la interacción entre un TLR y un ligando produce la activación del factor de transcripción NF-κB y se expresa una cito-cina en una forma inactiva (Pro-IL-1β). La activación de esta citocina se realizará por medio de una caspasa (caspasa-1) que a su vez precisará que se active por medio del denominado inflamasoma. El inflamasoma está formado por el NLRP3, la proteína ASC y la caspasa-1 inactiva. El inflamasoma se activará por toda una serie de DAMPs (co-lesterol, ATP, especies reactivas de oxígeno) y de PAMPs (como el DNA viral). Una vez el inflamasoma está activo, hace que la caspasa-1 pase a su forma activa (no indu-ce la apoptosis) y da lugar a la citocina en su forma activa (que será liberada). Los in-flamasomas se encuentran en el citoplasma de fagocitos, de células epiteliales, etc.

RLR (Rig-1 like receptors)

Los RLR están en el citoplasma y pueden detectar RNAs virales con diferentes características. Los dos receptores de esta familia que se citaron en clase fueron el RIG-1 (que le da el nom-bre a la familia) y el Mda5. La interacción receptor-ligando producirá, en último término, la formación de citocinas proinflamatorias (TNFα, IL-1 e IL-6) e interferones (IFNα/β). Están presentes en fagocitos.

CLR (C-type lectin receptors)

Estos receptores son proteínas transmembrana que reconocen motivos ricos en manosa, fucosa y β-glucano (se pueden encontrar en microorganismos) Se encuentra en macrófagos y células dendríticas. Hasta ahora, los receptores que hemos visto producían cascadas de señalización intracelular que culminaban con la liberación de sustancias. Los CLRs participan en procesos de internalización de microorganismos no opsonizados (fagocitosis).

Papel de DC-SIGN (CLR) en el sida. El virus del sida es endocitado por la célula dendrítica una vez que

éste ha interaccionado con el DC-SIGN, y en lugar de ser degradado permanece en un compartimento intracelular no degradativo. La célula dendrítica migrará hacia los ganglios linfáticos y ahí entrará en

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Mecanismo de acción intracelular del NLR. La activa-ción de la citocina se realiza por medio de una proteóli-sis catalizada por la caspasa-1.

contacto con un linfocito T CD4+. Cuando se da el contacto, las vesículas que contienen al virus se fu-

sionan con la membrana de la cél. dendrítica en el sitio de contacto entre ambas células, y transfieren la infección a los linfocitos T CD4+.

Receptores scavenger

Los receptores scavenger (carroñeros) se encuentran en la membrana de macrófagos, neutró-filos, células dendríticas, céls. endoteliales y epitelios. Reconocen LDL modificada (acetilada u oxidada), ligandos polianiónicos, componentes microbianos y restos de células apoptóticas

(como la fosfatidilserina oxidada). Nota. Todos estos receptores que estamos viendo nos demuestran la gran cantidad de familias de recep-tores que existen, las cuales pueden coexistir en una misma célula. La respuesta de una célula con dife-

rentes receptores será el resultado de la suma de las diferentes vías intracelulares.

Receptores para péptidos formilados (RFP)

Los RFP se encuentran en la membrana plasmática de los fagocitos y reconocen: (a) péptidos

N-formilados en el aa Met, que son producidos por las bacterias y que resultan en una activi-dad quimiotáctica sobre neutrófilos y macrófagos; (b) péptidos de algunos virus, como el VIH-1, el VIH-2 y el Ébola.

Receptores de patrones solubles

A continuación se exponen toda una serie de receptores que pueden interaccionar con pa-trones solubles.

- Colectinas. Son las formas solubles de la familia CLR. Reconocen motivos ricos en manosa, fucosa y β-glucano. Se citó la MBL, que consta de una lectina que se une a manosa. Son importantes para la activación del complemento. Estimulan la fagocito-sis.

- Ficolinas. Su principal caracteristica es que reconocen grupos acetilados (GlcNAc) que se encuentran principalmente en microorganismos y en céls. apoptóticas. Participan en la activación del complemento.

- Pentraxinas. Aquí pertenece una de las proteínas de la fase aguda: la proteína C reacti-

va (PCR). Principalmente reconocen la fosfocolina, que la podemos encontrar en hi-dratos de carbono de microorganismos y en la membrana celular de céls. necróticas y apoptóticas. Promueven la fagocitosis (al reconocer los patrones, la PCR podrá unir-se -con menor afinidad- al receptor de la Fc de Ig)14. Acaba activando al sistema del complemento.

- Sistema del complemento. Ya se explicará, pero comentar que pueden reconocer pa-trones solubles.

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14 La PCR junto con la fosfocolina del microorganismo (o de donde venga) podrá ser reconocida por el receptor de la Fc de la Ig presente en células como los fagocitos.

Como sucedía con los PRRs, la interacción entre el receptor de patrón soluble y su ligando puede producir: (a) fagocitosis; (b) activación del complemento (uno de los principales meca-nismos efectores de la inmunidad innata y en parte de la adaptativa); y (c) formación de cito-

cinas proinflamatorias (que son la IL-1, IL-6 y el TNFα). Los PRRs tienen un cierto solapamiento por lo que respecta a los PAMPs que recono-cen (es decir, un ligando puede ser captado por más de un receptor). Diferentes grupos de patógenos son reconocidos por grupos de receptores diferentes que inducirán una respuesta concreta con características particulares (depende del tipo celular y de receptor).

Nota. Se observa una diapositiva en la que se ilustran la cantidad inmensa de receptores de la inmuni-dad innata (PRRs) que sirven para detectar partes del hongo Candida albicans. La cél. dendrítica es la

que despliega un mayor repertorio de PRRs.

Reconocimiento y fagocitosis

A continuación se describen los diferentes pasos por los cuales una célula con actividad fa-gocítica puede incorporar un elemento ajeno. En primer lugar viene la quimiotaxis, que con-siste en la atracción y el movimiento hacia una partícula (p. ej., céls. muertas, partículas opso-nizadas). En el marco de la quimiotaxis, el fagocito sufrirá unos cambios en la membrana y en

el citoesqueleto que permiten el movimiento hacia la partícula en cuestión. En segundo lugar se produce el reconocimiento y la fagocitosis. El reconocimiento se da por los diferentes receptores presentes en la membrana, a su vez la interacción receptor-li-gando favorecerá la internalización del elemento extraño. La fagocitosis será más efectiva si la

partícula que debe ser interiorizada está opsonizada. Si está opsonizada quiere decir que está completamente rodeada por opsoninas (que pueden ser anticuerpos, receptores de patrones so-

lubles, componentes del complemento, etc). En tercer lugar, el microorganismo interiorizado da lugar a un fagosoma, al que se le fusionarán diferentes lisosomas para así formar un fagolisosoma15. En cuarto lugar, en estos fa-golisosomas se van a dar toda una serie de mecanismos microbicidas gracias a los cuales se destruirán los microorganismos. Parte de los péptidos fruto de la digestión que se produce pasarán al RE para interaccionar con moléculas de MHC II (que después pasarán al Golgi y se mostrarán en la membrana). En sexto y último lugar, los productos de la digestión que no han pasado al RE serán liberados al exterior.

Mecanismos microbicidas

Los mecanismos microbicidas se pueden dividir en dos grandes categorías, los (a) dependien-

tes del oxígeno, y los (b) independientes del oxígeno. En los fagolisosomas de los neutrófilos (numéricamente más importantes) y de los macrófagos se va a dar la formación de ROS (Eng: reactive oxygen species), lo que también recibe el nombre de explosión respiratoria (Eng: res-piratory burst). Para formar las ROS (o ROI)16 se precisa de la NADPH oxidasa de membrana. Además de los ROI encontramos los intermediarios reactivos del nitrógeno, entre los cuales ha-

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15 Atención, existen microorganismos que evitan esta fusión y por tanto se pueden perpetuar intracelularmente.

16 Intermediarios reactivos del oxígeno.

llamos el óxido nítrico (NO), que se forma gracias al iNOS (óxido nítrico sintasa inducible). El enzima iNOS se activa por el interferón gamma (entre otros elementos) y cataliza la siguiente reacción:

La NADPH oxidasa de membrana está formada por diversas subunidades. Es la que se va en-cargar de reducir el oxígeno al anión superóxido, el cual es bastante inestable y enseguida da lugar al peróxido de hidrógeno. La mieloperoxidasa transforma el peróxido de hidrógeno en el hipoclorito (empleando cloro). Atención, la célula que forma estas especies reactivas del oxígeno no queda exenta de un daño colateral, pero es notablemente menor al que sufre el microorganismo interiorizado.

Factores secretados por macrófagos activados

Una vez que el macrófago queda activado, por ejemplo, por la interacción entre un PAMP y su receptor, el macrófago libera/expresa toda una serie de elementos:

- Citocinas. El macrófago liberará tanto citocinas como quimiocinas. Las quimiocinas median el reclutamiento de diferentes poblaciones leucocitarias en el foco infeccioso. La liberación será mayor en función de la intensidad y duración de la infección (↑nº de macrófagos activados durante más tiempo).

- Citocinas proinflamatorias: IL-1, IL-6, TNFα.- Citocinas antiinflamatorias: IL-10, TGFβ. Son las típicas de los macrófagos M2.

Participan en la reparación de los tejidos. Recordemos que esta clase de macró-fagos aparecían en la fase final de la infección, cuando éstos detectan que hay daño tisular.

- IL-12: ya será estudiada con más detalle más adelante, pero comentar que pro-mueve la diferenciación de los T CD4+ en un perfil TH1 e induce la producción de IFNγ por parte de las NK.

- Factores de crecimiento. Como el M-CSF (macrófagos) y el G-CSF (granulocitos) que modulan la hematopoyesis.

- Receptores para la Fc de las Ig.

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L-arginina + O2 +NADPH iNOS⎯ →⎯⎯ NO + L-citrulina +NADP

Mecanismos dependientes del oxígeno Mecanismos independientes del oxígeno

Intermediarios reactivos del O2 (ROI): O*2- (anión

superóxido); OH* (radicales hidroxilo); H2O2 (peró-xido de hidrógeno); ClO- (anión hipoclorito).

Defensinas: forman canales permeables a iones que producen la lisis del microorganismo por desequili-brios iónicos o por flujos osmóticos.

Intermediarios reactivos del nitrógeno: NO (óxido nítrico); NO2 (dióxido de nitrógeno); HNO2 (ácido nitroso).

Enzimas hidrolíticos: como la lisozima.

Otros: NH2Cl (monocloramida). Citocinas proinflamatorias. IL-1, IL-6, TNFα

Nota. El anión superóxido es bastante inestable, por lo que pasa a ser rápidamente peróxido de hidrógeno.Nota. El anión superóxido es bastante inestable, por lo que pasa a ser rápidamente peróxido de hidrógeno.

Las citocinas proinflamatorias a nivel local pueden actuar sobre distintos tipos celulares: ma-crófagos, céls. endoteliales, neutrófilos, mastocitos, céls. dendríticas, etc. Además, estas mismas citocinas pueden actuar a nivel periférico. En clase se detalló que la IL-617 puede es-timular directamente al hígado para éste forme proteínas de la fase aguda, como por ejemplo lo son la proteína C reactiva o los receptores de patrones solubles. Si nos centramos en la C reactiva, ésta se une a la fosfocolina de la bacteria y actúa a modo de opsonina, por lo que el macrófago/neutrófilo de turno podrá fagocitar la bacteria con una mayor efectividad.

Otros efectos de las citocinas proinflamatorias a nivel periférico son los siguientes:- Endotelio de la médula ósea: movilización de neutrófilos (↑fagocitosis).- Hipotálamo: aumento de la temperatura corporal. Este aumento tiene como fin evitar

el crecimiento de aquellos microorganismos sensibles a la temperatura.- Grasa y músculo: produce toda una serie de cambios metabólicos (movilización de

proteínas y de energía para permitir el incremento de la temperatura corporal que or-dena el hipotálamo).

- Céls. dendríticas: el TNFα estimula su migración hacia los ganglios linfáticos y así ini-ciar la respuesta adaptativa. Un exceso de TNFα provoca un edema sistémico (↓vole-mia, neutropenia, hipoproteinonemia) que puede llevar a un fallo multiorgánico y a la muerte.

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17 Puede ser formada por otros tipos celulares a parte de los macrófagos, pero en menor cantidad.

ACCIONS SISTÈMIQUES CITOQUINES PRO-INFLAMMATÒRIES

Efectos sistémicos de las citocinas proinflamatorias. En este caso se habla de la IL-6 a nivel hepático. El hígado formará diferentes proteínas de la fase aguda, como la proteína C reactiva o la MBL (manose binding lectin), que al igual que ocurría con la C-reactiva, se podrá unir a elementos bacterianos a modo de opsonina.

4. ANTÍGENOS DE LA INMUNIDAD ADAPTATIVA

Antigenicidad e inmunogenicidad

Por antígeno entendemos aquella sustancia que puede ser reconocida directamente por un BCR (B-cell receptor/Ab de membrana) o por el TCR cuando forma un complejo con las mo-léculas de MHC. La antigenicidad es la capacidad que tiene un compuesto para unirse a pro-

ductos de la respuesta inmunitaria específica (anticuerpo y TCR). Un inmunógeno es una sustan-cia-antígeno que es capaz de inducir una respuesta celular y/o humoral; es decir, generar esta transformación:

La inmunogenicidad es la capacidad para generar una respuesta inmunitaria adaptativa. Final-mente, un hapteno es una sustancia pequeña (<4 kDa) y de estructura sencilla que puede ac-tuar a modo de antígeno pero que no genera una respuesta inmunitaria. En otras palabras, un hapteno es una sustancia antigénica que no tiene inmunogenicidad. Un hapteno que se con-jugue con un elemento más grande puede llegar a ser inmunogénico. Un ejemplo de hapte-no sería la penicilina.

Factores que influyen en la inmunogenicidad

Existen toda una serie de factores que influyen en la inmunogenicidad. A continuación se detallan en función de si son del propio antígeno o del sistema biológico en el que es intro-ducido. Empezaremos hablando de las características que hacen que el antígeno sea inmu-nogénico.

- Parecido con proteínas propias. Conforme más grande sea la distancia filogenética entre las dos especies, mayores serán las diferentes estructurales entre la molécula propia (del huesped) y la molécula ajena, y por tanto aumentan las posibilidades de que la molécula ajena sea reconocida como ajena.

Excepciones: proteínas conservadas (colágeno, citocromo c) o no accesibles al sistema inmunita-rio (esperma, tejido corneal).

- Tamaño molecular. Existe una correlación positiva entre tamaño e inmunogenicidad. No obstante, algunas moléculas pequeñas (<1 kDa) son inmunogénicas.

- Composición química y estructura molecular. Conforme más compleja y heterogénea sea la sustancia, más inmunogénica será (mayor cantidad de epítopos susceptibles a ser reconocidos por elementos del sistema inmunitario). La estructura primaria, secunda-ria, terciaria y cuaternaria contribuyen a la inmunogenicidad. Generalmente una pro-teína o un polisacárido es más antigénico que un lípido. No obstante, un lípido es an-tigénico si es empleado como hapteno y se combina con una proteína transportadora.

- Susceptibilidad de procesamiento y presentación. Los procesos de procesamiento y de presentación presentan diferencias entre individuos.

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Cél. B + antígeno → cél. B efectora (cél. plasmática) + cél. B de memoria

Cél. T + antígeno → cél. T efectora (TC, TH) + cél. T de memoria

- Forma. Hay una mayor inmunogenicidad en las formas desnaturalizadas o particuladas que en las nativas o solubles.

Por lo que respecta a características del sistema biológico, a continuación se describen algu-nas características que pueden determinar la inmunogenicidad del antígeno:

- Genotipo del animal receptor. Los receptores MHC18 son muy importantes para que los linfocitos T sean activados. Si el antígeno no puede acoplarse al MHC, ni los T, ni los B indirectamente (recordemos que los T activan a os B), podrán actuar.

- Dosis. Cada inmunógeno tiene una curva dosis-respuesta particular. Por booster enten-demos la aplicación reiterada de un inmunógeno. Una segunda aplicación generará una respuesta mayor respecto a una primera, pero no superior a una tercera (así hasta un límite).

- Via de administración. Existen diferentes vías de administración de antígenos. La más efectiva (en términos de generar una respuesta inmunitaria) es la subcutánea (mayor cantidad de céls. de Langerhans y dendríticas).

- Adyuvantes (adjuvare = ayuda). Son sustancias que se mezclan y se inyectan junto al antígeno para así aumentar la inmunogenicidad del mismo. Algunos de estos adyu-vantes pueden ser restos bacterianos, aluminio, aceite mineral, etc. Se desconoce el mecanismo de acción pero se sabe que el adyuvante: (a) aumenta la persistencia del antígeno; (b) incrementan las señales coestimuladoras; (c) aumenta la inflamación lo-cal; y (d) se estimula la proliferación no específica de linfocitos.

Epítopo

Por epítopo o determinante antigénico describimos una región inmunológicamente activa de un inmunógeno que interacciona con receptores de membrana específicos para el antígeno o con un anticuerpo libre. En un antígeno puede haber más de un epítopo. Existen diferentes clases de epítopos.

- Epítopo secuencial o lineal. Formado por residuos de aminoácidos continuos en la es-tructura primaria.

- Epítopo no-secuencial o conformacional. Está formado por segmentos de aas disconti-nuos en la secuencia primaria pero cercanos en la estructura tridimensional de la pro-teína. Huelga decir que esta clase de epítopo únicamente está presente en la estructu-ra nativa (y no en la desnaturalizada). La mayoría de Igs reconocen esta clase de epítopos.

- Neoepítopo. Aquel generado por modificaciones a partir del epítopo original. Entre estas modificaciones encontramos la fosforilación (de un residuo de serina, por decir algo) o la proteólisis. Por lo general, los neoepítopos se generan tras modificaciones postraduccionales.

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18 Los MHC pueden determinar la compatibilidad al realizar un transplante. Los genes que codifican para estas proteínas se caracterizan por tener diferentes polimorfismos, por lo que en la población hay distintos alelos.

Subcutánea > intraperitoneal > intravenosa > intragástrica

A pesar de que una proteína compleja pueda disponer de más de un epítopo (se pueden lle-gar a solapar), el sistema inmunológico únicamente reconoce a algunos de ellos, los inmuno-dominantes19. La determinación de qué epítopo es inmunodominante tiene que ver con ca-racterística topográficas intrínsecas del antígeno y con los propios mecanismos reguladores del huesped.

Haptenos

Como se ha comentado al inicio del tema, un hapteno es una molécula que por su reducido tamaño y escasa complejidad, no genera una respuesta inmunitaria. Si queremos que estos haptenos ganen inmunogenicidad, se les suele acoplar una macromolécula a la que deno-minamos transportador. Cuando se generen anticuerpos contra el complejo hapteno-transpor-tador, se podrán generar anticuerpos contra: (a) hapteno (que ya es un determinante antigéni-co); (b) transportador; y (c) complejo-hapteno-transportador. Algunos ejemplos de haptenos son la penicilina, la aspirina, algunas drogas e incluso hormonas peptídicas como la hCG. En el caso de la penicilina, ésta puede acoplarse a una proteína y entonces generar una reacción inmunitaria.

Complejo ternario

Para reconocer el antígeno, las céls. T deben formar un complejo ternario formado por los componentes que ahora se describirán. En primer lugar debe participar el TCR del LT, que

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19 Estrictamente, y según las diapositivas, los epítopos inmunodominantes son aquellos que generan una res-puesta más fuerte en comparación con el resto.

Naturaleza de los determinantes antigénicos. Los determinantes antigénicos (que se muestran en amarillo, azul y rojo) pueden depender del plegamiento de las proteínas (estructura tridimensional), así como de la estructura primaria. Algunos determinantes son accesibles en las proteínas originales y se pierden con la desnaturalización (A), mientras que otros quedan expuestos sólo al desplegarse la proteína (B). De las modificaciones postsintéti-cas, como la rotura de un enlace peptídico, surgen nuevos determinantes (C).

interaccionará con un MHC que será de clase I o II en función de si el LT es citotóxico o co-laborador. Supongamos que es colaborador, por lo que se formará un dímero MHCII-TCR, y en el MHC está el antígeno de unos 20 a 30 aas. Este dímero presenta un afinidad muy baja, por lo que necesitamos que un correceptor estabilice la unión. En este caso concreto, el co-rreceptor es el CD4, que parte de la membrana del TH para interaccionar con una parte de la estructura terciaria del MHC II y así estabilizar la unión. El antígeno incorporado pasará por un procesado por el cual se generará el péptido que interaccionará específicamente con la molécula de MHC. Atención, una molécula de MHC pue-de unir selectivamente péptidos diferentes con características estructurales comunes (la unión no es tan específica como la que se observa entre antígeno y anticuerpo. Los epítopos reconocidos por el TCR son generalmente motivos internos del antígeno.El epítopo para la célula B es un péptido que reacciona con el anticuerpo mientras que el epítopo para la célula T es un péptido que interacciona con el TCR y las moléculas de MHC.

Antígenos timo-dependientes y timo-independientes

Los antígenos timo-dependientes son aquellos que para activar a la célula B precisan de un contacto directo con el T colaborador (TH). Por el otro lado, los antígenos timo-independientes (TI) son aquellos que pueden activar a una célula B sin que haya contacto directo con una célula TH, aunque con la desventaja de que no se generan células de memoria. Encontramos dos grandes tipos de antígenos TI:

- TI de tipo 1 (TI-1). Mitógenos/activadores policlonales de céls. B. Un ejemplo dentro de esta categoría son los lipopolisacáridos. A bajas concentraciones los LPS inducen una producción de anticuerpos anti-LPS20, mientras que a altas concentraciones acti-van la división policlonal de LB. La alta concentración provoca la proliferación debi-do a que el exceso de LPS activa a los TLR4 presentes en la membrana de los LB.

- TI de tipo 2 (TI-2). Activación de LB por crosslinking de receptores mlg. Hay compues-tos bacterianos, como la flagelina (proteína polimérica) que se puede unir a varios BCR a la vez (crosslinking). Los TI-2 no son mitógenos de las céls. B, activan a aquellas maduras e inactivan a las inmaduras. Serán necesarias las citocinas del TH para que haya una proliferación eficiente de la cél. B y para un cambio de isotipo diferente del IgM.

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20 Estimulan a aquellas céls. que tienen un BCR que reconoce a los LPS.

Característica Célula B Célula TInteracción con el Ag Complejo binario: Ig de membrana - Ag Complejo ternario: TCR - Ag - MHCUnión de antígeno soluble Sí NoMHC No se precisan Se precisanNaturaleza química del Ag Proteico, polisacárido, lipídico Mayormente proteico, pero hay algu-

nos lípidos y glicolípidos presentados por moléculas MHC-like (CD1).

Propiedades del epítopo Accesible, hidrofílico. Secuencial o no secuencial.

Péptidos lineales internos producidos por el procesamiento del antígeno y posterior unión al MHC.

Granulomatosis inflamatoria crónica. A causa de una alteración en el gen que da lugar a la NADPH oxidasa,

no se puede producir la explosión respiratoria que se de en neutrófilos y macrófagos. Se forman abcesos y gra-nulomas. Un granuloma es un nódulo de tejido inflamado formado por macrófagos activos y LT, y se asocia a

necrosis y fibrosis.

Síndrome de Chediak-Higashi. Se observa que los lisosomas no pueden fusionarse con los fagosomas por un

defecto en el gen LYST (gen regulador del tráfico lisosomal).

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5. INMUNOGLOBULINAS (I)

Introducción

Las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos (Ab) son el principal elemento de la inmunidad adapta-

tiva y humoral. Éstos pueden aparecer en dos formas: (a) unidos a la membrana sobre la superfi-

cie de los linfocitos B (BCR); (b) en forma soluble en diferentes localizaciones (circulación san-guínea, mucosas, líquidos corporales en general). La interacción entre la Ig y el antígeno es específica y directa.

Nota. No sé exactamente por qué pero en la primera diapositiva del tema se vuelven a hablar de las ca-racterísticas que identifican a la respuesta adaptativa: (a) reconocer lo propio de lo ajeno; (b) especifici-

dad antigénica (gracias a la gran diversidad de linfocitos que tenemos); (c) diversidad (generada por re-combinación somática); (d) memoria (la selección clonal genera tanto linfocito efectores como de me-moria).

Las Ig son formadas por los LB y si se encuentran fijadas a su membrana pasan a denominar-se BCR. Cada cél. B forma un único BCR con una determinada especificidad, aunque su membrana está repleta de éstos (son copias). Aproximadamente disponemos de 109 tipos de LB, por lo que también tenemos 109 tipos de BCR y por tanto una gran diversidad (reconoce-remos a prácticamente todos los antígenos). Comentar que cuando se produce la unión entre el Ag y el BCR, nos encontramos en la fase de reconocimiento de la inmunidad humoral. Si, por el otro lado, los encontramos ya en su forma soluble e interaccionan ya con el Ag, es que estamos en la fase efectora de la inmuni-dad humoral. Las glucoproteínas del plasma o el suero se clasifican tradicionalmente por sus carac-terísticas de solubilidad en albúmina y globulinas, aunque también se pueden clasificar por su migración en un campo eléctrico (electroforesis). La mayor parte de los anticuerpos se en-cuentra en el tercer grupo que migra más rápido de globulinas, denominado gammaglobulinas (inmunoglobulinas).

