informe quimica 3

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Bioquímica II Extracción y cuantificación de proteína total y albúmina Facultad de Medicina, Universidad San Sebastián Docente: - Estela Pérez Integrantes: - Luis F. Concha Manríquez - Daniel Coria Guzmán - Pablo Gysling Merino Grupo B 16/11/2012

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Bioquímica II

Extracción y cuantificación de proteína total y albúmina Facultad de Medicina, Universidad San Sebastián

Docente: - Estela Pérez

Integrantes:

- Luis F. Concha Manríquez - Daniel Coria Guzmán - Pablo Gysling Merino

Grupo B 16/11/2012

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INDICE

1. Resumen…………………………………………….……………………….….. pág. 2

2. Introducción y objetivos……………………………………………………..…. pág. 3

3. Métodos……………………………………………..………………………..….. pág. 4

4. Significado de los resultados anormales ………….…………………………… pág. 5

5. Paso experimental.…………………………………. ……………………….….. pág. 6

6. Resultados……………………………………………………………………..…. pág. 7-8

7. Discusión……………………………………………………………………...…... pág. 9

8. Conclusión……………………………………………………………………...… pág. 10

9. Bibliografía…………………………………………………………………..…… pag. 11

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1. Resumen:

Las proteínas son moléculas formadas a partir de secuencias aminoacídicas. Estas son un componente fundamental para el correcto funcionamiento del organismo y sus actividades. Dentro

de las diferentes funciones que tiene las proteínas en el organismo se destacan algunas como:

funciones enzimáticas, energéticas, de transporte, inmunológicas, estructurales y contráctiles. Por

esta polifuncionalidad que tienen las proteínas para los organismos, podemos afirmar que son esenciales en el metabolismo, crecimiento y desarrollo celular.

La falta de proteínas tiene como consecuencia un grupo de diversos problemas, como lo pueden ser una hepatitis, que por ejemplo, tiene un pronóstico positivo si es diagnosticada a tiempo y puede ser

tratable. Por otro lado, hay enfermedades en que no tienen cura es decir, son irreversibles ante

cualquier tipo de tratamiento. Por ejemplo , la anemia falciforme en la cual una proteína encargada del transporte de oxígeno (hemoglobina) posee una estructura alterada la cual no le permite

transportar el oxígeno de forma eficiente, generando así problemas a las personas que padecen esta

mutación, sin embargo, a pesar de la baja eficiencia en el transporte de oxígeno, la hemoglobina en

la anemia falciforme tiene una actividad importante en la supervivencia en países donde hay alta incidencia de malaria, ya que la forma de la proteína a su vez no permite el alojamiento de la

enfermedad. Entonces, al determinar la ausencia o presencia de ciertas proteínas en individuos

problema, se puede determinar la incidencia de diversas patologías por mutaciones genéticas, o por infecciones, entre otros.

En este trabajo práctico se determinó la concentración de proteína total de una muestra problema

con el método de biuret, el cual se caracteriza por una reacción de los enlaces peptídicos en un medio alcalino con sulfato de cobre para formar un compuesto coloreado estable por cierto tiempo

para la determinación de concentración por espectrofotometría.

En el segundo experimento se determinó la concentración de albúmina (proteína principal del

plasma sanguíneo) presente en un muestra problema. En este caso utilizamos el método del verde

bromo cresol, el cual hace que la proteína se una a un compuesto coloreado con el que es posible determinar la concentración de la proteína por espectrofotometría.

El rango normal de proteína total oscila entre 6.0 a 8.0 gm/dL

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2. Introducción:

El examen de proteína total consiste en medir cantidad total de dos clases de proteínas: albúmina y

globulina. Ambas se encuentran en la porción liquida de la sangre.

Como se nombro anteriormente, la albúmina es la principal proteína de la sangre, y una de las más

abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hígado y está constituida por 585 aminoácidos con 17 puentes disulfuro entrecruzados en su molécula, y tiene un peso molecular de 67.000 Dalton.

Cabe mencionar que posee carga negativa.

Existen diferentes tipos de Albuminas:

Seroalbúmina: Es la proteína del suero sanguíneo.

Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara del huevo.

Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche.

