INGENIERA DE PROCESOS AGROINDUSTRIALES II Prctica N8:

OBTENCION Y EVALUACION DE ANIMALES

GELATINA A PARTIR DE HUESOS, PIEL Y PATAS DE

Profesor:

Ing. Cesar Moreno Rojo

Paredes Nurea Adderly Alumnos: Zavaleta Hernandez Luis Andrea Avils Murillo

Grupo:

A (mircoles 08-12 a.m.)

Nuevo Chimbote febrero del 2010

PRACTICA N 8 OBTENCIN Y EVALUACION DE GELATINA A PARTIR DE HUESOS, PIEL Y PATAS DE ANIMALES

I.

INTRODUCCION: La Gelatina es una mezcla coloide (sustancia semislida), incolora, translcida, quebradiza y casi inspida que se obtiene a partir del colgeno procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con agua. En el animal, la gelatina no existe como componente, se obtiene, como ya se dijo, por hidrlisis parcial irreversible del colgeno, su precursor insoluble. En el colgeno, la unidad bsica est formada por tres cadenas de polipptidos, enrolladas en forma de hlice y estabilizadas por uniones intramoleculares. Esto hace que el colgeno exhiba propiedades mecnicas nicas y forme la estructura del tejido conectivo de la piel, los tendones, los cartlagos y los huesos de los animales. La gelatina es una protena compleja, es decir, un polmero compuesto por aminocidos. Como sucede con los polisacridos, el grado de polimerizacin, la naturaleza de los monmeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de esta molcula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: se derrite con el agua caliente y se solidifica nuevamente y se hincha con el agua fra. Pocos alimentos renen tantas propiedades positivas como la gelatina. Sirve de fuente protenica de primera, no dispone de potencial alrgeno, es libre de colesterol, azcar y grasa, se digiere sin problemas y no contiene aditivos. Con la gelatina se puede crear platos bajos en caloras que, a pesar del bajo contenido en grasas, no pierden en sabor y garantizan un plus de protena Tradicionalmente relegada a la repostera, la gelatina es algo ms que un postre fcil de hacer. No slo es un ingrediente muy atractivo a la hora de cocinar platos elaborados y deliciosos, tanto dulces como salados, sino que tiene un alto valor nutritivo. De hecho, la gelatina es protena en estado puro.

II.

OBJETIVOS: Obtener gelatina a partir de patitas de res, de pollo y cuy tierno. Determinar los parmetros ms importantes del proceso de obtencin. Realizar un balance de materia para el proceso. Evaluar fsico qumica y sensorialmente el producto final. III. FUNDAMENTO TEORICO: GELATINA La gelatina, es una sustancia orgnica nitrogenada por hidrlisis parcial del colgeno contenido en la piel, tejidos conjuntivos o huesos de los animales. La gelatina es un material proteico dotado de propiedades gelificantes y espesantes nicos, a diferencia de los espesantes de origen vegetal, la gelatina es la nica protena natural de importancia comercial, capaz de producir geles termoreversibles en agua a temperatura cercanas a la temperatura corporal. Esta ventajosa capacidad de re-derretimiento a temperatura corporal, que no puede ser producida por otros materiales o sistemas, es la que imparte a los geles de gelatina su inigualable textura superior y su inconfundible palatabilidad y sensacin bucal. Segn la materia prima empleada y el mtodo de extraccin, las gelatinas varan en composicin molecular y propiedades fsicas. Por consiguiente, difieren de un fabricante a otro y no se pueden comparar fcilmente para aplicaciones especficas sin un adecuado conocimiento cientfico. En general, la propiedad ms importante de una gelatina desde el punto de vista comercial es su fuerza gelificante (medida en unidades Bloom). Otras propiedades fisicoqumicas tales como viscosidad, color y claridad, as como tambin su pureza qumica y bacteriolgica y los procesos de produccin utilizados, contribuyen al valor global del producto. Rodrguez, G. Muoz, J. La gelatina se forma mediante la hidrlisis del colgeno y se prepara a partir de materiales ricos en esta sustancia tales como la piel de cerdo, piel de ganado vacuno o huesos. La carne de animales jvenes en la que el colgeno todava no ha experimentado un entrecruzamiento intenso produce gelatina con facilidad mediante el proceso de cocinado ordinario.Ranken, M (1993)