Estructura de la inmunoglobulina

Todas las moléculas de anticuerpo comparten las mismas características básicas, pero mues-tran una variabilidad importante en las regiones que se unen a los antígenos. La estructura en común es la siguiente:

- Cadenas pesadas. Cada anticuerpo dispone de dos cadenas pesadas o H (heavy) idénticas, cada una de unos 50 kDa. Las cadenas pesadas pueden ser μ (M), γ (G), α (A), δ (D) o ε (E).

- Cadenas ligeras. Cada anticuerpo dispone de dos cadenas ligeras o L (light) idénticas, ca-da una de unos 25 kDa. Las cadenas ligeras pueden ser κ o λ.

Como vemos, el peso total del anticuerpo es de aproximadamente unos 150 kDa. Las cade-nas pesadas y ligeras están unidas por puentes disulfuro y enlaces no covalentes formándose un

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heterodímero (H-L)2. Dentro del anticuerpo podemos hablar de un fragmento cristalino (Fc) y de dos fragmentos de unión al antígeno (Fab). Esta división se realizó al tratar la Ig con papaína, haciendo que ésta se dividiera en una Fc y un Fab. Paralelamente, si se ataca a la Ig con mercaptoetanol (un reductor), el heterodímero se reducía (se perdían los enla-ces disulfuro) y por tanto dividíamos la Ig en sus cadenas pesadas y ligeras que la conforman.

Tanto la parte N-terminal de las cadenas ligeras como la de las cadenas pesadas son regiones variables, son las que se unen al antígeno. El resto de la Ig es constante, y se encarga de interactuar con los receptores de la Fc de las Ig o con el sistema del complemento. Como en toda proteína, en las Ig podemos distinguir diferentes niveles de estructura. La estructura primaria con-siste en la suma de la secuencia peptídica de la región va-riable y de la región constante. La estructura secundaria es el plegamiento (principalmente) en hoja β antiparalela. La es-tructura terciaria es cuando aparecen unos dominios globulares compactos (dominio Ig) que están conectados con dominios vecinos por la cadena polipeptídica situada fuera de las ho-jas con plegamiento β. Finalmente, la estructura cuaternaria es la interacción entre los domi-nios globulares de las cadenas pesadas y ligeras adyacentes, formando dos dominios funcio-nales: (a) dominio de unión al antígeno, y (b) dominio de actividad biológica/función efectora.

Dominio Ig

El dominio inmnuglobulina (Ig) está presente en una gran cantidad de proteínas del sistema inmunitario (y otras que no pertenecen al mismo) además de en las inmunoglobulinas. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas contienen estas unidadas homólogas que se repiten (dominios Ig), cada una de unos 110 aas de longitud y que se repliegan en una estructura glo-

bular. Un dominio Ig contiene dos capas de láminas β, compuestas cada una de ellas por tres a cinco hebras de cadenas polipeptídicas antiparalelas. Las dos capas de hebras se mantienen unidas por un puente disulfuro21 y las hebras adyacentes están conectadas por bucles cortos. Se cree que el dominio Ig facilita interacciones entre dominios no homólogos. Está presente en muchas moléculas: receptores Fc, TCR, MHC, moléculas de adhesión, etc. En las cadenas pesadas los dominios Ig están repetidos 4-5 veces, mientras que en las cadenas ligeras es-

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21 Dos cisteínas separadas por unos 60 aas.

Fragmentos proteolíticos de una molécula de IgG. La digestión con papaína produce la separación de dos lugares de fijación al antígeno (fragmentos Fab) de la porción de la molécula de IgG que se une al complemento y a los receptores Fc (fragmento Fc). La pepsina, en cambio, generaría un único fragmento de unión al antígeno bivalente, F(ab’)2.

tán repetidos dos veces. Dentro de estos dominios Ig, dis-tinguimos unos dominios variables (V) de otros que son constantes (C).

- Dominios variables (V). Es el dominio de unión al antígeno, ahora veremos en qué se diferencian respecto a los dominios Ig constantes. Se localizan en el extremo N-terminal de las cadenas pesadas (VH) y de las ligeras (VL).

- Dominios constantes (C). Determinan la actividad

biológica de la Ig. - IgA, IgD, IgG. CH1, región bisagra (hinge),

CH2, CH3. La región bisagra hace que estas Ig tengan una mayor flexibilidad.

- IgE, IgM. CH1, CH2, CH3, CH4.

La mayoría de las diferencias en la secuencia entre diferentes anticuerpos se limitan a tres breves segmentos de la región V de la cadena pesada y a tres segmentos de la región V de la cadena ligera. Estos segmentos se conocen como segmentos hipervariables o regiones determi-

nantes de la complementariedad (CDR), y que corresponden a tres bucles que sobresalen y que conectan las hebras adyacentes de las láminas β que forman los dominios V de las proteínas de las cadenas pesadas y ligeras de la Ig. Estos tres segmentos (CDR) están juntos en el espacio

tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno (son complementarias al mismo, de ahí que se hable de CDR). Las variaciones en la longitud y en la secuencia de las CDR son las responsables del amplio rango de especificidades que presentan los anticuerpos.

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IgG secretada. Podemos ver los diferentes dominios Ig constantes y variables. Entre el CH1 y el CH2 está la re-gión bisagra que aumenta la flexibilidad de la Ig. Vemos también como los puentes disulfuro están tanto entre las dos cadenas como en el propio dominio Ig.

Regiones hipervariables en IgA. Como vemos, los aas más variables se agrupan en tres regiones hipervariables: CDR1, CDR2 y CDR3. Los dominios Ig variables presentan 9 cadenas beta mientras que los dominios Ig cons-tantes presentan 7 cadenas.

Si lo pensamos, cada Ig dispone de cuatro dominios Ig variables: dos de la cadena pesada y dos de la cadena ligera. El resto de zonas del dominio Ig variable que presentan una menor variabilidad se conocen como regiones estructurales o frameworks (FR). Actúan a modo de esqueleto donde se apoyan las CDR y hay cuatro por cada región variable. Las regiones FR de diferentes anti-cuerpos se pueden superponer, cosa que no hacen las CDR.

Dominios constantes de las Ig

Hasta ahora hemos hablado de los dominios variables (V) tanto de la cadena ligera como de la pesada (VL + VH), que serán los que interaccionarán con el epítopo del antígeno. A conti-nuación hablaremos de las diferentes regiones constantes (C):

- Dominios CH1 y CL. Son los que están unidos a los dominios variables. Permiten exten-der los brazos Fab facilitando la interacción con el Ag y aumentando al máximo la capacidad de rotación. Mantienen unidos VH y VL por los puentes disulfuro entre las cadenas H-L. Contribuyen en la generación de diversidad de los anticuerpos aumen-tando el número de interacciones estables posibles en VH y VL.

- Región bisagra (hinge). Es una región rica en prolinas que une las regiones Fab y Fc de las cadenas pesadas γ (G), δ (D), y α (A). Proporcionan flexibilidad a la molécula, de tal manera que una Ig puede hacer que cada uno de sus dos brazos interaccione con un único epítopo (que serán iguales entre sí).

- Dominios CH2, CH3 y CH4. Son los que conforman la Fc. Son los dominios que interac-cionarán con el sistema del complemento o con un receptor para Fc.

- Dominios CH2 (ε y µ). Serían la bisagra. Función desconocida.- Dominios CH2-CH2 (IgA, IgD, IgG) y CH3-CH3 (IgE, IgM). Están separados por cade-

nas de oligosacáridos, lo que los hace más accesibles. A su vez, estos oligosacá-ridos otorgan especificidad en la interacción con los receptores Fc o el comple-mento.

- Dominios carboxi-terminal [CH3-CH3 (IgA, IgD, IgG) y CH4-CH4 (IgE, IgM)]. Es el do-minio que determina si la Ig es soluble (se secreta) o si se fija a la membrana. Inmunoglobulina soluble = slg; inmunoglobulina de membrana = mlg.

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Flexibilidad de las moléculas de anti-cuerpo. Los dos puntos de unión al antígeno de un monómero de Ig pue-den fijarse simultáneamente a dos de-terminados separados por distancias variables. (A) Se representa una molé-cula de Ig uniéndose a dos determi-nantes muy separados sobre una su-perficie celular. (B) El mismo Ab está unido a dos determinantes próximos.

Isotipos de Ig

Un isotipo es una clase de anticuerpo determinada por la región constante de la cadena pe-sada. Existen cinco isotipos, dos de ellos con diferentes subclases. Las diferentes clases o iso-tipos tienen propiedades fisico-químicas y biológicas diferentes. Hay diferentes receptores Fc pa-ra las IgG, las IgA y las IgE: únicamente estas tres Ig podrán funcionar a modo de opsoninas y facilitar la fagocitosis.

IgG

Las cuatro diferentes subclases de IgG se distinguen por sus diferencias de tamaño, de la re-

gión bisagra y de la posición de los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. Las diferentes subclases son codificadas por diferentes CH con un 90-95% de homología.

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Clase Cadena pesada Sublcases Cadena ligera Fórmula molecularIgG γ γ1, γ2, γ3, γ4 κ o λ γ2κ2IgG γ γ1, γ2, γ3, γ4 κ o λ

γ2λ2

IgM µ Ninguna κ o λ (µ2κ2)nIgM µ Ninguna κ o λ(µ2λ2)n

IgM µ Ninguna κ o λ

n = 1 o 5IgA α α1, α2 κ o λ (α2κ2)nIgA α α1, α2 κ o λ

(α2λ2)n

IgA α α1, α2 κ o λ

n = 1, 2, 3 o 4IgE ε Ninguna κ o λ ε2κ2IgE ε Ninguna κ o λ

ε2λ2

IgD δ Ninguna κ o λ δ2κ2IgD δ Ninguna κ o λδ2λ2

Isotipos de Ig. Vemos como las IgG tienen cuatro tipos de cadenas pesadas. Éstas, combinadas con las dos lige-ras (κ, λ) dan lugar a un total de ocho combinaciones. Las IgM y las IgA pueden formar polímeros: las IgM sue-len formar pentámeros (aunque también pueden estar en su forma monomérica) y las IgA suelen estar en forma de dímeros (aunque también hay trímeros, tetrámeros...).

ESTRUCTURA DE LES DIFERENTS SUBCLASSES D’IgGs

Codificats per diferents CH amb un 90-95% d’homologiaDiferència a nivell de tamany i de la regió bisagra i la posició dels ponts disulfurentre cadenes pesades

DiferDiferèènciesncies ActivitatActivitat BiològicaBiològica

Subclases de IgG. Cada subclase tiene una diferente función biológica.

Las IgG son las inmunoglobulinas más abundantes en el suero (10 mg/mL), representan el

80% del total de Igs. Predominan en la respuesta secundaria (en la primaria predominan las IgM). Entre las diferentes subclases de IgG hay, como es lógico, alguna diferencia por lo que respecta a la capacidad para realizar determinadas funciones:

- Unión a receptores Fc. Las IgG con mayor capacidad de opsonización son las IgG1, les siguen las IgG3 y las IgG4. Las IgG2 no tienen una gran capacidad.

- Activación del complemento22. Aquí el orden cambia: las IgG3 tienen una mayor capa-cidad para activar el complemento, les siguen las IgG1 y después las IgG2. Las IgG4 no tienen esta capacidad.

- Barrera placentaria. Las IgG1, las IgG3 y las IgG4 pueden atravesar la barrera placen-taria.

Las IgG además pueden unirse al receptor Fc

neonatal (FcRn), incrementando su vida me-dia hasta unos 23 días (la más elevada de entre todas las inmunoglobulinas). Este re-ceptor permite el paso de las IgG a través de la placenta y del epitelio intestinal y, ade-más, es el resposable del incremento de la vida media de las IgG en el adulto. ¿Por qué? El adulto expresa FcRn en el endotelio y

en muchos tejido epiteliales. Este receptor permitirá que las IgG interaccionen con él y sean endocitadas. Tras la endocitosis, parte del contenido endocitado será degradado en lisosomas y otra parte (las IgG) volverán de nuevo al espacio extracelular. Esto pro-tege a las IgG del posible efecto de las pro-teasas. En un inicio, el feto precisa de los anticuerpos de la madre para combatir a los microorganismos, de ahí que se transfundan IgG por medio de este FcRn. Cuando el ni-ño ya ha nacido, continuará recibiendo an-ticuerpos de la madre a través de la leche, que captará gracias a los FcRn que hay en su epi-telio intestinal. Progresivamente el niño podrá ir formando sus propias inmunoglobulinas.

IgD

Las IgD tienen una concentración bastante baja en suero (30 µg/mL), representando el 0,2%

de las Igs totales. Esta Ig junto a las IgM son las dos principales Igs que coexisten en la mem-

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22 A pesar de que ya lo daremos más adelante en profundidad, comentar que el sistema del complemento es un mecanismo efector soluble que permite destruir los patógenos.

Endocitosis de IgG. En clase se comentó que en reali-dad el mecanismo era una pinocitosis: se capturan pro-teínas (entre ellas IgG) que están a un pH fisiológico (7,4) y al pH del endosoma (2,0 aprox.) se producirá la interacción entre las IgG y el FcRn, haciendo que cuando se envie de nuevo el endosoma hacia la mem-brana para reciclar la bicapa lipídica, las IgG perma-nezcan intactas y se libren de la FcRn al subir el pH.

brana de los LB naive. Cuando éstos son activados pasarán a seleccionar un único isotipo. Las IgD tienen una vida bastante corta: aproximadamente de tres días.

IgE

Las IgE tienen una concentración mucho más baja (cien veces menor) que las IgD (0,3 µg/mL), aunque está aumentada en los individuos que padecen alergia. Las IgE pueden unirse a los receptores Fc de eosinófilos, basófilos y mastocitos. Recordemos que los mastocitos (y los basófilos) tienen unos receptores Fc de muy alta afinidad que les permite unir IgE a concen-traciones muy bajas. Se las relaciona con mecanismos de hipersensibilidad y de defensa contra

parásitos. A pesar de tener una vida corta (2,5 días), esta vida puede aumentarse si se fija al receptor Fc de los tipos celulares comentados. Cuando una IgE unida al receptor Fc de un mastocito (p. ej.) interacciona con un antí-geno, se produce una vía de señalización intracelular que culmina con la liberación del con-tenido de los gránulos (histamina principalmente) del mastocito, dando lugar la reacción de hipersensibilidad23.

IgA

Las IgA, en su forma monomérica, representan entre el 10 y el 15% de las Igs del suero (3,5 mg/mL). Además, la IgA es la principal inmunoglobulina de las secreciones de las mucosas, la leche, saliva, lágrimas, etc. La IgA es la que más se produce a lo largo del día (5-15 g/día) y tiene una vida media de unos 6 días. Las IgA se producen en los linfoci-

tos B de la lámina propia y se secreta en forma de un dímero que se mantiene unido mediante una cadena J que se ela-bora de manera coordinada. En contras-te, la IgA sérica es normalmente un mo-nómero que carece de cadena J. La ca-dena J facilita el transporte del dímero de IgA e impide su degradación. Desde la lámina propia, la IgA debe transportarse a través del epitelio hasta alcanzar la luz y esta función está mediada por el recep-

tor de poli-Ig. Este receptor se sintetiza en las céls. epiteliales de las mucosas y se expresa en sus superficies basal y lateral. Es una glucoproteína con cinco dominios extracelulares homólogos a los dominios

Ig. La IgA dimérica secretada que contiene la cadena J se une al receptor de poli-Ig asociado

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23 Las segundas exposiciones a alérgenos son siempre peores y más peligrosas que las primeras.

SECRECIÓ D’IMMUNOGLOBULINES A LES MUCOSES: TRANSCITOSI

Transcitosi: Transport d’Ig a través de l’epiteli (gastrointestinal, urogenital, mamari...)Transport depenent de les propietats de la regió constant de la Ig. Interacció Ig - Receptor Fc (Receptor Poly-Ig)

Secreción de IgG en las mucosas (transcitosis).

a la membrana de las céls. epiteliales de las mucosas. Este complejo se endocita al interior de la cél. epitelial y se transporta activamente en vesículas a la superficie luminal. Aquí, el receptor de poli-Ig se escinde proteolíticamente, sus dominios transmembranario y citoplas-mático se quedan unidos a la cél. epitelial y el dominio extracelular del receptor que trans-porta la molécula de IgA se libera a la luz intestinal. El componente del receptor asociado a la IgA se llama componente secretorio.

IgM

Las IgM representan un 5-10% de las Igs totales (1,5 mg/mL suero). Son las principales Ig que están en la respuesta primaria y las primeras en aparecer en una respuesta humoral. General-mente encontraremos las IgM en forma de pentámero (forma secretada). El pentámero se for-ma por medio de puentes disulfuro que unen Cµ4/Cµ4 y Cµ3/Cµ3. Las Fc quedan en el centro y las Fabs quedan en la periferia (interacciona hasta con 10 determinantes antigénicos). Cada pentámero tiene un péptido adicional denominado cadena J que también se unirá por puen-tes disulfuro. Las IgM activan al complemento de una manera mucho más eficiente que las IgG (res-puesta de 100 a 1.000 veces superior). En su forma monomérica están en forma de receptor de LB. Su vida media es de unos cinco días.

Determinantes antigénicos de las Ig (pág. 88 Abbas)

Las moléculas de anticuerpos son proteínas y, por consiguiente, pueden ser inmunógenas. Exis-ten tres grandes clases de determinantes antigénicos en las Ig:

- Determinante isotípico. Son los determinantes presentes en las regiones constantes de las diferentes clases de cadenas pesadas y ligeras de las Ig. Los determinantes isotípi-cos nos dicen a qué isotipo pertenece una Ig.

- Determinante alotípico. Son los determinantes presentes en las regiones constantes de cada uno de los alelos de las cadenas pesadas pesadas y ligeras de las Ig.

- Determinante idiotípico. Son los determinantes exclusivos de moléculas de anticuerpos individuales. En otras palabras: son los determinantes presentes en las regiones varia-bles de las Ig. Un idiotopo es cada uno de los determinante antigénicos de la región variable, y un idiotipo es la suma de los idiotopos de un anticuerpo.

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6. INMUNOGLOBULINAS II

Repertorio de anticuerpos

Cuando hablamos de un repertorio de anticuerpos nos referimos al sumatorio de especificida-des antigénicas, que puede superar las 108 en un individuo. Este repertorio también puede ser definido como el sumatorio de BCRs o el sumatorio de clones de los linfocitos B. Si dis-

ponemos de unos 25.000 genes, ¿cómo es posible que tengamos semejante diversidad? Durante mucho tiempo esta pregunta se mantuvo sin responder. El modelo genético que pretendiera explicar esta diversidad debía tener presente la estructura de las Igs, y concre-tamente dos puntos sobre la misma: (a) que tienen una cadena pesada y otra ligera, con una re-

gión variable (V) y otra constante (C); (b) y que existen diferentes isotipos de Ig con la misma espe-

cificidad antigénica (es decir, puede haber una IgM y una IgG con la misma especificidad an-tigénica). Se bajaron algunas hipótesis: la teoría de la línea germinal, la de la diversidad somáti-ca y el modelo (postulado) de los dos genes, que ya se acercaba bastante. La teoría de la di-versidad somática proponía que la recombinación genómica que explicaba la gran especifi-cidad de Igs se daba en el LB diferenciado, sin explicar por qué los cambios genómicos se reducían a una zona en concreto. El modelo de los dos genes proponía que había un gen para la región variable y otro para la constante (pero no lo pudieron demostrar). No fue hasta 1976 en que Tonegawa y Hozumi propusieron el modelo de la reordenación de los genes de las Igs.

Modelo de Tonegawa y Hozumi

El modelo de la reordenación de los genes de las Igs se demuestra comparando el genoma de una célula embrionaria con el de una célula de mieloma (cél. plasmática inmortal). Este genoma fue digerido con enzimas de restricción y los productos de la digestión se hicieron pa-sar por un gel de agarosa para hacer una separación diferencial por tamaño. A continuación se añadió una sonda que reconocía una parte del gen que codifica para la región V de la Ig (Southern Blot). Se observó como el fragmento con la sonda tenía un tamaño distinto en fun-ción de si se trataba del genoma digerido de la cél. embrionaria o de la cél. de mieloma. En la cél. del mieloma, por la recombinación, se había omitido un punto de restricción, por lo que la digestión de los dos genomas es distinta. Se llegaron a dos conclusiones:

- Genes separados. Los genes que codifican para las regiones V y C de las inmunoglobu-linas son distintos.

- Recombinación somática. El DNA genómico de los genes de las Ig se reordena a lo lar-go de los diferentes estadios de maduración de la cél. B a partir de cél. madre. Como no se da en la línea germinal, este proceso se denomina recombinación somática.

Organización de los genes de las Igs

La región variable se codifica a partir de múltiples segmentos génicos V, D y J. La VH se cons-truye a partir de segmentos V, D y J y la VL se construye a partir de segmentos V y J. Por el

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otro lado, la región constante se codifica a partir de un número limitado de segmentos géni-cos C. El locus que codifica para la cadena pesada está en el cromosoma 14, el locus que co-difica para la cadena ligera (κ) está en el cromosoma 2, y el locus que codifica para la cadena ligera (λ) está en el cromosoma 22. En cada locus habrán diferentes genes, separados entre sí, algunos de los cuales se juntarán para dar lugar a un “gen” que codificará una parte de la inmunoglobulina; esto es lo que se conoce como la organización multigénica de los genes de las inmunoglobulinas. En el extremo 5’ de cada uno de los locus de las Ig hay un grupo de segmentos génicos

V. Los números de segmentos de los genes V varían mucho entre los diferentes locus de las Ig y de unas especies a otras. P. ej., hay aproximadamente 35 genes V en el locus de la cadena ligera κ humana y aproximadamente 100 genes funcionales en el locus de la cadena pesada humana. Upstream respecto a los segmentos V encontramos un segmento guía (L, de leader) que codifica los 20-30 aas N-terminales de la proteína traducida. Estos aas son moderada-mente hidrófobos y constituyen el péptido señal. Downstream respecto a los segmentos V es-tán los segmentos J. Únicamente en el locus que codifica para la cadena pesada encontramos unos segmentos D entre los segmentos V y J.

Hasta ahora hemos visto la ubicación de los segmentos génicos que dan lugar a zonas varia-

bles. Ahora bien, ¿qué ocurre con las zonas constantes? Pues que se codifican a partir de di-ferentes segmentos C que están hacia el extremo 3’ de los locus de las Ig. En los seres huma-nos, el locus de la cadena ligera κ tiene un único gen C (Cκ), y el locus de la cadena ligera λ tiene cuatro genes C funcionales (Cλ). El locus de la cadena pesada de las Ig tiene nueve ge-nes C (CH), dispuestos en una organización en tándem, que codifican las regiones C de los nueve isotipos y subtipos diferentes de las Ig (Cµ, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ y Cε). El orden de los genes CH está relacionado con la expresión secuencial de los diferentes isotipos a

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Organización de los locus de las Ig. Se muestran los locus de la cadena pesada, la cadena ligera κ y la cadena ligera λ. Únicamente se han dibujado los genes funcionales, los pseudogenes se han omitido. Los exones y los intrones no están dibujados a escala. Cada gen CH se ilustra en una sola caja, pero está formado por diferentes exones (tal y como se muestra para Cµ). L = leader; V = variable; D = diversity; J = joining; C = constant, y enh = enhancer.

lo largo de la maduración de los linfocitos B. Si nos fijamos, los dos primeros genes C en expre-sarse son el Cµ y el Cδ, y precisamente el LB naive expresa en su membrana los isotipos IgM e IgD.

Recombinación de los genes de las Igs

Una vez hemos descrito la “anatomía” de los locus de las Igs veremos cómo se produce la recombinación (la unión de los diferentes fragmentos génicos). Estrictamente lo que sucederá es una serie de rupturas bicaternarias en los extremos de ADN de los fragmentos génicos y la pos-terior unión para producir genes funcionales.

- Cadena pesada. En la cadena pesada se producirá una primera rotura y una posterior unión que dará lugar a la formación de un complejo D-J. Este primer reordenamiento se da en el DNA germinal (precursor del linfocito). El siguiente paso será la unión V-DJ. Esta reordenación de segmentos génicos separados funcionalmente da lugar al gen

funcional que perseguíamos formar. Lo que hemos hecho ha sido unir un fragmento V con uno D y otro J, y toda una ristra de genes C downstream respecto a J. Estos genes C que tenemos nos van a permitir generar una Ig con la misma región variable pero con diferentes regiones constantes (V + D + J = VH). Este gen será transcrito y nos dará un tránscrito primario que pasará por un proceso de splicing posterior.

- Cadena ligera. En la cadena ligera sucederá exactamente lo mismo que en la cadena pesada, sólo que como el locus que da lugar a las cadenas ligeras no tiene fragmentos génicos D, únicamente se da la unión entre el V y el J: unión VJ (V + J = VL).

