UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA

INFLUÊNCIA DO METANOL E DO ETANOL SOBRE A

ATIVIDADE E A EXPRESSÃO GÊNICA DAS

ECTONUCLEOTIDASES E ACETILCOLINESTRASE EM

CÉREBRO DE ZEBRAFISH (Danio rerio)

EDUARDO PACHECO RICO

Orientadora:

Prof. Dra. CARLA DENISE BONAN

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas –

Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul

para obtenção do título de mestre em Bioquímica

Porto Alegre

2007

ii

Agradecimentos

Aos meus pais, pela educação, amor, apoio e incentivo, fundamentais para a minha

formação.

Aos meus irmãos Gustavo e Maurício, pelo forte companheirismo, e acima de tudo a

amizade que existe entre nós.

À minha orientadora Carla, pela oportunidade e confiança dedicada à minha capacidade

desde a minha iniciação científica, pelo seu exemplo de profissionalismo, pelo agradável

convívio e amizade durante estes anos.

Aos professores, Renato Dutra Dias, Maurício Reis Bogo e Maria da Graça Fauth, pela

riqueza no convívio ajuda na minha formação acadêmica e pessoal.

Ao Mário, Marcelo e Denis e Giovana pela participação fundamental na realização deste

estudo e a todo pessoal do Laboratório Neuroquímica e Psicofarmacologia da PUCRS

pelo ótimo ambiente de trabalho.

A todos meus verdadeiros amigos e a todas as pessoas que de algum modo contribuíram

pelo meu desenvolvimento como ser humano.

Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRGS, pelo nível

de qualificação em pesquisa, e ao CNPq pela bolsa concedida para a realização deste

trabalho.

iii

Índice

Parte I

I.1. Resumo.........................................................................................................................2

I.2. Abstract........................................................................................................................3

I.3. Lista de Abreviaturas...................................................................................................4

I.4. Introdução

I.4.1. Zebrafish........................................................................................................6

I.4.2 Sinalização colinérgica...................................................................................9

I.4.3 Acetilcolinesterase (AChE; E.C.3.1.1.7)......................................................10

I.4.4 Sinalização purinérgica................................................................................12

I.4.5 Ectonucleotidases.........................................................................................15

I.4.6. Metanol........................................................................................................17

I.4.7 Etanol............................................................................................................19

I.5. Objetivos....................................................................................................................22

Parte II

II.1. Capítulo 1 – RICO, E.P., ROSEMBERG, D.B., SENGER, M.R., ARIZI M.DE B.,

BERNARDI, G.F., DIAS, R.D., BOGO, M.R., BONAN, C.D. Methanol alters ecto-

nucleotidases and acetylcholinesterase in zebrafish brain (2006). Neurotoxicology and

Teratology, 28(4), 489-496…….......................................................................................24

iv

II.2. Capítulo 2 – RICO, E.P., ROSEMBERG, D.B., DIAS, R.D., BOGO, M.R.,

BONAN, C.D. Ethanol alters acetylcholinesterase activity and gene expression in

zebrafish brain. (artigo submetido ao periódico Neurotoxicology and

Teratology).......................................................................................................................33

II.3. Capítulo 3 –RICO, E.P., ROSEMBERG, D.B., SENGER, M.R., ARIZI M.DE

B., DIAS, R.D., SOUTO, A.A., BOGO, M.R., BONAN, C.D. Ethanol and acetaldehyde

alters NTPDase and 5’-nucleotidase from zebrafish brain membranes. (artigo submetido

ao periódico Neurochemstry International).....................................................................55

Parte III

III.1. Discussão.................................................................................................................86

III.1.1. Considerações gerais............................................................................................86

III.1.2. Efeito in vivo do metanol e etanol sobre ectonucleotidases e AChE........86

III.1.3. Efeito in vitro metanol e etanol sobre ectonucleotidases e AChE............89

III.2. Conclusão final........................................................................................................92

Referências Bibliográficas................................................................................................93

Anexos............................................................................................................................110

1

Parte I

2

I.1. Resumo O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica, onde pode agir em receptores específicos localizados na membrana celular denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ecto-nucleotidases. Dentre este grupo de enzimas, destacam-se as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5’-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso, já foi descrito na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. A acetilcolina é um neurotransmissor secretado pelos nervos colinérgicos terminais, juntamente com o ATP. Após exercido seu sinal nos receptores nicotínicos e muscarínicos, a acetilcolina é inativada pela ação de uma enzima denominada acetilcolinesterase (AChE), que hidrolisa a acetilcolina até colina e acetato. O gene da AChE já foi clonado e seqüenciado e esta atividade enzimática foi detectada em cérebro de zebrafish. O metanol é um composto neurotóxico responsável por sérios danos ao SNC. Além de ser encontrado como um contaminante ambiental, este álcool é também empregado como componente de soluções crioprotetoras para embriões de zebrafish. Os efeitos do consumo agudo de etanol exercem uma variedade de modificações como coordenação motora, percepção sensorial e cognição. O etanol promove diversas alterações bioquímicas e fisiológicas em células do sistema nervoso central. Portanto, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo dos álcoois metanol e etanol sobre as ectonucleotidases e acetilcolinesterase em SNC de zebrafish. Após o tratamento agudo com metanol a 0,5 e 1,0% houve uma redução significativa na hidrólise de ATP e ADP. Entretanto, não foram verificadas alterações na atividade da ecto-5´-nucleotidase em cérebro de zebrafish. Uma inibição significativa na atividade da AChE foi observada na faixa de 0,25 a 1,0% de exposição ao metanol. Quatro seqüências de NTPDase foram identificadas através de uma análise filogenética, na qual uma é similar a NTPDase1 e as outras a NTPDase2. O metanol foi capaz de inibir os transcritos para a NTPDase1, duas isoformas da NTPDase2 e AChE. Metanol a 1,5 e 3,0% inibiu in vitro a hidrólise de ATP, e a hidrólise de ADP somente a 3,0%. No entanto, a hidrólise de AMP e a atividade da AChE não foram alteradas. A exposição ao etanol a 0,5 e 1,0% diminuiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto que a atividade da AChE apresentou um aumento significativo a 1,0%. Nenhuma alteração foi observada na atividade da ecto-5’-nucleotidase. Etanol in vitro a 0,5 e 1,0% não alterou a hidrólise de ATP, ADP e a atividade da AChE, mas a hidrólise de AMP foi inibida. Acetaldeído in vitro, na faixa de 0,5-1,0%, inibiu a hidrólise de ATP e ADP, mas a hidrólise de AMP e acetiltiocolina foi reduzida a 0,25, 0,5 e 1,0%. Acetato in vitro não alterou a atividade destas enzimas. O tratamento com etanol reduziu os níveis de mRNA para AChE, NTPDase1 as três isoformas de NTPDase2. Estes resultados demonstram que a intoxicação aguda por metanol e etanol pode influenciar as enzimas envolvidas na degradação dos neurotransmissores ATP e acetilcolina, sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico podem ser alvos para os efeitos neurotóxicos destes álcoois.

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I.2. Abstract Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. In the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors named purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5’-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDases and ecto-5’-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter secreted by the cholinergic nerve endings and ATP is co-released with ACh. After exerts its signaling on nicotinic e muscarinic receptors, ACh is inactivated through an enzyme named acetylcholinesterase (AChE), that can hydrolyze ACh into choline and acetate. The AChE gene is already cloned and sequenced and this enzyme activity was detected in zebrafish brain. Methanol is a neurotoxic compound responsible for serious damage on CNS. Besides it can be found as an environmental contaminant, this alcohol is also employed as a component of cryoprotector solutions for zebrafish embryos. The effects of acute ethanol consumption promote several changes related to motor coordination, sensory perception and cognition. Ethanol promotes many biochemical and physiological alterations on nervous cells. Therefore, we investigated the in vitro and in vivo effect of alcohols methanol and ethanol on ectonucleotidases and acetilcholinesterase in CNS of zebrafish. After acute treatment, there was a significant decrease of ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%. However, no significant alteration on ecto-5´-nucleotidase activity was verified in zebrafish brain. A significant inhibition on AChE activity was observed in the range of 0.25 to 1.0% methanol exposure. Four NTPDase sequences were identified from phylogenetic analyses, which one is similar to NTPDase1 and the others to NTPDase2. Methanol was able to inhibit NTPDase1, two isoforms of NTPDase2 and AChE transcripts. Methanol inhibited in vitro ATP hydrolysis at 1.5 and 3.0% and ADP hydrolysis only at 3.0%. Nevertheless, AMP hydrolysis and AChE activity were not changed. Ethanol exposure decreased ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%, while the AChE activity presented a significant increased at 1.0%. No changes on ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro did not alter ATP, ADP hydrolysis and AChE activity, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5 and 1.0%. Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but AMP and acetylthiocholine hydrolysis were reduced at 0.25, 0.5 and 1.0%. Acetate in vitro did not alter these enzyme activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´-nucleotidase was performed. Ethanol treatment reduced AChE, NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA levels. These results demonstrate that acute methanol and ethanol intoxication may influence the enzymes involved in the degradation of neurotransmitters ATP and ACh, suggesting that the purinergic and colinergic system can be a target to the neurotoxic effects of these alcohols.

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I.3. Lista de Abreviaturas

Acetil CoA – acetil coenzima A

ACh – acetilcolina

AChE – acetilcolinesterase

ADH – álcool desidrogenase

ADP – adenosina 5’-difosfato

ALDH – aldeído desidrogenase

AMP – adenosina 5’-monofosfato

AMPc – adenosina 3’,5’- monofosfato cíclico

ASCh – acetiltiocolina

ATP – adenosina 5’-trifosfato

BuChe – butirilcolinesterase

CD73 – proteína de superficie de linfócitos

CHAT – acetilcolina transferase

CYP2E1 – citocromo P450

E-NPP – ecto-nucleotídeo pirofosfatase

ERK – cinases reguladas por sinalização extracelular

FSH – hormônio folículo estimulante

G6PD – glicose-6-fosfato desidrogenase

GABA – ácido γ-aminobutírico

GPI – glicosil-fosfatidilinositol

GTP – guanosina 5’-trifosfato

KM – constante de Michaelis

LC50 – concentração letal 50

5

LDH – lactato desidrogenase

NAD+ – nicotinamida adenina dinucleotídeo

NTPDase – nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase

MAP – proteína cinase ativada por mitógeno

mRNA – RNA mansageiro

PKC – proteína cinase C, proteína cinase dependente de AMP cíclico

SNC – sistema nervoso central

SNP – sistema nervoso periférico

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I.4. Introdução

I.4.1. Zebrafish

O Zebrafish ou peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo (3-4 cm) da

família Cyprinidae, sendo uma espécie bastante conhecida pelo seu uso como peixe

ornamental (Figura 1). O pioneiro a estudar esta espécie foi George Streisinger que, no final

da década de 60, aplicou as técnicas de análise mutacional para estudar o desenvolvimento

embrionário do zebrafish (GRUNWALD & EISEN, 2002). Atualmente, este peixe é um

modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, tais como: genética e

genômica, desenvolvimento, teratologia, comportamento, toxicologia e neurociências

(VASCOTTO et al., 1997). Este peixe possui diversas características favoráveis, tais como:

pequeno custo e espaço requerido para manutenção, rápido desenvolvimento e ciclo

biológico, grande prole e embriões translúcidos e suscetíveis à manipulação e microinjeção

(LELE & KRONE, 1996). O interesse pela espécie pode ser observado pelo número

crescente de laboratórios que tem utilizado este teleósteo como um modelo experimental

em suas pesquisas (SPRAGUE et al., 2001). Foi criada uma rede de informações na web

sobre o zebrafish (http://zfin.org), na qual laboratórios do mundo inteiro podem depositar

informações sobre esta espécie (SPRAGUE et al., 2003). Além disso, existe um excelente,

compreensivo e freqüentemente atualizado manual de manutenção e controle das condições

em laboratórios para este teleósteo (WESTERFIELD, 2000).