COLAGENO El colgeno, es una fraccin principal del tejido conectivo, viene a ser una protena de estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, se encuentra en los tejidos de todos los organismos multicelulares, desde los ms primitivos hasta el hombre. El colgeno representa aproximadamente el 30% del conjunto proteico en los mamferos, siendo la caracterstica de esta protena el predominio de cuatro aminocidos en su composicin: glicina, alanita, prolina e hidroxiprolina, representando ste ltimo el 14% en peso total de aminocidos componentes del colgeno, adems la suma de estos 4 aminocidos representa casi el 75% de los aminocidos totales del colgeno. La obtencin de la gelatina de diversas calidades se ve influenciada por la complejidad del colgeno (influenciada a su vez por el tipo de tejido, edad y especie animal), as como de los diferentes procesos qumicos disponibles para la ruptura de las estructuras y enlaces del polmero. Tabla 1: Contenido de colgeno en diferentes tejidos Contenido base Peso seco% 90 90 40 20

Tejido Tendones Piel Cartlago Huesos

Inicialmente el colgeno es insoluble en agua, debido a su estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, pero bajo la accin de tratamientos cidos o bsicos moderados, esta estructura organizada se desorganiza, provocando el paso de fibras a fibrillas, luego a tropocolgeno (unidad monomrica bsica) y posteriormente la desorganizacin de las tres constitutivas de las hlices mediante los siguientes mecanismos:

Apertura en tres cadenas alfa desorganizadas e independientes (peso molecular de 80 000 a 125 000), siendo la gelatina con esta composicin la de ms alta calidad tcnica.

Apertura en dos molculas, una de ellas alfa desorganizada y la otra molcula doble beta (unin de 2 alfas mediante enlaces) de peso molecular de 160 000 a 250 000.

La no apertura y desorganizacin de la espiral nos da una molcula gama de 240 000 a 375 000 dltons. (tres cadenas alfa unidas covalentemente (tres cadenas alfas unidades

Las tres cadenas alfa unidas entre s forman una hlice triple y compacta denominada tropocolgeno, en donde la localizacin de sus componentes prolina e hidroxiprolina les proporciona esta configuracin helicoidal. . Rodrguez, G. Muoz, J. OBTENCION DE GELATINA Para obtener gelatina, es necesario transformar el colgeno hasta obtener un producto de la mejor calidad comercial posible, en este caso el colgeno se puede disponer de las siguientes materias primas: Piel fresca de cerdo Huesos Pieles de ternero, bovinos, bfalos, etc. Cartlagos Existen cuatro mtodos utilizados para obtener la gelatina, siendo las ms utilizadas en la actualidad el mtodo cido y el mtodo bsico: Extraccin cida.- es el mtodo ms rpido, se aplica a materia

prima con poco grado de entrecruzamiento, por ello se utiliza ms en las pieles de cerdo, obtenindose una gelatina denominada A. Extraccin alcalina.- es el mtodo ms lento y se utiliza frecuentemente tiempos que van de tres a cinco meses a temperaturas menores a 20C, ste mtodo se aplica de preferencia a materiales con alto

grado de entrecruzamiento tales como las pieles de bovinos y bfalos. En este proceso, el colgeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin accin qumica complementaria puede completar la transformacin hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. Extraccin enzimtica.- se han realizado investigaciones sobre este mtodo, para ello se ha empleado la enzima pronasa en presencia de cloruro de calcio, el tiempo necesario es inclusive menor al mtodo cido. Extraccin microbiana.- se han tratado pieles con mycoderma y torulopsis y se ha obtenido gelatina en 21 das. Esta tcnica y la enzimtica son relativamente nuevas. Para obtener la gelatina se requieren tres etapas bien diferenciadas: Preparacin de la materia prima

La materia prima, al margen de su procedencia, debe primero seleccionarse, clasificarse, cortarse en tamaos uniformes y purificarse (lavado, desgrasado, eliminacin de pelo, etc.), luego mediante los tratamientos cidos, bsicos o biotecnolgicos, se incrementa la blandura y el volumen de la materia prima, adems a nivel de estructuras moleculares, se produce una ruptura parcial de uniones peptdicas y una disociacin parcial de los enlaces covalentes existentes entre las cadenas. Extraccin

Durante la extraccin de la gelatina, mediante tratamientos con agua a temperaturas altas (promedio de 80C), se acenta la ruptura de estos enlaces incluido los puentes hidrgeno, separndose en cadenas individuales, permitiendo mayor conversin de colgeno a gelatina. Un pretratamiento alcalino de la materia prima, produce una gelatina con punto iso-elctrico ms bajo, aproximadamente 5, en tanto que un pretratamiento cido, limitado casi exclusivamente a material de piel de cerdo, produce una gelatina con un punto iso-elctrico entre 7 y 9. Purificacin y secado