Para que las rupturas bicatenarias se produzcan en unos puntos concretos y no en zonas aleatorias del genoma existen unas señales: las secuencias de reconocimiento de recombinación (RSS; recombination signal sequences). Estas secuencias están localizadas en dirección 3’ a cada uno de los segmentos de los genes V, en dirección 5’ a cada uno de los segmentos J y flranqueando a cada uno de los segmentos D a ambos lados. Las RSS están formadas por una

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Formación de la unión VJ (cadena ligera). A mi parecer, el DNA recombinado dará lugar a un gen funcional con una zona V(D)J (en la ilustración parece ser que esta recombinación se ha dado en el locus de la Ig de la cadena ligera κ) y varios (o uno solo) exones C, pudiendo generar Igs con la misma zona variable y diferente zona constante (isotipos de Igs distintos con la misma especificidad antigénica.

secuencia muy conservada de 7 nucleótidos, denominada heptámero, localizada adyacente a la secuencia codificadora, seguida por un espaciador de exactamente 12 o 23 nucleótidos no conservados, seguido por una secuencia de 9 nucleótidos muy conservada y rica en AT de-nominada nonámero. Los espaciadores de 12 y de 23 nucleótidos corresponden a aproxima-damente una o dos vueltas de hélice de DNA, respectivamente, y probablemente sitúan dos heptámeros distintos en posiciones que son accesibles simultáneamente a las enzimas que catalizan el proceso de recombinación.

Los enzimas que se encargan de efectuar los cortes en determinadas partes del DNA debi-damente señaladas por las secuencias RSS son las recombinasas V(D)J. Tenemos dos recombi-nasas (RAG-1 y RAG-2; Eng: recombination-activating gene), ambas necesarias, que se expre-san en un estadio concreto de la maduración del linfocito B (células pro-B y pre-B). La re-combinación está regulada por la presencia o no de estos enzimas, por lo que la recombina-ción se dará únicamente en esos dos estadios de la cél. B. Ademas de estas dos recombinasas, hay otros enzimas que son importantes para que se dé la recombinación:

- Terminal deoxinucleotidil transferasa (TdT). Tras el corte del DNA introduce nucleótidos en el extremo recién cortado, por lo que se genera variabilidad. Atención, este enzima únicamente está presente en la cél. pro-B. Podríamos llegar a prescindir de este enzi-ma, pero del resto no.

- Genes del mecanismo de reparación del DNA. Son genes que se expresan de manera constitutiva y que serán importantes para reenganchar los extremos cortados del DNA. Estos genes codifican para las siguientes proteínas: DNA-PK, Artemis, Ku70/Ku86, XRCC4 y la ligasa IV.

Proceso de la recombinación de los genes de las Igs

En primer lugar se da la sinapsis, que consiste en la aproximación de los dos segmentos géni-cos que se quieren acoplar. Para que se produzca esta sinapsis tiene que haber un reconoci-miento de las señales RSS por parte de RAG-1/2. Este reconocimiento llevará a la formación de un bucle cromosómico que se va haciendo mayor a medida que las dos secuencias géni-cas, en un principio separadas, se van acercando. Atención, la recombinación entre dos segmentos únicamente será posible si se da la regla 12/23. Esta regla dictamina que la re-combinación se da entre un segmento con un RSS de una vuelta y otro segmento con un RSS

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Seqüències de reconeixement de recombinació (RSSRSS, recombination signal sequences)Flanquegen cada fragment V, D i J germinal i són senyals pel reordenarment gènic

ELEMENTS I GENS DE LA RECOMBINACIÓ SOMÀTICA

• Recombinases V(D)JExpressió específica a limfòcits (cèl.lula pro-B i pre-B)Gen 1 activador de la recombinació (RAG-1, recombination-activating gene 1)Gen 2 activador de la recombinació (RAG-2, recombination-activating gene 2)• Terminal deoxinucleotidil transferasa (TdT, terminal deoxynucleotidy tranferase)Expressió específica a limfòcits (cèl.lula pro-B)• Diferents gens del mecanisme de reparació del DNAExpressió ubíquaDNA-PK, Artemis, Ku70/Ku86, XRCC4, Lligasa IV

RSS de vuelta única o de doble vuelta. La presencia de un espaciador con más o menos nucleótidos permite que el RSS sea de vuelta única o de doble vuelta.

de doble vuelta. Con esto aseguramos que: (a) no se unan dos fragmentos del mismo tipo (p. ej., D-D), (b) y que se produzca una unión ordenada (V-D-J).

Una vez el bucle se ha formado, se da la escisión, que consiste en la rotura de las dos cade-nas de DNA. El corte lo realizarán las RAG-1/2 en el punto entre las secuencias codificadoras y su secuencia RSS. Sobre estos extremos habrá un procesado que consistirá, por ejemplo, en la adición de nucleótidos por parte de la TdT y así generar una mayor diversidad. Finalmente se dará una unión por los mecanismos de reparación de DNA que tiene la propia célula. Como hemos dicho, para que se dé la recombinación nos tendremos que librar de una parte del DNA en el que encontramos también las secuencias RSS. Si los dos fragmentos génicos que deben ser unidos se encuentran en la misma dirección, se realiza una unión por

deleción en la que se forma un anillo residual de DNA que contiene las dos secuencias RSS. En cambio, si los dos fragmentos a unir están orientados en direcciones opuestas, se realizará una unión por inversión (sin formación de anillo de DNA).

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Regla 12/23. Observamos como los diferentes fragmentos V, D y J presentan RSS de tipos alternos (con espa-ciador de 12 y de 23). Por ejemplo, un segmento génico V del locus que da para la cadena pesada (H) presen-ta un RSS de doble vuelta en el extremo 3’. Este RSS tendrá que interactuar obligatoriamente con uno de vuel-ta única, que precisamente lo encontramos en 3’ y 5’ del segmento D.

Unión por deleción (izquierda) y unión por inversión (derecha).

Cuando se produce la escisión entre la RSS y la secuencia codificante, RAG-1/2 corta una de las dos hebras del DNA. Esto deja un extremo OH 3’ que realizará un ataque nucleofílico sobre la otra cadena, para después formar una horquilla covalente (un bucle). Este bucle se formará en los dos extremos de DNA que deben ser enganchados (oséase, entre los dos extremos de las dos regiones codificantes que se enfrentan entre sí). Estos dos bucles sufrirán un corte aleatorio por medio de una endonucleasa, generando lugares de adición para las polimerasas. Estas polimerasas irán añadiendo nucleótidos complementarios dando lugar a secuencias pa-lindrómicas (los nucleótidos añadidos se denominan nucleótidos-P). Paralelamente, en los ex-tremos de las cadenas, podemos añadir nucleótidos nuevos, hasta 15, gracias a la acción de la TdT (nucleótidos-N). Estos dos mecanismos generan variabilidad ya que se forman aleato-riamente secuencias ausentes en la línea germinal.

La adición de nuevas secuencias que no estaban presentes en la línea germinal pueden ge-nerar, efectivamente, una utilísima diversidad. No obstante, también es probable que la in-corporación de nuevos nucleótidos modifique los codones de tal manera que, al transcribir el gen y traducir el mRNA, nos encontremos con un codon de STOP en medio de la secuen-cia. Esto es lo que se conoce como reordenamiento no productivo. Si esto no sucede, es decir, si se genera una secuencia de aas alternativa a la secuencia original, hablamos de un reorde-

namiento productivo. Existe una flexibilidad de unión entre los diferentes fragmentos génicos: ésta no debe darse por unos nucleótidos específicos. Toda esta variabilidad explica, por ejemplo, la presencia de las zonas CDR en los do-minios Ig de las zonas variables de las cadenas pesadas y ligeras de las Ig. A modo de resumen, recordemos que los reordenamientos V-J, D-J y V-DJ se dan completamente al azar y que eso también hace que la generación de las especificidades de los anticuerpos sea al azar. Durante la ontogenia de la cél. B se observa un proceso de recombinación secuencial. En primer lugar se reordena la región variable de la cadena pesada: primero se da la unión DJ y después la interacción V-DJ. Así generamos una única secuencia génica VDJ. Por el otro

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ADDICIÓ DE NUCLEÒTIDS-P i -N EN LA UNIÓ V(D)J: DIVERSITAT

Addició de Nucleòtids-P Addició de Nucleòtids-N

La ruptura del bucle genera llocs per l’addició de nucleòtids

(ruptura aleatòria)

Polimerases afegeixennucleòtids complementaris

generant seqüències palindròmiques(Nucleòtids-P)

La ruptura del bucle genera llocs per l’addició de nucleòtids

(ruptura aleatòria)

TdTTdT afegeix nucleòtids-N (fins 15)i enzims de reparació afegeixen

nucleòtids complementaris

Diversitat

Generació aleàtoria de seqüències absents en la línia germinalAdición de nucleótidos-P (izquierda) y de nucleótidos-N (derecha). La horquilla o bucle (hairpin) se formó por la rotura inicial de una de las hebras de DNA y el posterior ataque nucleofílico realizado por ésta hacia la otro hebra. La ruptura al azar despliega el bucle, permitiendo la acción de las polimerasas y de la TdT.

lado se da el reordenamiento de la región variable de la cadena ligera, que si recordamos úni-camente dispone de segmentos V-J (por lo que se genera una única secuencia génica VJ). Rei-teramos, ya que es importante tenerlo presente, que estos sucesos ordenados tienen lugar, cada uno de ellos, al azar.

Atención, las TdT se expresan en el estadio de pro-B y ya está, por lo que en la cadena ligera no se podrán añadir nucleótidos-N.

Exclusión alélica

La exclusión alélica explica que únicamente se exprese el gen reordenado de uno de los dos alelos. Es por eso que cada cél. B posee una especificidad antigénica única (expresa un solo tipo de receptor). En primer lugar se empieza con el reordenamiento de la cadena pesada. Si éste es productivo, se inhibe el otro alelo. Si, por el otro lado, el reordenamiento no es productivo, se inicia el reordenamiento con el otro alelo. Si sigue sin darse un reordenamiento producti-vo, la célula entrará en muerte celular. Recordemos que la cadena pesada será en un inicio del tipo µ y que despúes se producirá el cambio de isotipo. Supongamos que se obtiene una cadena µ productiva. Ahora pasaremos a formar una cadena ligera productiva. Para esta ocasión tendremos cuatro oportunidades (2 alelos κ y otro λ; generalmente se empieza con el κ). En el momento en que se produzca una reorde-namiento productivo de la cadena ligera, se inhibirán el resto de alelos que quedaban por recombinar (de cadena ligera).

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Cél. madre hematopoyética → Cél. linfoide → (reordenamiento cadena pesada) → Cél. pro-B → (fin reordena-miento cadena pesada) → Cél. pre-B → (reordenamiento cadena ligera) → Cél. B inmadura

BASE PER A L’ESPECIFICITAT ANTIGÈNICA ÚNICA DE LA CÈL.LULA BEXCLUSIÓ AL.LÈLICA

Exclusió al.lèlica: Només s’expressa el gen reordenat d’un dels al.lels.Mecanisme pel qual la cèl.lula B posseeix una especificitat antigènica única

Cadena P inhibeix el reordenamentdel segon al.lel P i indueix el reordenament de la cadena N

P i N inhibeixen el reordenamentdel segon al.lel k i indueixen elreordenament de la cadena O

P i N inhibeixen el reordenamentdel la cadena O

P i O inhibeix el reordenamentdel segon al.lel O

Exclusión alélica. Este mecanismo asegura que el linfocito B exprese una especificidad antigénica única.

Un linfocito B no saldrá de la médula ósea si reconoce a un antígeno propio. Si eso se produ-ce, se podrá dar lo que se conoce como edición del receptor, que consiste en que se volverá a producir una recombinación del gen que codifica para la cadena ligera (se vuelve a formar un segmento VJ). Si éste procedimiento da lugar a una unión no productiva o a una producti-va que sigue reconociendo a un antígeno propio, la célula entrará en apoptosis.

Mecanismos generadores de diversidad.

Hasta ahora hemos visto varios mecanismos que generan diversidad: (a) los múltiples segmen-

tos V, D y J en la línea germinal; (b) la diversidad de combinación V-J y V-D-J; (c) la flexibilidad de

unión V-J y V-D-J; (d) la adición de nucleótidos P y N; (e) la combinación de las asociaciones de cadenas pesadas y ligeras; y, finalmente, (f) la hipermutación somática.

Hipermutación somática

Como su nombre indica, la hipermutación somática consistirá en un incremento de las muta-ciones en la región variable ordenada. Para hacernos una idea, cuando replicamos el DNA aparecen mutaciones cada 108 pb; en la hipermutación somática esta frecuencia aumenta hasta 103 pb. Esto quiere decir que cada dos divisiones aparece una mutación. Este incre-mento de mutaciones (hipermutación) es somática porque se da una vez el gen que codifica para la cadena, ligera o pesada, se ha recombinado. Concretamente, el momento de pro-ducción de estas mutaciones se da cuando la célula B es activada (al interaccionar con un an-tígeno) y empieza a proliferar. Además de comentar que las mutaciones afectan a la zona variable, se seleccionan aquellas que afectan a las regiones CDR. Se irá haciendo una selección positiva que consistirá en que únicamente aquellas céls. B que presenten una mayor capacidad de interacción con el antígeno (mayor afinidad), sobrevivirán. La respuesta secundaria (o terciaria y sucesivas) será más efectiva y fulminante precisamente por eso: se han seleccionado previamente a las céls. B que interaccionan mejor con el antígeno. La variabilidad de CDR1, CDR2 y CDR3 está determinada por el segmento variable y por

la hipermutación somática (V en CDR1-2; VDJ o VJ en CDR3). Además, la variabilidad en CDR3 está determinada por otros factores adicionales: la flexibilidad de unión y la adición de nucleótidos-P y nucleótidos-N.

Cálculo teórico de la diversidad de anticuerpos

Si tenemos en cuenta la cantidad la cantidad de segmentos V, D y J en los locus para la ca-dena pesada y las dos ligeras, nos sale (por combinatoria) una diversidad del orden de 106. Para llegar a valores de 109-1011 precisamos de la flexibilidad de unión, la adición de nucleó-tidos P y N, y de la hipermutación somática.

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7. INMUNOGLOBULINAS III

Expresión de las inmunoglobulinas

Como sabemos, las células B proceden, en primera instancia, de la célula precursora hematopoyética pluripotencial (HSC; Eng: hematopoietic stem cell). Ésta da lugar al precursor linfoide y ya en esta célula se va a dar un primer reordenamiento del gen de la cadena pesada. Se llegará al estadio de pro-B en el que se proseguirá con dicho reordenamiento y, cuando se finalice, ya hablaremos de una célula pre-B que expresa en su membrana la cadena pesada µ. En el paso de pre-B a la célula B inmadura se da el reordenamiento del gen de la cadena ligera y la célula B inmadura expresará una IgM en su membrana. Finalmente, la cé-lula B madura expresa en su membrana tanto IgM como IgD (mIgM + mIgD). Por tanto, como podemos observar, podemos llegar a discernir entre los diferentes estadios de céls. B únicamente observando las Igs que expresan en su membrana. Una vez se llega al estadio de B madura, y si no reconoce a un Ag propio, saldrá en forma de B naive de la médula ósea en dirección a los ganglios linfáticos, donde podrán interactuar con un Ag, activarse y diferenciarse. Las céls. B naive pueden activase (al interaccionar con el Ag) y dar lugar: (a) cél. plas-

mática sin cambio de isotipo (expresa IgM); (b) cél. plasmática con cambio de isotipo (expresará IgG, IgA o IgE); (c) cél. B de memoria de varios isotipos (no a la vez). La B naive pasará a ser un tipo de plasmática generadora de Igs en función de la citocina con la que haya contactado.

Cambio de isotipo de la cadena pesada

Una vez tenemos el gen funcional para la cadena pesada, éste será transcrito y obtendremos un mRNA con varios exones. Uno de estos exones será producto de la unión VDJ y dará lugar al dominio variable de la cadena pesada (VH). A continuación se observan exones que dan lugar a los diferentes dominios constantes, primero los Cµ y después los Cδ. La formación de IgM o de IgD dependerá del splicing diferencial y de la poliadenilación (poli(A)). La cadena de poliadeninas nos indica el final del tránscrito, por lo que todo lo que quede downstream res-pecto a ésta no será traducido. Existen cuatro puntos de poli(A):

- Poli(A) 1. Está tras el segmento que codifica la Cµ4. Si se efectúa aquí la poliadenlia-ción formaremos IgM soluble (al menos su cadena pesada; así en todos los casos). Estric-tamente lo correcto es decir que formamos Hµ secretada.

- Poli(A) 2. Está tras el segmento que codifica para la parte transmembrana de la mIgM. Si se efectúa aquí la poliadenlización formaremos Hµ de membrana.

- Poli(A) 3. Está tras el segmento que codifica la Cδ3. Obtendremos Hδ secretada.

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Cél. madre hematopoyética (HSC)

Célula linfoide

Cél. pro-B

Reordenamiento parcial H

Cél. pre-B

Reordenamiento completo H

B inmadura

B madura

Cambio procesado RNA

Reordenamiento completo L

mIgMmIgD

mIgM

µ

Maduración de las céls. B.

- Poli(A) 4. Está tras el segmento que codifica para la parte transmembrana de la mIgδ. Si se efectúa aquí la poliadenilación fomaremos Hδ de membrana

Apenas hay IgD soluble, por lo que apenas se usa el tercer punto de poli(A). Si, por ejemplo, se efectúa la poliadenilación en el cuatro punto, se evitarán los segmentos que codifican para elementos de Hµ gracias al splicing diferencial. Con esto hemos podido explicar cómo se forma IgM o IgD. ¿Qué ocurre con el resto de isoti-pos? Pues tendrá que haber una especie de recombi-

nación. Recordemos que el cambio de isotipo de la

cadena pesada se da una vez la cél. B ha entrado en contacto con un antígeno y que en virtud a este cambio, un mismo segmento VHDHJH se combinará con cualquier CH. Para que esta recombinación pue-da darse tendrán que haber unas secuencias de cam-

bio que flanqueen las CH (excepto las Cδ) y que puedan ser reconocidas por las recombinasas de

cambio. Las secuencias de cambio son regiones de entre 2 y 10 kb en las que aparecen secuencias repe-

tidas (p. ej., TGGGG). Las citocinas serán las respon-sables de dirigir el cambio de isotipo hacia uno en concreto. Un ejemplo sería el TGFβ, muy presente en las mucosas, que induce la formación de IgA. Atención, la recombinación que se produce con el fin de generar un isotipo en concreto hace que se pierda DNA en el que hay información para codificar otros isotipos. Eso quiere decir que, por ejemplo, cuando formamos IgE no podemos formar IgG ya que la información que codi-fica para Hγ ha sido omitida.

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EXPRESSIÓ DE LES FORMES DE MEMBRANA I SECRETADES D’IgM I IgD

Transcrit primari RNA de la cadena H

Mecanisme: : processament diferencial del RNApoliadenilació i splicing diferencial

HHPPsecretadasecretada

HHPPmembranamembrana

HHGGsecretadasecretada

HHGGmembranamembrana

Poli-ALloc 2

Poli-ALloc 1

Poli-ALloc 3

Poli-ALloc 4

COEXPRESSIÓ D’IgM I IgDTránscrito primario de la cadena H. En función del lugar donde se produzca la poliadenilación, obtendremos un isotipo u otro (M o D) y su forma soluble o de membrana.

Recombinación para un cambio de isotipo.

Síntesis, ensamblaje y secreción de Igs

La traducción de los mRNAs de las cadenas H y L se da en el RER (translocación proteica). Se romperá el péptido señal y el ensamblaje por puentes disulfuro se dará en el propio RER. En el caso de las IgM, en primer lugar se forma el heterodímero H-L y después se forma (H-L)2. En cambio, en el caso de las IgG, primer se forma un monómero H-H, después forma-mos H2L y finalmente H2L2. El RER emitirá vesículas que irán hacia el Golgi, donde las Igs sufrirán un procesado (glicosilación) y finalmente la vesícula emitida por el trans Golgi se fu-sionará con la membrana y secretará la Ig. En el caso de mIgs, la Ig ya estará insertada en la vesícula emitida por el Golgi.

Regulación de la transcripción de los genes de las Igs

Lo que sucederá cuando se produzca la recombinación es que aproximaremos al promotor con un enhancer, potenciando la expresión del gen. Se comentó que los promotores los po-demos encontrar upstream (5’) respecto a la secuencia L de cada VH y VL, antes del cluster de genes Jk y en cada uno de los genes DH. También se habló de cajas TATA, el octámero-1 y el octámero-2 (específico de la cél. B). En cuanto a elementos moduladores (enhancers o silenciadores), se destacó el E2A, ubicado entre la región V y C del gen. Este incremento de la expresión de los genes de las Igs puede ser contraproducente en el caso de que se produzcan translocaciones cromosómicas. Por ejemplo, en el linfoma de

Burkitt24 hay una translocación del gen c-myc (relacionado con la proliferación celular) al lo-

cus del gen de la cadena pesada de las Igs. Esto hace que la célula sea inmortal: linfoma de céls. B. Por lo general, la translocación de genes reguladores de la proliferación o apoptosis (pro-

tooncogenes) en los locus de las Igs causa un aumento de su expresión y pueden ser la causa de cáncer. Otro método de regulación de la expresión de Igs es ya a nivel postranscripcional: vida media del RNA, traducción, mecanismos post-traduccionales y el ensamblaje de las cadenas H y L.

Inhibición de la expresión en céls. T

Los linfocitos T reordenan los genes del TCR por medio de los mismos mecanismos por los que se reordenan los genes de las Igs en los linfocitos B (RAG-1/2, RSSs), pero cada proceso da un único tipo celular. Por tanto, deben haber mecanismos reguladores de esta especifici-dad. Esto aún no está del todo respondido, pero se baraja la posibilidad de la existencia de una proteína inhibidora de la unión V-J que se expresaría únicamente en LT.

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24 Las personas con este linfoma suelen estar infectadas con el virus de Epstein-Barr.

8. ONTOGENIA DE LOS LINFOCITOS B

Introducción

Los linfocitos B se forman, antes del nacimiento, en el saco embrionario, el hígado y en la médula ósea. Tras nacer únicamente se formarán en la médula ósea. El desarrollo de una cé-lula B pasa por tres etapas bien diferenciadas, que también suceden en diferentes regiones del organismo: (a) maduración, que se da en la médula ósea; y (b) activación y (c) diferencia-ción, que se dan en la periferia (ganglios linfáticos).

Maduración de las céls. B

Como ya hemos dicho, la maduración de la célula B es un proceso que se da en la médula ósea. Como ocurre con todas las células sanguíneas, partiremos del precursor hematopoyético

pluripotencial (HSC). Al principio de la maduración, la interacción entre proteínas de mem-brana de los linfocitos que están madurando y las que están en las células troncales de la mé-

dula ósea será fundamental. Concretamente, la interacción será importante en las etapas de precursor linfoide y célula pro-B (y aquí distinguimos entre un estadio inicial y otro final). Se destacó el papel de IL-7 en esta maduración.25

Como se observa en la tabla superior, cada etapa de maduración se caracteriza por el reor-denamiento o no de la cadena pesada o ligera. Este reordenamiento controla la maduración de los LB. La expresión de las proteínas que regulan el reordenamiento está programada a lo lar-

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25 En las diapositivas además se habla del SDF-1/PBSF (cell-derived factor/pre-B growth factor stimulating factor) que es secretado por las células estromales y que se trata de una quimiocina. Creo que es la propia IL-7.

Genes de la c. pesada

Genes de la c. ligera Ig de superficie

Célula madre Línea germinal Línea germinal Ausente

Pro-B temprana Reordenamiento D-J

Línea germinal Ausente

Pro-B tardía Reordenamiento V-DJ

Línea germinal Ausente

Pre-B grande VDJ reordenado Línea germinal Cadena µ en la superficie como parte del re-ceptor pre-B

Pre-B pequeña VDJ reordenado Reordenamiento V-J Cadena µ en el citoplasma y en la superficie

B inmadura VDJ reordenado VJ reordenado IgM expresada en la superficie celular

B madura VDJ reordenado VJ reordenado IgD e IgM a partir de un procesamiento alter-nativo de tránscritos de cadena H

Estadios de desarrollo de la cél. B. En verde se muestran aquellas células en que hay expresión de RAG-1/2 (hay recombinación) y además se expresa la TdT (adición de nucleótidos-N). Por contra, en naranja se muestra aquella etapa del desarrollo en que si bien se expresan RAG-1/2 que permiten la recombinación, no hay expre-sión de TdT.

go del desarrollo (TdT únicamente en pro-B). Debemos tener presente que, por ejemplo, la célula al llegar al estadio de pro-B detendrá su proliferación y se producirá el reordenamien-to de la cadena pesada, después seguirá proliferando hasta pre-B26 y ahí se detendrá para expresar los enzimas que le permitan recombinar el gen de la cadena ligera. En cuanto al receptor de la cél. B, éste se irá formando por partes, ya que desde un ini-cio no disponemos de todos sus componentes (el gen de la cadena ligera y de la pesada re-combinados). Por lógica, nada más llegar al estadio de pre-B, la célula únicamente dispondrá de la cadena pesada en su membrana (VHDHJHCµ). A modo de sucedáneo de cadena ligera, se le une la surrogate light chain, formada por dos proteínas: Vpre-B y λ5. Ésta última (λ5) será esencial para que el desarrollo de la cél. B prosiga y que por tanto haya la expresión de RAG-1/2 que recombinen el gen de la cadena ligera. Una vez llegamos al estadio de cél. B inmadura, que ya tiene IgM en la membrana, podrá interaccionar con un antígeno. Fruto de esta interacción se darán tres respuestas: (a) activa-

ción; (b) anergia (insensibilización; se interactúa con un Ag pero la cél. no responde); (c)

apoptosis. Este linfocito inmaduro únicamente sobrevivirá si no contacta con ligandos que estén en la médula ósea, puesto que son Ag propios. Recordemos que si aún le quedan ale-los, se podrá realizar una edición del receptor.