La concentración normal de albúmina en la sangre humana fluctúa entre 3,5 y 5,0 g/dL. Constituyendo esta un 54,31% de la proteína plasmática. El resto de proteínas presentes en el

plasma se llaman en conjunto globulinas.

Esta proteína es esencial en la correcta distribución de los fluidos corporales entre el sistema

vascular (Vasos sanguíneos) y el extravascular. Por esto, la disminución de esta traerá como consecuencia el desplazamiento del líquido intravascular hacia afuera, invadiendo el espacio tisular

generando hinchazón en los individuos.

Dentro de las funciones que posee la albúmina dentro del organismo se destaca su papel en el control del pH y es utilizada por el mismo organismo como molécula transportadora.

Se ha observado que la albumina puede transportar vitaminas, bilirrubina, lípidos, hormonas, etc.

En cambio, las globulinas constituyen el 46% restante de las proteínas del plasma sanguíneo. Se caracterizan por ser un grupo de proteínas solubles en agua presentes en animales y vegetales. Se

dividen en tres grupos de acuerdo a su función en el organismo: alfa, beta y gammaglobulinas, estas

últimas constituyen ciertos anticuerpos. (Sistema inmunitario).

Niveles normales de globulinas en el plasma: 2.0 a 3.5 g/dL.

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3. Método

Para este trabajo experimental se utilizo el método de

reacción de Biuret, en el cual los enlaces peptídicos de la

proteína reaccionan con el reactivo a pH básico para formar un complejo colorido azul-violeta. Este complejo azul-

violeta es directamente proporcional a la concentración de

proteína presente en las muestras a estudiar en el ensayo.

La proteína de la muestra de plasma sanguíneo reacciona con

el cobre del reactivo de Biuret causando un aumento en la

absorbancia. Esto siempre teniendo un medio alcalino para realizar esta reacción.

Esta reacción se realiza en exámenes para así poder diagnosticar enfermedades que involucren a los

riñones y al mismo hígado.

Previo a su utilización, el reactivo biuret debe ser preparado en base a los siguientes elementos:

1. Tartrato de sodio y potasio………………………….……...70mM 2 .Sulfato de cobre II …………………………………………15mM

3. Hidróxido de sodio……………………………………….. 200mM

4. Ioduro de potasio……………………………….…………. 10mM 5 . Surfactantes y preservantes

El producto final debe ser claro, si este es turbio debe repetirse la preparación.

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4. Significado de los resultados anormales:

Los niveles superiores a los niveles normales pueden deberse a:

Inflamación o infección crónica, incluyendo VIH y hepatitis B o C

Mieloma múltiple

Enfermedad de Waldenstrom

Los niveles inferiores a los normales pueden deberse a:

Agamaglobulinemia Hemorragia

Quemaduras

Glomerulonefritis

Enfermedad hepática Malabsorción

Desnutrición

Síndrome nefrótico

Enteropatía por pérdida de proteína

Las mediciones de proteínas totales se pueden incrementar durante el embarazo.

Con respecto la medición de albumina en el plasma sanguíneo, el fundamento se basa en la unión de

albúmina a colorantes o marcadores (en nuestro caso al verde de bromo cresol).

El aumento de color es proporcional a la concentración de Albumina presente.

Los rangos normales son 3.5 a 5.0 g/dL

Los niveles inferiores de lo normal indican:

Enfermedades renales.

Enfermedad hepática (por ejemplo, hepatitis, cirrosis o ascitis).

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5. Paso experimental:

EXPERIMENTO N°1: DETERMINACIÓN DE PROTEINA TOTAL

Se preparo 3 soluciones, la primera, solución blanco con 1000 µl de reactivo

(RGT), la segunda, muestra estándar con 1000 µl de reactivo (RGT) y 20 µl de estándar

(STD) y la tercera, muestra problema con 1000 µl de reactivo (RGT) y 20 µl de muestra

(las pipetas deben estar limpias y libres de residuos para evitar la contaminación de las

soluciones). Como se muestra en la tabla N°1:

Luego de preparadas las soluciones, se incubó durante 10 minutos a temperatura

ambiente (20° a 25° C) y finalmente se leyó la absorbancia a 540 nm, llevando a cero el

espectrofotómetro con el blanco de reactivo.