La suspensin de gelatina obtenida despus de la extraccin se clarifica mediante centrifugado y filtracin, adems mediante la desionizacin se purifica la gelatina an ms eliminando sales inorgnicas. Mediante la evaporacin se concentra la suspensin de gelatina en preparacin para el secado. Una filtracin secundaria pule la suspensin y resulta en una gelatina de mayor brillo, luego a fin de asegurar el grado mximo de pureza se pasteuriza y se enfra rpidamente y se extruda el gel resultante en forma de fideos, los que se distribuyen en bandejas o fajas transportadoras, para su traslado hasta los tneles de secado hasta reducir la humedad del producto entre 10 y 12%. Posteriormente estos fideos se trituran y el polvo resultante se tamiza a travs de mallas ajustadas a distintas especificaciones y se envasa. Rodrguez, G. Muoz, J. COLGENO HIDROLIZADO El colgeno hidrolizado es una protena de bajo peso molecular (es decir escaso poder gelificante) para su uso especial en aplicaciones alimenticias y no alimenticias en las cuales se requiere propiedades espesantes y texturizantes de la gelatina sin sus efectos gelificantes. Esta caracterstica abre nuevas perspectivas para su aplicacin en industrias que anteriormente no podan utilizar las propiedades fisicoqumicas de la gelatina debido a su poder gelificante. El peso molecular promedio del colgeno hidrolizado se ubica dentro de la escala de 4 000 a 20 000, siendo el valor calrico de 4 cal/gramo. El colgeno hidrolizado es un producto adecuado para incrementar el contenido proteico de los alimentos debido a su elevado contenido de protenas. Rodrguez, G. Muoz, J.

RENDIMIENTO El siguiente cuadro, se muestra el rendimiento de gelatina en base a pieles de diferentes animales: Tabla N2: Rendimiento de gelatina

Materia Prima Piel de ternero (seco) Piel de bfalo (seco) Tendn de ternero Piel de cerdo (congelado) Hueso de ternero (seco)

Rendimiento (%) 35 52 15 50 50 70 18 22 14 18

VALOR BIOLGICO DE LA GELATINA El colgeno, es una protena muy resistente a la accin hidroltica de los enzimas digestivos; mientras que la gelatina es de fcil digestin pero su valor biolgico es muy bajo, debido a su deficiencia de los aminocidos esenciales lisina y triptfano. FUERZA DE GEL DE LA GELATINA La fuerza del gel se expresa mediante los grados BLOOM, en el mercado existen gelatinas que van desde 50 a 320 grados Bloom, la tcnica toma las siguientes condiciones: Se aplica a aquellas preparaciones gelificadas a 10C y maduradas durante 16 a 18 horas, y corresponden a peso en gramos, necesarios para obtener un hundimiento de 4 mm. El gel de un pistn cilndrico de 12,7 mm de dimetro geomtricamente definido. USOS DE LA GELATINA Su uso en la Agroindustria es variada debido a sus propiedades fisicoqumicas y sensoriales, entre estos tenemos: Postres de gelatina en agua Industria Lctea (espumante, flan de leche, en quesos mejora el rendimiento, en yogurt ayuda a estabilizar la viscosidad, en helados, en mantequilla, etc.) Postres espumosos (estabilizacin de crema chantilly) Pastelera, mejora el espumado Industria Crnica, absorbe y estabiliza los lquidos presentes en los jamones, salchichas, etc.

Encapsulantes de sabores y aromas durante su secado, mediante la formacin de un matriz. Clarificantes de vino y jugo de fruta, mediante la formacin de flculos con los taninos, los que al precipitar, clarifican estos lquidos. Confitera, en la elaboracin de malvaviscos y caramelos suaves, marshmellows, etc. Rodrguez, G. Muoz, J. METODOS USADOS EN LA OBTENCION DE GELATINA Existen cuatro mtodos utilizados para obtener gelatina, siendo las ms utilizadas en la actualidad el mtodo cido y el mtodo bsico: Extraccin cida.- es el mtodo ms rpido, se aplica a materia prima con poco grado de entrecruzamiento, por ello se utiliza ms en las pieles de cerdo, obtenindose una gelatina denominada A. Extraccin enzimtica.- Se han realizado investigaciones sobre ste mtodo, para ello se ha empleado la enzima pronasa en presencia de cloruro de calcio, el tiempo necesario es inclusive menor al mtodo cido. Extraccin microbiana.- Se han tratado pieles con mycoderma y torulopsis y se ha obtenido gelatina en 21 das. sta tcnica y la enzimtica son relativamente nuevas. Extraccin alcalina.- es el mtodo ms lento y se utiliza frecuentemente tiempos que van de tres a cinco meses a temperaturas menores a 200C, ste mtodo se aplica de preferencia a materiales con alto grado de entrecruzamiento tales como las pieles de bobinos y bfalos. En este proceso, el colgeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin accin qumica complementaria puede completar la transformacin hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. DIAGRAMA DE FLUJO PARA OBTENCION DE GELATINA TIPO A

DIAGRAMA DE FLUJO PARA OBTENCION DE VITAMINA TIPO B

Como forma de presentacin encontramos gelatina en lminas, en forma de grnulos ms o menos pulverulentos. Las caractersticas comerciales de una determinada gelatina, por ejemplo de tipo A (cerdo), se miden segn la dureza de sus geles (grados Bloom) y el tamao de la partcula o polvo (Mesh o Malla). A mayor grado Bloom, ms fuerza de gel (suele oscilar entre 80-100 a 200-220Bloom) y, en cuanto al tamao de partcula, a mayor nmero de Mesh, ms fino es el polvo.