En la maduración de los LB se da una selección negativa y una selección positiva. Por selección negativa entendemos que se eliminarán aquellos linfocitos B específicos para antígenos pro-pios (90% de los casos). La eliminación se producirá por apoptosis (deleción clonal por apop-

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26 Gracias a esto, podremos generar diferentes clones de linfocitos con la misma cadena pesada (µ) pero dife-rente cadena ligera, puesto que es difícil que la recombinación que se dará en el estadio de pre-B sea exacta-mente la misma para todos los clones formados.

Puntos de verificación de la maduración de los linfocitos. Los procesos de selección negativa y positiva hacen que finalmente nos quedemos con aquellos linfocitos que nos son útiles.

tosis). Por selección positiva entendemos la preservación de los linfocitos que son capaces de responder a antígenos no propios (10% de los casos). Existen cuatro posibles tipos de inte-racciones con ligandos en la médula ósea:

- Sin interacción. Si no se produce interacción con ningún ligando el linfocito B inmadu-ro migrará hacia la periferia y ahí se transformará en un linfocito B maduro.

- Unión multivalente con una molécula propia. El LB inmaduro entrará en apoptosis o, si puede, realizará la edición del receptor (y si no es fructífera entrará en apoptosis).

- Unión con moléculas propias solubles. En este caso el linfocito B inmaduro migrará a la periferia y se transformará en un linfocito B anérgico.

- Unión de baja afinidad con moléculas propias solubles. Es similar al caso anterior, el LB migra a la periferia y se transformará en un LB maduro en los que la interacción con el antígeno propio que reconoce no producirá ningún efecto (similar a la anergia).

Dinámica de la población de céls. B

En la médula ósea acabaremos finalmente con un repertorio de células B que han pasado por un proceso de selección en función de si reconocen o no antígenos propios (inducción de

tolerancia). Las céls. B que han pasado por el proceso migrarán hacia la sangre y de ahí po-drán entrar o no en los folículos linfoides.

- Células B que no pueden entrar en los folículos linfoides. Tendrán una vida media bastan-te reducida, de aproximadamente tres días. Parece ser que no pueden entrar porque no expresan las moléculas de membrana necesarias (no han sido correctamente seña-lizadas para que las expresen).

- Células B que pueden entrar en los folículos linfoides. Entrarán en los folículos y circula-rán por el sistema linfático-sanguíneo. Son las formas naive y pueden vivir entre 3 y 8 semanas. Si en este tiempo de vida no entran en contacto con un antígeno, entrarán en apoptosis. Si, por contrario, entran en contacto con un antígeno, quedarán activadas y darán lugar a células de memoria y células efectoras que migrarán al lugar de infec-ción.

Activación del linfocito B

La activación de los linfocitos B o, en otras palabras, la inducción de la respuesta humoral, puede darse en el bazo y en los nódulos linfáticos, ya que en estos dos lugares se genera el microambiente adecuado para restringir un tipo concreto de interacciones celulares. Como ya se ha ido comentando en otros temas, la activación de un linfocito B precisa de (a) la interacción con un antígeno, y (b) la interacción con un TH. Una vez producida dicha activación, se da la famosa expansión clonal que da lugar a células plasmáticas (secretoras de IgM; para excretar los otros tipos precisamos de un cambio de isotipo)27 y la formación de células de memoria. Todo este proceso se da en el folículo germinal. Ahora discutiremos un poco por encima como se produce la activación del LB.

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27 Recordemos que también habrá una maduración de afinidad, que no es más que la hipermutación.

- Antígeno y TH. Los antígenos presentes en la zona de la infección serán captados por una célula dendrítica local, Ésta migrará al ganglio y lo presentará al TH (vía MHC) Se producirá una interacción entre TCR-MHC II (y CD4; complejo ternario) y el linfocito TH quedará activado.

- Antígeno y LB. El antígeno no se quedará en una zona del cuerpo, si no que proba-blemente alcanzará la sangre y la linfa y finalmente podrá llegar al ganglio, en el que interaccionará con la cél. B (se discutirá más adelante con mayor detalle) y la activará. El linfocito B activado migrará a la periferia del folículo primario.

Linfocitos TH activados y linfocitos B se irán acercando unos a otros. El linfocito B en este ca-so actuará como una molécula presentadora de antígeno, incorporará el antígeno y mostrará una parte del mismo por medio de una molécula de MHC II. Se dará una activación bidireccional

B-T. Esto se da así para incrementar las probabilidades de contacto entre célula B y célula T; logramos que el T prolifere en la periferia y después migre hacia el ganglio para contactar con el LB.

En un plazo de 7 a 10 días tras la exposición al antígeno, algunos linfocitos B activados mi-gran a zonas profundas del folículo y comienzan a proliferar rápidamente, haciendo que la región central del folículo pase a denominarse centro germinal. En el centro germinal pode-mos distinguir una zona clara y una zona oscura. La zona oscura es más externa y contiene linfocitos B en proliferación rápida (centroblastos). La zona clara es más interna y es donde se experimentan los procesos de diferenciación y selección (centrocitos quiescentes). Para la formación de un centro germinal es esencial la presencia de linfocitos T colaboradores. En los folículos linfáticos encontramos las células dendríticas foliculares (CDF), que se caracterizan por expresar receptores del complemento (CR1, CR2 y CR3) y receptores de Fc (no tienen MHC de clase II). Las largas prolongaciones que tienen forman una red alrededor de la cual se forman los centros germinales. En la zona oscura, las céls. B activadas harán la hipermutación somática y darán lugar a linfocitos B con la misma especificidad antigénica pero con diferente afinidad. En sus prolongaciones, las CDF presentan una cantidad limitada

de antígeno, por lo que únicamente los LB activados con una mayor afinidad por el antígeno 52

ESDEVENIMENTS DE LA RESPOSTA HUMORAL A L’ANTÍGEN

Interacción entre linfocitos B y T en el ganglio linfático. En el momento de la activación definitiva del linfocito B, cuando éste prolifere, hablaremos de folículo germinal en lugar de primario. Como vemos también en el es-quema, la interacción B-T se da en el paracórtex.

podrán interaccionar con él. Todos aquellos LB que no se unan al antígeno será fagocitados. La CDF no presenta MHC de clase II en la membrana, en su lugar, para presentar el antí-geno utiliza el receptor del complemento (CR1/

CR2, que se une a una porción del antígeno unida a un fragmento del complemento) o bien por medio del receptor de Fc (une la Ig que a su vez está unida al antígeno). Además de tener que interactuar con el antígeno presentado por la CDF, la célula B sobrevivirá si reciben señales de los TH. Sin estas señales no se producirá el cambio de afi-nidad ni el cambio de isotipo. En las diapositi-vas se menciona las interacciones que se dan con los TH: CD40/CD40L y MHCII/Ag-TCR.

Síndrome de hiper-IgM. Debido a la falta de expresión de CD40L, no se pueden generar ni céls. B de memoria, ni se da el cambio de isotipo ni la hipermutación somática. Es una enfermedad genética ligada

a X y se manifiesta con unos niveles altos de IgM.

Poblaciones de linfocitos B

Tenemos dos grandes clases de poblaciones de linfocitos B, los B1 y los B2:- Linfocitos B1. Son minoritarios (5%), se forman en el hígado fetal y se localizan en las

cavidades peritoneal y pleural además de en las mucosas. Se pueden autorrenovar y dis-ponemos de un repertorio reducido (limitado tipo V y no hay expresión de TdT en precursores). Tienen una baja afinidad y reconocen lípidos, polisacáridos microbianos o virales. Los anticuerpos “naturales” que forman se secretan rápidamente (72-92h).

- Linfocitos B2. Se forman en la médula ósea. Dentro de las B2 podemos encontrar otras dos clases:

- B2 zona marginal. Están en el seno marginal del bazo. Son similares a las B1, tie-nen una diversidad limitada, una baja afinidad, forman IgM, reconocen polisa-cáridos y lípidos microbianos/virales, y pueden formar anticuerpos “naturales” rápidamente (72-92h).

- B2 folicular. Es el B2 convencional. Se localizan en los folículos y van recirculan-do.

Hay tumores para cada uno de los estadios del desarrollo de los LB (p. ej., macroglobulinea de Walndeström: en la cél. B secretora de IgM).

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MADURACIÓ DE L’AFINITATSELECCIÓ DE CÈL.LULES B AMB ALTA AFINITAT AL CENTRE GERMINAL

SupervivènciaSupervivència//SeleccióSeleccióde les cèl.lules B

que interaccionen amb l’Ag deles cèl.lules dentrítiques fol.licularsi que, a més a més, reben senyals

de les TH (CD40/CD40L i MHCII/Ag-TCR).El reste de cèl.lules B moren per apoptosiapoptosi

Només les cèl.lules B ambIg amb elevada afinitat poden

competir per interaccionar ambl’Ag de les cèl.lules dendrítiques

foliculars

Cèl.lules B amb hipermutaciósomàtica als segments V

i Igs amb diferentsdiferents afinitatsafinitats perperl’antígenl’antígen

X-linked hyper-IgM syndromeNo expressió de CD40LNo generació de cèl.lules B de memòria, nicentres germinals ni hipermutació somàtica

Interacción entre CDR y linfocitos por medio del receptor del complemento y del receptor Fc.

9. COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC)

Introducción

Un antígeno puede unirse tanto a un BCR, a un TCR a través de una molécula del MHC o inclu-so también a un receptor de la inmunidad innata (PRR). El MHC será de una clase u otra en función del tipo de linfocito T. También se habló de unas moléculas MHC-like, como CD1, que son capaces de mostrar moléculas lipídicas o glicolipídicas a algunos tipos de células NK (NK1-T). Por lo que respecta a su descubrimiento, entre 1930 y 1950 se realizaron toda una serie de experimentos con ratones. Se cruzaron ratones emparentados (uniones consanguí-neas) en hasta veinte ocasiones par así lograr cepas de ratones singénicas, es decir: genética-

mente idénticos en los alelos de los genes polimórficos28 (homocigotos en todos los locus poli-mórficos). Por el otro lado, se cruzaron ratones para dar lugar a cepas de ratones alogénicas, es decir: con diferencias en los alelos de los genes polimórficos (se expresan alelos diferentes en los locus genéticos polimórficos). A continuación se realizó un injerto de piel en ratones de la misma cepa singénica, aceptándose el injerto en el receptor. Por contra, si el injerto se reali-zaba entre donante y receptor de cepas distintas, se producía un rechazo. Se asumió, por tanto, que la capacidad para reconocer aquello propio de lo ajeno era algo que podía here-darse. El rechazo de los tejidos ajenos es el resultado de una respuesta inmunitaria a diversas moléculas de superficie (antígenos o genes de histocompatibilidad).

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28 Un gen o alelo polimórfico es aquel en que en la población, y con frecuencias estables, existen en formas alternativas. Por contra, un gen o alelo no polimórfico es aquel que está representado por una única secuencia, a excepción de mutaciones extrañas.

DESCOBRIMENT DELCOMPLEX PRINCIPAL D’HISTOCOMPATIBILITAT

MHC: “Major Histocompatibility Complex”

Gorer i Snell (1930-1950)El rebuig a teixits foranis era el resultat d’una resposta immunitària a

diverses molècules de superfície (“antígens/gens d’histocompatibilitat”)

Experimentos de Gorer y Snell. Los injertos entre animales de la misma cepa singénica o endogámica son acep-tados. Los injertos entre animales de diferentes cepas alogénicas o no endogámicas son destruidos por el siste-ma inmunitario.

Cuando los genes de histocompatibilidad se identificaron en el genoma, se observó que és-tos están localizados en un locus genético amplio, en que hay genes de clase I, de clase II y de clase III. Los de clase III están relacionados con la respuesta inmunitaria, pero no tienen nada que ver con la histocompatibilidad. En los humanos, el sistema MHC se denomina HLA (Eng: human leukocyte antigens), mientras que en ratón se denomina H-2.

Los genes de la histocompatibilidad son altamente polimórficos: hay muchas formas alternati-vas del gen o los alelos para cada locus (pueden dar lugar a moléculas con hasta 20 aas dis-tintos)29. Es posible que una persona forme MHCs que no puedan reconocer a un péptido en concreto (el MHC pertenece a la inmunidad innata). Los genes de la histocompatibilidad tam-bién son poligénicos: dan lugar a grupos de proteínas con estructura y función similares pero no idénticos. La suma del polimorfismo y la poligenia contribuyen a la diversidad individual y

poblacional del MHC (dificultad para realizar transplantes).

Reconocimiento del complejo MHC-péptido

La célula T reconocerá a un antígeno presentado por una molécula MHC. El MHC interac-cionará tanto con el péptido así como también con el linfocito T: se unirá a unos residuos de

anclaje del péptido a presentar y también interaccionará con el TCR directamente. Estas dos interacciones son claves para que el sistema inmunitario pueda discernir entre lo ajeno y lo propio. Únicamente podremos reconocer antígenos unidos a MHCs propios. La molécula de MHC tiene dos roles muy importantes:

- Presentación de antígeno. Es la función más evidente: presenta el antígeno al LT. El péptido presentado presenta unos residuos de contacto (unión a TCR) y otros de anclaje (unión a MHC). Estas dos clases de residuos son responsables de la elevada especifi-cidad del reconocimiento.

- Restricción por MHC. Los linfocitos T únicamente podrán reconocer a un antígeno pre-sentado por una molécula de MHC propia.

Las interacciones entre aminoácidos, ya sea entre TCR y Ag o TCR y MHC, serán no covalen-

tes (puentes de hidrógeno, interacciones de carga, etc). Los residuos del MHC que son más

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29 (Roitt pág. 81): “A diferencia de lo que ocurre con el sistema de la inmunoglobulina, en el cual hemos visto, la variabilidad se logra en cada individuo por un sistema multigénico, el MHC evolucionó en lo que se refiere a la varabilidad entre los individuos con un sistema altamente polimorfo basado en múltiples alelos. En el geno-ma humano los genes de la clase I y clase II son los más polimorfos; en algunos de estos genes se identificaron más de 200 variantes alélicas”.

ORGANITZACIÓ DELCOMPLEX PRINCIPAL D’HISTOCOMPATIBILITAT

H-2: antígens d’histocompatibilitat 2, per l’antigen polimòrfic sanguini “Antigen II” identificat per Snell i col.

HLA: human leukocyte antigens

Complejo HLA humano.

determinantes, que en su mayoría van a ser polimórficos, son los que forman el surco de in-teracción con el antígeno y los que contactan con el TCR (responsables de la restricción por MHC de las células T).

Estructura de la molécula del MHC de clase I y II

Una molécula del MHC es una glucoproteína transmembrana constituida por dominios Ig y con una pequeña ranura para que se añade el péptido que debe ser presentado. El patrón de plegamiento es similar entre las moléculas de clase I y II. Los residuos polimórficos están en la ranura y en zonas adyacentes. Los dominios Ig no polimórficos contienen lugares de unión para las moléculas CD4 y CD8 de los linfocitos T.

Molécula de clase I del MHC

La molécula de clase I del MHC es un heterotríme-

ro: (a) cadena α; (b) microglobulina β2 y (c) péptido. La cadena α consta de tres dominios Ig (α1, α2 y α3), los dos primeros (α1 y α2) formarán la famosa ranura a la que se unirá un péptido de 8 a 11 aas; en esta ranura hay residuos polimórficos. El seg-mento α3 no es polimórfico, consta de una parte transmembrana y es donde se unirá CD8. Por lo que respecta al dominio microglobu-lina β2 , no es polimórfico, no está codificado por el MHC, es de naturaleza Ig e interacciona de una manera no covalente con los tres segmentos de la cadena alfa.

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Reconocimiento por los linfocitos T de un complejo péptido-MHC. Este esquema muestra una molécula del MHC uniéndose y presentando un péptido a un receptor de linfocitos T, que reconoce dos residuos polimórficos de la molécula del MHC y un residuo del péptido.

Molécula de clase II del MHC

Al igual que la molécula de clase I del MHC, la molécula de clase II es un heterotrímero formado por: (a) cadena α, (b) cadena β, y (c) péptido. La cadena α es una glicoproteína que consta de dos segmentos, uno polimórfico (α1) y otro no poli-mórfico o Ig (α2). La cadena β presenta una es-tructura similar a la alfa: un segmento polimórfico (β1) y otro no polimórfico o Ig que se une a CD4 (β2). La ranura que interaccionará con el péptido que presente la molécula de clase II está formada por el segmento α1 y β1. Los dominios C-termina-les de la cadena alfa y de la cadena beta están anclados en la membrana (región transmembrana).

Achtung! Sabemos que las moléculas de clase I del MHC casi siempre presentan péptidos propios. Ahora bien, las moléculas de clase II del MHC también presentan casi siempre péptidos propios. Las células

que son capaces de expresar MHCII en su membrana, lo harán siempre, no únicamente cuando incorpo-ren un elemento extraño. Por tanto, cuando no se ha incorporado nada ajeno (céls. viejas por ejemplo), se expresan en la membrana MHCII unidos a péptidos propios.

Los péptidos se unen a las moléculas del MHC I por sus extremos, mientras que las que se unen a las del MHC II lo harán por medio de interacciones a lo largo del surco de unión. Esto permite que una molécula del MHC pueda unirse a péptidos distintos con unos residuos comunes en posiciones concretas (residuos de anclaje)30. El péptido que se una al MHCII ten-drá que tener sus residuos de anclaje a unas distancias específicas (la longitud del péptido será variable).

Polimorfismo en las moléculas del MHC de clase I y II

En la población existen diferentes alelos para los diferentes genes del sistema MHC. Las dife-rencias entre estos alelos se dan en lugares específicos dentro de la molécula del MHC. Los polimorfismos se centran en los residuos del surco de unión al antígeno y la de la región de interacción con el TCR (se determina la especificidad de unión del péptido y el reconoci-miento del antígeno por el TCR).

Unión de péptidos a las moléculas de clase I y II del MHC

Las moléculas del MHC presentan una amplia especificidad de unión a péptidos (en este aspec-to las moléculas del MHC son promiscuas). Esta promiscuidad se basa en tres aspectos:

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30 En general los residuos N- y C-terminales del péptido son hidrofóbicos e interaccionan con los residuos del surco de la molécula del MHC I.

- Cada molécula del MHC I y II tiene un surco único en el que se pueden unir péptidos diferentes. Y también un péptido puede interaccionar con MHC distintos.

- Los péptidos que se unen tienen características estructurales comunes.- Los polimorfismos ubicados en el surco de unión y regiones próximas determinan que

diferentes alelos de un mismo gen unan péptidos distintos.

La asociación péptido-MHC es bastante estable. La interacción es de baja afinidad, pero la velocidad de asociación es más rápida que la de disociación (la asociación puede durar de horas a días). Finalmente la molécula del MHC de un individuo no discrimina entre péptidos extraños

y propios (lo más común es que se unan a péptidos propios).

La diversidad en las moléculas del MHC de clase I y II (existencia de múltiples alelos) es im-portante a nivel poblacional ya que asegura que al menos algunos individuos puedan respon-der a todos los antígenos de los patógenos. El conjunto de moléculas del MHC influencia directamente en el repertorio de antígenos que pueden ser detectados por TH y TC,y por tanto está relacionado con la respuesta a infecciones y con los procesos de autoinmunidad.

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10. EXPRESIÓN Y REGULACIÓN DEL MHC

Introducción

Como ya se vio en el tema anterior, los genes de histocompatibilidad se encuentran en un locus extenso, el complejo HLA en humanos (y el complejo H-2 en ratones). Dentro de esta región del genoma distinguimos entre genes de clase I, de clase II y de clase III. Las tres clases de genes dan lugar a proteínas del sistema inmunitario, pero únicamente los de clase I y II están relacionados con la histocompatibilidad.

- Genes de clase I. Se expresan en todas las células y presentan el Ag a los TC.- Genes de clase II. Se expresan en céls. presentadoras de antígenos (macrófagos, céls.

dendríticas, LB) y presentan el Ag a los TH. - Genes de clase III. Dan lugar a proteínas del complemento, moleculas inflamatorias,

etc. Como vemos, no tienen nada que ver con la histocompatibilidad.

Los genes de clase I y II son los clásicos. Después también podemos encontrar (no sé si en el complejo HLA) los genes del MHC no clásicos, que se pueden expresar en algunos tipos celu-lares y que tienen funciones especializadas o poco conocidas. Los genes del MHC no clási-cos también se pueden distinguir entre de clase I o de clase II en función a su estructura.

Genes de clase I del MHC

En los humanos encontramos tres grandes genes de clase I clásicos: HLA-A, HLA-B y HLA-C (en ratón son H-2K, H2D y H-2L). Se encargan de presentar el antígeno a los linfocitos T CD8 (citotóxicos). Además de estos genes clásicos, encontramos las moléculas de clase I del MHC no clási-

cas, cuya función aún se discute. Se cree que: (a) presentan péptidos a céls. T, y que (b) activan/

desactivan a céls. NK. Tanto las moléculas clásicas como no clásicas tienen en común la pre-sencia de la β2-microglobulina en su estructura. Se comentaron las siguientes moléculas no clásicas31:

- HLA-G y HLA-E. Presentan Ag a céls. NK.- HLA-H. Implicada en el metabolismo del hierro.- MIC. Su expresión en el epitelio intestinal es inducida por el estrés. La proteína MIC

es reconocida por los receptores NK, de céls. Tγδ y TC. - CD1 [no presente en la región MHC]. Hasta ahora hemos visto moléculas no clásicas

presentes en la región MHC, ésta no lo está. Ya vimos que CD1 era una molécula MHC-like que presentaba antígenos lipídicos o glicolipídicos a céls. T.

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31 Todos los ejemplos que ahora pondremos son humanos. En clase se comentó también el gen H-2M de ratón, que se encarga de presentar péptidos con una Met terminal aminoformilada (péptidos derivados de procariotas que crecen intracelularmente, como el Mycobacterium tuberculosis).

Genes de clase II del MHC

En los humanos encontramos múltiples alelos de las cadenas α y β de DR, DP y DQ (en ratón de IA e IE). Se encargan de presentar el antígenos a los linfocitos T CD4 (colaboradores). Además de estos genes clásicos, encontramos las moléculas de clase II del MHC no clá-

sicas, que son moléculas implicadas en el procesamiento y presentación del antígeno. Tienen un patrón de expresión distinto en comparación con las moléculas clásicas, aquí vemos al-gunos ejemplos:

- DM. Se trata de una molécula MHC-like y facilita la carga del péptido antigénico.- DO. Regula el procesado del Ag de clase II. Se observa en el timo y LB maduros.- TAP1/2. Son transportadores del péptido a presentar del citosol al retículo.- LMP2/7. Son subunidades del proteasoma.

Expresión de las moléculas del MHC I y II

Las moléculas del MHC I se expresan en la gran mayoría de tipos celulares, aunque con nota-bles diferencias por lo que respecta al nivel de expresión. Las células con una mayor canti-dad de expresión de MHC I son las del sistema inmunitario: linfocitos, macrófagos, céls. dendríticas y neutrófilos. Las células que expresan niveles bajos son los fibroblastos, las céls. epiteliales, las musculares, los hepatocitos y las neuronas. Hay células que no expresan estas moléculas, como los eritrocitos y algunos estadios de diferenciación de neuronas y esperma (evitar el rechazo). La expresión de estas moléculas es inducible por citocinas (IFNs I/II). Las moléculas del MHC II se expresan en un número más reducido de células. De mane-ra constitutiva la expresan las céls. presentadoras de antígeno (CPA): dendríticas, LB y epiteliales

tímicas (para que así los LT que se formen en el timo puedan interaccionar con péptidos). Los eritrocitos no expresan MHC II. La expresión de estas moléculas se puede inducir o depende de: (a) citocinas (IFNγ que estimula su expresión en macrófagos, céls. dendríticas y fibroblas-tos); (b) estímulos vía TLRs; (c) estados de diferenciación en el LB (la cél. pre-B ni la cél. plasmá-tica no expresan MHC II; la B madura sí).

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Factores reguladores de la expresión de moléculas del MHC I y IIFactores reguladores de la expresión de moléculas del MHC I y IICitocinasCitocinas

Interferones (α, β y γ) ↑MHC ITNF

↑MHC I

IFNγ ↑MHC IICorticoesteroides(1) ↓MHC IIProstaglandinas

↓MHC II

Virus(2)Virus(2)

Citomegalovirus (CMV) ↓MHC IHepatitis B (VHB)

↓MHC I

Adenovirus 12 (Ad12)

↓MHC I

(1) Los corticoesteroides tienen una función antiinflamatoria, lo cual tiene sentido si vemos que inducen una reducción de la expresión de las moléculas del MHC II: se dificulta la presentación de Ag a los LT CD4.(1) Los corticoesteroides tienen una función antiinflamatoria, lo cual tiene sentido si vemos que inducen una reducción de la expresión de las moléculas del MHC II: se dificulta la presentación de Ag a los LT CD4.(2) Los virus reducen la expresión de MHC I a modo de estrategia evasiva. (2) Los virus reducen la expresión de MHC I a modo de estrategia evasiva.

Los promotores de los genes del MHC II (y creo que los de clase I también, entre ellos) son similares, por lo que tienen mecanismos reguladores parecidos (p. ej., factores de transcrip-ción). La regulación es coordinada tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional.