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Figura 1: Zebrafish (Danio rerio)

Nos últimos anos, houve um progresso considerável na genética e genômica do

zebrafish. Em 2001, o Instituto Sanger iniciou o seqüenciamento do genoma total (VOGEL,

1992; STERN & ZON 2003), e o genoma mitocondrial já está seqüenciado, servindo de

base para estudos filogenéticos (BROUGHTON et al., 2001). O estudo do genoma do

zebrafish pode servir como um complemento funcional para o projeto genoma humano, o

qual produz enormes quantidades de seqüências, mas carece de informações funcionais

para a maioria dos genes identificados (DOOLEY & ZON, 2000). Além disso, grandes

segmentos dos cromossomos do zebrafish estão em sintonia com os cromossomos humanos

e de camundongo, e muitos genes apresentam um alto grau de similaridade, quando

comparados em sua seqüência (BARBAZUK et al., 2000).

O zebrafish se tornou o principal modelo experimental para o estudo do

desenvolvimento de vertebrados (ANDERSON & INGHAM, 2003). As características

básicas de sua embriogênese são bem conhecidas, assim como o destino celular durante o

seu desenvolvimento (KIMMEL & WARGA, 1988; KIMMEL, 1989). Atualmente, um

amplo espectro de estudos sobre o desenvolvimento de diversos sistemas, órgãos e

patologias relacionadas são realizados nesta espécie (DODD et al., 2000; ACKERMANN

& PAW, 2003). Comparando-se as seqüências do genoma humano e de zebrafish, muitos

genes como os do ciclo celular, supressores tumorais e oncogenes se mostram conservados

8

(AMATRUDA et al., 2002). Já foram observados muitos tipos de neoplasias no zebrafish,

as quais são semelhantes histologicamente e geneticamente com as de humanos, o que

mostra que a biologia do câncer é muito similar nestes organismos (AMATRUDA et al.,

2002; STERN & ZON, 2003). Além disso, animais transgênicos podem ser gerados com

alterações em genes específicos envolvidos no câncer (LONG et al., 1997).

Recentemente, estudos avaliando características comportamentais do zebrafish

foram desenvolvidos (GUO, 2004; GERLAI et al, 2000). A maioria dos trabalhos avaliou o

efeito de pesticidas, drogas e xenobióticos na atividade comportamental desta espécie

(LEVIN & CHEN, 2004; SWAIN et al., 2004). Alguns estudos também observaram a

importância do comportamento inato e adquirido em modelos de agressividade,

sociabilidade e sua preferência por ambientes claros ou escuros (SERRA et al., 1999).

Devido às vantagens de se usar o zebrafish como modelo experimental, o efeito

agudo e crônico de diversas substâncias tóxicas pode ser avaliado facilmente. Devido ao

pequeno espaço requerido por estes animais, uma quantidade menor de toxinas é

empregada nos testes toxicológicos (YAMAZAKI et al., 2002).

Atualmente, muitos estudos são realizados nesta espécie para estudar as bases

moleculares da neurobiologia, identificando genes envolvidos na formação de circuitos

neuronais, no comportamento e nos mecanismos envolvidos na neuropatogênese

(VASCOTTO et al., 1997; GUO, 2004). Muitos sistemas de neurotransmissão já foram

identificados no zebrafish tais como: glutamatérgico (EDWARDS & MICHEL, 2002),

colinérgico (BEHRA et al., 2002; CLEMENTE et al., 2004), dopaminérgico (BOEHMLER

et al., 2004), serotoninérgico (RINK & GUO, 2004), histaminérgico (KASLIN &

PANULA, 2001), gabaérgico (KIM et al., 2004) e purinérgico (KUCENAS et al., 2003;

RICO et al., 2003; SENGER et al., 2004).

9

I.4.2. Sinalização colinérgica

A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor clássico que desempenha diversas

funções no SNC e SNP, sendo sintetizada pela reação catalisada pela colina

acetiltransferase (ChAT; EC 2.3.1.6).

Sua síntese ocorre a partir de Acetil CoA, formada durante o metabolismo celular

mitocondrial, e da colina, um importante produto do metabolismo dos lipídios. A etapa

final da síntese da ACh ocorre no citoplasma, sendo o neurotransmissor transportado para o

interior de vesículas sinápticas (KAPCZINSKI et al., 2000). A colina usada na síntese de

ACh pode vir diretamente da reciclagem da ACh, que é hidrolisada pela AChE na fenda

sináptica ou a partir da fosfatidilcolina. Essas duas fontes de colina são particularmente

importantes para o SNC, porque a colina presente no plasma não ultrapassa a barreira

hemato-encefálica (TAYLOR & BROWN, 1994).

A liberação de ACh depende das variações no potencial elétrico das membranas dos

terminais nervosos e este processo é dependente da concentração de cálcio intracelular

(BRADFORD, 1986). A ACh é um neurotransmissor de fundamental importância nas

funções desempenhadas pelo córtex cerebral. Esse transmissor tem sido associado com as

funções cognitivas, o processamento das funções sensoriais, com a organização cortical de

movimento e com o controle do fluxo sanguíneo cerebral (SCREMIM et al., 1997). A ação

excitatória ou inibitória da ACh depende da via nervosa que é estimulada (BRADFORD,

1986). Além de sua ação neurotransmissora, a ACh possui função neuromoduladora, pois

os níveis da mesma podem regular a concentração de outros neurotransmissores no cérebro

(COOPER et al., 1991).

10

Os efeitos intracelulares da acetilcolina são mediados pela ativação de receptores

colinérgicos nicotínicos e muscarínicos (BURGEN, 1995). No SNC, existem evidências de

que estes receptores estejam estão envolvidos no controle motor cardiovascular, na

regulação da temperatura e na memória (CAULFIELD & BIRDSALL, 1998). Quando

ativado, o receptor poderá abrir ou fechar canais de K+, Ca2+ ou Cl-, dependendo do tipo de

célula. A estimulação dos receptores muscarínicos conduzirá à despolarização ou

hiperpolarização da membrana. A estimulação dos receptores muscarínicos também é capaz

de inibir a enzima adenilato ciclase e ativar a enzima fosfolipase C (COOPERR et al.,

1991).

Os receptores nicotínicos para a acetilcolina consistem de cinco subunidades

designadas α, β, γ e δ, sendo que a subunidade α é espressa em duas formas. Estudos

estruturais mostram que as subunidades estão arranjadas ao redor de uma cavidade central,

com uma grande porção de proteína voltada para a superfície extracelular. A ACh se liga

normalmente a subunidade α, produzindo mudanças conformacionais, que permitem a

passagem, principalmente de cátions. A desensibilização do receptor aumenta quando o

mesmo é fosforilado por proteína quinase dependente de AMPc, PKC ou tirosina quinase

(COOPER et al, 1991).

I.4.3. Acetilcolinesterase (AChE; E.C.3.1.1.7)

As colinesterases hidrolisam a ACh na fenda sináptica e são enzimas que

desempenham um papel muito importante na neurotransmissão colinérgica, além de outras

funções fisiológicas. Elas são classificadas de acordo com suas propriedades catalíticas,

11

especificidade de inibidores e distribuição nos tecidos: a AChE é encontrada,

principalmente nas sinapses do SNC, SNP parassimpático e junção neuromuscular; e a

butirilcolinesterase (E.C. 3.1.1.8, BuChe) encontrada no plasma, no intestino e em outros

tecidos (MASSOULIÉ & BOM, 1982). A AChE é uma importante enzima regulatória que

controla a transmissão de impulsos nervosos através da sinapse colinérgica pela hidrólise

do neurotransmissor excitatório ACh (MILATOVIC & DETTBARN, 1996). A AChE é

uma serina hidrolase que desempenha um papel essencial no mecanismo colinérgico,

catalisando a hidrólise natural do substrato acetilcolina em acetato e colina (QUINN, 1987).

A seqüência de aminoácidos da AChE mostrou que serina, histidina e glutamato são

resíduos importantes para a atividade catalítica (SUSSMAN et al, 1991). Os níveis de

AChE parecem ser controlados pela interação da ACh com seus receptores; quando a

interação é acentuada, aumentam os níveis de AChE. No entanto, a AChE pode ser usada

como um marcador da função colinérgica, e mudanças na atividade da enzima podem

indicar alterações na disponibilidade de ACh e do nível de seus receptores (FERNANDES

& HODGES-SAVOLA, 1992).

ARENZANA et al., 2005 estudaram o desenvolvimento do sistema colinérgico em

cérebro e retina de zebrafish, sendo também mostrado através de análise histoquímica e

imunohistoquímica em SNC desta espécie (CLEMENTE et al., 2004). O gene da AChE já

foi clonado e sequenciado, e sua atividade enzimática já foi detectada no cérebro

(BERTRAND, et al., 2001). Este peixe apresenta uma única situação entre os vertebrados,

pois a BuChE, responsável pela hidrólise de butirilcolina, não está presente no seu

genoma. Além disso, subunidades de receptores muscarínicos e nicotínicos também são

expressos nesta espécie (ZIRGER, et al., 2003).

12

I.4.4. Sinalização purinérgica

O ATP foi descrito inicialmente como neurotransmissor através dos estudos que

mostravam a sua liberação a partir de nervos sensoriais (HOLTON & HOLTON, 1954 e

HOLTON, 1959). Entretanto, sua ação como neurotransmissor só foi reconhecida pelos

estudos realizados pelo grupo de Geoffrey Burnstock e colaboradores, que desenvolveu a

hipótese purinérgica (BURNSTOCK et al., 1970; BURNSTOCK, 1972). O ATP pode ser

armazenado e liberado para o meio extracelular juntamente com outros neurotransmissores,

tais como: acetilcolina, glutamato, norarenalina, serotonina e GABA (BURNSTOCK,

1999; BURNOSTOCK, 2004) através de vesículas pré-sinápticas dependentes de cálcio,

(PHILLIS & WU, 1982). DOWDALL et al. (1974) demonstraram que o ATP pode ser

estocado, junto com acetilcolina, nas vesículas sinápticas dos terminais nervosos

colinérgicos de órgão elétrico de Torpedo marmorata.

No sistema nervoso central e periférico, o ATP age como neurotransmissor

excitatório e possivelmente como neuromodulador (CUNHA & RIBEIRO, 2000;

SALGADO et al., 2000). Os nucleotídeos e o nucleosídeo da adenina podem exercer seus

efeitos através da ativação de receptores purinérgicos subdivididos em dois grandes grupos:

P1 e P2. Os purinoreceptores do tipo P1 são mais eficientemente ativados por adenosina,

enquanto que os purinoreceptores P2 são ativados por ATP (RALEVIC & BURNSTOCK,

1998). Estes receptores são denominados purinoceptores P2 e são divididos em duas

subclasses, os receptores ionotrópicos P2X, que são canais iônicos dependentes de ligantes,

e os receptores metabotrópicos P2Y, que são acoplados à proteína G. Membros de ambos

tipos de receptores são distribuídos no SNC e SNP e estão envolvidos em uma miríade de

funções (BARNARD et al., 1997, BURNSTOCK & KNIGTH, 2004).

13

A clonagem e caracterização molecular dos subtipos dos receptores P2X do

zebrafish já foram realizadas (DIAZ-HERNANDEZ et al., 2002; BOUÉ-GRABOT et al.,

2000; EGAN et al., 2000; NORTON et al., 2000). A análise da seqüência de nove genes

sugere que cinco deles são ortólogos a genes dos receptores P2X de mamíferos, dois são

parálogos e um ainda precisa ser devidamente classificado (KUCENAS et al., 2003). Todos

os subtipos de receptores P2X do zebrafish contêm resíduos altamente conservados, os

quais são encontrados nas subunidades de mamíferos. Até o momento, na família de

receptores P2Y foram identificadas oito proteínas que possuem respostas funcionais

(RALEVIC & BURNSTOCK, 1998; LAZAROWSKI et al., 2003; ILLES & RIBEIRO,

2004). Também existem evidências que os receptores P2Y estão envolvidos na transdução

de sinal mediada por proteínas ligantes de GTP e proteínas quinases como a PKC, MAP,

ERK1 e 2 (COMMUNI et al., 2000; BOEYNAEMS et al., 2000). Entretanto, até o

momento, somente foram identificados receptores P2Y1 em trombócitos de zebrafish

(GREGORY & JAGADEESWARAN, 2002).