Una gelatina muy castigada por el tratamiento de extraccin y que al final no tenga fuerza para gelificar (0Bloom) se llama hidrolizado de gelatina y slo tiene inters en cosmtica (cremas de belleza) y farmacia (productos que mejoran el cartlago de las articulaciones, que endurecen las uas...) o como aporte proteico en alimentos (especialmente en productos crnicos). Finalmente existe una gelatina que acta en fro, sin necesidad de calentar como las otras. Se denomina Gelatina Instant y se utiliza en postres para preparar en fro (preparar, montar, refrigerar, dejar reposar y comer). Esta gelatina se obtiene por un proceso especial de secado. APLICACIONES La gelatina se utiliza en pastelera por su capacidad de formar geles. Para ello hay que trabajarla de la siguiente manera: Dejarla hidratar un tiempo en agua fra. El tiempo depender del grosor de la partcula. En el agua fra veremos que los grnulos, o la lmina de gelatina, se hinchan y se vuelven ms flexibles y pegajosos, pero no se solubilizan. Si no se remoja la lmina o no se hidrata bien el producto en polvo, es muy probable que, al final, queden grnulos de gelatina sin disolver. Seguidamente hay que calentar el agua para lograr la completa solubilizacin de la gelatina. Cuando est perfectamente solubilizada, la gelatina no se ve en el agua y tampoco aporta viscosidad a la misma. Se puede solubilizar a partir de los 45-50 C. Mientras ms caliente est el agua, antes se solubiliza, pero un exceso de calentamiento (autoclave, olla a presin) puede hacer que se hidrolice y pierda fuerza de gel. Tambin el medio cido (zumos de frutas, cido ctrico o tartrico...) aceleran la hidrlisis de la gelatina y forman geles menos duros si el calentamiento en medio cido se mantiene un tiempo prolongado. Tras el calentamiento se puede dejar atemperar y no gelificar hasta alcanzar los 40C. Se puede mezclar con otros ingredientes, montarla en forma de espuma, etc. Colocarla en el molde adecuado y dejarla en el refrigerador, preferiblemente 24 horas, para que alcance toda su fuerza. Las aplicaciones ms habituales de la gelatina para pastelera son: - Estabilizacin de espumas (en sifn), mousses, babaroises, etc. 35-

- Gelificacin de cremas o lquidos para postres o interiores de tartas, gelatinas de frutas, hierbas, etc. - Glaseados y gelatinas para recubrimiento de tartas - Gominolas, marsmalow, caramelos (en algunos casos). La gelatina tiene un amplio uso en la industria alimenticia, principalmente como emulsificante en la repostera y heladera; se usa tambin en la industria farmacutica como cubierta de las cpsulas, y en la fotografa como base para la emulsin de cristales de haluros de plata (la parte sensible a la luz) de las pelculas y papeles fotogrficos. IV. 4.1 MATERIALES Y METODOS: MATERIALES: 4.2 Balanza analtica Materiales de vidrio diversos: pipetas, probetas, vasos de precipitados. Olla grande Estufa pH-metro Termmetro Molino de martillos Materia prima: huesos, patitas de res y carcasa de cuy tierno. Reactivos: HCl diluido, NaOH 0.05 N

METODOS DE ANALISIS Y CONTROL: Determinar el pH de remojo y temperatura de extraccin. Determinar los slidos totales en la etapa de concentracin Determinar humedad del producto final y grado de gelificacion Realizar un anlisis sensorial al producto final, preparando una gelatina.

V.