Expresión de los alelos

Generalmente expresamos uno de los dos alelos de un gen, ya sea el paterno o el materno. Con los genes del MHC esto no sucede así, puesto que hay una codominancia, se expresan los dos alelos dando lugar a la formación de moléculas heterólegas con genes paternos y mater-

nos, incrementando así la diversidad. Diferentes individuos dentro de una especie podrán un-ir grupos diferentes de péptidos virales. Los genes del MHC presentan un polimorfismo muy

elevado. Entendemos por haplotipo del MHC el conjunto de alelos del MHC presentes en cada cromosoma. Los heterocigotos tienen dos haplotipos del MHC, generalmente uno idéntico al paterno y el otro al materno. Para que un transplante sea lo más efectivo posible, la diferen-cia entre el haplotipo del MHC del receptor y el del donante debe ser mínima. Existe, teóri-camente un total de 2,25 · 1018 combinaciones posibles de haplotipo del MHC, aunque esta diversidad es inferior (hay que tener en cuenta factores como la presión selectiva o la fre-cuencia de recombinaciones más elevada en determinadas regiones del DNA que determi-nan la frecuencia de asociación alélica). Recordemos que una célula sana presentará péptidos propios, mientras que una célu-la infectada presentará péptidos propios y ajenos.

Se comenta en las diapositivas que por polimorfismo se entiende la existencia de múltiples alelos de un locus genético dentro de una especie y de bastantes alelos de un locus en cada individuo, que pueden diferir en un 5-10% de la secuencia de aas con otro individu y tam-bién en el número de alelos. Yo también comentaría que estas diferencias deben ser estables en la población. Este polimorfismo nos lleva a una gran diversidad (tanto a nivel individual como de especie).

Ejemplo histocompatibilidad con ratones. Donador BB, si le damos un tejido a un KK hay rechazo y si se da a

un BB hay aceptación. Si el donador es B/K, el rechazo se produce en homocigotos y se acepta en los heteroci-gotos.

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11. PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DEL ANTÍGENO A LOS LINFOCITOS T

Introducción

Los linfocitos T, a diferencia de los B, no pueden reconocer un antígeno de manera directa, si no que requieren que este antígeno, que además generalmente será de naturaleza proteica, sea presentado por una molécula (no reconocen Ag solubles). El epítopo que suelen reconocer los linfocitos T es de carácter lineal (secuencial).

Existen dos grandes clases de células que pueden mostrar un antígeno a los linfocitos T: las (a) células diana, y las ya conocidas (b) células presentadoras de antígeno (CPA).

(a) Céls. diana. Son aquellas células que presentan péptidos a través del MHC I a los linfocitos T CD8. Casi todas las células son diana, puesto que la expresión del MHC I es casi constitutiva. Las células que serán atacadas por los T CD8 son las infecta-das, las cancerosas, las viejas, las apoptóticas, las alogénicas y todas aquellas que expresen algo ajeno en su MHC I.

(b) CPA. Son aquellas células que presentan péptidos a través del MHC II a los linfocitos T CD4. Dentro de las CPA distinguimos entre:

- CPA profesionales. Céls. dendríticas, macrófagos y linfocitos B.- CPA no profesionales [no pertenecen al sistema inmunológico]. Fibroblastos

(piel), glía, céls. β pancreáticas, céls. epiteliales tímicas, epiteliales tiroideas y endoteliales vasculares.

Procesamiento del antígeno

Existen dos grandes vías de procesamiento y presentación del antígeno: (1) vía citosólica (o vía del MHC I); y la (2) vía endocítica (o vía del MHC II). La primera vía presenta antígenos in-tracelulares o endógenos, tales como proteínas celulares normales, proteínas tumorales o, en el caso de que la célula esté infectada, proteínas virales y bacterianas. La segunda vía pre-senta antígenos extracelulares o exógenos, incorporados por endo-/pinocitosis. Aquí encon-tramos antígenos de complejos extracelulares o de virus o bacterias en su fase extracelular.

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RECONEIXEMENT DE L’ANTIGEN PER LA CÈL.LULA T

• La majoria de cèl.lules T reconeixen pèptids i no altres molècules

• Les cèl.lules T reconeixen determinants lineals i no comformacionals dels pèptids

• Les cèl.lules T reconeixen antigens associats a cèl.lules (presentats per molèculesdel MHC) i no antigens solubles

L’activació de la cèl.lula T requereix el

processament de l’antigen

Activación de linfocitos T. La activación de la célula T requiere del procesado del antígeno. Ya hemos dicho que el LT no puede reconocer un antígeno soluble.

Vía citosólica

Toda proteína tiene un ciclo de vida que gene-ralmente finaliza con su degradación en el proteasoma. Esta degradación no suele ser ab-soluta, siempre suelen quedar algunos pépti-dos que, si no hay nada que lo impida, acaba-rán también siendo degradados hasta descom-ponerlos en aminoácidos. Es posible que al-guno de estos péptidos pase al interior del RER a través de un transportador TAP. El transporta-dor TAP (Eng: transporter associated with anti-gen processing) es un heterodímero trans-membrana formado por TAP1 y TAP2, que me-dia el transporte dependiente de ATP de glú-cidos, iones, aas y péptidos (preferentemente hidrofóbicos y básicos). Los genes que codifi-can para TAP1/2, que ya vimos que eran molé-culas no clásicas de clase II del MHC, son bas-tante polimórficos, lo cual permite que haya diferencias individuales en lo que respecta la presentación de péptidos (y por tanto condicionamos también la respuesta inmune). Si nos centramos de nuevo en el péptido interiorizado en el RER con la ayuda de TAP, veremos co-mo éste se unirá a una molécula de clase I del MHC conjugada con varias proteínas. La unión se producirá gracias a unas chaperonas. En el RER, la cadena α de la molécula de clase I del MHC se une a la calnexina, que favorece su plegamiento. Acto seguido, se une al complejo cadena α-calnexina tres elemen-tos adicionales: (a) tapasina, (b) calreticulina (estas dos acercan el TAP a las MHC I), y (c) β2 microglobulina. Finalmente, de este complejo saldrá la calnexina para que entre el péptido (si éste es afín) y finalmente también saldrán la tapasina y la calreticulina, dejando ya a una molécula de clase I del MHC conjugada con un péptido, que saldrá a la superficie celular vía

Golgi.

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VIA CITOSÒLICA

Transport dels pèptids des del citosol al reticle endoplasmàtic rugós

TAP (transporter associated with antigen processing): heterodímertransmembrana format per TAP1 i TAP2 (proteïnes de la famíliaATP-binding cassetes) que media el transport depenent d’ATP de sucres,ions, aminoàcids i pèptids (preferentment hidrofòbics i bàsics)-Polimòrfics: diferent resposta individual front antígens endògens-Deficiències: síndrome amb aspectes d’immunodeficiència i autoimmunitat

TAP. Una deficiencia que afecte a la producción de TAP1/2 se manifiesta en forma de procesos de inmu-nodeficiencia y autoinmunidad. Por un lado nuestro sistema inmunitario será deficiente ya que habrán péptidos que no podrán ser presentados (no se acti-van los LT). Por el otro lado, si no podemos presentar algunos péptidos por el MHC (y para ello es esencial su procesado previo), no podremos seleccionar y omitir aquellos linfocitos T que reconozcan antíge-nos propios. La inmunodeficiencia y la autoinmuni-dad no son absolutas.

Els pèptids s’associen a les molècules del MHC I ajudats per xaperonescalnexina: proteïna del reticle endoplasmàtic

s’associa amb al cadena D del MHC I i facilita el seu plegamentcalreticulina i tapasina: acosten el TAP a les MHC I que poden unir el pèptidERp57

El complex MHC I/pèptid és estable i es poden dissociar la calreticulina i la tapasina,i anar a la superfície cel.lular via Golgi

Associació i estabilització de les molècules MHC I

VIA CITOSÒLICA

Asociación y estabilización de las moléculas MHC I. En las diapositivas también se habla de una proteína adi-cional, ERp57, pero no se comentó nada acerca de su función.

Vía endocítica

La vía endocítica consiste en la presentación de péptidos que se generan a partir de molécu-las incluidas en el interior de vesículas endocíticas gracias a una fagocitosis y/o endocitosis (mediada por receptor/pinocitosis). El antígeno será procesado en tres compartimentos ácidos

cuyo pH va disminuyendo progresivamente (endosoma temprano, tardío y lisosoma). En los liso-somas, además, hay toda una serie de enzimas hidrolíticos. La molécula de clase II del MHC se forma en el RER, tanto la cadena α como la β (DR, DP y DQ). Como esta molécula es un heterotrímero, es decir, que necesita de un pépti-do para ser estable, se le unirá una cadena invariante (li) que facilita el plegamiento de la mo-lécula, evita que se una a péptidos dentro del RER y dirige el transporte de las moléculas MHC

II a las vesículas endocíticas. El complejo MHC II-li irá desde el RER al Golgi, donde sufrirá un procesado. Este complejo además viajará en forma de trímeros: (MHC II-li)3. Las vesículas emitidas por el trans-Golgi llegarán a los endosomas tempranos y desde éstos el contenido de las vesículas (MHC II-li) llegarán hasta los lisosomas. A medida que se pasa a un compartimento con ma-yor capacidad proteolítica (endosoma temprano > tardío > lisosoma), la cadena li se irá degra-

dando y quedará únicamente en un fragmento CLIP (Eng: class II-associated invariant chain pep-tide), que impide la unión prematura del péptido. La molécula HLA-DM, que es una molécula MHC ni clásica ni polimórfica que se expresa

en compartimentos endosomales, cataliza el intercambio del fragmento CLIP por el péptido antigénico. El heterotrímero MHCII-péptido es más estable32 y es transportado a la membrana.

Presentación cruzada

Es un fenómeno que únicamente se da en céls. dendríticas. Consiste en que los péptidos gene-rados a partir de la digestión de proteínas endocitadas pueden entrar al RER y ser presenta-dos por moléculas de clase I del MHC. Así pueden presentar antígenos procedentes de céls. infectadas o tumorales a T CD8. Con esto podemos hacer que una célula dendrítica presente

64

32 Esta interacción es tan fuerte que es difícil intercambiar el péptido del MHC II en condiciones fisiológicas.

Vía de presentación endocítica.

péptidos virales sin que ésta tenga que ser infectada. Habría que preguntar si las células dendríticas pueden incorporar el antígeno por fagocitosis además de por pinocitosis (en His-tología se dijo lo contrario).

Inmunogenicidad de los antígenos proteicos

En el tema en el que se trataron los antígenos se dijo que la inmunogenicidad era la capaci-dad de una molécula para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa. Los epítopos peptídi-

cos inmunodominantes son aquellos, de entre los múltiples epítopos de un antígeno, que pue-den unirse al MHC del individuo y por tanto inducir esa respuesta. Recordemos que cada CPA muestra continuamente péptidos derivados de proteínas propias o extrañas. Únicamente algunos de los complejos péptido-MHCII serán susceptibles de activar una célula T específica (0,1%).

Presentación de antígenos no peptídicos

La molécula CD1, que es una molécula MHC I no clásica y asociada con la β2 microglobuli-na, puede presentar antígenos no peptídicos (lípidos y glicolípidos) derivados de antígenos bacte-

rianos a Tγδ, Tα y diversas T. Las células NKT (subpoblación de NK que presenta TCR) pueden reconocer CD1d pre-

sentando péptidos propios, por lo que estas células pueden servir para eliminar células altera-das por estrés, envejecimiento o neoplasia. La vía por la cual la CD1 presenta un antígeno es distinta a la observada para la presentación a través del MHC I. La CD1 tiene un surco de

unión al péptido más grande y profundo respecto a la MHC I.

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Presentación cruzada de los antígenos a los linfocitos T CD8+. Las células infectadas por gérmenes intracelula-res, como virus, son ingeridas por las células dendríticas, y los antígenos de los gérmenes infecciosos son pro-cesados y presentados a los linfocitos T CD8 asociados a moléculas del MHC de la clase I. Así, las céls. dendrí-ticas son capaces de presentar los antígenos vesiculares endocitados por la vía de la clase I.

12. LINFOCITOS T: RECEPTOR Y ONTOGENIA

Receptor de la célula T

El receptor de la célula T (TCR) se caracteriza por toda una serie de rasgos. En primer lugar tiene una especificidad dual; es decir, que reconoce tanto unos residuos del péptido unido al

MHC (especificidad) así como también los residuos polimórficos del MHC (restricción por el MHC). En segundo lugar el TCR se expresa de forma clonal; todos los TCR de la célula son idéntidos entre sí ya que se forman a partir del mismo gen. En tercer lugar, al igual que ob-servamos con los BCR, el gen que da lugar al TCR se recombina de una manera muy similar (para así generar diversidad). En cuarto lugar, y a diferencia del BCR, el TCR se forma siem-pre con una zona transmembrana; no existe una forma soluble. En quinto y último lugar, la célula T dispone de unos 100.000 receptores en su membrana.

Estructura del TCR

El receptor de la célula T es un heterodímero formado por una cadena α y β o bien una γ y una δ. Como otras proteínas del sistema inmuni-tario, el TCR basa su estructura en dominios Ig. El dominio Ig que ocupa la posición N-terminal es el dominio Ig variable y el que es más cercano al C-terminal es el dominio Ig constante. Como ocu-rría con las inmunoglobulinas, el dominio Ig va-riable es el que condiciona la especificidad de unión al péptido presentado. El dominio Ig va-riable dispone de tres regiones hipervariables33 (el V β dispone de cuatro). La diferencia que hay entre el TCRαβ y el TCRγδ es el ángulo que forman sus dominios Ig variables respecto a los dominios Ig constantes (147º vs 111º).

Organización genómica

Como ya hemos dicho en el primer apartado de este tema, el gen que da lugar al TCR se re-combina de una forma muy similar al gen del BCR. La parte variable de la cadena β (Chr. 7) está formada por la suma de tres segmentos génicos: V, D y J. A continuación encontramos un dominio Cβ que da lugar al dominio constante de la cadena β y finalmente el dominio transmembrana. La cadena α (Chr. 14) sería lo equivalente a la cadena ligera de una Ig. Su parte varia-ble se forma a partir de la suma de dos segmentos génicos: V y J. Después, igual que con la ca-

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33 Equivalente a los CDRs de las Ig.

Estructura del TCRαβ. Si nos fijamos, recuerda al fragmento de unión al antígeno de la inmunoglo-bulina (Fab).

dena β, hay un dominio constante Cα y un dominion transmembran. La cadena δ presenta la peculiaridad de formarse a partir de unos segmentos génicos ubicados dentro del locus don-de están los segmentos génicos que dan lugar a la cadena α (Chr. 14 entonces). Esto implica que cuando se recombine el gen de la cadena α, es posible que se pierda la información que da lugar a la cadena δ (y este es uno de los mecanismos que impide a la cél. T expresar a la

vez TCRαβ y γδ). El dominio Ig variable de la cadena δ se forma a partir de la unión VDJ.

Finalmente la cadena γ se forma de una forma similar a la δ (la parte variable está formada por la suma de VJ), con la excepción de que los fragmentos génicos que la codifican se en-cuentran en un locus independiente (Chr. 7), distanciado de otros locus que dan lugar a otras cadenas del TCR.

Reordenamiento de los segmentos génicos del TCRαβ

La recombinación se da igual que en las Igs: se emplean secuencias RSS y RAGs. En primer lugar habrá un reconocimiento de las RSSs por parte de las RAG1/2, después la sinapsis, des-pués la ruptura y finalmente la unión. Si recordamos, la unión podía ser por deleción (si los dos fragmentos génicos V y J están en la misma orientación) o por inversión (si están en orien-tación opuesta). En primer lugar se recombina la cadena β (que sería equivalente a la cadena pesada de las Ig): unión D-J y después V-DJ (diversidad). Cuando se produce esta unión tenemos una serie de mecanismos generadores de diversidad: (0) ruptura de la horquilla covalente al azar; (1) adición de nucleótidos-P; (2) adición de nucleótidos-N (a través de la TdT); (3) flexibilidad de

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Organización de los genes del TCR. Fijémonos en la posición en la que se encuentran los segmentos génicos que dan lugar a la cadena δ.

unión. En segundo lugar ya se podrá pasar directamente a la transcripción del gen ya funcional, ya que se ha acercado el promotor a una región que actúa a modo de enhancer. Finalmente se dará la traducción. Como la cadena α no se forma a la par que la β, la cadena β se expre-sará en la membrana de la célula T junto a un “sucedáneo” de la cadena α (como ocurría con el BCR). La cadena α formará su parte variable con la unión de un segmento V con uno J. Tras la transcripción y posterior traducción, tendremos un péptido α que podrá unirse al β: el hete-rodímero podrá expresarse en la membrana (TCR funcional). La recombinación se gracias a que las RAG1/2 reconoce segmentos génicos flanquea-dos por RSS de una vuelta o dos. Las uniones se dan siguiendo la regla 12/23. Ahora bien, mientras que los segmentos D del gen del BCR estaban flanqueados por RSS del mismo nú-

mero de vueltas, los segmentos D del TCR (cadena β, δ) están flanqueados por RSS de diferen-

te número de vueltas. Esto permite que dos segmentos D puedan unirse entre sí, dando lugar a

nuevas combinaciones (p. ej., V-D-D-J). Este es un mecanismo generador de diversidad adicio-nal que no encontramos en el BCR. Atención, en la recombinación somática del TCR no se da la hipermutación somática. Esto asegura que no haya un cambio de afinidad del TCR después de la selección tímica. Es-to reduce las posibilidades de generar TCRs autorreactivos.

Posible lio. Para aclararnos, los mecanismos de generación de diversidad son (según las diapostivas): (a) combinatoria de unión V-J y VDJ; (b) unión alternativa de segmentos D; (c) flexibilidad de unión; (d) adi-

ción de nucleótidos-N (y P no?).

Ontogenia de las células T (mirar esquema de las diapositivas)

El primer precursor de la célula T es la ya famosa célula madre hematopoyética (HSC), pre-sente en la médula ósea. Ésta da lugar al precursor linfoide, que una vez formado migrará al timo, donde encontramos un microambiente adecuado para que se dé la maduración. Al en-trar al timo (precursor de la célula T), se induce la expresión de RAG y produce la unión de los segmentos Dβ-Jβ (célula pro-T doble negativa CD4-/CD8-). A continuación se da la unión de los segmentos Vβ-DβJβ (célula pre-T doble negativa)34. En este estadio de pre-T DN comenzará la

expresión de CD3 y en su membrana también encontraremos la cadena β junto al sucedáneo

de la cadena α (pre-Tα). Finalmente se producirá la recombinación de la cadena α (Vα-Jα) (célula pro-T doble positiva CD4+/CD8+). La célula pro-T acabará expresando únicamente CD4 o CD8 mientras que se da una selección positiva (reconocimiento de MHCs propios) y negativa (se eliminan las células T que reconocen péptidos propios). El receptor pre-TCR, formado por el TCRβ y pre-Tα, produce toda una serie de señales intracelulares: (a) se detiene la recombinación del gen de la cadena β (exclusión alélica); (b) se estimula la proliferación; (c) se estimula la expresión de CD4 y CD8 (DP); (d) empieza la recombinación de la cadena α35.

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34 Doble negativo = DN; doble positivo será DP.

35 No hay un proceso estricto de exclusión alélica para la cadena α, se pueden llegar a recombinar los dos ale-los.

Debido a la selección positiva y la selección negativa cerca de un 98% de los timocitos mue-

ren (proceso muy costoso por tanto). Si la selección positiva elimina a aquellas células T que no reconocen las moléculas del MHC propias, estamos generando un repertorio de células T

restringido por el MHC propio. Por el otro lado, si la selección negativa omite aquellas células T que reconocen, con una gran afinidad, a péptidos propios, estaremos generando un reperto-

rio de células T auto-tolerante.

Para que se dé la selección positiva necesitamos que haya una interacción entre célula T y moléculas de clase I y de clase II del MHC. Las células epiteliales tímicas eliminan a aquellas T que no pueden interaccionar con estas células a través del MHC (las que pueden interaccio-nar reciben señales de supervivencia). Una vez tenemos un repertorio de células T que reco-nocen el MHC propio, aquellas células T que reconozcan un péptido presentado por una célula

dendrítica del timo (vía MHC I y II) con una elevada afinidad entrará en apoptosis. Hemos de pen-sar que por narices reconocerán un péptido propio, ya que las moléculas del MHC se expre-san en la membrana siempre con algún péptido. Sobre el papel ninguna célula T podría ma-durar, cosa que no sucede (incógnita de la selección tímica). La hipótesis que actualmente dispone de más adeptos es la que hemos comentado de la afinidad36. La presentación de los péptidos en el timo se da gracias a las células epiteliales tími-cas (forman una red en la que están los timocitos madurando; elevada expresión de MHCI/II) y otras células estromales (macrófagos y dendríticas), que también expresan MHCI/II. Como no todos los péptidos pueden ser presentados por el timo (p. ej., específicos de tejidos con-

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36 Existe otra hipótesis, la de la señalización diferencial, que consiste en que la selección está determinada por señales diferentes en lugar de por la intensidad de la misma señal.

Maduración de los linfocitos T en el timo.

cretos), las células epiteliales del timo expresan la proteína AIRE (Eng: autoimmune regulator), una proteína nuclear que induce la expresión de genes tejido-específicos en el timo.

Paso de doble positivo (DP) a single positive (SP)

Existen dos modelos que explican como se pasa de DP a SP. El modelo estoclástico afirma que al azar se deja de expresar CD4 o CD8 independientemente de la especificidad por el TCR. Únicamente los timocitos con un TCR y un co-receptor que reconozcan a la misma clase de molécula del MHC sobrevivirán. El modelo instructivo (el más aceptado) dice que el TCR específico para MHC I + CD8 genera una señal diferente a la del TCR específico para MHC II + CD4. Estas señales diferen-tes instruyen a los timocitos a diferenciarse en CD4+ o CD8+. La gran mayoría de los linfocitos T en el timo son DP, y en la sangre son SP (aunque pueden haber DP y DN). Cuando se está en el estado de DP, en primer lugar se pasará a un estado de CD4+ y CD8lo (lo = low) antes de acabar siendo un CD4+ o CD8+. En sangre la proporción entre colaboradores (CD4+) y citotóxicos (CD8+) es de 2:1.

Los Tγδ únicamente representan entre el 5 y el 10% de los linfocitos T en sangre. La recom-binación de los genes de la cadena γ y δ se da a lo largo de la vida del individuo (en diferentes etapas vitales). El reordenamiento se da en grupos de células que expresan diferentes seg-mentos Vγ y Vδ. Entre los Tγδ podemos distinguir una subpoblación que expresa CD8. Los Tγδ se les puede considerar un brazo de la inmunidad innata ya que pueden reconocer estructuras presentes en microorganismos habitualmente localizados en las barreras epiteliales.

Alorreactividad

La alorreactividad es el reconocimiento de aloantígenos. Un aloantígeno es una molécula que difiere entre los miembros de una misma especie por variaciones genéticas, como por ejem-

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Expresión de CD4 y CD8 en los timocitos. La imagen A corresponde a una citometría de flujo en dos colores (se emplean anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 marcados con fluorocromos distintos).

plo los polimorfismos. Un ejemplo de aloantígeno son las moléculas del MHC. En la alo-rreactividad se da una respuesta directa de células T a las moléculas del MHC alogénicas. Para comprenderlo mejor: la alorreactividad abre una modalidad adicional de activación de la célula T:

- Método tradicional. Una CPA propia presenta gracias a su MHC un péptido alogénico, como puede ser uno formado por la incorporación de una molécula de MHC alogé-nica.

- Método nuevo (alorreactividad)37. La célula T es capaz de reconocer directamente la mo-lécula de MHC alogénica que tiene en su membrana la célula ajena. Esto se explica por la reactividad cruzada: hay un parecido estructural entre el MHC propio y el alo-génico. A esta similitud estructural puede contribuir o no el péptido presentado por el MHC alogénico.

Del total de células T, entre el 1 y el 5% son alorreactivas para un determinado aloantígeno. Las dos clases de activación se dan simultáneamente. Esto es lo que se da en los transplantes de órganos, de ahí el uso de los inmunosupresores.

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37 Se rompe, por tanto, el dogma TCR-Ag/MHCpropio (ahora puede ser TCR-Ag/MHC ajeno).

13. MOLÉCULAS DE ADHESIÓN

Introducción

Las moléculas de adhesión las encontramos en células del sistema inmunitario y otras que no pertencen al mismo. Son las encargadas del homing (dirigir a los leucocitos a los tejidos adecuados) y la recirculación de los linfocitos. Las moléculas de adhesión aumentan la intensi-

dad de las interacciones funcionales entre las moléculas del sistema inmunitario (entre CPA y TH, B-TH y cél. diana-TC). Supogamos un leucocito formado en la médula ósea que está circulando por el to-rrente sanguíneo. En el tejido subyacente al endotelio se produce una infección que produce la liberación de toda una serie de citocinas. Estas citocinas activan al endotelio, que mostrará una serie de moléculas de adhesión en su membrana apical que permitirán que el leucocito disminuya su velocidad, se adhiera al endotelio y finalmente se extravase para combatir la infección.

Moléculas de adhesión

Hay cuatro grandes familias de moléculas de adhesión: (a) mucinas; (b) selectinas; (c) superfa-

milia de las Igs (ICAM); (d) integrinas. Las interacciones serán entre mucinas y selectinas, y en-tre ICAMs e integrinas.

(a) Mucinas. Las mucinas son unas proteínas muy glicosiladas ricas en Ser y Thr. Presen-tan ligandos carbohidratados y sializados (ácido siálico) en las lectinas.