A ação sinalizadora dos nucleotídeos é terminada por uma cascata de enzimas

localizadas na superfície celular. No caso da degradação extracelular do ATP, o produto

final é o neuromodulador adenosina. Esta degradação pode inativar a sinalização mediada

pelo ATP através dos receptores P2 e aumentar a sinalização mediada pela adenosina

através dos receptores P1 (KATO et al., 2004).

A adenosina é uma substância que pode ser formada nos espaços intracelular e

extracelular. No meio extracelular esta purina se comporta como uma molécula

sinalizadora, influenciando a transmissão sináptica e a atividade do sistema nervoso central

(RIBEIRO et al., 2003). Sua formação intracelular é devido a ação, principalmente, da

enzima 5’-nucleotidase que hidrolisa AMP à adenosina e da hidrólise do substrato S-

14

adenosil-homocisteína pela S-adenosil-homocisteína hidrolase. A adenosina gerada

intracelularmente pode ser transportada ao espaço extracelular através de transportadores

bidirecionais, por um mecanismo de difusão facilitada que regula os níveis intracelulares e

extracelulares deste nucleosídeo (FREDHOLM et al., 2001). Entretanto, a adenosina não é

considerada um neurotransmissor, pois não há indícios de que é armazenada em vesículas

sinápticas (BRUNDEGE & DUNWIDDIE, 1997; RIBEIRO et al., 2003).

A adenosina atua como um importante modulador sináptico no sistema nervoso

central (DUNWIDDIE E MASINO, 2001). Suas ações são exercidas através de um grupo

de receptores, que estão divididos em quatro subtipos: A1, A2A, A2B e A3. Grande parte do

conhecimento sobre a distribuição e funcionalidade destes receptores corresponde aos

receptores de baixa afinidade A1 e A2A. Os receptores A1 e A2 são acoplados à proteína G

inibitória e estimulatória, respectivamente, porém estudos evidenciam que estes receptores

podem ser acoplados a outras proteínas G (FREDHOLM et al., 2001). Estudos têm

demonstrado que a adenosina formada a partir dos nucleotídeos da adenina age

preferencialmente nos receptores A2A e a adenosina liberada como tal preferencialmente

age sobre os receptores A1 (CUNHA, 2001).

A adenosina está envolvida nos efeitos comportamentais e neuronais induzidos pelo

etanol (DOHRMAN et al., 1997). Diversos estudos demonstraram que o etanol altera a

função neuronal por modificar rotas de transdução de sinais mediadas por hormônios e

neurotransmissores. Estudos em cultura de células neurais demonstraram que o etanol,

através da ativação dos receptores A2A, estimula a sinalização mediada pela via da

adenosina monofosfato cíclico/protein kinase A (AMPc/PKA) e a expressão gênica

mediada pelo elemento regulator de AMPc e que este efeito é bloqueado pela subunidades

beta e gama da proteína G inibitória (AROLFO et al., 2004).

15

I.4.5. Ectonucleotidases

A sinalização mediada por nucleotídeos extracelulares necessita de mecanismos

eficientes para a inativação de seu sinal. Muitos estudos evidenciaram a presença de uma

variedade de enzimas localizadas na superfície celular denominadas ectonucleotidases, que

são capazes de hidrolisar, e assim, controlar os níveis de nucleotídeos para os receptores P2

quanto de nucleosídeos para os receptores P1 (BONAN et al., 2001; SEVIGNY et al.,

2002).

Este conjunto de enzimas inclui a família das E-NPP (ectonucleotídeo

pirofosfatase/fosfodiesterase), a família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato

difosfoidrolase), as fosfatases alcalinas e a ecto-5’-nucleotidase (EC 3.1.3.5) (ROBSON et

al., 2006).

A família das E-NPPs consistem em sete membros localizados tanto na superfície

celular quanto secretadas. Estas proteínas hidrolisam ligações fosfato ou fosfodiéster de

moléculas como nucleotídeos e dinucleotídeos (NPP1-3), (liso)fosfolipídios (NPP2) e

ésteres de colina fosfato (NPP6 e NPP7) (STEFAN et al., 2005).

Na família das NTPDases, já foram descritas até o momento em mamíferos oito

membros, que foram clonados e caracterizados (ZIMMERMANN, 2001; BIGONNESSE

et al., 2004). As NTPDases1, 2, 3 e 8 possuem seus sítios catalíticos voltados para a

superfície celular. Já os outros membros (NTPDase 4-7) possuem seu sítio catalítico

voltados para o lúmen de organelas intracelulares, como o sistema de Golgi, o retículo

endoplasmático e/ou vacúolos lisossomais/autofágicos. As NTPDases 5 e 6 também podem

ser encontradas na membrana plasmática e possivelmente secretadas por clivagem

proteolítica (ZIMMERMANN, 2001). Esta família de enzimas possui uma topologia de

16

membrana comum com dois domínios transmembrana e uma alça extracelular, contendo

cinco domínios denominadas ACRs (regiões conservadas da apirase) (ZIMMERMANN,

2001). Estas enzimas possuem uma ampla especificidade de substrato, hidrolisando

nucleotídeos púricos e pirimídicos. Para a sua atividade catalítica máxima, estas enzimas

necessitam de cátions divalentes, como cálcio e magnésio e um pH alcalino. Na maioria dos

casos, os valores de KM para ATP e ADP estão geralmente na ordem micromolar

(PLESNER, 1995, ZIMMERMANN, 2001).

A ecto-5’-nucleotidase, também conhecida como a proteína linfocitária CD73

hidrolisa nucleotídeos 5’-monofosfatatos púricos e pirimídicos aos respectivos

nucleosídeos. Esta atividade enzimática é dependente de cátions divalentes, como cálcio e

magnésio. A ecto-5’-nucleotidase é uma enzima ancorada à membrana plasmática por GPI,

sendo que formas solúveis da enzima podem ser originadas mediante a ação de uma

fosfolipase específica (ZIMMERMANN, 1992). Esta enzima encontra-se presente na

maioria dos tecidos e sua principal função é a hidrólise de nucleosídeos monofosfatados

extracelulares, tais como AMP, GMP ou UMP, a seus respectivos nucleosídeos, sendo o

AMP o nucleotídeo hidrolisado com maior eficiência com valores de KM na faixa de

micromolar (ZIMMERMANN, 1996). O ATP e o ADP são inibidores competitivos da 5’-

nucleotidase com valores de Ki também na faixa de micromolar (ZIMMERMANN, 1996).

Em SNC, a ecto-5’-nucleotidase está predominantemente associada à glia, mas várias

evidências têm demonstrado que esta atividade também está associada a neurônios

(ZIMMERMANN, 1996; ZIMMERMANN et al., 1998; ZIMMERMANN, 2001).

Outra família de enzimas pertencentes ao grupo das ecto-nucleotidases são as

fosfatases alcalinas (EC 3.1.3.1). Estas enzimas catalisam a hidrólise de monoésteres de

ácido fosfórico e também catalisam a transfosforilação na presença de altas concentrações

17

de aceptores de fosfato. As fosfatases alcalinas são enzimas homodiméricas e cada sítio

catalítico contém três íons metálicos, dois Zn e um Mg, necessários para a atividade

enzimática (Millán, 2006).

A hidrólise extracelular de ATP por essa via resulta na formação de ADP, AMP e

do nucleosídeo adenosina, que pode agir sobre seus próprios receptores ou ser captado pela

célula e participar na rota de salvação do metabolismo das purinas (ROBSON et al., 2006).

Muitos estudos demonstraram a presença de ectonucleotidases como a ATP

difosfoidrolase (SARKIS & SALTÓ, 1991; SCHETINGER et al., 2001) e 5´-nucleotidase

(VOGEL et al., 1992; VOLKNANDT, 1991) em teleósteos. Em zebrafish, estudos do nosso

laboratório demonstraram a presença de uma NTPDase e uma ecto-5’-nucleotidase em

membranas cerebrais, apresentando um pH ótimo entre 7.2 e 8.0, um KM na faixa do

micromolar e uma ampla especificidade por outros nucleotídeos (RICO et al., 2003;

SENGER et al., 2004). Além disso, as atividades destas enzimas já foram avaliadas quanto

às ações promovidas por contaminantes ambientais, tais como pesticidas e metais pesados

(SENGER, et al., 2005; 2006a; 2006b).

I.4.6 Metanol

O metanol é um álcool bastante utilizado industrialmente como matéria prima para

diversos produtos, incluindo pesticidas, sabões, solventes e removedores (BUDVARI,

1989). Devido ao seu uso em grande quantidade, este componente pode ser encontrado em

efluentes de indústrias, sendo descrito como um importante contaminante ambiental

afetando a biota aquática (KAVIRAJ et al., 2004). Estudos têm mostrado que a exposição

ao metanol pode causar danos ao SNC de ratos no estágio de gastrulação (DEGITZ et al.,

18

2004) e é também reconhecido como uma neurotoxina capaz de causar cegueira, afetando o

nervo óptico e retina (MURRAY et al., 1991; EELLS, 1991).

A investigação dos efeitos causados pela exposição de compostos solventes ao

ecossistema tem despertado o interesse em pesquisas envolvendo a utilização de

organismos aquáticos, como espécies de peixes. Na literatura, o metanol tem sido testado

na busca de parâmetros bioquímicos para esclarecer os mecanismos da sua toxicidade.

Exposições de carpas (Cyprinus carpio) ao metanol em concentrações subletais são capazes

de induzir aumento nos níveis de cortisol, além de alterações nos níveis de proteína e

colesterol em soro (GLUTH & HANKE, 1985). Além disso, seu efeito também foi

evidenciado ao alterar o sistema endócrino de salmonídeos, inibindo a síntese e secreção de

hormônios FSH e esteróides, (DICKEY & SHANSON, 1998; GIESY et al., 2000),

mostrando sua possível capacidade de afetar o potencial reprodutivo de diversas espécies.

A perturbação de um sistema por concentrações letais de metanol pode provocar séria

toxicidade ao meio aquático, devido ao tempo que este agente tóxico leva para ser

removido através de fotoxidação e processos de biodegradação (KAVIRAJ et al., 2004).

Em 96 horas de exposição, o valor de LC50 do metanol para peixes variou entre 15,4 e 29,4

mg/L (POIRIER et al., 1986), mostrando seu poder de toxicidade ao ambiente.

O metanol é catabolizado por uma enzima álcool desidrogenase formando

formaldeído, que pode ser oxidado até formato ou ácido fórmico. O metabólito formaldeído

pode facilmente reagir, causando destruição da função de membranas, proteínas e ácidos

nucléicos (HECK & CASANOVA, 1990). A toxicidade aguda do metanol varia

amplamente entre diferentes espécies, sendo bastante alta em grupos com relativa

dificuldade em remover formato (JOLIN et al., 1987). A toxicidade ocular é caracterizada

por um seletivo acúmulo de formato na retina e humor vítreo comparado com outras

19

regiões do SNC (WALLACE et al., 1997), devido a uma possível capacidade limitada de

oxidar o formato (EELLS et al., 1994). A toxicidade promovida por este metabólito é

devido a sua capacidade de inibir a enzima citocromo oxidase, componente da cadeia

transportadora de elétrons envolvida na síntese de ATP (WALLACE et al., 1997).