PROCEDIMIENTO: 5.1 Diagrama de Flujo para la obtencin de gelatina a partir de patitas pollo.Materia Prima

Lavado

Restos de grasa

Cortado

Desengrasado

Tamao: 40 50 mm gua caliente T = 80C t = 50 min pH 1,8 t = 24 h NaOH 0.05 N

Remojo en medio acido

Neutralizacin

Extraccin, T060-800C x 2 a 4 h. pH neutro

Filtracin Concentracin a vaco, 500C hasta 20% slidos. Secado, 500C Triturado y envasado Almacenado

5.2 Descripcin de los anlisis a realizar

Determinacin de pH: Preparar una solucin acuosa al 1% y medir pH Determinacin de la viscosidad: Se pesa 7,5 g de gelatina en 105 ml de agua Se vierte sobre el recipiente del viscosmetro Brookfield Se usa la aguja N1 y la T debe estar en 40C Se mide la viscosidad a 20, 50 y 100 RPM Los resultados se expresan en centipoise (cp) Determinacin de color, olor y turbidez: Estos anlisis se evaluaran con una escala hednica de 5 puntos que cada grupo elaborara para su gelatina obtenida Determinacin de Grados Bloom: Se determinara en forma cualitativa a travs de un cuadro elaborado para tal caso. VI. RESULTADOS : 6.1.Determinacin de Grados Bloom: Gelatina: 102 gr 10 gr 1500ml X X = 147.06 ml Colapiz : 102 gr 7.5 gr X = 110.3 ml ml ml

1500ml X

Tipos de gelatina

Grados bloom

caractersticas

1 2 3

200 230 120 -150 50 80

Tiene una buena solidez de los geles formados Los geles formados tiene una solides no muy consistente Los geles formados no tienen poca solides

Los geles formados por la gelatina comercial y por el colapiz tuvieron una buena consistencia esto se debi ya que son gelatinas comerciales por lo cual estuvieron en el tipo de gelatina 1 con 200 230 grados bloom. 6.2.Determinacin de pH: Gelatina: Colapiz: 7.5 7.2

Determinacin de color, olor y turbidez: Gelatina sabor a fresa: al ser una gelatina comercial la que se el experimento el laboratorio el color fue un rojo

aplico para

caracterstico el olor a fresa como es la caracterstica de dicho producto. Para el colapiz no tenia olor y era de un color tranparente ya que

fue comercial tambin el colapiz es un tipo de gelatina sin olor ni sabor que se utiliza para aumentar los grados bloom de la gelatina comercial y as esta pueda gelatinizar ms rpido. VII. DISCUSION:

Segn Ranken, M (1993). La gelatina se forma mediante la hidrlisis del colgeno y se prepara a partir de materiales ricos en esta sustancia tales como la piel de cerdo, piel de ganado vacuno o huesos. La carne de animales jvenes en la que el colgeno todava no ha experimentado un entrecruzamiento intenso produce gelatina con facilidad mediante el proceso de cocinado ordinario. En la prctica realizada se trabajo con gelatina comercial (gelatina y colapiz)

Segn Rodrguez, G. Inicialmente el colgeno es insoluble en agua, debido a su estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, pero bajo la accin de tratamientos cidos o bsicos moderados, esta estructura organizada se desorganiza, provocando el paso de fibras a fibrillas, luego a tropocolgeno (unidad monomrica bsica) y posteriormente la desorganizacin de las tres constitutivas de las hlices. A travs de varias semanas de un tratamiento alcalino, se obtiene una cuidadosa transformacin de la estructura del colgeno.. Segn Rodrguez, G. Los huesos desengrasados usados para la extraccin de gelatina se reducen de tamao de hasta 5-10 mm. En el proceso de extraccin, la materia prima neutralizada y desmineralizada, se somete a la extraccin en caliente, siendo muy importante la influencia de la temperatura y el tiempo de extraccin en la calidad de la gelatina; en la prctica realizada se utilizo una temperatura de 60-80C por 2-4 horas. VIII. CONCLUSIONES: Se utilizo gelatina comercial ( colapiz y gelatina) Los grados Bloom se miden segn la dureza de sus geles . A mayor grado Bloom, ms fuerza de gel (suele oscilar entre 80-100 a 200-220Bloom) Un criterio importante para determinar la calidad de la gelatina son los grados Bloom que generalmente est entre 50 y 300. Con este valor se determina la estabilidad y el poder de gelificacin de la gelatina. Cuanto ms alto sea el valor Bloom tanto ms alta es la intensidad de gelificacin Hay varios tipos de gelatina segn la especie animal, el origen del colgeno, el proceso de obtencin y la forma de secado. Las ms frecuentes son: Gelatina de cerdo: tambin llamada gelatina A ya que se obtiene con un tratamiento cido. Es la ms utilizada en alimentacin en los pases no rabes. Gelatina de vacuno: llamada gelatina B ya que las pieles y huesos de vacuno se deben alcalinizar para obtener la gelatina. La gelatina obtenida est catalogada como gelatina Tipo A. El componente principal de la gelatina es la protena colgeno. Para la gelatina comercial se prepara 102gr en una dilucin de 1.5 litros igualmente para el colapiz ya que es una gelatina sin sabor.