- CD34 y GlyCAM-1. Presentes en las céls. endoteliales de los nódulos linfáticos. Son reconocidas por las L-selectinas de los leucocitos.

- PSGL-1. Presentes en los neutrófilos; interactúa con las selectinas E y P.(b) Selectinas. Son unas glicoproteínas de membrana con dominios lectina-like que se

unen a carbohidratos específicos (presentes en las mucinas). Las selectinas son las responsables de la adhesión inicial de los leucocitos al endotelio.

- Selectina L. Presente en los leucocitos circulantes.- Selectinas E y P. Presentes en las células endoteliales activadas.

(c) Integrinas38. Las integrinas son unas proteínas heterodiméricas (cadena α y β). Se ex-presan en leucocitos (diferentes formas en diferentes poblaciones) y facilitan y regu-lan la (1) interacción cél-cél y la (2) adhesión al endotelio (extravasación). La unión en-tre integrina y ligando suele requerir una activación (quimiocinas regulan la afinidad de unión). Se habló de Mac-1 que forma parte del CD11b de los leucocitos.

(d) ICAMs. Son unas proteínas formadas por dominios Ig-like. Se expresan en las céls. endoteliales. En el endotelio vascular encontramos ICAM-1/2/3 y VCAM. En el endote-

lio de la mucosa encontramos MadCAM-1, que contiene dominios Ig-like (unión a in-tegrinas) y mucina-like (a selectinas) [molécula bifuncional]. Permiten la entrada de linfocitos a la mucosa.

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38 Una deficiencia a nivel de integrinas puede causar una alteración de la respuesta inmunitaria (p. ej., LAD; Eng: leukocyte-adhesion deficiency).

Extravasación/homing de linfocitos

Los homing receptors son aquellos que dirigen las subpoblaciones de linfocitos a un órgano linfoide concreto o a los lugares de inflamación. Estos receptores son distintos en las diferen-tes subpoblaciones de leucocitos y linfocitos (distintos, p. ej., entre T naive, efectores y de memoria). Las quimiocinas regulan la expresión y la afinidad de los homing receptors39. Las vénulas de endotelio alto (HEV; Eng: high-endothelial venules) son unas células es-pecializadas del endotelio vascular de las vénulas post-capilares de los órganos linfoides (excepto bazo). Disponen de toda una serie de moléculas de adhesión, algunas tejido-espe-cíficas (adresinas vasculares) que permiten una extravasación de un gran número de linfocitos por segundo. Esta extravasación está regulada por las citocinas producidas en respuesta a la captura de un antígeno. A continuación veremos como un T naive puede extravasarse a través de una HEV. En primer lugar hay una interacción entre la L-selectina y CD34 (HEV). Esto une el T naive débil-mente a la HEV. En segundo lugar una quimiocina expresada por la HEV inducirá un cambio en la conformación de la integrina LFA-1 del T naive, lo que hará que la célula T se una fuer-temente a la HEV gracias a la interacción entre LFA-1 e ICAM-1 (HEV). Las células T efectoras y de memoria harán un homing dirigido al paso a tejidos espe-cíficos o inflamados por medio de la interacción entre receptores homing y moléculas de adhesión específicas. A nivel del intestino, por ejemplo, es importante la interacción entre LPAM-1 (T) y MadCAM-1 (endotelio). A nivel de la piel, es importante la interacción entre CLA (T) y la E-selectina (endotelio) [vaya broma, ¿de verdad me lo tengo que aprender?].

Recirculación de los linfocitos

La recirculación de los linfocitos es un mecanismo que incrementa las posibilidades de en-cuentro de un linfocito con el antígeno que reconoce específicamente. Eminentemente se basa en la extravasación, el paso (mediado por moléculas de adhesión) de linfocitos desde la san-gre a los tejidos (linfoides y extralinfoides).

Moléculas accesorias de la célula T

Las moléculas accesorias de la célula T son una serie de proteínas de membrana del linfocito T, diferentes del TCR40 que tienen un papel crucial en la respuesta al antígeno (activación de la

célula T). Interaccionarán con otras moléculas (ligandos) de otras células (p. ej., CPA) y son no

polimórficas e invariantes. La afinidad del TCR por complejo MHC-péptido es baja en compa-ración con la unión Ag-Ig o ligando-receptor; las moléculas de adhesión (accesorias) aumentan la fuerza de interacción entre cél. T y CPA. Un ejemplo de molécula accesoria clave es CD3, que permite la transducción de señales. Sin CD3, no se expresa el TCR.

73

39 Con esto lo que se quiere decir es que, por ejemplo, la IL-8 puede hacer que las integrinas que presenta la membrana de un neutrófilo cambien su conformación y puedan interaccionar con las ICAM del endotelio.

40 Si nos fijamos, el TCR apenas tiene residuos citosólicos más allá del dominio transmembrana. La activación de la célula T (vía de señalización intracelular) se dará gracias a las proteínas que veremos a continuación.

La activación de una célula T naive requiere dos señales (símil de la guerra nuclear):- Señal 1. Es la dependiente del antígeno (estímulo) y por tanto específica. TCR-Ag-MHC-

CD4/CD8.- Señal 2. Independiente del antígeno (coestímulo). CD28-CD80/86 (o B7-1/2). Las cé-

lulas que no expresen B7 no podrán activar un gran número de T naive. Las células activadoras de T naive por antonomasia son las células dendríticas maduras. Los LB y los macrófagos

41 también pueden llegar a activar T naive.

Los T efectores y los de memoria ya no precisan del señal coestimulador. Si la célula T naive recibe un estímulo antigénico en ausencia de coestímulo, no podrá volver a ser activada aun-que reciba un nuevo estímulo + coestímulo (base para la tolerancia periférica a antígenos propios); el T naive en este caso habrá entrado en anergia.

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41 Los macrófagos también pueden expresar B7, aunque en menor cuantía. No podrán activar demasiados T naive ya que el macrófago no puede migrar, reside en el tejido al que se ha extravasado (y hay pocos naive en los tejidos periéricos).

Augment de la força d’interacció entre la cèl.lula T i la cèl.lula APC(integrines i ICAMs)

+Transducció de senyals

MOLÈCULES ACCESSÒRIES DE LA CÈL.LULA T

Moléculas accesorias de la célula T. Ya las iremos viendo, pero se avanzaron que las siguientes moléculas eran importantes: CD3, CD28 (que determina si el T naive se acaba activando), CD4, CD8, CD2 y diversas integri-nas. CD28 interaccionará con CD80/86 de la CPA, que también puede denominarse B7-1/2.

14. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T

Introducción

La activación es una fase que va entre la fase de reconocimiento (CPA o célula diana que inte-racciona con la célula T) y la fase efectora (proliferación, diferenciación y funciones efecto-ras). La interleucina 2 (IL-2) será esencial para que se dé esta proliferación, ya que permite el paso del linfocito T de G0 a G1. El T naive migrará al ganglio linfático, interaccionará con una célula dendrítica que le presentará el antígeno y se producirá la activación. Una vez activada, las células efectoras que se forman migrarán al tejido donde está la infección, donde se pro-ducirá una segunda activación (ya sin que se necesite el coestímulo).

Formación de la sinapsis inmunológica

Antes del reconocimiento del antígeno, los receptores de la célula T y sus ligandos en la CPA están dispersados por la membrana plasmática de las dos células. Cuando se da el reconocimien-to del antígeno, habrá una redistribución de moléculas dando lugar a un área concreta de con-tacto célula-célula (sinapsis inmunológica). Esta sinapsis consta de dos partes: un círculo cen-tral (cSMAC; Eng: central supramolecular activation cluster) y un anillo periférico (pSMAC; Eng: peripheral supramolecular activation cluster). En el círculo central está el TCR (en T) y el MHC (en la CPA) mientras que en el anillo periférico están las moléculas de adhesión.

Complejo TCR-CD3

CD3 es un dímero formado por dos de cinco cadenas polipeptídicas invariantes; los dímeros pueden ser ζζ (o ζη), γε y εδ. Dispone de unos dominios ITAM (Eng: immunoreceptor tyrosi-ne based activation motif) citosólicos que contienen residuos Tyr a una cierta distancia unos de

otros que pueden ser fosforilados y así reclutar a diferentes sustratos relevantes para la seña-lización de la célula T. CD3 no tiene actividad enzimática y es necesario para la expresión del TCR en la membrana (y que éste sea estable).

Funciones de los motivos ITAM

Las funciones de los motivos ITAM son las siguientes:(a) Importantes en la transmisión de señales. Permite que la interacción antígeno-TCR dé

lugar a una respuesta intracelular mediada por estos dominios.(b) Sustrato y ligando de proteínas-tirosina-cinasas (PTK). Las tirosinas son el sustrato de

PTKs de la familia Src (como lck y fyn) o bien un ligando para la familia de las Syk (como ZAP-70).

(c) Multiplicidad vs especificidad de las ITAM. Serán importantes para la amplificación y la diversificación de la señal.

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Transducción de señales por el TCR/CD3. Vía Ras-MAPK

Cuando se produce la interacción entre el TCR y el antí-geno la membrana de la célula T sufre una redistribución de las moléculas formándose la sinapsis inmunológica. Esta recolocación permite que las PTKs lck y fyn puedan fosfo-rilar los dominios ITAM de CD3. Atención, lck está asocia-

da con CD4/8. Estas tirosinas fosforiladas serán el ligando al que se unirán los dominios SH242 de ZAP70. Esta PTK se caracteriza por tener dos dominios SH2 a una distancia determinada, lo que le permite interactuar específicamen-te con un dominio ITAM en concreto. Uno de los sustra-tos de ZAP70 será la proteína de membrana adaptadora

LAT, que dispone de un dominio citosólico rico en tirosi-nas. Por proteína adaptadora entendemos que está cons-tituida por dominios de interacción proteína-proteína. Las fosfotirosinas de LAT serán el punto de unión de otras proteínas, como por ejemplo la fosfolipasa Cγ (PLCγ). Como resultado de todas estas fosforilaciones y recluta-mientos, llegaremos a la activación de toda una serie de ví-

as intracelulares por medio del incremento del Ca2+, y se producirán cambios en el citoesqueleto de actina. Ya que hemos hablado de los dominios SH2, comentar que en algunas proteínas de estas vías de transducción encontraremos los dominios SH3, que reco-nocen zonas ricas en prolina presentes en otras proteínas (median, por tanto, interacciones entre proteínas). Volviendo a LAT, sus fosfotirosinas pueden servir para unir la proteína GRB2, que dis-pone de un dominio SH2 para ello. GRB2 además dispone del dominio SH3 (dispone de dos) que acabamos de comentar, por lo que podrá unirse a una zona rica en prolina presente en la proteína SOS. Esta última proteína induce el intercambio del GDP de Ras a GTP, activan-

do a esta proteína G monomérica e induciendo la vía de las MAPK (Ras-GTP libera a Raf y se une a ella → Raf fosforila MEK → MEK fosforila a ERK-1,2). En último término se produce la sín-tesis y activación de factores de transcripción (TF).

Regulación del metabolismo de los fosfoinositoles y el Ca2+ (Fig. 7-15 Abbas 7a ed)

La PLCγ hidrolizará el fosfatidil-inositol-(4,5)-difosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG), que per-manecerá en la membrana, y en inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3), que irá hacia el retículo endo-plasmático y abrirá unos canales de Ca2+, incrementando la concentración intracelular del mismo. Este incremento del Ca2+ citosólico se producirá en poco tiempo y además se man-

tendrá durante una hora gracias a que la proteína STIM1 del retículo interactuará con el canal

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42 Los dominios SH2 tienen una alta afinidad por las fosfotirosinas. Su nombre procede de uniones con homo-logía a Src, el primer oncogen descubierto (ratón).

Cinasas implicadas en la activación de la célula T. Se puede ver de qué domi-nios consta cada una de las cinasas.

CRAC de la membrana plasmática, un canal de calcio que permitirá el paso de calcio extra-celular al citosol. Huelga decir que el incremento del Ca2+ citosólico mediará una respuesta celular.

Factores de transcripción implicados

Los diferentes factores de transcripción activados y translocados al núcleo se unirán al pro-

motor de un gen. A continuación veremos algunos:- Jun. Ras-GTP permitirá que JNK fosforile a Jun y así éste pueda translocarse al núcleo.

Para activarse precisará de la proteína Fos. Fos-Jun-P se unirá al promotor del gen de la interleucina-2, permitiendo que se forme el mRNA de IL-2 (será uno de tantos TFs que se unen a ese promotor).

- ELK. Ras-GTP permtirá que ERK fosforile a ELK. En su forma fosforilada, ELK se trans-locará al núcleo y se unirá al promotor del gen fos, dando lugar a la proteína Fos en último término.

- NFAT. A diferencia de otros TFs, NFAT está fosforilado en el citosol e inactivo. Cuando la concentración de Ca2+ citosólico incrementa, la calmodulina se unirá a la calcineurina (S/T fosfatasa), y ésta a su vez desfosforilará a NFAT. NFAT será uno de los TFs impli-cados en la regulación del gen IL-2. Sin la expresión de NFAT no podrá formarse IL-2, por lo que la célula T no se podrá activar.

- NF-κB. El factor de transcripción NF-κB está secuestrado en el citosol porque está unido a

IκB. Una vez fosforilamos a este proteína secuestradora, IκB es degradada y NF-κB puede translocarse al núcleo, donde irá al promotor del gen de la IL-2.

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Transducción de señales por TCR/CD3 (vía Ras-MAPK). Esta imagen corresponde al aparado anterior. Nótese como ZAP-70, una vez acoplada a los dominios ITAM de (en este caso) ζ, ha podido también fosforilar a la fos-folipasa Cγ1.

Activación de la célula T por CD28

Las células T naive no se activarán únicamente con la interacción entre su TCR y el MHC que presente un péptido específico, precisan además de una señal coestimuladora (CD80/86;

B7-1/2). Si esto no se da así, la célula T entrará en un estado de anergia. Las moléculas B7 están en la CPA, generalmente una célula dendrítica, e interactuarán con CD28, presente en la membrana de la cél. T. La vía de transducción generada a partir de este contacto y a las vías ya vistas por la interacción entre el TCR y el antígeno dan lugar a tres efectos principales:

(a) Supervivencia celular. Por incremento de la producción de genes antiapoptóticos co-mo Bcl-xL y Bcl-2.

(b) Proliferación celular. Por el incremento de la formación de IL-2, la síntesis del receptor de dicha interleucina (IL-2R), la formación de ciclinas y la disminución de los inhi-bidores del ciclo celular.

(c) Diferenciación a célula efectora y de memoria. A través del múltiples mecanismos.

Función de CD40 en la activación de la célula T

Cuando una cél. T reconoce a un antígeno, haya o no coestimulador, se inducirá la expre-sión en la misma del ligando CD40 (CD40L). Este ligando interactuará con CD40 de la célula dendrítica, lo que hará que ésta forme B7 así como también libere citocinas encargadas de estimular la proliferación y diferenciación de la célula T.

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Detalle de las diferentes vías de activación de los factores de transcripción implicados en la expresión de ge-nes de la respuesta inmunitaria. Hay un error, Ras-GDP no activa a ERK, es Ras-GTP

Papel de CTLA-4

Tras la activación de la célula T, ésta acabará expresando la proteína de membrana CTLA-4 con el fin de controlar la respuesta (es un inhibidor del linfocito T). Esta inhibición se realiza por medio de desfosforilaciones, de impedir que se formen los IP3, etc.

Superantígenos

Los superantígenos (p. ej., staphylococcal enterotoxins; alimentos) son proteínas virales o bacterianas que se unen simultáneamente a la cadena α del MHC de clase II y al dominio Vβ del TCR. Son peligrosos ya que pueden hacer que haya una activación policlonal del 5% de TH, lo que conlleva una sobreproducción de citocinas y una toxicidad sistémica.

Ciclosporina: inhibe a la calcineurina para que NFAT no se desfosforile y así no se forme IL-2, evitando la acti-vacion de las células T. Ésta y FK506 son fármacos inmunosupresores. Otros mecanismos en la diapositiva.

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Inhibición de la transducción de señales. A continuación se muestran mecanismos para inhibir la transducción de señales. (izquierda) Se puede observar como se reclutan protein-tirosina-fosfatasas (SHP1/2) para desfosfori-lar las fosfotirosinas. Estas fostasas se reclutan en los dominios ITIM (Eng: immunoreceptor tyrosine-based inhi-bitory motif. (derecha) Se puede observar como se reclutan ubiquitin-ligasas (como Cbl-b) que se encargan de, por ejemplo, mandar a degradar la ZAP-70. Además de los ITIM están los ITSM, que tendrían una doble fun-ción, tanto activar como inhibir (Eng: immunoreceptor tyrosine-based switch motif).

15. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS B

Introducción

La mayor parte de los linfocitos B precisan contactar con el antígeno y con otro estímulo, como una interacción con un linfocito T colaborador, para activarse. Estas dos señales harán que el LB abandone su estado de quiescencia (Go) y que entre en el ciclo celular, dando lu-gar a la expansión clonal. Los productos de esta expansión clonal son células plasmáticas (o efectoras) que han incrementado la afinidad de su BCR (hipermutación somática), han sufrido un cambio de isotipo o bien son células B de memoria. Además del TH y del antígeno, que ha-cen que el LB entre en el ciclo, se precisan toda una serie de señales de progresión que hacen que el proceso aquí explicado siga adelante (citocinas y otros elementos).

Subpoblaciones de Bs

Tenemos dos grandes poblaciones de linfocitos B: B1 y B2; y los B2 pueden distinguirse en B2 foliculares y B2 de la zona marginal. Los B2 foliculares están presentes en el bazo y otros órganos linfáticos, y para ser activados precisan de una interacción con un TH además de con el antígeno. Los B2 de la zona marginal (también típicos del bazo y otros órganos linfáticos) y los B1 (mucosas, peritoneo) son T-independientes43 y forman células plasmáticas secretoras de IgM y de vida corta (el pie de página aclara bastante).

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43 Las respuestas de anticuerpos frente a antígenos multivalentes (que presentan varios epítopos idénticos) no proteínicos como los polisacáridos, algunos lípidos y los ácidos nucleicos, no requieren T cooperadores espe-cíficos frente al antígeno.

Diferentes subgrupos de linfocitos B median diferentes tipos de respuestas de anticuerpos. Los LB foliculares son células recirculantes que reciben ayuda del LT cuando responden a antígenos proteínicos, y así inician res-puestas de anticuerpos dependientes de T. Estas respuestas pueden llevar a la formación de centros germinales, donde puede producirse el cambio de clase y la mutación somática del gen del anticuerpo, lo que da lugar a respuestas especializadas de anticuerpos de afinidad alta. Las respuestas independientes de T frente a antígenos multivalentes, como los lípidos, los polisacáridos y los ácidos nucleicos, están mediadas, sobre todo, por LB de la zona marginal en el bazo y B1 en las mucosas.

Activación de un linfocito B por un antígeno timo dependiente (v. Fig. 11-7 Abbas)

Remito al tema 8 (Ontogenia de los linfocitos B), aunque no sin antes hacer una aclaración adicional. Cuando se produce la interacción entre linfocitos B y linfocitos T, algunos de los LT pueden diferenciarse en linfocitos T foliculares colaboradores (TFH). Éstos migrarán al folículo para activar a los LB. En los folículos se formarán los centros germinales, lugares de extensa proliferación de los linfocitos B, cambio de isotipo, mutación somática, acontecimientos se-lectivos que conducen a la maduración de la afinidad, la generación de linfocitos B de me-moria y la inducción de células plasmáticas de vida larga que migran a la médula ósea.

Complejo BCR

El BCR no es más que la forma de membrana de un anticuerpo (mIgM). Como estas formas tienen una parte intracelular más bien corta (tres aas), no se puede dar la transducción de la señal. En su lugar, la transducción de la señal fruto de la inte-racción entre Ig y Ag se realizará gracias a dos moléculas, Igα e Igβ, unidas entre sí por enlaces disulfuro y que se expresan en los LB asociadas de

forma no covalente a la Ig de membrana. Estas pro-teínas contienen un dominio ITAM en su cola ci-toplasmática y van a ser necesarias para el trans-porte de moléculas mIg hacia la superficie celu-lar. La suma de estas dos proteínas junto a la Ig de membrana de turno (en función de si ha habi-do cambio de isotipo o no) constituye el complejo receptor del linfocito B (BCR).

Transducción de señales por el complejo BCR/Igα/Igβ

La transducción señales se inicia cuando se produce el entrecruzamiento entre el BCR y un antígeno multivalente, permitiendo que cinasas de la familia Src (como Lyn, Blk y Fyn) unidas a la membrana puedan fosforilar las tirosinas de los dominios ITAM de la Igα e Igβ. Una vez fosforiladas, éstas serán el punto donde se acoplarán proteínas con dominios SH2, como la tirosina cinasa Syk (que tiene dos dominios SH2 en tandem). La interacción con las fosfotiro-sinas activa a la cinasa, que empezará a fosforilar a toda una serie de sustratos intracelulares. En el caso en el que el antígeno sea monovalente (incapaz de entrecruzar múltiples moléculas de Ig), se puede producir la señalización intracelular pero puede ser necesaria una activa-ción adicional derivada de los TH para activar completamente al linfocito B.

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Complejo receptor para el antígeno del linfocito B. La IgM de membrana (y la IgD) en la superficie de los LB maduros se asocia a las moléculas invariantes Igβ e Igα, que contienen ITAM en sus colas citoplasmáticas, que median la transmisión de señales.

Una de las moléculas que participa en la vía de transducción de señal es la btk (Bruton’s tyrosine kinase). Una mutación en el gen que codifica esta proteína puede producir un de-fecto en la transducción de señales, comprometiendo la activación de la célula B. Esto es lo que se conoce como agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (no hay Ig en el suero).

Transducción de señales por el correceptor de la cél. B (complejo CR2, CD19 y CD81/TAPA1)

La célula B dispone de un correceptor formado por el receptor del complemento CR2, CD19 y CD81 (o TAPA1). CR2 se unirá al fragmento C3b que estará unido a un microorganismo (que puede tener epítopos susceptibles a ser reconocidos por el BCR también). CD19 dispone de un dominio citosólico ITAM que permite, una vez fosforilado por Syk, el reclutamiento de la PI3-cinasa (que fosforilará a toda una serie de sustratos intracelulares, favoreciendo la activa-ción del LB). La cola fosforilada de CD19 también permite un mejor reclutamiento de Lyn, que si recordamos es la encargada de fosforilar los dominios ITAM de Igα/Igβ. Generalmente el linfocito B sufrirá simultáneamente las dos vías de señalización: (1)

BCR; (2) correceptor de la célula B. Esto es especialmente útil cuando hay poca cantidad de antígeno.

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Transducción de señales por el complejo BCR. La tirosina cinasa Syk fosforilará a la proteína adaptadora SLP-65, que está unida a la btk que hemos comentado en el cuerpo del texto. La fosforilación de SLP-65 permite que se una Grb2, y ésta recibirá a SOS, un intercambiador de nucleótidos de guanina. Ras-GTP activará la cas-cada MAPK. La PLCγ que aquí se muestra es la isoforma 2 (la 1 es la típica de los LT). Esta fosfolipasa liberará IP3 (que incrementará el Ca2+ citosólico) y DAG (que activará a la PKC). Como resultado final tenemos la acti-vación de una serie de factores de transcripción que modularán la expresión génica.

Los TLRs también pueden tener un efecto similar al producido por la interacción entre antí-geno-C3b y correceptor de la célula B: amplificar la señal. Una vez se produce la activación del BCR, habrá toda una serie de respuestas funcio-nales: (a) ↑supervivencia; (b) proliferación; (c) ↑expresión de B7-1/2; (d) ↑expresión de repto-res de citocinas; (e) ↑expresión de CCR7 y migración desde el folículo hacia zonas donde ha-ya linfocitos T. Como vemos, el LB se empieza a preparar para su interacción con los linfocitos

colaboradores.

Activación del linfocito B mediada por el linfocito T

Se trata de un proceso que consta de las siguientes etapas:(A) En primer lugar se produce el entrecruzamiento (crosslinking) entre antígeno y mIg

[señal 1] Esto producirá un incremento en la expresión de MHCII y de B7. A conti-nuación se producirá la internalización de los complejos mIg-Ag (endocitosis media-da por receptor) y posterior degradación para que así se pueda presentar en la membrana el complejo MHCII-péptido.

(B) Llegados a este punto, el TH será capaz de reconocer el antígeno presentado por la molécula de MHCII y gracias a las señales coestimuladoras (B7-CD28), se dará la acti-

vación de la célula T.

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Papel del complemento en la activación del linfocito B. Los antígenos microbianos que se han unido al frag-mento del complemento C3b pueden unirse simultáneamente a la molécula CR2 y a la Ig de membrana en la superficie de un linfocito B. Esto inicia las cascadas de transmisión de señales a partir del complejo BCR y el complejo CR2, debido a lo cual la respuesta a los complejos C3b-antígeno aumenta mucho en relación con la respuesta al antígeno solamente. Este sería un buen ejemplo de relación entre la inmunidad innata (comple-mento) y la adaptativa. (creo que es C3b y no C3d)

(C) La célula TH expresará el ligando CD40L, que interaccionará con CD40 de la célula B. Esta es la señal 2.

(D) Fruto de esta interacción la célula B formará receptores de citocinas y la célula T ex-

presará citocinas (IL-2, IL-4,…). Estas citocinas secretadas son señales que promue-ven la proliferación, diferenciación, cambio de isotipo, maduración de la afinidad y la memoria de la célula B.