O metanol tem sido testado em protocolos de vitrificação, atuando como substância

crioprotetora essencial na conservação de embriões. Seu uso vem sendo freqüente nesse

tipo de técnica, evitando a formação de cristais de gelo nos meios celulares. Apesar de o

metanol proporcionar benefícios às técnicas de criopreservação, sua adição também pode

causar injúrias celulares, podendo promover efeitos tóxicos ou teratogênicos em sistemas

biológicos (ROBLES et al., 2004). Pelo fato do zebrafish ser amplamente estudado também

na área da biologia do desenvolvimento, seu uso vem aumentando quanto à exposição dos

ovos a compostos crioprotetores no sentido de melhorar a conservação de diferentes

linhagens (ZHANG et al., 2005). O efeito deste álcool sobre diferentes atividades

enzimáticas, tais como a LDH e G6PD foi testado em embriões de zebrafish (ROBLES et

al., 2004).

I.4.7. Etanol

O consumo excessivo de álcool é um problema de saúde pública que afeta milhares

de pessoas em todo o mundo. Seu consumo abundante está associado com a ocorrência de

muitas condições patológicas, como câncer, doenças hepáticas, danos cerebrais, entre

outros. Muitos órgãos são capazes de metabolizar o etanol, mas a maior parte (mais de

90%) é metabolizada no fígado (QUERTEMONT et al., 2005). Sua eliminação é através de

uma cascata metabólica de degradação envolvendo múltiplas reações enzimáticas.

20

A principal via do metabolismo do álcool é através de duas reações enzimáticas que

requerem nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) como cofator. No primeiro passo, a

enzima álcool desidrogenase (ADH) converte o etanol em acetaldeído, reduzindo o NAD+

nesse processo. No segundo passo, o acetaldeído é metabolizado a ácido acético (acetato)

pela enzima aldeído desidrogenase (ALDH), reduzindo também NAD+ (SWIFT, 2003). Em

mamíferos, cinco classes distintas de ADH têm sido caracterizadas, apresentando diversas

características moleculares e cinéticas (REIMERS et al., 2004a). Além disso, duas classes

de ADH foram caracterizadas em zebrafish e compartilham similaridade estrutural com as

de mamíferos (REIMERS et al., 2004b), mas apresentam características funcionais

distintas.

Além da principal rota de degradação envolvendo ADH e ALDH, há duas menores

vias oxidativas para a degradação do etanol em acetaldeído: citocromo P450, (CYP2E1)

que é responsável por uma pequena parte do total metabolizado, e a catalase, capaz de

transformar etanol em acetaldeído a partir de um radical peróxido (SWIFT, 2003). Neste

contexto, acetaldeído e acetato vêm sendo investigados no sentido de esclarecer o

envolvimento dos metabólitos da degradação do etanol em respostas comportamentais e

farmacológicas (ISRAEL et al., 1994; QUERTEMONT et al., 2005). Estudos têm

demonstrado o papel do acetaldeído em diversos efeitos neuroquímicos e farmacológicos

promovidos pelo etanol. O acetaldeído, produto intermediário da ADH, é uma molécula

altamente reativa que pode formar complexos com proteínas e outros componentes

biológicos formando aductos (NIEMELA, 2001).

A utilização do zebrafish em pesquisas envolvendo drogas de abuso vem

aumentando consideravelmente, principalmente no que se refere à intoxicação por álcool.

Estudos demonstram que o etanol causa alterações neste teleósteo, tais como anormalidades

21

craniofaciais, malformações cardíacas e prejuízos no seu desenvolvimento (CARVAN 3RD

et al., 2004; REIMERS et al., 2004b; BILOTTA et al., 2004). Isso faz com que esta espécie

sirva como um importante modelo para biologia do câncer devido às diversas ações

teratogências promovidas por este composto (SCALZO & LEVIN, 2004). Recentemente, o

zebrafish tem sido utilizado com sucesso em pesquisas que envolvem as mais diversas

respostas comportamentais aos efeitos de drogas, dentre elas, o etanol. O etanol é capaz de

alterar a atividade locomotora, aprendizado, agressividade e interação social (GERLAI et

al., 2000), servindo de base para estudos genéticos, na qual linhagens de diferentes

genótipos podem ser expostas ao etanol (DLUGOS & RABIN, 2003).

Então, devido ao fato do ATP ser um co-transmissor liberado junto com a ACh

(BURNSTOCK, 2004) e estes dois neurotransmissores serem hidrolisados na fenda

sináptica pelas NTPDases e AChE, respectivamente, o estudo dos efeitos do metanol e

etanol sobre a atividade dessas enzimas em cérebro de zebrafish é de peculiar interesse.

22

I.5. Objetivos

Considerando que: (1) o zebrafish é um importante e consolidado modelo

experimental em estudos toxicológicos, (2) os sistemas purinérgico e colinérgico exercem

um importante papel na sinalização no sistema nervoso central e (3) receptores e enzimas,

envolvidos nestes importantes sistemas de neurotransmissão, já foram descritos nesta

espécie, o objetivo geral deste estudo foi avaliar o efeito dos compostos metanol e etanol

na atividade e padrão de expressão de enzimas envolvidas na hidrólise dos

neurotransmissores ATP e acetilcolina em cérebro de zebrafish.

Objetivos específicos:

Verificar o efeito in vivo da exposição aguda (1 hora) do metanol sobre a atividade e

(expressão gênica) padrão de expressão das ecto-nucleotidades e AChE em cérebro de

zebrafish.

Avaliar o efeito in vitro do metanol na hidrólise de ATP, ADP, AMP e ASCh em

cérebro de zebrafish.

Estudar a influência da exposição aguda do etanol na atividade e expressão gênica

padrão de expressão das ecto-nucleotidases e acetilcolinesterase em cérebro de

zebrafish.

Investigar possíveis alterações induzidas in vitro pelo etanol, acetaldeído e acetato sobre

a hidrólise de ATP, ADP, AMP e ASCh em cérebro de zebrafish.

23

Parte II

24

II.1. Capítulo 1 – RICO, E.P., ROSEMBERG, D.B., SENGER, M.R., ARIZI M.DE B.,

BERNARDI, G.F., DIAS, R.D., BOGO, M.R., BONAN, C.D. Methanol alters ecto-

nucleotidases and acetylcholinesterase in zebrafish brain (2006). Neurotoxicology and

Teratology, 28(4), 489-496.

25

26

27

28

29

30

31

32

33

II.2. Capítulo 2 – RICO, E.P., ROSEMBERG, D.B., DIAS, R.D., BOGO, M.R., BONAN,

C.D. Ethanol alters acetylcholinesterase activity and gene expression in zebrafish brain.

(artigo submetido ao periódico Neurotoxicology and Teratology).

34

Ethanol alters acetylcholinesterase activity and gene expression in zebrafish brain

Eduardo Pacheco Rico a,b, Denis Broock Rosemberg a,b , Renato Dutra Dias a, Mauricio

Reis Bogo c,*, Carla Denise Bonan a,*.

a Laboratório de Neuroquímica e Psicofarmacologia, Departamento de Biologia Celular e

Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do

Sul. Avenida Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto Alegre, RS, Brazil.

b Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul. Rua Ramiro Barcelos 2600-Anexo, 90035-003 Porto Alegre,

RS, Brazil.

c Centro de Biologia Genômica e Molecular, Departamento de Biologia Celular e

Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do

Sul. Avenida Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto Alegre, RS, Brazil.

*Corresponding authors: cbonan@pucrs.br and mbogo@pucrs.br

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Avenida Ipiranga, 6681, 90619-

900, Porto Alegre, RS, Brazil.

Tel: +55-51-3320-3500/Ext. 4158

Fax: +55-51-3320-3568

35

Abstract

Acute ethanol administration exerts a variety of actions on the central nervous

system (CNS). Zebrafish has been used as an attractive model system to investigate

mechanisms promoted by alcohol intoxication. However, the interactions between ethanol

consume and cholinergic neurotransmission still remain unclear. Here we investigated in

vitro and in vivo effects promoted by ethanol and its metabolites on zebrafish brain

acetylcholinesterase (AChE). AChE activity presented a significant increase (33%) at 1.0%

ethanol after acute exposure. However, ethanol in vitro did not alter AChE activity.

Acetaldehyde, the first metabolite of alcohol metabolism, promoted a dose-dependent

decrease (15%, 27.5% and 46.5%) at 0.25%, 0.5% and 1%. Acetate, product of

acetaldehyde degradation, did not change AChE activity. Ethanol was able to inhibit AChE

transcripts at 0.5 and 1.0%. These findings suggest that the alterations on zebrafish AChE

could reveal molecular mechanisms related to cholinergic signaling in alcoholism.

Key words: ethanol, acetaldehyde, acetylcholinesterase, zebrafish, alcoholism.

36

1. Introduction

Alcohol abuse is a health problem throughout the world. Alcohol consumption is

linked to the occurrence of many pathological conditions, such as various forms of cancer,

liver disease, brain damage and fetal injuries during pregnancy [25]. Furthermore, the

presence of ethanol impairs motor coordination, sensory perception and cognition [13].

Molecular mechanisms have been postulated in order to explain the ethanol effects,

including damage induced by ethanol and its metabolites and the production of oxygen

reactive species (ROS) and oxidative stress [32]. The major metabolic pathway for alcohol

metabolism is through a two-step enzymatic process that requires nicotinamide adenine

dinucleotide (NAD+) as a co-factor. In the first step, the enzyme alcohol dehydrogenase

(ADH) converts ethanol to acetaldehyde, reducing NAD+ in the process. In the second step,

acetaldehyde is metabolized to acetate by the enzyme aldehyde dehydrogenase (ALDH),

again reducing NAD+ [33]. Phylogenetic analysis of two zebrafish ADHs indicates that they

share a common ancestor with mammalian ADHs [27]. In addition, there are two minor

oxidative pathways for metabolizing ethanol to acetaldehyde in brain, involving

cytochrome P450 (CYP2E1) and the enzyme catalase. Although CYP2E1 is present in low

levels in CNS, induction of this enzyme together with increased ROS production has been

reported in rats after ethanol administration [20]. Furthermore, in the presence of peroxides,

the enzyme catalase can also oxidize ethanol to acetaldehyde and acetate [33].

Previous studies in zebrafish demonstrated that ethanol leads to craniofacial

abnormalities, cardiac malformations and developmental delays [3,7,27]. This specie is

used to study several neurobehavioral parameters, such as locomotor activity, learning,

37

aggression and social interaction [14,30]. Moreover, different zebrafish strains permit to

investigate the genetic determinants involved in regulating the responses to ethanol [10,36].

Ethanol administration leads to an imbalance in different excitatory and inhibitory

neurotransmitters such as the GABA, glutamate, dopamine, noradrenaline and

acetylcholine [15,12]. Two different types of cholinesterases are able to hydrolyze ACh:

acetylcholinesterase (AChE) (E.C.3.1.1.7) and butyrylcholinesterase (BuChE)

(E.C.3.1.1.8). It has been demonstrated that BuChE is not encoded by zebrafish genome,

but AChE gene is already cloned, sequenced and functionally detected in zebrafish brain

[1]. This enzyme can rapidly cleave ACh into choline and acetate and it has been described

as a well known biomarker for several environmental contaminants. Previous studies have

described that AChE can be affected by carbamate insecticides, methanol and heavy metals

in different fish species, such zebrafish and goldfish [28, 31, 35].

Therefore, the aim of this study was to evaluate the in vivo and in vitro effects of

ethanol on acetylcholinesterase activity on zebrafish brain, followed by expression pattern

analysis after short-term ethanol treatment.

2. Methods

2.1. Animals

Adult zebrafish were obtained from commercial supplier. All fish were acclimated

to their new environment for at least 2 weeks in 50-L conditioned at 25 ± 2°C under natural

light-dark photoperiod. They were used according to the National Institute of Health Guide

for Care and Use of Laboratory Animals, being healthy and free of any signs of disease.