El colapis es un tipo de gelatina que no tiene sabor ni olor y es utilizado para aumentar los grados bloom de la gelatina comercial. El ph de la gelatina comercial fue de 7.5 y del colapis fue de 7.2

IX. 1. 2. 3.

BIBLIOGRAFIA: Rodrguez, G. Muoz, J. Procesos Agroindustriales II. Universidad Nacional del Santa. Ranken, M (1993). Manual de la Industria de los alimentos, segunda edicin, Editorial Acribia S.A Zaragoza.Espaa http://www.gelita.com/DGFspanish/gelatine/gelatine_herstellung.html 4. 5. ctos.pdf 6. lAeg22wAw&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=1&ved=0CAkQ7gEwAA&pr ev=/search%3Fq%3Dgrados%2Bbloom%2Bwiki%26hl%3Des%26sa%3DG 7. 8. 9. http://jacintoluque.blogcindario.com/2008/07/00020produccion-de-gelatina.html http://www.aulachocovic.es/docs/articles/Gelatina.pdf http://www.gelatinascordoba.com.ar/productos.htm http://translate.google.com.pe/translate? hl=es&sl=it&u=http://it.wikipedia.org/wiki/Grado_Bloom&ei=WOBiS4fjFcid http://www.aulachocovic.es/docs/articles/Gelatina.pdf http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ljaime/subprodu

CUESTIONARIO 1) Por qu la gelatina se obtiene por hidrlisis parcial del colgeno?

El colgeno es una protena fibrosa que contribuye muy significativamente a las singulares funciones desempeadas por los tejidos conectivos de la piel, los tendones, los cartlagos, los huesos etc. La unidad estructural del colgeno es el tropocolgeno, una protena en forma de varilla, formada por tres cadenas polipeptdicas superenrrolladas en una triple hlice y estabilizadas por uniones intramoleculares. Estos enlaces influyen en las propiedades moleculares de la gelatina resultante. Inicialmente el colgeno es insoluble en agua, debido a su estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, pero bajo la accin de tratamientos cidos o bsicos moderados, esta estructura organizada se desorganiza, provocando el paso de fibras a fibrillas, luego a tropocolgeno (unidad monomrica bsica) y posteriormente la desorganizacin de las tres cadenas constitutivas de alfa hlices ; las tres cadenas alfa unidas entre s forman una hlice triple y compacta denominada tropocolgeno, en donde la localizacin de sus componentes prolina e hidroxiprolina les proporciona esta configuracin helicoidal. La obtencin de gelatina de diversas calidades se ve influenciada por la

complejidad del colgeno, as como de los diferentes procesos qumicos disponibles para la ruptura de las estructuras y enlaces del polmero. El producto hidrolizado depende de los enlaces cruzados que queden entre las cadenas peptdicas y de los grupos reactivos terminales aminos y carboxilos libres que se formen. Dado que las tres cadenas no son idnticas, despus de la degradacin resultan tres tipos bsicos de nuevas cadenas: Las cadenas alfa, compuestas de una sola cadena peptdica. Las cadenas beta, formadas por dos cadenas peptdicas conectadas. Las cadenas gamma, con tres cadenas peptdicas interconectadas Segn esto, una muestra de gelatina tiene varios pesos moleculares. La distribucin de pesos moleculares de la gelatina determina caractersticas como la dispersabilidad en agua, la viscosidad, la adherencia y la resistencia de los geles.

Cuando la concentracin relativa de molculas de bajo peso molecular aumenta, se reduce la viscosidad y la resistencia de los geles. 2) Por qu la extraccin de gelatina a partir de la piel y huesos de pescado es por extraccin bsica? Es el mtodo ms lento y se utiliza frecuentemente tiempos que van de tres a cinco meses a temperaturas menores a 20C, ste mtodo se aplica de preferencia a materiales con alto grado de entrecruzamiento tales como las pieles de bovinos y bfalos. En este proceso, el colgeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin accin qumica complementaria puede completar la transformacin hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. Este mtodo se aplica de preferencia a materiales con alto grado de entrecruzamiento. En este proceso, el colgeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin accin qumica complementaria puede completar la transformacin hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. El grado de entrecruzamiento se define como la concentracin de puntos de unin efectivos en la red polimrica.

3)

Cmo precipitara usted las protenas que acompaan al colgeno despus del remojo de las patitas de res en medio acido? El procedimiento de la obtencin del producto se caracteriza por someter las pieles y/o tejido conectivo a una serie de lavados, seguido de un tratamiento con lcali diluido para obtener una completa limpieza del producto y preparacin para la presolubilizacin. Su duracin e intensidad depender del estado de la materia prima. Posteriormente, tras un lavado para neutralizar se somete a un tratamiento con cido diluido. Las propiedades que infiere el cido seleccionado predisponen para obtener unas propiedades finales del producto elevadas. La concentracin

del acido(s) y el tiempo de permanecia en l depender del estado de la materia prima, grado de entrecruzamiento del colgeno, etc. Una vez pregelatinizada la protena se lava abundantemente y se procede a la extraccin de la gelatina en un bao de agua. Segn la temperatura y tiempo aplicado se obtendrn unas caractersticas y rendimiento determinado. Las protenas pueden precipitarse del colgeno de distintos mtodos entre ellos tenemos: Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas Mtodos cromatogrficos Mtodos electroforticos 1. Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas.