La respuesta humoral de la célula B frente a antígenos proteicos precisa, por tanto, de tres eventos: (a) reconocimiento del Ag por la LB; (b) reconocimiento del Ag por el TH; (c) cooperación

entre LT y LB específicos para el antígeno. Todo se da gracias a interacciones bidireccionales (MHCII-Ag/TCR-CD4; CD40/CD40L; B7/CD28) y monodireccionales (las citocinas liberadas por el TH). En función de las citocinas a las que quede expuesta la célula B se producirá un cam-bio de isotipo u otro. En un principio, los LB forman IgM pentaméricas. A partir de aquí pue-den suceder tres cosas:

- Exposición a IFNγ. Se producirá un cambio hacia IgG (principalmente IgG1 e IgG3). Estas Ig pueden interaccionar con receptores de la Fc de las Ig presentes en macrófagos. Participan en la activación del complemento y en la inmunidad neonatal.

- Exposición a IL-4. Se producirá un cambio hacia IgE, que está relacionada con proce-sos de hipersensibilidad (liberación de gránulos por parte de los mastocitos) y defensa contra parásitos.

- Exposición hacia citocinas que suelen estar en mucosas (TGF-β). Se producirá un cambio hacia IgA, importante para la inmunidad de las mucosas.

Para que el cambio de isotipo, además de ser necesarias estas citocinas, es importante que se produzca la interacción entre CD40 y CD40L. Si no se da (por una deficiencia en CD40L), entonces no habrá cambio de isotipo, ni hipermutación somática ni se formarán células de memoria. Esto es lo que se conoce como síndrome de hiper-IgM ligado a X.

Activación de un LB por antígemos timo independientes

Los antígenos timo independientes (antígenos TI-1) son antígenos no proteicos (polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos) que se entrecruzan (crosslinking) con múltiples mIg y que pueden activar al complemento. Pese a poder inducir una activación policlonal, no lograrán que se dé un cambio de isotipo, ni una maduración de afinidad, ni se generará memoria ni habrá una respuesta secundaria (en cambio, todo esto sí que se da en el caso de que la célula B haya sido activada por un antígeno TD o timo dependiente).

Regulación de la activación de la célula B

En el sistema inmunitario es tanto o quizá más importante la activación como el control de la

activación. A continuación se van a discutir toda una serie de mecanismos que participan en la regulación de la activación de la célula B.

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- Feedback negativo por anticuerpos a través de FcγR. Simplificando mucho se basaría en una inhibición por producto. La Ig secretada inhibirá la activación continuada de la célula B forman-do complejos que se unen simultáneamente al BCR y a los receptores FcγRIIB. Este último re-ceptor tiene un motivo ITIM que sirve de punto de unión para tisosina fosfatasas como SHIP (que desfosforilarán las fosfotirosinas del complejo BCR).

- Receptor CD22. El receptor CD22 de la célula B contiene también dominios ITIM que son el punto de unión para tirosina fostatasas (SHIP-1).

- Competición antigénica. La exposición a un antí-geno competitivo puede regular la respuesta a un antígeno no relacionado por el cual se dé una reacción cruzada. La exposición previa a un antígeno puede dar lugar a la tolerancia y a la generación de células de memoria (ni idea).

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Regulación de la activación del LB por FcγRIIB. Los complejos Ag-Ig pueden unirse simultáneamente a la Ig de membrana (a través del antígeno) y al receptor FcγRIIB a través de la porción Fc del anticuerpo. Como conse-cuencia de esta unión simultánea de receptores, las fosfatasas asociadas a la cola citoplasmática del receptor de la Fc inhiben las señales producidas por el complejo BCR y bloquean la activación del LB.

16. CITOCINAS

Introducción

Las citocinas son proteínas reguladoras de bajo peso molecular asociadas a muchos tipos ce-lulares distintos (tanto del sistema inmunitario como no) y secretadas en respuesta a diferentes

estímulos. Las citocinas controlan la proliferación, la diferenciación, y el desarrollo, intensi-dad y duración de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Intervienen, por tanto, en la regulación de la hematopoyesis, de la inflamación y de la inmunidad. Las interleucinas son citocinas producidas por leucocitos que actúan sobre otros leu-cocitos. Las quimiocinas son citocinas que afectan a la quimiotaxis y al tráfico de los leucoci-tos (entre otras funciones). Tan importante es la señal (citocina) como el receptor que la recibe. La expresión de receptores de citocinas permite que una célula pueda responder ante éstas.

Propiedades de las citocinas

Las citocinas pueden tener una acción autocrina, paracrina o incluso endocrina. No obstante, principalmente se van a dar los dos primeros casos. Para que haya una acción endocrina de-be haber una estimulación persistente (y generalmente suele ser transitoria). Las citocinas tienen cuatro propiedades principales.

- Pleiotropía. Es la capacidad para actuar sobre distintos tipos celulares y mediar diver-sos efectos biológicos. P. ej., la IL-4 activa e induce la proliferación y la diferenciación de los linfo-

citos B; mientras que a los timocitos y a los mastocitos únicamente estimula la proliferación.- Redundancia. Muchas citocinas tienen los mismos efectos funcionales.- Sinergia. Dos o más citocinas pueden tener un efecto superior que individualmente.- Antagonismo. La acción de unas citocinas es inhibida por otras (se dará aquel efecto

biológico provocado por la citocina que esté en mayor cuantía).

Muchas veces las citocinas actúan en forma de cascada; es decir, que una citocina estimula la síntesis de otra citocina o bien influye sobre su acción. Como ejemplo tenemos el eje TH-

macrófago. Una célula TH(1) activada libera IFNγ, el cual es recibido por el macrófago y éste, como respuesta, liberará IL-12. La IL-12 será clave para conectar la inmunidad innata con la adaptativa, puesto que activará a los linfocitos T colaboradores e inducirá una diferenciación hacia un perfil TH1.

Citocinas en la hematopoyesis

Hay toda una serie de citocinas que son importantes para la hematopoyesis. Si nos centra-mos en la línea mieloide, se precisa IL-3, IL-6 y GM-CSF para el paso del progenitor mieloide hacia tipos celulares más diferenciados. Dentro de la misma línea mieloide, la IL-5 será im-

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Estímulo inductor (PAMPs, DAMPs, antígeno, citocina) → afecta a una célula productora de citocinas → for-mación de citocinas → recepción de la citocina por parte de una célula diana → transducción y cambios en la expresión génica → efecto biológico (respuesta).

portante para la formación del progenitor eosinófilo, y la IL-3 para el paso del progenitor de granulocitos-monocitos a neutrófilo. Si nos centramos en la línea linfoide, la IL-7 es importante para la formación tanto de linfocitos B y T.

Citocinas en el desarrollo de las subpoblaciones de linfocitos T

La activación de un linfocito T naive precisa de una doble señal tal como vimos en capítulos anteriores. Ahora bien, si bien esta activación promueve la diferenciación, no la determina hacia ningún perfil en concreto. Las citocinas serán las encargadas de determinar el destino de

la diferenciación. Estas citocinas pueden ser secretadas por la propia célula presentadora de antígeno (como una cél. dendrítica) u otras que estén en el medio.

- Linfocito Treg. El TGFβ liberado por los macrófagos de perfil M2 (antiinflamatorio) esti-mulará esta clase de diferenciación. Los Treg libera a su vez el mismo TGFβ y también IL-10.

- Linfocito TFH. Estos linfocitos son los que están presentes en el centro germinal y los que favorecen la diferenciación de las células B. IL-6 es la encargada de estimular la diferenciación hacia esta clase de linfocito.

- Linfocito TH1. Tanto esta población como la siguiente (TH2) fueron las dos primeras subpoblaciones de linfocitos T que se descubrieron. En este caso, IL-12 (macrófagos M1) e IFNγ favorecerá esta clase de difenciación. Los TH1 forman IL-2 e IFNγ.

- Linfocito TH2. Esta clase de diferenciación se favorece por medio de la IL-4. Produce IL-4 e IL-5. Las poblaciones TH1 y TH2 se encuentran en equilibrio. La IL-4 que esti-mula la diferenciación hacia TH2 inhibe la diferenciación a TH1. Con el IFNγ ocurre algo similar: favorece la diferenciación hacia TH1 e inhibe la diferenciación a TH2.

- Linfocito TH17. Esta población se denomina así porque forma IL-17 (e IL-6) La diferen-ciación hacia este perfil se da gracias a la exposición a IL-1, IL-6 (citocinas proinfla-matorias) y TGFβ (esta última de forma indirecta)

Además de todas las interleucinas que hemos comentado que son importantes para hacer que el linfocito T se diferencia hacia un perfil u otro, se necesita la IL-2 en todos los casos. Una manera de distinguir las distintas subpoblaciones es observar los factores de transcripción que se activan y translocan cuando las citocinas interactúan con su receptor.

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Citocinas de la inmunidad innata y adaptativaCitocinas de la inmunidad innata y adaptativaCitocinas de la inmunidad innata y adaptativaInmunidad innata Inmunidad adaptativa

Citocinas TNFα, IL-1, IL-6, IFNα/β, IL-12, IL-10, quimiocinas

IL-2, IL-4, IL-5, IFNγ, TGFβ

Síntesis Macrófagos, dendríticas, NKs Linfocitos TFunciones Mediadiores de la inmunidad innata y la

inflamación (local y sistémica)Proliferación y diferenciación del linfocitos; activación de células efectoras (macrófagos, eosinófilos, mastocitos)

Estímulos PAMPs, DAMPs Antígenos proteicosConcentración Elevada; detectable en suero Generalmente localEnfermedades Sistémicas (p. ej., shock séptico) Herida tisular local (granuloma, inflamación)

Inhibidor síntesis Corticoesteroides Ciclosporina, FK-506

Funciones del TNFα, IL-1 e IL-6

El TNFα, la IL-1 y la IL-6 son los principales mediadores de la respuesta inflamatoria aguda (tienen funciones redundantes). Favorecen el reclutamiento y la activación de neutrófilos y macrófagos. Activan las células endoteliales, lo cual favorece la inflamación y la coagula-ción. Sobre la médula ósea estimula una hematopoyesis dirigida hacia la formación de neutrófi-

los. Sobre el hipotálamo estimulan la fiebre. Sobre el hígado favorece la síntesis de proteínas de

la fase aguda. Sobre el músculo y el tejido adiposo favorece el catabolismo y una resistencia a

la insulina. Sobre muchos tipos celulares favorecen la apoptosis. A nivel cardíaco puede in-crementar la frecuencia cardíaca. Exceso de citocinas. Una cantidad elevada de citocinas puede tener efectos muy perjudiciales para el

organismo (shock séptico o tormenta de citocinas). Un shock tóxico podría darse por los superantígenos (acti-vación parcial de la población de linfocitos T).

IL-12

La IL-12 es liberada por macrófagos y células dendríticas activadas gracias a los receptores de patrones comunes. Ésta actuará sobre células NK, linfocitos T citotóxicos (incrementa su capa-cidad citotóxica) e inducirá el paso de linfocito T a linfocito TH1. Estas tres células liberarán el famoso IFNγ, que activa a los macrófagos44 (se establece un feedback positivo). Se la considera como el principal mediador clave de la respuesta innata frente a pató-

genos intracelulares. Es un regulador clave de la inmunidad adaptativa celular.

Funciones de los interferones de tipo I

A veces los patógenos intracelulares, como los virus, no son bien eliminados por las especies reactivas del oxígeno. Para destruirlos entonces se recurre a otros mecanismos, como los in-

terferones α/β, que se agrupan bajo la familia de interferones de clase I. Estas moléculas son liberadas eminentemente por las células dendríticas plasmacitoides y también algunos tipos de células epiteliales. Los interferones de clase I afectan a todos los tipos celulares promoviendo un estado antiviral (incremento de la expresión de MHC I e inhibición de la replicación viral). Además, se estimula la activación de las células NK.

IL-2

La IL-2 es producida principalmente por los linfocitos T CD4+ una vez que éstos han interac-tuado con el antígeno. El receptor de la IL-2 está formado por tres proteínas asociadas no co-valentemente: IL-2Rα, IL-2/15Rβ y γc. De las tres cadenas. sólo IL-2Rα es exclusiva del IL-2R. La IL-2 se une al a cadena α sola con baja afinidad, y esto no produce ninguna transducción de señales citoplasmática detectable ni ninguna respuesta biológica. Serán las otras dos pro-

teínas las encargadas de activar la vía de transducción de señales.

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44 Estrictamente, parece ser que estimula la expresión de los mecanismos microbicidas (iNOS).

Un linfocito T en reposo (naive) expresará, en un principio, en su membrana únicamente el complejo IL-2Rβγc (solamente las cadenas β y γ). Este complejo puede unirse a la IL-2 con una Kd de aproximadamente 10-9 M. La expresión de la cadena α, inducida por estimulación

antigénica, harán que el complejo receptor pueda unirse a la IL-2 con mayor avidez (Kd = 10-

11 M aprox). Con esto aseguras que únicamente los linfocitos específicos para un determina-do antígeno capten la mayor parte de IL-2.

¿Y qué hace la IL-2? Pues tiene una multitud de ac-ciones biológicas, quizá la más destacable es que induce la proliferación y diferenciación tanto de los lin-focitos T como B activados por antígeno. También induce la proliferación y la diferenciación de las cé-lulas NK. Finalmente, también potencia la apoptosis de aquellas células T activadas por antígeno de forma

constante (expresión de Fas y FasL)45.

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45 Hemos de pensar que un estímulo persistente quizá lo es porque en realidad es un estímulo propio. Se trata-ría por tanto de un mecanismo de tolerancia periférica.

Regulación del receptor para la expresión de la IL-2. Los linfocitos T en reposo (vírgenes) expresan el complejo IL-2Rβγ, que muestra una afinidad moderada por la IL-2. La activación de los linfocitos T por el antígeno, los coestimuladores y la propia IL-2 lleva a la expresión de la cadena IL-2Rα y de cantidades altas del complejo IL-2Rαβγ de afinidad alta.

Acciones biológicas de la IL-2. La IL-2 estimula la superviven-cia y la proliferación de los linfocitos T, con lo que actúa como un factor autocrino de crecimiento. La IL-2 también mantiene funcionales a los linfocitos T reguladores, y así controla las res-puestas inmunitarias (p. ej., contra antígenos propios). Hay Treg específicos para un antígeno).

Interferón γ

El interferón γ (o interferón de tipo II) desempeña un papel clave tanto en la respuesta inmu-nitaria innata como en la adaptativa. En primer lugar, es un activador de los macrófagos (favo-rece la actividad microbicida) y de las células NK. En segundo lugar estimula la diferenciación de los T hacia un perfil TH1 e inhibe la diferenciación hacia TH246. En tercer lugar favorece la ex-presión de MHCI/II en las CPA. Finalmente, también promueve en linfocitos B cambios hacia isotipos opsonizantes (IgG2a, IgG3). Recordemos que es liberado por TH1, NK y TCD8+.

IL-4

Es formada por los TH2, mastocitos y basófilos. Se trata de un antagonista del IFNγ, por lo que inhibe las reacciones de la inmunidad celular. Promueve, en los LB, el cambio hacia isotipos no opsonizantes como IgE (a pesar de tener receptores para la Fc) e IgG4. Tiene una acción proliferativa autocrina para los TH2 (es esencial para la diferenciación haia este perfil.

IL-5

La forman las células TH2 CD4+. Promueve la activación, la proliferación y la diferenciación de los eosinófilos. Promueve la proliferación de los linfocitos B y un cambio de isotipo hacia la IgA (inmunidad de las mucosas).

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46 Osea, que promueve las reacciones inflamatorias medidas por macrófagos e inhibe las dependientes de IgE.

Acciones biológicas del IFNγ. El IFNγ activa a los fagocitos y las CPA (que expresen más MHC) e induce el cambio en los LB a algunos isotipos de Ig que con frecuencia se unen al complemento y a los receptores de la Fc de los fagocitos (diferentes a los isotipos que induce la IL-4). El efecto inductor de los TH1 del IFNγ puede ser indirecto, mediado por un aumento de la síntesis de la IL-12 y de la expresión del receptor.

TGFβ

El TGFβ es formado por macrófagos (M2) y otras células (queratinocitos, Treg). Junto con la IL-10 regulan de manera negativa la respuesta inmune (inhibe la proliferación y activación de linfocitos y otros leucocitos). Estimula la producción de IgA (inmunidad de las mucosas).

IL-10

La IL-10 es formada por macrófagos y por linfocitos TH2 (caray, y antes no se dice). Inhibe a los macrófagos activados y a las células dendríticas. Además, también inhibe la expresión de IL-12, la expresión del MHC II y los coestimuladores. Como vemos, la IL-10 es importante para regular las reacciones de la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa celular.

Receptores de citocinas

Las citocinas únicamente podrán afectar a una célula si ésta expresa en su superficie recepto-

res para dicha citocina. Existen diferentes familias de receptores de citocinas: (a) de tipo I; (b)

de tipo II; (c) receptor de la familia TNF; (d) receptor de la familia IL-1; (e) receptores con 7 domi-nios transmembrana acoplados a proteínas G.

Dentro de la familia de receptores de citocinas de tipo I, encontramos diferentes subfamilias: (a1) subfamilia del receptor de IL-2 [cadena γc]; (a2) subfamilia del receptor de GM-CSF; [cadena β]; (a3) subfamilia del receptor de IL-6 [subunidad gp130]; Cada subfamilia tiene subunidades de señalización que son comunes (dentro de los miembros de una misma subfamilia). La ca-dena o subunidad entre corchetes tras cada subfamilia es la subunidad que se tiene en co-mún.

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Familias de receptores para citocinas. Los receptores para diferentes citocinas se clasifican en familias en fun-ción de dominios extracelulares conservados y de mecanismos transmisores de señales Las citocinas u otros ligandos que se unen a cada familia de receptores se enumeran debajo de las figuras.

Señalización de los receptores de citocinas de tipo I y II

La señalización intracelular se basa en la vía JAK/STAT. Las proteínas Jak (Janus kinase) tienen actividad tirosina cinasa y forman una familia formada por varios miembros, unos presentes en todos los tipos celulares (Tyk2, Jak1/2) y otros presentes en tipos celulares concretos, como Jak3, presente en células hematopoyéticas. En cuanto a su estructura, las proteínas Jak tienen unos dominios de unión al receptor y un dominio JH1 con la actividad tirosina cinasa que carateriza a esta familia47.

El otro componente de la vía es el factor de transcripción STAT (Eng: signal transducers and activators of transcription) que además de ser un TF puede actuar como molécula transduc-tora de señales. Dispone de un dominio SH2 (de unión a fosfotirosinas), uno SH3 y una re-gión de unión al DNA.

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47 Existe un dominio JH2 adyacente al JH1 que es pseudo-TK (no tiene actividad catalítica).

Composición de las subunidades de los receptores para citocinas. Los grupos de receptores para citocinas comparten cadenas de subunidades idénticas o muy homólogas.

Receptor de citocinas. Vemos como el receptor de citocinas dispone de las proteínas Jak en su dominio intrace-lular para que sus tirosinas puedan ser fosforiladas y que éstas sirvan como punto de anclaje para proteínas con dominios SH2.

Cuando la citocina interacciona con su receptor, las JAK fosforilarán tirosinas presentes en el dominio citosólico de dicho receptor. Estas fosfotirosinas serán el punto de anclaje de las proteínas STAT (a través de SH2). Las propias STAT también sufrirán una fosforilación (en ti-rosinas) por parte de JAK y entonces se dará una dimerización que precederá a la posterior

translocación al núcleo. Una vez en el núcleo, el dímero STAT se unirá al DNA y regulará la expresión génica. Como hemos dicho antes, podemos hablar de tres clases de receptores de citocinas

de tipo I en función de la cadena que tienen en común (γc, β y gp130). Será esta cadena la que se encargará de contactar con la cinasa (Jak), que fosforilará a un STAT específico. En clase se recalcaron cuatro interacciones.

El resto de receptores generalmente se asocian con STAT3 y 5. Los STATs diferencian tres grandes poblaciones de linfocitos T. TH1 se asocia con STAT4, TH2 con STAT6 (vemos su rela-ción con IL-4).

Bloqueo de STAT4. No dispondremos de TH1.Bloqueo de STAT3. El ratón no llegará a nacer puesto que este factor de transcripción participa en las

vías de señalización de varias citocinas y además también es importante en la hematopoyesis.Bloqueo de STAT1/2. Este factor participa principalmente en la señalización de los interferones. Sin éste, el individuo no podrá defenderse de las infecciones, pero podría vivir perfectamente en un ambiente

aséptico.

En la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) hay un defecto tanto en la cadena γc (común a varios receptores de citocinas) como de Jak3. En la SCID están afectados tanto los linfocitos B como los T. Hay virus que evitan el sistema inmunitario por medio de mecanismos basados en las

interleucinas. Por ejemplo, el virus de Epstein-Barr libera un homólogo de la IL-10, que como sabemos es una citocina inmunosupresora. Otro ejemplo es el virus de la viruela, que libera un receptor soluble de la IL-1β, interaccionando con la IL-1 que pudiera haber en el medio. Actualmente se están desarrollando terapias que se basan en las citocinas.

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Citocina JAK-cinasa STAT

Receptores de tipo I (cadena γ en común )Receptores de tipo I (cadena γ en común )Receptores de tipo I (cadena γ en común )IL4 Jak1, Jak3 STAT6Receptores de tipo I (subunidad gp130 en común )Receptores de tipo I (subunidad gp130 en común )Receptores de tipo I (subunidad gp130 en común )IL12 Tyk2, Jak2 STAT4Receptores de tipo IIReceptores de tipo IIReceptores de tipo II

IFNα/β Jak1, Tyk2 STAT1, STAT2

IFNγ Jak1, Jak2 STAT1

16(2). ANEXO CITOCINAS

Lepra

La lepra es una enfermedad causada por el Mycobacterium leprae. Existen dos formas pola-res de la lepra: (a) lepromatosa y (b) tuberculoide. No obstante, muchos pacientes no pueden ser catalogados en uno de los dos tipos, sino que se encuentran en medio.

- Lepra lepromatosa. Hipergammaglobulinemia (muchas Ig específicas para el bacilo). Respuesta celular débil por parte de las células T. Se detectan bacterias en el interior de los macrófagos. El crecimiento y la persistencia de las bacterias, junto con una ac-tivación insuficiente de los macrófagos, dan lugar a lesiones destructivas de la piel y los tejidos subyacentes.

- Lepra tuberculoide. Al contrario que el tipo anterior, los niveles de Ig son normales, pe-ro la respuesta celular es potente, por lo que apenas hay bacterias. Aparecen granulo-mas y lesiones en los nervios periféricos, lo que provocará que secundariamente haya lesiones en la piel (insensibilidad).

¿Por qué unas personas desarrollan un tipo de lepra y otros otra? Está claro que tiene que es-tar relacionado con la expresion de citocinas y la diferenciación de los TH. El patrón de dife-renciación de éstos y la síntesis de citocinas pueden variar entre las personas. Los enfermos de lepra tuberculoide se caracterizan por presentar IFNγ e IL-2 en las lesiones, que como sa-bemos son las citocinas producidas por los TH1. En cambio, los enfermos de lepra leproma-tosa se caracterizan por tener menos IFNγ y más IL-4 e IL-10 (típicas de los TH2). En el caso de la lepra lepromatosa, tanto la ausencia de IFN como la presencia de IL-4 e IL-10 hace que la respuesta celular sea pobre y por tanto las bacterias no pueden ser controladas.

Funciones de los TH1

La diferenciación del TH a un perfil TH1 está inducida por la IL-12 y el IFNγ. El TH1 libera el propio IFNγ e IL-2. Destacamos que el IFNγ activa a los macrófagos, incrementando su capa-cidad microbicida (induce la iNOS), favoreciendo la síntesis y liberación de citocinas infla-matorias (IL-1, IL-6 y TNFα), y aumentando la expresión de B7 y MHC. Recordemos también que, a nivel de las células B, el IFNγ va a ser importante para inducir un cambio hacia isoti-pos opsonizantes (IgG).

Funciones de los TH2

La diferenciación del TH a un perfil TH2 está inducida por la IL-4. El TH2 libera la propia IL-4 e IL-5. La IL-4 es un antagonista del IFNγ, por lo que es lógico pensar que induce una acti-vación del macrófago hacia el perfil M2 (junto con la IL-13) La IL-4 también favorece el cam-bio de isotipo de los linfocitos B hacia la IgE (degranulación de mastocitos) y la IgG4. De la IL-4 hay un efecto que no se comentó previamente: promueve el peristaltismo y la secreción intes-

tinal. Sobre la IL-5, recordemos que ésta es importante para la activación de los eosinófilos.

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Función de los TH17

Los TH17 producen varias citocinas, pero nosotros destacamos la IL-17. Esta citocina tiene dos efectos principales. En primer lugar induce la liberación de quimiocinas y citocinas proinflamatorias (IL-1, IL-6 y TNFα) para favorece una respuesta neutrófila (reclutamiento y activación de neutrófilos, que atacarán patógenos extracelulares = hongos y bacterias). En segundo lugar, estimula la producción de sustancias antimicrobianas, como las defensinas, en numerosos tipos celulares.