38

The Ethics Committee of Pontifical Catholic University of the Rio Grande do Sul (PUCRS)

approved the protocol under the number 477/05 – CEP.

2.2. Chemicals

Ethanol (C2H6O; CAS number 64-17-5) and acetate (C2H4O2; CAS number 127-09-

3) were purchased from Merck, and Acetaldehyde (C2H4O; CAS number 75-07-0) from

Fluka. Trizma Base, EDTA, EGTA, sodium citrate, Coomasie Blue G, bovine serum

albumin, acetylthiocholine, 5, 5´-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) were purchased

from Sigma (USA).

2.3. In vivo and in vitro treatments

For acute treatment, fish were introduced in 20-L aquariums containing three

different concentrations of ethanol v/v (0.25, 0.5 and 1.0%). The animals were maintained

during 1 hour and brains were dissected before biochemical and molecular analysis. For in

vitro assays, ethanol, acetaldehyde and acetate were added to reaction medium before the

enzyme preincubation and maintained throughout the enzyme assays. The final

concentration of ethanol, acetaldehyde and acetate were in the range of 0.25 to 1.0%.

2.4. Determination of AChE activity

Zebrafish brains were homogenized on ice in 60 volumes (w/v) of Tris-citrate buffer

(50 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, pH 7.4, with citric acid) in a motor driven

Teflon-glass homogenizer. The rate of hydrolysis of acetylthiocholine (ACSCh, 0.8 mM) in

2 ml assay solutions with 100 mM phosphate buffer, pH 7.5, and 1.0 mM DTNB was

determined as described previously [11]. Before the addition of substrate, samples

39

containing protein (10 μg) and the reaction medium mentioned above were preincubated

for 10 min at 25oC. The hydrolysis of substrate was monitored by the formation of thiolate

dianion of DTNB at 412 nm for 2-3 min (intervals of 30 s). Controls without the

homogenate preparation were performed in order to determine the non-enzymatic

hydrolysis of ACSCh. The linearity of absorbance towards time and protein concentration

was previously determined. AChE activity was expressed as micromole of thiocholine

(SCh) released per hour per milligram of protein. We performed four different replicate

experiments.

2.5. Protein Determination

Protein was measured using Coomassie Blue as color reagent [4] and bovine serum

albumin as a standard.

2.6. Molecular Analysis

In order to identify AChE zebrafish orthologous genes, the mouse protein sequence

(AAH11278) was used as query. NCBI Blast searches of GenBank yielded one zebrafish

sequence similar to AChE. Forward (5´-CCAAAAGAATAGAGATGC CATGGACG-3´)

and reverse (5´-TGTGATGTTAAGCAGACGAGGCAGG-3´) primers were designed and

optimal conditions for RT-PCR were determined. The β-actin primers forward (5´-

GTCCCTGTACGCCTCTGGTCG-3´) and reverse (5´- GCCGGACTCATCGTACTCCTG

-3´) were used as previously described [8].

Total RNA was isolated from zebrafish brain using Trizol reagent (Invitrogen) in

accordance with manufacturer instructions. RNA was quantified by spectrophotometry and

40

all samples were adjusted to 160 ng/µl. cDNA species were synthesized with SuperScriptTM

First-Strand (Synthesis System for RT-PCR) Invitrogen Kit following the suppliers. One

microliter of RT reaction mix was used as a template for each PCR. PCR for AChE was

performed in a total volume of 25 μl using 0.08 μM of each primer, 0.2 μM dNTP, 2 mM

MgCl2 and 1 U Taq DNA polymerase (Invitrogen). PCR for β-actin gene was performed in

a total volume of 20 μl using 0.1 μM of each primer, 0.2 μM dNTP, 2 mM MgCl2 and 0.5

U Taq DNA polymerase (Invitrogen). PCR were conducted at 1 min at 94 °C, 1 min at

60°C (AChE) and at 54 °C (β-actin), and 1 min at 72 °C for 35 cycles. A post-extension

cycle at 72 °C was performed for 10 min.

For each set of PCR, negative control was included. PCR products were analyzed on

1.0% agarose gel, containing ethydium bromide and visualized with ultraviolet light. The

Invitrogen 1Kb ladder was used as molecular marker and normalization was performed

employing β-actin as a constitutive gene.

2.7. Statistical Analysis

Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), being expressed as

mean ± S.D. A Duncan multiple test range as post-hoc was performed, considering a level

of significance of 5%.

3. Results

The acute ethanol treatment was evaluated on AChE activity in zebrafish brain. The

experiments were performed after 1 hour in vivo ethanol exposure at varying concentrations

0.25, 0.5 and 1.0%. Ethanol, at 0.25 and 0.5%, did not alter AChE activity in zebrafish

41

brain membranes. However, this enzyme activity was significantly increased (33%) at 1.0%

ethanol when compared to the control group (Fig.1). On the other hand, ethanol did not

promote significant changes on zebrafish brain AChE activity when tested in vitro at 0.25,

0.5 and 1.0% (Fig 2A).

In order to verify if the metabolites acetaldehyde and acetate could influence AChE

activity, these compounds were added directly to reaction medium at 0.25, 0.5, and 1.0%.

Acetaldehyde presented a significant effect on AChE, inhibiting in vitro ASCh hydrolysis

(15%, 27.5% and 46.5%) at 0.25, 0.5, and 1.0%, respectively (Fig.2B). Acetate was not

able to promote any alteration in the AChE activity in the same concentrations tested

(Fig.2C). Since acetate can mediate ethanol effects [16], we performed experiments testing

acetate in vivo on AChE activity. The aquariums were treated in the range 0.1 to 1.0%

sodium acetate and there were no significant changes on AChE activity (data not shown).

The increased of ASCh hydrolysis promoted by ethanol could be consequence of

transcriptional control. RT-PCR analyses were performed when kinetic alterations have

occurred. Therefore, the ethanol concentrations tested were 0.5 and 1.0%. The 0.5% ethanol

was tested because a trend toward an increase of AChE activity was induced by the

treatment with this ethanol concentration. The expression patterns were presented (Fig.3)

and have shown that AChE transcription was reduced at 0.5% and 1.0% after acute ethanol

treatment.

4. Discussion

In the present study, we have shown that ethanol can alter the activity and

expression pattern of AChE in zebrafish brain. The relationship between cholinergic system

and operant tasks, exposition to novel stimuli, locomotor activity and the performance of

42

spatial memory tasks is well established [24]. The influence of ethanol has been described

in these behavioral parameters in zebrafish [14].

Acute ethanol exposure enhanced the AChE activity, but when the same

concentrations have been tested in vitro, AChE activity was not modified. There are several

mechanisms that can contribute for enzyme activities in biological systems, which include

modifications at transcriptional or post-transcriptional levels. The neuronal responses to

alcohol involve several hormone and neurotransmitter-activated signal transduction

pathways, leading to short-term (acute) and long-term (chronic) changes in gene expression

and neuronal function. [19]. In order to verify if the AChE gene could be modulated after

ethanol exposure, we have performed semi-quantitative RT-PCR experiments after 0.5 and

1.0% treatments. Interestingly, the results demonstrated that AChE mRNA levels were

decreased after 1.0% exposure, suggesting that the increase of AChE activity is not directly

related to a higher AChE gene expression. The transcription machinery is continuously

controlled by a complex signaling system, creating a set of signals able to adjust gene

expression profile of the cell. This signal transduction can be exerted by proteins, products

of enzyme reactions or even toxins able to regulate transcription factors [18]. The

phenomena known as negative feedback loop [29,17], which is situated at the interface of

genetic and metabolic networks, could explain the concomitant increase of ACh hydrolysis

and the decrease of AChE mRNA levels in zebrafish brain after ethanol exposure.

Furthermore, ethanol could exert an influence on post-translational modulation. Zebrafish

AChE sequence presents a high predicted score of possible PKC phosphorylation sites,

according to analysis in NetPhosk, a kinase-specific prediction of protein phosphorylation

site tool. Therefore, the increase of AChE activity could be attributed to a possible indirect

effect of ethanol mediated by a set of molecular and biochemical modulatory mechanisms.

43

Considering that ethanol metabolites could be involved in the observed effects, we

carried in vitro assays testing acetaldehyde and acetate in order to verify the action of

ethanol metabolites on zebrafish brain AChE activity. Acetaldehyde, first metabolite of

ethanol catabolism pathway, inhibited AChE activity in a concentration-dependent manner.

Studies have demonstrated the role of acetaldehyde in several neurochemical and

pharmacological effects promoted by ethanol. It has been postulated that in vivo

acetaldehyde production may play a role in the ethanol cytotoxicity, inducing neuronal

degeneration [34]. It is not possible to exclude that an important mechanism for ethanol

toxicity is lipid peroxidation through the induction of the formation of free radicals and/or

acetaldehyde adducts, which could be associated with brain and others organs damage

[22,21,32]

Acetate, another product of this pathway, is a short-chain fatty acid that increases

after ethanol administration and readily crosses the blood-brain-barrier, being metabolized

in brain. This metabolite can be destined to acetyl-CoA, which is formed from acetate well

as can be metabolized for energy generation into CO2 and water [5]. Furthermore, evidence

has suggested that extracellular acetate can be accumulated and released by cholinergic

nerve terminals after stimuli [6], resulting in the increase of ACh levels at synaptic cleft.

Since acetate treatment did not alter AChE activity, it is possible to exclude the

involvement of this metabolite in the effects induced by ethanol.

Ethanol is able to modulate the action of several neurotransmitters and

neuromodulators, including adenosine. This alcohol has been proposed to stimulate

adenosine receptors by two mechanisms. The first involves metabolism of acetate, which

requires ATP and yields AMP. The latter compound is converted into adenosine by the

enzyme 5’-nucleotidase [2]. The second mechanism involves an inhibition promoted by

44

ethanol on type I equilibrative nucleoside transporter (ENT1), which leads to the

accumulation of extracellular adenosine [9]. The stimulation of adenosine A2A receptors

leads to the activation of Gαs-coupled adenyl cyclase, increasing the generation of cAMP

and acetylcholine release from rat hippocampus [23]. Consequently, an increase of ACh

levels promoted by adenosine A2A receptors could also induce an enhancement of AChE

activity by a stoichiometric effect, which could represent an important compensatory

mechanism in order to maintain the control of ACh levels during ethanol exposure.

The search for biological alterations on cholinergic system during alcohol exposure

in zebrafish may not only render some important insights into the pathophysiology of

alcohol dependence, but might also identify neurochemical and molecular mechanisms

involved in the alcoholism.

Acknowledgments

This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) and FAPERGS. E.P.R and D.B.R. were recipient of fellowship from CNPq. The

authors would like to thank the Instituto de Pesquisas Biomédicas (IPB-PUCRS) for the

technical support.

45

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50

Figure legends

Fig.1: In vivo effect of ethanol on AChE activity in zebrafish brain homogenates. For acute

treatment, fish were exposed to ethanol v/v (0.25, 0.5 and 1.0%) during 1 hour. Bars

represent the mean ± S.D. of at least three different experiments. The control AChE activity

was 25.5 ± 2.5 micromole of thiocholine released per hour per milligram of protein.

(ANOVA followed by a Duncan multiple range test, considering P ≤ 0.05 as significant). *

Significantly different from control group.

Fig.2: In vitro effect of ethanol (A), acetaldehyde (B) and acetate (C) on AChE activity in

zebrafish brain. ASCh hydrolysis was evaluated in different concentrations (0.25, 0.5 and

1.0%). Bars represent the mean ± S.D. of at least three different experiments. The control

AChE activity was 24.82 ± 1.7, 30.47 ± 2.1, 32.33 ± 1.8 micromole of thiocholine released

per hour per milligram of protein, respectively. (ANOVA followed by a Duncan multiple

range test, considering P ≤ 0.05 as significant). * Significantly different from control group.