El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo de rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se va a aislar la protena, as como de su localizacin. Entre los distintos mtodos ellos estn: " Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos

animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula, causando su hinchamiento y rotura. " Destruccin mcanica. Entre estos mtodos se encuentran la homogenizacin (hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o almina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un pequeo orificio), la sonicacin (someter las clulas a vibraciones de ultrasonido).

"

Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas a un

cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones especficos para protenas solubles o bien que contengan adems detergentes si se pretende purificar protenas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a muchos agentes que pueden daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdico) son los principales factores que pueden desnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo ms corto posible, adems en ocasiones es necesario aadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin

(10.000 - 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena de inters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estn fijos. Para purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico y fcil de llevar a cabo. En este sentido es mucho ms cmodo trabajar con enzimas, pues se detectaran mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar protenas no enzimticas, se requieren mtodos de seleccin ms especficos. 2. Mtodos cromatogrficos para separacin de protenas Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga, tamao o afinidad de las diferentes protenas. Uno de los mtodos ms habitualmente utilizados para la separacin de protenas es la cromatografa en columna, aunque tambin existe la cromatografa en papel y en placa. La columna est rellena con un material slido con las caractersticas qumicas adecuadas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace pasar a travs de la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase mvil. Cada protena migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidad por la fase estacionaria. Generalmente estas cromatografas se realizan de una forma semiautomtica, la fase mvil se hace pasar a la columna a travs de una bomba peristltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto nmero de gotas o de volumen. Despus hay que localizar en que tubo o tubos est la protena que se pretende purificar. Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos: o La filtracin o exclusin molecular o El cromatografa de intercambio inico o La cromatografa hidrofbica

o La cromatografa de afinidad a. Filtracin en gel o cromatografa de exclusin molecular. La fase estacionaria esta constituida por partculas de polmeros de diferente porosidad. La separacin se basa en el tamao de las partculas. Las protenas ms grandes que no pueden penetrar en los poros de las partculas de la matriz de filtracin son eluidas con ms rapidez que las protenas ms pequeas que penetran por los poros de las partculas y siguen un camino ms tortuoso y ms largo. El tamao de los poros internos depende de la naturaleza del polmero en cuestin, y permite la entrada a protenas por debajo de un determinado peso molecular.

b.

Cromatografa de intercambio inico. En ella, la columna est rellena con un

soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aninico) o negativamente (intercambio catinico). Estos grupos cargados normalmente estn neutralizados por iones del tampn. Estos iones son reversiblemente reemplazados

por las protenas con ms tendencia a unirse al soporte. Las protenas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catinicos o aninicos dependiendo de su carga neta. Las protenas ms cargadas se unirn ms fuertemente al intercambiador y por lo tanto sern ms difciles de eluir. La afinidad con la que una protena se une a un intercambiador inico depende de la fuerza inica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la protena y los iones de la fase mvil. Una vez pegadas las protenas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza inica de la fase mvil (aumentando la concentracin de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las protenas mas dbilmente retenidas y cuando la fuerza inica sea mayor saldrn las protenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas.

c. Cromatografa hidrofbica. Se trata de un mtodo similar al anterior con la nica diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofbica), es decir, la protena se pega al soporte por los resto de aminocidos apolares, cuanto ms residuos de este tipo tenga en su superficie, ms apolar ser, ms se retendr en la columna y se eluir ms tarde. En este caso a elusin se realiza aumentando la apolaridad de fase mvil. d. Cromatografa de afinidad.

Muchas protenas tienen la capacidad de unirse especficamente a ciertas molculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta tcnica la molcula que se une especficamente a la protena se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de protenas se aplica a la columna, la protena buscada se unir al ligando inmovilizado mientras que las dems saldrn de la columna con el tampn. En este caso tambin se utiliza el incremento de fuerza inica para eluir las protenas.

Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatogrficos tales como el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta presin (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altas presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de purificacin y utilizan fases estacionarias con mayor poder de retencin, lo que se incrementa los porcentajes y rendimiento de las purificaciones.