Inmunidad frente a las bacterias intracelulares

Una característica de las bacterias intracelulares es su capacidad para sobrevivir e incluso replicarse en el interior de los fagocitos. Dado que estos microorganismos pueden encontrar un nicho donde son inaccesibles a los anticuerpos circulantes, su erradicación requiere la participación de la inmunidad celular. Los fagocitos (neutrófilos y macrófagos) podrán reconocer a un patógeno intracelular y fagocitarlo, pero no lo podrán degradar: habrán quedado infectados. Las células infectadas liberarán IL-12, un poderoso inductor de la respuesta innata contra patógenos intracelulares: la caballería llega en forma de células NK. Éstas liberan IFNγ, que incrementa la actividad microbicida de macrófagos para así intentar cargarse lo que tienen en su interior. Pese a que la inmunidad innata puede controlar la infección, es insuficiente para erradicarla. Para ello necesitamos el concurso de la inmunidad adaptativa: TH (en realidad TH1, recordemos que hay IL-12 en el medio) y TC.

Inmunidad frente a las bacterias extracelulares

Para enfrentarnos a las bacterias extracelulares nos basaremos bastante en la inmunidad in-nata humoral (complemento) y la adaptativa. El complemento recordemos que puede inducir la inflamación, la lisis de patógenos o su fagocitosis. La inmunidad adaptativa actuará en dos frentes: LB que liberan Ig, y T que libera citocinas que regulan la respuesta inmunitaria (in-flamación, activación de macrófagos vías IFNγ, inducción del cambio de isotipo en LB).

Inmunidad frente a virus

Aquí también actúa la inmunidad innata como la adaptativa. Cuando nos referimos a innata recalcamos el papel de las células dendríticas plasmacitoides en la inducción del estado anti-

viral, la liberación del IFNα/β y la destrucción de células infectadas por parte de las células

NK. La inmunidad adaptativa colabora con los TC y los LB específicos para el virus.

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17. CITOTOXICIDAD

Introducción

Hay dos células en nuestro sistema inmunitario con una clara función citotóxica. Por un lado tenemos a los linfocitos T citotóxicos (TC o CTL), de la inmunidad adaptativa, y por el otro lado encontramos las células NK, de la inmunidad innata. Los requisitos para que las dos células puedan realizar su función citotóxica serán distintos.

Generación de CTLs efectores y de memoria

Para que un CTL naive se active vamos a necesitar tres señales: (a) péptido presentado vía MHC

I; (b) coestímulo CD28-B7; y (c) IL2-/IL-2R (recordemos que la IL-2 la liberan las células TH1). Podemos hablar de tres grandes clases de CTL:

- CTL-P naive (P = precursor). Precisarán de las tres señales que acabamos de comentar para su activación. Apenas tendrá en su interior los mecanismos necesarios para reali-zar su función citotóxica (no habrán madurado). Están en los ganglios linfáticos.

- CTL efector. Su activación y proliferación ya no necesita la ayuda de los TH. Los meca-nismos citotóxicos ya serán maduros.

- CTL de memoria. Exactamente igual que el efector: su activación y proliferación no precisa la ayuda de los TH.

Mecanismos efectores de los CTL

Principalmente encontramos dos mecanismos que provocan la muerte de la célula diana. Por un lado tenemos la (a) vía de la perforina/granzimas. Esta vía consiste en la liberación di-reccional de proteínas citotóxicas (perforina y granzimas) por parte de las CTLs hacia las cé-lulas diana, provocando su apoptosis. Por el otro lado está la (b) vía de Fas/FasL. Esta vía con-siste en la interacción entre el ligando de Fas, presente en la superficie de los CTLs, con el re-

ceptor de Fas, presente en la superficie celular. Tras este contacto, se induce la apoptosis de la célula diana.

Vía de la perforina/granzimas

La perforina es una molécula perturbadora de la membrana homóloga a la proteína C9 del complemento y está contenida en unos gránulos intracelulares en los que también están las granzimas, unas serina-proteasas que acabarán activando las caspasas inductoras de la apop-tosis celular. Cuando se produce la interacción entre célula diana y CTL, éste último experi-menta un incremento del Ca2+ intracelular que llevará a la liberación de estos gránulos repletos de perforina y granzimas. Una vez liberado el contenido al espacio extracelular, la perforina se introducirá en la membrana de la célula diana y se polimerizará para formar poros cilíndri-

cos. Estos poros pueden matar a la célula diana por el choque osmótico y además van a ser la vía de entrada de las granzimas.

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Las granzimas, como hemos dicho, pueden entrar a través de los poros formados por la perforina o bien ser endoci-tadas por la célula diana y después salir de la vesícula de endocitosis por medio de un proceso dependiente de la perforina. Parece ser que para que se dé esta última vía las granzimas deben unirse a unos receptores de manosa-fosfa-

to. Tanto las granzimas (una vez dentro de la célula diana) como la vía de Fas logran que la procaspasa-8 (inac-tiva) pase a activarse (caspasa 8), induciendo la apoptosis de la célula diana. Esta apoptosis también se puede dar por la vía mitocondrial. En el marco de la apoptosis, habrá una fragmentación del DNA celular y viral (hay una inhi-bición de la replicación viral antes de la destrucción de la célula diana). Las células diana son destruidas de manera selecti-

va, sin que las células vecinas se vean afectadas. Esto se puede realizar gracias a que hay un reconocimiento especí-

fico de la célula infectada y que los gránulos se liberan en una dirección en concreta (libera-ción polarizada).

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Porus de perforina a la superfície d’un eritròcit

1. L’augment en Ca2+ intracel.lular induit per la interacció CTL-cèl.lula diana2. Exocitosis dels grànuls del CTL que es fusionen amb la membrana cel.lular3. Alliberament de perforina en el petit espai entre les dues cèl.lules4. Inserció de la perforina a la membrana de la cèl.lula diana5. Polimerització dels monòmers de perforina dins la membrana6. Formacio de porus cilíndrics

LISIS DE LA CÈL.LULA DIANA PELS LIMFÒCITS CITOTÒXICS

Liberación de los gránulos de granzimas y perforinas. Como vemos, el espacio existente entre la célula diana y el linfocito T citotóxico es muy pequeño, hecho que favorece que la perforina se acople rápidamente a la mem-brana de la célula diana.

Pasos en la lisis mediada por el CTL de las células diana (imagen superior). Un CTL reconoce a la célula diana que expresa el antígeno y se activa. La activación da lugar a la liberación del contenido de los gránulos de los CTL hacia la célula diana a través de la zona de contacto (sinapsis inmunitaria). El contenido de los gránulos da un golpe mortal a la diana. El CTL puede desprenderse y matar otras células diana. La formación de conjugados entre un CTL y su diana y la activación del CTL también requieren interacciones entre moléculas accesorias (LFA-1, CD8) situadas en el CTL y sus ligandos específicos situados en la célula diana.

Células NK

Las células NK constituye el otro gran tipo celular con capacidad citotóxica (aunque no tan específica). El IFNα, el IFNβ y la IL-12 [PAMPs?] estimulan la actividad de estas células, y éstas a su vez liberan múltiples citocinas, como IFNγ y TNFα (participan así en la inmunidad innata y en la adaptativa). Las células NK pueden ser consideradas como la primera línea de defensa contra la infección viral antes de que aparezcan los CTLs específicos. También partici-parían en la respuesta antitumoral. Podemos hablar de diferentes poblaciones de células NK en función a los niveles de expresión de CD16 (un receptor de la Fc) y de CD56 (marcador de la NK humana).

(a) NK CD56bright/CD16dim. Principalmente forman IFNγ y TNFα.(b) NK CD56dim/CD16+. Tienen capacidad citotóxica. En su interior tienen gránulos con

perforina y granzimas que, a diferencia de los CTLs, ya están presentes desde un ini-cio (no ocurría así con los CTLs-P naive). Esta población es la mayoritaria.

Reconocimiento de las células infectadas por parte de las NK

Los CTLs pueden reconocer un péptido a través del MHC I. Las células NK no disponen de este mecanismo. Entonces ¿cómo es posible que puedan reconocer, y por tanto únicamente atacar, a aquellas células infectadas? Existen dos opciones. En primer lugar está la conocida como citotoxicidad dependiente de anticuerpo, que no es más que la NK lo que hace es reco-nocer, vía CD16, la Fc de una Ig que está unida a un epítopo de una molécula de la superfi-cie de la célula diana. Este mecanismo también lo usan macrófagos, eosinófilos y neutrófilos En segundo lugar está la citotoxicidad independiente de anticuerpos, en el que la interacción entre NK y la célula diana se da por medio de una serie de ligandos y receptores específicos. Este último mecanismo también se puede denominar modelo de las señales opuestas y consiste en que la NK inducirá la apoptosis de la célula diana en función al equilibrio de se-

ñales “positivas” y “negativas” que recibe. Es decir, una señal negativa puede ser, por ejemplo, la detección del MHC I en la célula diana. Mientras la célula diana tenga unos niveles ade-cuados de MHC I, no tiene por qué ser destruida por la NK. Ahora bien, si tras ser infectada por un virus esta célula empieza a presentar niveles más bajos de MHC I (estrategia típica de evasión del sistema inmunitario), las señales positivas vencerán a las negativas y entonces la célula diana será destruida. Este modelo de señales opuestas necesita de receptores inhibidores y activadores en la superficie de la célula NK48. Los receptores inhibidores tienen motivos ITIM49 y son específi-cos para MHC I. Los receptores estimuladores disponen de motivos ITAM y son específicos para diversos ligandos.

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48 A modo de curiosidad: estos receptores son polimórficos. Hay diferencias entre individuos.

49 Los dominios ITIM contactan con fosfotirosina fosforilasas que desfosforilarán a las tirosinas fosforiladas de los dominios ITAM (vaya trabalenguas).

Funciones de los receptores activadores e inhibidores de los linfocitos NK (página siguiente). (A) Los recepto-res activadores de los linfocitos NK reconocen ligandos en las células diana y activan la proteína tirosina

Además de para eliminar células infectadas o estresadas, las células NK también realizarán una especie de control de calidad de las cé-lulas dendríticas (si no tienen suficiente MHC I por ejemplo). Las NK se forman en la médu-la ósea y de ahí irán hacia los tejidos y los ganglios linfáticos.

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cinasa (TK), cuya actividad es inhibida por los receptores inhibidores que reconocen moléculas de la clase I del MHC y activan las proteínas tirosina fosfatasas (PTP). Los linfocitos NK no matan de modo eficiente células sa-nas que expresen la clase I del MHC. (B) Si una infección vírica u otro tipo de estrés inhibe la expresión de la clase I del MHC en las células infectadas e induce la expresión de ligandos activadores adicionales, el receptor inhibidor del linfocito NK no se une a su ligando y las funciones del receptor activador sin ninguna oposición desencadenan respuestas de linfocitos NK, como la muerte de células diana y la secreción de citocinas. (C) Las células estresadas por la infección o por la transformación neoplásica pueden expresar mayores cantidades de ligandos activadores, que se unen a los receptores activadores del linfocito NK e inducen una mayor fosforila-ción de tirosinas de las que pueden compensar las fosfatasas asociadas al receptor inhibidor, lo que provoca la muerte de las células estresadas.

NATURAL KILLERS (NKs) I LIMFOCITS T CITOTÒXICS (CTLs)EN LA INFECCIÓ VIRAL

Papel de las NK y los CTL en la infección viral. Tras una infección viral, en primer lugar veremos unos niveles elevados de IFNα/β liberado por las células plasmacitoides y células infectadas. A continuación aparece la primera línea de defensa: las células NK, que empezarán a contener la infección. Después, al cabo de unos días ya aparecería la segunda (y defini-tiva) línea de defensa: los CTLs específicos. Las NKs son importantísimas para contener la infección hasta que llegue la caballería (CTLs específicos).

18. SISTEMA DEL COMPLEMENTO

Introducción

Hacia finales del s. XIX Jules Bordet demostró que, si añadía a las bacterias un suero fresco que contenía un anticuerpo antibacteriano a temperatura fisiológica (37 ºC), las bacterias se

lisaban. Sin embargo, si se calentaba el suero a 56 ºC o más, éste perdía su capacidad lítica. Esta pérdida de capacidad lítica no se debía a la falta de actividad de los anticuerpos, ya que éstos son termoestables e incluso el suero caliente era capaz de aglutinar a las bacterias. Bordet concluyó que el suero debía contener otro componente termolábil que ayuda, o com-plementa, la función lítica de los anticuerpos; este componente recibió más adelante el nombre de complemento. Molecularmente, el complemento consta de toda una serie de proteínas que actúan en

forma de cascada, en el que cada enzima cataliza la reacción del siguiente. Se trata de un sis-tema muy regulado que puede ser activado por medio de tres vías: (a) vía clásica [inm. adap-tativa]; (b) vía alternativa [inm. innata]; (c) vía de las lectinas [inm. innata]. La actividad bioló-gica del complemento afecta a la inmunnidad innata y a la adaptativa.

Componentes del sistema del complemento

Como hemos dicho, el complemento está formado por toda una serie de proteínas séricas. Éstas generalmente se encuentran en una forma inactiva (proenzimas) y su activación se da por proteólisis (se omite un fragmento inhibidor y se expone el centro activo). A continuación se exponen los diferentes elementos que forman el complemento:

- Proteínas C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9.- Factores B, D, H e I. Properdina (P).- Mannose binding lectin (MBL). Serina-proteasas asociadas a MBL (MASP-1/2).- Inhibidor de C1 (C1-INH, serpin), C4-binding protein (C4-BP), decay accelerating fac-

tor (DAF), proteína S (vitronectina).- Receptor C1q (C1qR), receptor C1 (C1R).

Cuando hay una proteólisis de una proteína del complemento, se genera un fragmento grande y otro pequeño. El fragmento grande suele unirse a la membrana cerca del lugar de activa-ción (complejo de activación) y el fragmento pequeño queda soluble y puede iniciar respues-tas inflamatorias (anafilotoxina) uniéndose a receptores específicos. En cuanto a la nomencla-tura, se suele añadir una letra “b” al fragmento grande, y la letra “a” al fragmento pequeño (C3b/C3a). Atención, hay una excepción: C2a es el fragmento grande unido a la membrana y C2b el fragmento pequeño soluble. Los fragmentos del complemento interaccionan los unos con los otros para formar complejos funcionales. Los complejos que tienen actividad enzimática y los componentes ac-tivados, en general, se indican con una línea por encima del nombre (p. ej., C4b2a).

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Vía clásica de activación

Las tres vías de activación convergen en un mismo punto: la activación de C3 y la genera-ción de la convertasa C5. La vía clásica perte-nece a la inmunidad adaptativa puesto que necesita anticuerpos. La proteína C1 inicia la vía clásica al unirse al anticuerpo con un an-tígeno. La proteína C1 (también se puede es-cribir como C1qr2s2) es un complejo hetero-

mérico: C1q, que se une a la Fc de los anti-cuerpos con antígeno unido; C1r, que es una serina proteasa que fragmenta C1s convirtién-dola en una proteasa activa; y C1s, una serina proteasa que rompe C4 y C2. Una Ig puede tener una conformación distinta en función de si está unida o no a un antígeno. Los lugares de unión de Fc de la IgM a la C1q son más accesibles cuando la IgM está unida a un antígeno (forma de “grapa” y pentamérica) que cuando está libre (forma planar y pentamérica). La IgG también puede unirse a C1q activar el complemento. Cada molécula C1 debe unirse almenos a dos luga-res Fc para que haya una unión estable. Esto en realidad no supone ningún problema, ya que generalmente las primeras Ig en formarse son las IgM, que son a su vez las más eficien-tes para activar el complemento.

Al producirse la unión entre Fc de la Ig y C1q, C1r se activará autocatalíticamente y activará a la otra serina proteasa C1r (hay dos). Las dos C1r activarán a la serina proteasa C1s. Esta última proteolizará C4 y C2, dando lugar a C4a, C4b, C2a y C2b. Tanto C4b como C2a (re-cordemos la excepción) se unirán a la superficie diana cerca de C1, formando el complejo C4b2a o convertasa C3. La convertasa C3, como su nombre indica, tiene la capacidad de es-

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Estructura de C1. Se pueden observar las diferentes subunidades. Recordemos que C1q será el punto de unión a la Fc de un anticuerpo unido a antígeno.

Unión de C1 a las porciones Fc de la IgM y la IgG. El C1 debe unirse a dos o más porciones Fc para iniciar la cascada del complemento. (A) Las porciones Fc de la IgM soluble no son accesibles a C1. (B) Después de que la IgM se una a antígenos adheridos a la superfi-cie, sufre un cambio de forma que le permite unirse al C1 y activarlo. (C) Las moléculas solubles de IgG no activarán el C1, porque cada IgG tiene solo una región Fc. (D) Tras unirse a los antígenos de la superficie celu-lar, las porciones Fc adyacentes de la IgG pueden unir-se al C1 y activarlo.

cindir C3 en C3a (soluble) y C3b (unión a la membra-na). Algunas de las moléculas C3b se combinan con la convertasa C3 para dar lugar al complejo C4b2a3b o convertasa C5. La convertasa C3 tiene una gran capa-cidad de generación de moléculas de C3b, hay una gran amplificación. La membrana de las células de mamífero tienen niveles elevados de ácido siálico (Neu5Ac), que inactiva rápidamente a las moléculas de C3b. Con esto logramos no destruir células pro-pias. El componente C3b de la convertasa C5 se une a C5, permitiendo que C4b2a (el resto de la converta-sas C5) corte C5 y dé lugar a C5a y C5b. C5b se unirá a C6 para iniciar la formación del complejo de ataque a

la membrana (MAC). Tras C6 se unirán secuencialmente C7, C8, C9 (varias) y C10 (sin que haya una proteóli-sis). Finalmente se formará un canal a través de la membrana de la célula diana que permite la difusión libre de iones y pequeñas moléculas a través de la membrana. Esto lleva a la pérdida de la estabilidad os-

mótica y a la muerte celular. Hemos de pensar que además del MAC se habrán formado muchas molécu-las con inflamatorias.

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Vía clásica de activación del complemento (derecha) Los com-plejos antígeno-anticuerpo que activan la vía clásica pueden ser solubles, estar fijados a la superficie de las células o depositarse unidas a su antígeno.

Últimos pasos en la activación del complemento y la formación del MAC. Se muestra una imagen esquemática de los acontecimientos que tienen lugar en la superficie celular y que llevan a la formación del MAC. La C5-convertasa asociada a la célula escinde el C5 y genera C5b, que se une a la convertasa. El C6 y el C7 se unen de forma secuencial y el complejo C5b,6,7 se inserta directamente en la bicapa lipídica de la membrana plas-mática, seguido de la inserción estable del C8. Pueden polimerizar entonces hasta 15 moléculas de C9 alrede-dor del complejo para formar el MAC, lo que crea poros en la membrana e induce la lisis celular. El C5a libera-do en la proteólisis de C5 estimula la inflamación.

Vía alternativa

Tanto esta vía como la siguiente (la de las lectinas) son independientes de anticuerpos y por ello pertenecen a la inmunidad innata. De manera basal, una pequeña cantidad de C3 solu-ble se escinde espontáneamente para formar C3a y C3b. El fragmento grande (C3b) podrá unir-se a una superficie extraña, como una pared bacteriana. Si no se produce esta unión, C3b quedará inactivo por hidrólisis. La C3b, una vez unida a a una superficie extraña, puede ser-vir como punto de unión para el factor B, que será escindido por el factor D y así liberar un pequeño fragmento denominado Ba. Esta hidrólisis da lugar al complejo C3bBb, que es equi-valente a la convertasa C3. La properdina estabiliza esta convertasa. La C3 convertasa escinde C3 en C3a y C3b (amplificación)50, y una pequeña proporción de este último se une a la con-vertasa C3 para formar el complejo C3bBb3b, que es una convertasa C5. Lo que sigue es lo mismo que hemos visto antes: C5b se une a C6 y así se iniciará la formación del complejo de

ataque a la membrana (MAC)

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50 De hecho en unos cinco minutos se pueden conseguir unas 105 moléculas de C3b en la superficie celular.

La vía alternativa de activación del complemento. El C3 soluble en el plasma sufre una hidrólisis espontánea a baja intensidad de su enlace tioéster interno, lo que lleva a la formación de una C3-convertasa en la fase líqui-da (no mostrado) y a la generación de C3b. Si el C3b se deposita en las superficies de los microbios, se une al factor B y forma la C3-convertasa de la vía alternativa. Esta convertasa escinde el C3 para producir más C3b, que se une a la superficie microbiana y participa en la formación de una C5-convertasa. La C5 convertasa es-cinde el C5 para generar C5b, acontecimiento iniciador de los pasos tardíos de la activación del complemento.

Vía de las lectinas

La vía de las lectinas se inicia en la unión de la lectina ligadora de manosa (MBL; Eng: manno-se-binding lectin) a residuos de manosa presentes en la superficie de patógenos. La MBL es una proteína con una función similar al C1q de la vía clásica y es producida en la respuesta

inflamatoria (hígado). Esta lectina está a su vez asociada con las MASP-1 y MASP-2, dos seri-

na-proteasas análogas a C1r y C1s que escindirán C4 y C2. Los dos fragmentos grandes pro-ducidos por esta escisión, C4b y C2a, forman la convertasa C3. A partir de aquí todo igual (formación de C3b, convertasa C5, C5b, C6 e inicio de la formación del MAC).

Regulación del sistema del complemento

La regulación del complemento está medida por varias proteínas circulantes y de membrana. Muchas de estas proteínas, así como varias proteínas de las vías clásica y alternativa, perte-necen a una familia llamada reguladores de la actividad del complemento (RCA; Eng: regulators of complement activity). Es necesario regular la actividad del complemento por dos razones:

(1) Activación baja del complemento espontánea. El complemento puede activarse de ma-nera espontánea. Esto puede ser dañino para las células normales y los tejidos.

(2) Limitar su acción. Incluso cuando se activa el complemento allí donde es necesario, como en un microbio o un complejo antígeno-anticuerpo, necesita ser controlado, porque los productos de degradación de las proteínas del complemento pueden di-fundirse a células adyacentes y dañarlas.

Para regular el complemento tendremos: (a) reguladores del inicio de las vías de activación, co-mo el inhibidor de C1 (C1Iab); (b) reguladores de la formación/actividad de las convertasas, co-mo la proteína de unión de C4b (C4bBP), el factor I, CRI, MCP, el factor H y DAF; (c) regula-

dores de la formación de MAC, como la proteína S, HRF y CD59. La proteína S evita la inserción del componente del MAC C5b67 a la membrana. Las proteínas HRL y CD59 (o MIRL) se unen a C5b678 en células autólogas y evitan el ensambla-je del poli-C9. Así se evita la lisis no específica de las células propias. Estas dos proteínas son responsables de la restricción homóloga.

Funciones del complemento

Las principales funciones efectoras del sistema del complemento en la inmunidad innata y en la humoral específica son (a) promover la fagocitosis de los microbios sobre los cuales se activa el complemento, (b) estimular la inflamación e (c) inducir la lísis de estos microbios.

El complemento también puede

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ser vir para neutralizar partículas víricas. Puede bloquear la infección viral impidiendo la ad-hesión a la célula huésped. Facilita la unión del virus a células con receptores Fc o CR1 (fa-gocitosis). Puede llegar a lisar virus. Una función adicional del complemento es la de solubilizar y aclarar los inmunocom-

plejos. Un inmunocomplejo no es más que un antígeno unido a su anticuerpo. Si éstos se acumulan en la sangre, pueden depositarse en las paredes vasculares y provocar reacciones inflamatorias que dañen los vasos y los tejidos que los rodean. Para evitarlo, C3b puede unir-se a la Ig de estos inmunocomplejos. Los eritrocitos disponen de receptores CR1 (CD35) en su membrana que pueden unirse a C3b. En este momento el eritrocito podrá transportar el in-munocomplejo asociado al complemento hacia el hígado y el bazo, donde éste podrá ser fagocitado. En cuanto a la función de estimulación de las reacciones inflamatorias, las anafilotoxi-nas C3a, C4a y C5a son las responsables de esta función. Los leucocitos pueden ser reclutados y activados por medio de C3a y C5a (favorecen la extravasación y la quimiotaxis).

Receptores del complemento

Queremos destacar tres:- CR1: acabamos de ver que está en los eritrocitos y permite la fagocitosis de los inmu-

nocomplejos. También está presente en células dendríticas foliculares.- CR3. Está formado por CD11b/18. CD11b lo empléabamos en la citometría de flujo

para identificar poblaciones celulares. Este receptor se une a iC3b.- Receptor de C5a. Se une a C5a y está presente en mastocitos, basófilos, granulocitos,

monocitos, macrófagos, plaquetas y células endoteliales. Induce la liberación de gránu-

los por parte de basófilos y mastocitos.

Resumen finala) Beneficios del complemento: (1) opsoniza e incrementa la fagocitosis; (b) lisis de bacterias y céls. infectadas;

(c) regulación de la respuesta a anticuerpos; (d) eliminación de complejos inmunitarios; (d) eliminación de céls. apoptóticas; (f) atracción y activación de fagocitos.

b) Perjuicios: inflamación y anafilaxis.c) Deficiencias: infecciones recurrentes e incremento de los inmunocomplejos (con el consiguiente daño celu-

lar).

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Funciones del complemento (pág. anterior). El C3b unido a la célula es una opsonina que promueve la fagoci-tosis de las células cubiertas.

Estímulo de reacciones inflamatorias. Los productos proteolíticos C5a, C3a y (en menor grado) C4a estimulan el reclutamiento de los leucocitos y la inflamación.