Fig. 3: AChE and β-actin mRNA expression in the brain of adult zebrafish. Fish were

exposed to ethanol concentrations (0.5 and 1.0%), the brains were excised and total RNA

was isolated being subjected to RT-PCR for the indicated targets. RT-PCR products were

subjected to electrophoresis on a 1.0% agarose gel. Three independent experiments were

performed, with entirely consistent results.

51

Fig.1

52

Fig.2A

Fig.2B

53

Fig.2C

54

Fig.3

55

II.3. Capítulo 3 –RICO, E.P., ROSEMBERG, D.B., SENGER, M.R., ARIZI M. DE B.,

DIAS, R.D., SOUTO, A.A., BOGO, M.R., BONAN, C.D. Ethanol and acetaldehyde alters

NTPDase and 5’-nucleotidase from zebrafish brain membranes. (artigo submetido ao

periódico Neurochemstry International).

56

Ethanol and acetaldehyde alter NTPDase and 5’-nucleotidase from zebrafish

brain membranes

Eduardo Pacheco Ricoa, Denis Broock Rosemberga, Mario Roberto Sengera,

Marcelo de Bem Arizib, Renato Dutra Diasb, André Arigony Soutoc, Maurício Reis Bogod,*,

Carla Denise Bonanb,*

a Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde,Universidade

Federal do Rio Grande do Sul. Rua Ramiro Barcelos 2600-Anexo, 90035-003 Porto Alegre,

RS, Brazil.

bLaboratório de Neuroquímica e Psicofarmacologia, Departamento de Biologia

Celular e Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio

Grande do Sul. Avenida Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto Alegre, RS, Brazil.

c Faculdade de Química,Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

Avenida Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto Alegre, RS, Brazil.

dCentro de Biologia Genômica e Molecular, Departamento de Biologia Celular e

Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do

Sul. Avenida Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto Alegre, RS, Brazil.

Running Title: Ethanol alters zebrafish ecto-nucleotidases

**Address correspondence and reprint requests to Carla Denise Bonan (cbonan@pucrs.br)

or Mauricio Reis Bogo (mbogo@pucrs.br), Faculdade de Biociências, Pontifícia

Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Avenida Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto

Alegre, RS, Brazil. Phone: +55-51-3320-3500/Ext. 4158 Fax: +55-51-3320-3568

57

Abstract

Alcohol abuse is an acute health problem throughout the world and alcohol consumption is

linked to the occurrence of several pathological conditions. Here we tested the acute effects

of ethanol on NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and 5’-

nucleotidase in zebrafish (Danio rerio) brain membranes. The results have shown a

decrease of ATP (36.3% and 18.4%) and ADP (30% and 20%) hydrolysis after 0.5 and

1.0% (v/v) ethanol exposure during 60 minutes, respectively. In contrast, no changes on

ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro

did not alter ATP and ADP hydrolysis, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5, and 1.0%

(23% and 28%, respectively). Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP

(40%-85%) and ADP (28%-65%) hydrolysis, but AMP hydrolysis was reduced (52%, 58%

and 64%) at 0.25, 0.5 and 1.0%, respectively. Acetate in vitro did not alter these enzyme

activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´-nucleotidase was

performed. Ethanol treatment reduced NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA

levels. These findings demonstrate that acute ethanol intoxication may influence the

enzyme pathway involved in the degradation of ATP to adenosine, which could affect the

responses mediated by adenine nucleotides and nucleosides in zebrafish CNS.

Keywords: ethanol, ecto-nucleotidase, NTPDase, ecto-5’-nucleotidase, adenosine,

zebrafish.

58

1. Introduction

Alcohol abuse is a significant public health problem. Its consumption affects wide

proportion of the general population, being responsible for the occurrence of several mental

disorders throughout the world. The acute effects are characterized by a variety of

behavioral changes related to motor coordination, sensory perception and cognition

(Fleming et al., 2001). Ethanol promotes several biochemical and physiological alterations

on central nervous system, involving specific neurotransmitter systems and intricate

signaling pathways (Chandler et al., 1997; Esel, 2006).

The zebrafish Danio rerio is a small freshwater teleost emerging as an important

model in genetic and developmental neurobiology (Zon and Peterson, 2005). Zebrafish

genes present a high degree of conservation and share a 70-80% homology to those of

humans (Dooley and Zon, 2000). Therefore, zebrafish has become an excellent model

system for identifying and understanding the genes responsible for normal vertebrate

development, as well genes that regulate sensitivity and resistance to toxicants, including

ethanol.

Recently, the terarogenic properties of ethanol have been established in zebrafish,

through developmental abnormalities as Fetal Alcohol Syndrome (FAS) and induction of

cell death in the CNS (Dlugos and Rabin, 2003). In addition, ethanol influences behavioral

parameters, such as locomotor activity, aggression, group preference and pigment response

in this specie (Gerlai et al., 2000; Reimers et al., 2004). The gene of alcohol dehydrogenase

(ADH), the primary enzyme responsible for the degradation of alcohol, has been described

and cloned in this specie (Reimers et al., 2004a, Dasmahapatra et al., 2001).

59

Extracellular ATP can play an important pivotal role in synaptic transmission,

acting as a neurotransmitter and/or a neuromodulator (Cunha and Ribeiro, 2000; Burnstock,

2004). In literature, both ionotropic P2X and G protein-coupled P2Y receptors have already

been characterized in this specie (Kucenas et al., 2003). Signaling events induced by

extracellular adenine nucleotides are controlled by the action of a variety of surface-located

enzymes known as ecto-nucleotidases (Zimmermann, 2001, Robson, 2006). There are

important mechanisms involved in the control of ligand concentrations and hence regulate

the activation of purinoceptors. Ecto-nucleotidases constitute a highly refined system for

the regulation of nucleotide-mediated signaling, controlling the rate, amount and timing of

nucleotide degradation and formation. The hydrolysis of ATP to AMP is catalyzed mainly

by a family of ecto-nucleotidases named NTPDases (nucleoside triphosphate

diphosphohydrolase). The nucleotide AMP is hydrolyzed to adenosine, an important

neuromodulator, by the action of an ecto-5’-nucleotidase (Robson et al., 2006; Colgan et

al., 2006). Adenosine can mediate different cellular functions by operating G-protein-

coupled receptors (A1, A2A, A2B, A3), which can inhibit (A1 and A3) or facilitate (A2A and

A2B) neuronal communication (Fredholm et al., 2001).

Recently, we characterized the presence of NTPDase and ecto-5’-nucleotidase

activities in brain membranes of zebrafish (Rico et al., 2003; Senger et al., 2004).

Orthologous NTPDase1, three NTPDases2 and ecto-5’-nucleotidase genes were identified

in zebrafish genome, presenting expression in brain (Rico et al, 2006). Thus, there are

important mechanisms involved in the control of nucleotide and nucleoside concentrations,

regulating the purinergic neurotransmission.

In order to understand the control of extracellular nucleotide levels in zebrafish

brain and considering that: (i) Ethanol mediates actions in several excitatory or inhibitory

60

neurotransmitter systems; (ii) P2X receptors play a role in mediating cellular and

behavioral effects of ethanol (Franke & Illes, 2006); (iii) ethanol activates signal

transduction pathways, leading to changes in gene expression and neuronal function

(Diamond & McIntire, 2002), the present study evaluated in vivo effects of ethanol on

activities and the pattern of expression of the ecto-nucleotidase. In addition, in vitro effects

of ethanol and its metabolites, acetaldehyde and acetate, were also investigated in zebrafish

brain membranes.

2. Material and Methods

2.1.Animals

Adult zebrafish of both sexes were obtained from commercial supplier and acclimated

for at least 2 weeks in a 50-L aquarium, with feeding done twice daily. The fish were kept

between 25 + 2oC under a natural light-dark photoperiod. The use of animals was according

to the National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals and the

experiments were designed to minimize discomfort or suffering to the animals, as well the

number used. The Ethics Committee of Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul

(PUCRS) approved the protocol under the number 477/05 – CEP.

2.2. Chemicals

Ethanol (C2H6O; CAS number 64-17-5) and acetate (C2H4O2; CAS number 127-09-

3) were purchased from Merck, and acetaldehyde (C2H4O; CAS number 75-07-0) from

Fluka. Trizma Base, malachite green, ammonium molybdate, polyvinyl alcohol,

nucleotides, EDTA, EGTA, sodium citrate, Coomassie Blue G, bovine serum albumin,

61

calcium and magnesium chloride were purchased from Sigma (USA). All other reagents

used were of analytical grade.

2.3. In vitro assays

Ethanol, acetaldehyde and acetate were added to reaction medium before the

preincubation with the enzyme and maintained throughout the enzyme assays. The

compounds were tested in the following final concentrations: 0.25, 0.5, and 1%.

2.4. Acute ethanol exposure

For the in vivo treatments, animals were introduced to the test aquariums (20 L)

containing solutions of ethanol at three different concentrations (0.25, 0.5 and 1.0%). The

animals were maintained in the test aquarium during 1 hour. The acute ethanol exposure

has been performed as described previously (Gerlai et al., 2000) and it was able to promote

significant changes in zebrafish behavior.

2.5. Membrane preparation

The preparation of brain membranes was performed as described previously (Barnes,

1993). Zebrafish were sacrificed, their brains were removed of cranial skull by dissection

technique and briefly homogenized in 60 volumes (v/w) of chilled Tris-citrate buffer (50

mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, pH 7.4, with citric acid) in a motor driven Teflon-

glass homogenizer. The samples were centrifuged at 1.000 g during 10 min and the pellet

was discarded. The supernatant was centrifuged for 25 min at 40.000 g. The resultant pellet

was frozen in liquid nitrogen, thawed, resuspended in Tris-citrate buffer, and centrifuged

62

for 20 min at 40.000 g. This fresh-thaw-wash procedure was used to ensure the lysis of the

brain membranes. The final pellet was resuspended and used in the enzyme assays. All

samples were maintained at 2- 4°C throughout preparation.

2.6. Enzyme assays

The conditions of NTPDase and ecto-5’-nucleotidase assay were performed as

described previously (Rico et al., 2003; Senger et al., 2004). Zebrafish brain membranes (3-

10 �g protein) were added to the reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

and 5 mM CaCl2 (for the NTPDase activity) or 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) and 5 mM MgCl2

(for the ecto-5’-nucleotidase activity) in a final volume of 200 �L. The samples were

preincubated for 10 min at 37�C and the reaction was initiated by the addition of substrate

(ATP, ADP or AMP) to a final concentration of 1 mM. The reaction was stopped by the

addition of 200 �L 10% trichloroacetic acid and samples were chilled on ice for 10 min.

Samples were then removed and it was added 1 ml of a mixture containing 2.3% polyvinyl

alcohol, 5.7% ammonium molybdate and 0.08% Malachite Green in order to determinate

the inorganic phosphate released (Pi) (Chan et al., 1986). Controls with the addition of the

enzyme preparation after mixing with trichloroacetic acid were used to correct non-

enzymatic hydrolysis of the substrates. Incubation times and protein concentrations were

chosen in order to ensure the linearity of the reactions. Specific activity was expressed as

nanomole of Pi released per minute per milligram of protein. All enzyme assays were run at

least in triplicate.

63

2.7. Protein determination

Protein was measured using Coomassie Blue as color reagent (Bradford et al., 1976)

and bovine serum albumin as a standard.

2.8. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

In order to obtain NTPDase1 and NTPDase2 zebrafish orthologous genes, the

mouse proteins sequences (AAH11278 and NP_033979) were used as query. NCBI Blast

searches of GenBank yielded one zebrafish sequence similar to NTPDase1 and three

different isoforms of NTPDase2. PCR NTPDase1, NTPDase2_mg, NTPDase2_mq,

NTPDase2_mv primers were designed based on sequences obtained throughout GenBank

and the optimal conditions for primers annealing were determined (Table 1). The �-actin

primers were designed as described previously (Chen et al., 2004).