EXPERIMENTO N°2: DETERMINACIÓN DE ALBUMINA

Al igual que en el ensayo anterior, se preparó 3 soluciones de la forma como se

presenta en la tabla N°2:

Blanco Estándar Muestra

1000 µl RGT 1000 µl RGT 1000 µl RGT

------- 20 µl STD -------

------- ------- 20 µl muestra

Posteriormente se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente (20° a 25° C) y luego

se midió la absorbancia a 540 nm, llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de

reactivo.

Blanco Estándar Muestra

1000 µl RGT 1000 µl RGT 1000 µl RGT

------- 20 µl STD -------

------- ------- 20 µl muestra

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6. Resultados:

EXPERIMENTO N°1: PROTEINAS TOTAL

Blanco 0

Estándar 0,553

Muestra 0,301

Cálculos:

Concentración = 8 x (abs muestra – abs blanco) [g/dL]

(abs STD – abs blanco)

= 8 x (0,301 - 0) [g/dL]

(0,553 – 0)

= 4,354 g/dL

Observaciones:

Se observó diferencias de color entre las sustancias:

Muestra color lila

Blanco color celeste

Estándar color morado

Los colores se potenciaron levemente luego de los 10 minutos de incubación.

Absorbancia proteína total

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EXPERIMENTO N°2: ALBUMINA

Blanco 0

Estándar 0,376

Muestra 0,129

Cálculos:

Concentración: = 8 x (abs muestra – abs blanco) (g/dL)

(abs STD – abs blanco)

= 8 x (0,129 – 0) (g/dL)

(0,376– 0)

= 2,745 g/dL

Observaciones:

Se observaron diferencias de color entre las sustancias:

Muestra color morado

Blanco color celeste

Estándar color morado

Los colores se acentuaron luego de los 10 minutos de incubación.

Absorbancia albumina

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7. Discusión:

En el presente paso práctico se observó un nivel de proteína total de 4,35 d/dL, o

que se traducen en un bajo nivel de concentración protéica a nivel de plasma sanguíneo

respecto a los niveles normales de 6.0 a 8.0 g/dL en adultos. Por lo tanto se puede asumir

que nos encontramos frente a un paciente con posible patología hepática, desnutrición,

síndrome nefrótico o enteropatía por mala absorción. Sin embargo, no tan solo la proteína

total nos dirá de qué patología se trata, sino que se necesitará de exámenes aún más

precisos los cuales determinen la cantidad concreta de proteínas específicas para asegurar

dónde se presenta la patología.

En base al segundo ensayo, se observa que la concentración de albúmina

corresponde a 2,74 g/dL, por lo que se asume que el individuo problema está en una

condición patológica de déficit de albúmina y de proteínas totales. El déficit de esta

proteína observado en el ensayo refleja la posibilidad de enfermedad renal o hepática, como

también puede ser producto de problemas de absorción de nutrientes a nivel entérico. Por

ejemplo, enfermedad de Whipple, luego de una cirugía para reducir peso, cambio dietario

por dietas bajas en proteínas, entre otros.

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8. Conclusión:

Para finalizar, es posible concluir que los objetivos clave del presente paso práctico

fueron cumplidos exitosamente, permitiendo establecer los niveles de concentración

proteica total y de albúmina en un individuo problema. Al mismo tiempo, permite

internalizar una de las metodologías utilizadas en la determinación de las proteínas en

solución, para su posterior análisis respecto a los niveles normales de éstas y así determinar

el estado de salud del individuo problema. Gracias a los resultados obtenidos, y la

investigación de los significados patológicos de los niveles anormales para las variables en

estudio, se pudo deducir la naturaleza de los resultados obtenidos para el individuo

estudiado.

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9. Bibliografía:

1. Bazari H. Approach to the patient with renal disease. In: Goldman L,

Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders

Elsevier; 2007:chap 115.

2. Riegler, E., A Colorimetric Method for the Determination of Plasma

Albumin, Z. Anal. Chem. 53, 242 (1914).

3. Tricot G. Multiple myeloma. In: Hoffman R, Benz EJ Jr, Shattil SJ, et al,

eds. Hoffman Hematology: Basic Principles and Practice. 5th ed.

Philadelphia, Pa: Churchill Livingstone Elsevier; 2008:chap 87.

4.

5. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003544.htm

6. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003483.htm