3. Mtodos electroforticos Para comprobar si la protena de inters se ha separado del resto, es decir si la protena est pura, se requieren las tcnicas electroforticas. La electroforesis de protenas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en funcin de la concentracin de acrilamida. Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de las protenas es un campo elctrico, y el gel acta como filtro molecular, ralentizando la migracin de las protenas en funcin de su relacin carga/masa. A diferencia de lo que ocurra en la cromatografa de filtracin, en las electroforesis las protenas mayores son retardadas y se mueven ms lentamente a travs del gel, ay que las va frenando el tamao del poro y las protenas ms pequeas avanzan ms rpidamente. En la figura vemos un tpico aparato de electroforesis. El gel se encuentra entre dos placas (normalmente de vidrio). La colocacin de un peine de electroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formacin de unos pocillos, donde se colocarn posteriormente y una vez retirado el peine, las muestras, que se desplazarn por calles paralelas al aplicar el campo elctrico.

Las muestras de protena se disuelven en una pequea cantidad de una solucin tampn, que contiene glicerol, que hace que la muestra se site en el fondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeo peso molecular que nos indica migracin del frente. El tampn de electroforesis cierra el circuito entre el ctodo (+) y el nodo (-). El sistema se conecta a una fuente de alimentacin y las protenas migran hacia el polo positivo, situado en la base del gel. Despus el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presencia del colorante adecuado (azul de Coomassie), que tie por completo el gel. A continuacin se destie con una disolucin de etanol/actico y el gel queda transparente y las bandas de protenas quedan teidas de color azul.

Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas las protenas se separan en funcin de su carga/masa; y en condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente, el SDS (dodecil sulfato sdico). El SDS es un detergente aninico, que se une a todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que stas se separan solo en funcin de su masa e independientemente de su carga. El nico inconveniente de esta tcnica es que el SDS desnaturaliza las protenas y las protenas multimricas se separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS adems de permitir calcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas, nos indican las distintas subunidades que posee la protena. Generalmente la protena inters se analizan incluyendo calles con marcadores moleculares, que son protenas de peso molecular conocido que nos permiten determinar el peso molecular de la cadena polipeptdica, como se muestra en la siguiente figura. En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido, en la calle 2 se encuentra la protena sujeta a estudio, de tal manera que se puede hacer una relacin lineal entre el Log del peso molecular de las protenas y la distancia que recorren en el gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente). La siguiente figura nuestra la diferencia entre la electroforesis nativa (NATIVAPAGE) y la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Como se aprecia en la figura una banda en la Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si la protena tiene varias subunidades de distinto peso molecular, o bien en una banda de menor peso molecular, si las subunidades poseen el mismo peso molecular. De la figura se deduce que, la protena est pura (pues solo aparece un banda) y que adems posee 2 subunidades de 15000 g/mol (o lo que es lo mismo 15 kDa ) cada una.

4)

Por qu la extraccin de gelatina a partir de los huesos de vacuno involucra una desmineralizacin? por que se realiza en medio acido? La desmineralizacin del hueso a travs del tratamiento intermedio con cido clorhdrico diluido, en procesos de corriente inversa a bajas temperaturas por varios das, remueve el fosfato contenido en el hueso. Este procedimiento es conocido como maceracin, el hueso calibrado desmineralizado se denomina osena. Al final los cidos excedentes son retirados a travs de un lavado intensivo. Los huesos se tratan con una solucin cida para extraer los minerales (fosfato de calcio) sin afectar los contenidos orgnicos. Despus de un lavado, este producto llamado osena, se vuelve flexible. Los fosfatos se separan por precipitacin con cal.

La osena y las pieles se procesan con cidos para su hidrlisis a temperatura ambiente por un tiempo relativamente corto. Por otra parte, los cueros y la osena se ponen en contacto con una solucin de cal durante 5 a 10 semanas a temperatura ambiente. Luego se ajusta al pH requerido para la extraccin de gelatina propiamente dicha. 5) Qu es el grado Bloom en gelatinas y cual es la metodologa para medirlo? Un criterio importante para determinar la calidad de la gelatina es el llamado valor Bloom que generalmente est entre 50 y 300. Con este valor se determina la estabilidad y el poder de gelificacin de la gelatina. Cuanto ms alto sea el valor Bloom tanto ms alta es la intensidad de gelificacin. ndice de Bloom o Resistencia de Gel. El Bloom es la medida de fuerza necesaria para formar una depresin de 4 mm por medio de un mbolo de 12.7 mm de dimetro en una solucin al 6.66% de gelatina mantenido a 10C x 18. La tcnica es la siguiente: Se aplica a aquellas preparaciones gelificadas a 10C y maduradas durante 16 a 18 horas, y corresponden al peso en gramos, necesarios para obtener un hundimiento de 4 mm. En el gel de un pistn cilndrico de 12.7 mm. De dimetro geomtricamente definido.