Total RNA was isolated from zebrafish brain using Trizol reagent (Invitrogen) in

accordance with manufacturer instructions. RNA was quantified by spectrophotometry and

all samples were adjusted to 160 ng/µl. cDNA species were synthesized with SuperScriptTM

First-Strand (Synthesis System for RT-PCR) Invitrogen Kit following the suppliers. PCR

reactions for different NTPDase2 and �-actin genes were performed in a total volume of 20

μl, 0.1 μM primers (Table 1), 0.2 �M dNTP, 2 mM MgCl2 and 0.5 U Taq DNA

polymerase (Invitrogen). The PCR conditions for NTPDase1 were similar to those

described above, except that 1.5 mM MgCl2 was employed. The following conditions were

used for the PCR reactions: 1 min at 94 °C, 1 min for annealing temperature (see Table 1),

1 min at 72 °C for 35 cycles. Post-extension at 72 °C was performed for 10 min. For each

set of PCR reactions, negative control was included. PCR products were analyzed on 1.5%

64

agarose gel, containing ethydium bromide and visualized with ultraviolet light. The Low

DNA Mass Ladder (Invitrogen) was used as molecular marker and normalization was

performed employing β-actin as a constitutive gene.

2.9. Statistical analysis

Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), being expressed as

means + S.D. A Duncan multiple test range as post-hoc was performed, considering a level

of significance of 5%.

3. Results

Ecto-nucleotidase activities were evaluated after ethanol acute treatment in

zebrafish brain membranes. After 1 hour of ethanol exposure at varying concentrations at

the range of 0.25 to 1.0%, this alcohol was able to inhibit NTPDase activity. There was a

significant decrease of ATP (36.3% and 18.4%) and ADP hydrolysis (30% and 20%) at 0.5

and 1.0%, respectively (Fig.1A and 1B). Ecto-5'-nucleotidase was not altered in the

concentrations tested (Fig.1C).

Ethanol in vitro did not promote a significant effect on ATP and ADP hydrolysis

(Fig.2A and 2B), while the AMP hydrolysis was reduced (23.3% and 28.1%) at 0.5 and

1.0%, respectively (Fig.2C). Therefore, our results have shown that ethanol was able to

inhibit ATP and ADP hydrolysis in vivo, but not in vitro. These findings lead us to the

investigation of possible indirect effects of ethanol, which could be mediated by its

metabolites. Thus, we tested the in vitro effect of the metabolites, acetaldehyde and acetate,

produced through ethanol degradation pathway (Table 2). Acetaldehyde, the first product of

ethanol catabolism, presented a significant effect on ecto-nucleotidases, inducing a decrease

65

of ATP hydrolysis in a dose-dependent manner (40.5%, 65.8% and 85.5%) at the

concentrations 0.25, 0.5 and 1.0%, respectively. When acetaldehyde was added to the

enzyme assay, ADP hydrolysis also presented an inhibitory effect (28.5%, 44.7% and

64.7%) in the concentrations 0.25, 0.5 and 1.0%, respectively. There was a significant

decrease of AMP hydrolysis in all concentrations of acetaldehyde tested (52.2%, 58.7% and

64.4% in the concentrations 0.25, 0.5 and 1.0%, respectively). In the next step of ethanol

catabolism, acetaldehyde is metabolized to acetate. Acetate in vitro did not induce

alterations on NTPDase and 5'-nucleotidase activities in the concentrations tested (Table 2).

The inhibitory effect promoted by ethanol could be a consequence of transcriptional

control. The semi-quantitative RT-PCR analyses were performed when kinetic alterations

had occurred. For this reason, 5'-nucleotidase and the concentrations of 0.25% ethanol for

NTPDase1 and NTPDases2 isoforms were not analyzed. The constitutive gene was

normalized to β-actin expression to allow the comparison in different experimental

conditions. Ethanol exposure decreased the expression of NTPDases in zebrafish brain

(Fig.3). NTPDase1, NTPDase2_mg and NTPDase2_mv presented a decrease in the level of

transcripts after exposure to ethanol 0.5%, while that NTPDase2_mq transcription

apparently was not affected. Interestingly, all NTPDases demonstrated a reduction in the

transcript levels at 1% of ethanol treatment.

4. Discussion

The results presented demonstrate the influence of ethanol on ecto-nucleotidase

activities and expression patterns in zebrafish brain. Acute treatment significantly inhibited

66

NTPDase activity at higher concentrations tested. However, ecto-5’-nucleotidase did not

present any significant change after in vivo exposure.

To verify if the inhibition observed in ATP and ADP hydrolysis from zebrafish

brain could be due to alteration on gene expression, NTPDase and ecto-5’-nucleotidase

primers were synthesized and RT-PCR experiments were conducted. The results have

shown a decrease on NTPDase1, NTPDase2_mg, and NTPDase2_mv transcript levels after

ethanol treatment.

Since these enzymes contribute to maintenance of physiological effects of

extracellular ATP, ADP, AMP and adenosine, the influence of the enzymatic cascade

involved in the control of these nucleotides and nucleosides have been proposed in several

pathophysiological situations (Agteresch et al., 1999). Our results suggest that the

inhibitory effect on ATP and ADP hydrolysis observed after ethanol exposure could induce

a increase in the extracellular ATP levels and a consequent decrease of adenosine levels.

Considering that ATP is an important excitatory neurotransmitter in CNS (Di Iorio et al.,

1998), the inhibition of ATP hydrolysis could promote several processes related to brain

excitability. As the massive release of extracellular ATP leads to excitotoxicity and cell

death via activation of P2X7 receptor in neuronal cells, studies have related this nucleotide

to neuropathological events targeting the CNS (Le Feuvre et al., 2002).

In order to verify the direct effect of ethanol on ecto-nucleotidase activities, in vitro

assays were performed in zebrafish brain membranes. The NTPDase was not altered, but

5’-nucleotidase activity was inhibited at 0.25, 0.5, and 1.0%. Alcohol is believed to interact

with biological membranes due to its lipophilic nature. The direct interaction of the ethanol

molecule, per se, with membrane structures is complex and may involve such membrane

components (Lovinger et al., 1989). Ethanol treatment was able to inhibit the NTPDase

67

activity while alterations were not observed on in vitro assays. These results permit to

conclude that ethanol could not act directly, but indirectly through its metabolites,

acetaldehyde and acetate. Generation of oxygen free radicals and reactive aldehydes as a

result of excessive ethanol consumption has been well established and have indicated that

acetaldehyde, and the aldehydic products of lipid peroxidation can bind to proteins in

tissues forming stable adducts (Niemela O, 2001). Moreover, neuronal responses to alcohol

involve several hormone- and neurotransmitter-activated pathways, leading short-term

(acute) and long-term (chronic) changes in gene expression and neuronal function

(Diamont & McIntire, 2002). Thus, the in vivo inhibitory effect on transcriptional and

kinetic parameters could be associated to toxicity formation of adducts and oxidation stress.

After alcohol consumption, ethanol is metabolized in the liver through several

mechanisms (Ramchandani et al., 2001), including alcohol dehydrogenase (ADH),

cytocrome P4502E1 (CYP2E1) and catalase. Acetaldehyde hydrolysis is mainly mediated

by aldehyde dehydrogenase (ALDH), producing acetate. It is already known that there are

two oxidative pathways for metabolizing ethanol to acetaldehyde in brain: catalase may be

responsible for about 60% of the process (Zimatkin et al., 2006) while cytocrome P450

(CYP2E1) is involved in the metabolic conversion of ethanol to reactive oxygen species

(Sun & Sun, 2001, Yadav et al., 2006). Furthermore, it is consolidated that acetaldehyde

and acetate play a key role in the brain mediating some of the actions of ethanol (Israel,

1994; Dietrich 2004). It is well established that acetaldehyde mediates the toxic effects of

ethanol, and studies were aimed at unraveling its effects in pathological conditions

(Quertermont et al., 2006). In order to understand the possible effect of products of ethanol

metabolism, acetaldehyde and acetate were tested in vitro on ecto-nucleotidase activities.

Acetaldehyde promoted an inhibition on NTPDase activities in a dose-dependent manner

68

ranging from 0.25 to 1.0%, while the activity of 5’-nucleotidase was equally inhibited at all

concentrations tested.

Acetate is a molecule that promotes significant effects on CNS that can either

potentiate or antagonize the effects of ethanol molecule (Carmichael et al., 1991). Acetate

in vitro was not able to modify ecto-nucleotidase activities. Ethanol has been proposed to

stimulate adenosine receptors by two mechanisms. The first involves metabolism of ethanol

by liver, which generates acetate that can be metabolized to adenosine in the brain

(Carmichael et al., 1991). The main entry point for acetate is its conversion to Acetyl-CoA

that requires ATP and yields AMP. This AMP is converted to adenosine by the 5’-

nucleotidase (Bianchi and Spychala, 2003). The second mechanism has been demonstrated

through the inhibition of the type I equilibrative nucleoside transporter (ENT 1), which

leads to accumulation of extracellular adenosine (Choi et al, 2004). The association of

NTPDase and 5’-nucleotidase can promote the hydrolysis of ATP, ADP and AMP, leading

to the formation of adenosine. To prevent adenosine accumulation, the inhibitory responses

promoted by ethanol on NTPDases could be a compensatory mechanism to avoid a

significant increase of adenosine levels, which can lead to desensitization of the adenosine

receptors (Kiselevski et al., 2003). The action of ethanol on neuromodulatory function of

adenosinergic system regulates the release of several neurotransmitters (Fredholm et al.,

2005).

Recent evidence indicates that ethanol modulates the function of specific

intracellular signaling cascades, including those that contain cyclic adenosine 3’, 5’-

monophosphate (cAMP)-dependent, protein kinase A (PKA) and protein kinase C (PKC)

(Newton and Messing, 2006). Zebrafish NTPDase1 and all NTPDases2 isoforms protein

sequences present possible PKC phosphorylation sites, according to analysis performed in

69

NetPhosk, a kinase-specific prediction of protein phosphorylation site tool. Furthermore,

PKC phosphorylates numerous proteins, including transcription factors, which regulate the

activity of many genes in the cell nucleus (Dohrman et al., 1997). Besides the decrease in

NTPDase transcript levels, the inhibition on these enzyme activities could also be attributed

to ethanol effect on signaling pathways involved in the possible post-translational

modulation of these enzymes.

In summary, these findings demonstrate the actions induced by ethanol and its

metabolites on ecto-nucleotidases in zebrafish brain. This investigation evaluated the

relationship between ethanol, recognized for acting in neurotransmission, and the enzymes

responsible for the hydrolysis of the neurotransmitter ATP to adenosine. The changes

induced by ethanol acute treatment on ecto-nucleotidases suggest that the purinergic system

is an interesting target for potential pharmacological studies. Our results could help to

clarify the importance of neurochemical effects on purine metabolism associated to alcohol

consumption.

Acknowledgements

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do

Sul (FAPERGS), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) and Third World Academy of Sciences (TWAS). E.P.R. and D.B.R were recipient

of fellowship from CNPq. M.R.S. was recipient of fellowship from CAPES. M.B.A. was

recipient of fellowship from FAPERGS. The authors would like to thank the Instituto de

Pesquisas Biomédicas (PUCRS) for the technical support.

70

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75

Figure legends

Fig.1: Effect of acute ethanol treatment on ecto-nucleotidase activities in zebrafish brain.

The ATP (A), ADP (B) and AMP (C) hydrolysis were evaluated in three different

concentrations (0.25, 0.5 and 1.0%). Data are expressed as mean ± S.D. of at least three

different experiments. The control ATP, ADP and AMP hydrolysis (without ethanol) were

680.3 ± 38, 137.1 ± 11, 22.4 ± 1.6 nmol Pi min−1 mg−1 of protein, respectively. Asterisk (*)

indicates significantly different from control group (P≤0.05).

Fig.2. In vitro effect of varying concentrations of ethanol on ATP (A), ADP (B) and AMP

(C) hydrolysis in zebrafish brain membranes. Bars represent the means ± S.D. of at least

three different experiments. The control ATPase, ADPase and AMPase activities (no

ethanol added) were 559.6 ± 63.5, 114.7 ± 8.9 and 18.9 ±1.8 nmol Pi min−1 mg−1 of protein,

respectively. Asterisk (*) indicates significantly different from control group (P≤0.05).

Fig.3: Gene expression patterns after acute ethanol exposure. The figure shows �-actin,

NTPDase1, NTPDase2_mg, NTPDase2_mq and NTPDase2_mv mRNA expression in the

brain of adult zebrafish. Fish were exposed to ethanol concentrations (0.25, 0.5 and 1.0%),

the brains were excised and total RNA was isolated being subjected to RT-PCR for the

indicated targets. RT-PCR products were subjected to eletrophoresis on a 1.5% agarose gel.

Three independent experiments were performed, with entirely consistent results.

76

0100200300400500600700800

Control 0.25 0.5 1.0

Ethanol concentration (%)

nmol

Pi.m

in-1

.mg-1

of p

rote

in *

*

Fig.1A

A

77

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control 0.25 0.5 1.0

Ethanol concentration (%)

nmol

Pi.m

in-1

.mg-1

of p

rote

in

B

Fig. 1B

* *

78

0

5

10

15

20

25

Control 0.25 0.5 1.0

Ethanol concentration (%)

nmol

Pi.m

in-1

.mg-1

of p

rote

in

Fig. 1C

C

79

0

100

200

300

400

500

600

700

Control 0.25 0.5 1.0

Ethanol concentration (%)

nmol

Pi.m

in-1

.mg

-1 o

f pro

tein

Fig. 2A

A

80

0

20

40

60

80

100

120

140

Control 0.25 0.5 1.0

Ethanol concentration (%)

nmol

Pi.m

in-1

.mg-1

of p

rote

in

Fig.2B

B

81

0

5

10

15

20

25

Control 0.25 0.5 1.0

Ethanol concentration (%)

nmol

Pi.m

in-1

.mg-1

of p

rote

in

Fig.2C

C

* *

82

Fig.3

83

Table 1 : PCR primer design

Enzymes

Sequences (5’-3’)

Annealing

temperature

(ºC)

PCR

product

(bp)

GenBank

Accession

number

NTPDase1 CCCATGGCACAGGCCGGTTG (forward)

GCAGTCTCATGCCAGCCGTG (reverse)

54

380

AAH78240

NTPDase2_mg* GGAAGTGTTTGACTCGCCTTGCACG (forward)

CAGGACACAAGCCCTTCCGGATC (reverse)

64

554

XP_697600

NTPDase2_mq* CCAGCGGATTTAGAGCACGCTG (forward)

GAAGAACGGCGGCACGCCAC (reverse)

64

313

XP_687722

NTPDase2_mv* GCTCATTTAGAGGACGCTGCTCGTG (forward)

GCAACGTTTTCGGCAGGCAGC (reverse)

64

263

AAH78419 β-actin GTCCCTGTACGCCTCTGGTCG (forward)

GCCGGACTCATCGTACTCCTG (reverse)

54

678

AAC13314

* Correspond to the two first aminoacids residues of the protein sequence.

84

Table 2. In vitro effects of acetaldehyde and acetate on ATP, ADP and AMP hydrolysis in zebrafish brain membranes. Acetaldehyde Acetate ATP ADP AMP ATP ADP AMP Control

613.1 ± 66.0 123.5 ± 16.1 21.3 ± 2.6 630.1 ± 125.2 114.3 ± 6.6 22.2 ± 2.3

0.25

365.2 ± 71.1* 88.3 ± 2.5* 10.2 ± 1.7* 598.7 ± 115.1 128.8 ± 20.6 22.4 ± 4.9

0.5

210.2 ± 57.6* 68.4 ± 8.8* 8.7 ± 2.5* 586.8 ± 144.3 124.2 ± 19.4 19.3 ± 3.9

1.0

89.5 ± 22.3* 43.7 ± 6.1* 7.6 ± 3.2* 553.1 ± 116.6 103.9 ± 4.8 18.4 ± 3.5

Data represent the mean ± S.D. of at least three different experiments. The control ATPase, ADPase and AMPase activities for acetaldehyde were 613.1 ± 66.0, 123.5 ± 16.1, 21.3 ± 2.6 nmol Pi min−1 mg−1 of protein, respectively. The control ATPase, ADPase and AMPase activities for acetate were 630.1 ± 125.2, 114.3 ± 6.6, 22.2 ± 2.3nmol Pi min−1 mg−1 of protein, respectively. * Significantly different from control group (P≤0.05) using ANOVA followed by a Duncan multiple range test.

85

Parte III

86

III.1. Discussão

III.1.1. Considerações gerais

Os resultados apresentados neste estudo demonstram o efeito agudo do metanol e do

etanol na atividade e expressão gência e padrão de expressão das ectonucleotidases e

acetilcolinesterase em cérebro de zebrafish. Com o objetivo de investigar no genoma do

zebrafish a presença dos genes de NTPDase1 e NTPDase2, genes ortólogos de

camundongo foram utilizados como molde para busca. No banco genômico do zebrafish,

foram encontradas uma seqüência similar a NTPDase1 e três diferentes isoformas de

NTPDase2. Uma análise filogenética foi realizada mostrando que no genoma do zebrafish

há um gene para NTPDase1 consistentemente agrupado às NTPDases1 humana e de

camundongo. Ao comparar os genes de NTPDase2 entre zebrafish, camundongos e

humanos, observa-se que estas seqüências estão agrupadas em um mesmo clado com alto

valor de suporte, mostrando uma proximidade filogenética para NTPDases2. Para

investigar se os genes para estas enzimas estão sendo expressos em cérebro de zebrafish, as

seqüências obtidas serviram para a construção de primers específicos. A análise da

expressão semi-quantitativa mostrou que estas NTPDases são expressas em cérebro de

zebrafish.

III.1.2. Efeito in vivo do metanol e etanol sobre ectonucletidases e AChE

Os tratamentos in vivo mostraram que tanto o metanol quanto o etanol são capazes

de inibir a hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP, bem como promover redução nos níveis

de transcritos na maioria dos genes das NTPDases. Desse modo, é evidente o potencial

destes álcoois em alterar estas enzimas tanto em nível molecular quanto cinético nesta

87

espécie. Sabe-se que estas enzimas contribuem para a manutenção dos níveis extracelulares

de ATP, ADP, AMP e adenosina. Diversas situações patofisiológicas podem influenciar

esta cascata enzimática (AGTERESCH et al., 1999, BONAN et al., 2001). Assim, nossos

resultados sugerem que o efeito inibitório observado na hidrólise de ATP e ADP após a

exposição aguda ao metanol e ao etanol poderia induzir um aumento nos níveis

extracelulates de ATP e a conseqüente diminuição nos níveis de adenosina.

O ATP extracelular pode agir nos receptores purinérgicos P2X ou P2Y. A subclasse

P2X7, já identificada em zebrafish, participa de eventos relacionados a apoptose

(KUCENAS et al., 2003). Estudos mostram que o ATP extracelular e receptores P2 podem

estar associados em eventos neuropatológicos e injúria cerebral (RYU et al., 2002). A

inibição das NTPDases poderia promover um aumento extracelular dos níveis de ATP e

estimular a apoptose. Além disso, considerando que o ATP é um importante

neurotransmissor excitatório no SNC (Di IORIO et al., 1998), a inibição da hidrólise do

ATP poderia promover diversos processos relacionados com a excitabilidade cerebral.

Após os tratamentos, não foram observadas alterações na reação de hidrólise do AMP até

adenosina, mostrando que a ecto-5´-nucleotidase não foi sensível aos efeitos destes álcoois.

A atividade da AChE pode ser usada como um marcador da função colinérgica e

mudanças na atividade da enzima podem indicar alterações na disponibilidade de ACh e do

nível de seus receptores (FERNANDES & HODGES-SAVOLA, 1992). O número de

moléculas de AChE pode ser aumentado (MOUDGIL & KANUDO, 1973) ou diminuído

(BATTIE & MORAN, 1990), dependendo do estímulo recebido. Os níveis de AChE

parecem ser controlados pela interação de ACh com seus receptores; quando a interação é

acentuada, aumentam os níveis de AChE. A exposição aguda ao metanol promoveu uma

significativa inibição na atividade da AChE e nos níveis de mRNA desta enzima. No

88

entanto, a exposição ao etanol promoveu um aumento na atividade da AChE e uma redução

nos níveis de transcritos.

Neurotoxinas como methylazoxy-metanol e etanol, são capazes de influenciar a

transdução de sinal, modificando a atividade da PKC (Di LUCA, et al., 1994; NEWTON &

MESSING, 2006). AChE, NTPDases1 e as três isoformas de NTPDase2 apresentam

possíveis sítios de fosforilação para PKC. As sequências das proteínas foram analisadas

através do NetPhosk, uma ferramenta que prediz possíveis sítios de fosforilação para

diversas proteínas quinase. A alteração da atividade das ecto-nucleotidases e AChE poderia

também ser atribuída ao efeito destes álcoois na via de sinalização envolvida e na possível

modulação pós-traducional destas enzimas. Além das modulações promovidas por

xenobióticos, o maquinário de transcrição é continuamente controlado por um complexo

sistema de sinalização, criando um ajuste no perfil de expressão gênica na célula. Assim,

esta transdução pode ser exercida por proteínas e produtos de reações enzimáticas capazes

de regular os fatores de transcrição (KRISHNA et al., 2006). Este fenômeno é conhecido

como “negative feedback loop”, na qual ocorre uma interface nas vias metabólica e gênica

e poderia explicar o aumento na atividade com a concomitante redução na nos níveis de

mRNA para a AChE em cérebro de zebrafish após aguda exposição ao etanol.

O acetato produzido a partir da degradação do etanol rapidamente é capaz de

ultrapassar a barreira-hemato-encefálica, sendo metabolizado no cérebro. Este metabólito

pode ser destinado à formação de Acetil CoA utilizado na geração de energia até CO2 e

H2O (CARMICHAEL et al., 1991). Evidências têm sugerido que o acetato extracelular

pode ser acumulado e liberado através dos nervos terminais colinérgicos após o estímulo

(CARROL, 1997), resultando em um aumento nos níveis de ACh na fenda sináptica.

Conseqüentemente, este aumento de ACh poderia induzir um aumento na atividade da

89

AChE por um efeito estequiométrico, que poderia representar um importante mecanismo

compensatório no sentido de manter o controle dos níveis de ACh durante a exposição de

etanol. Desde que o tratamento com acetato não alterou a atividade da AChE, é possível

excluir a ação deste metabólito em mediar efeitos induzidos pelo etanol.

Além disso, o etanol está envolvido na ação de diversos neurotransmissores e

neuromoduladores, incluindo a adenosina. A conversão de acetato em Acetil CoA requer

ATP e forma AMP. Este AMP é convertido a adenosina através da 5’-nucleotidase

(BIANCHI & SPYCHALA, 2003). Outro mecanismo envolve uma inibição promovida

pelo etanol no transportador bidirecional de adenosina (ENT1), levando a um acúmulo de

adenosina no espaço extracelular (CHOI et al., 2004). Portanto, as respostas inibitórias

promovidas pela exposição aguda ao metanol e ao etanol na atividade e expressão das

NTPDases poderiam induzir a uma menor formação de adenosina, uma vez que o

prolongado aumento dos níveis de adenosina durante o consumo de etanol pode levar a uma

alteração da sensibilidade aos receptores de adenosina (KISELEVSKI, et al., 2003).

III.1.3. Efeito in vitro do metanol e etanol sobre ectonucletidases e AChE

Metanol e etanol também foram testados in vitro com o objetivo de verificar se estes

compostos podem modificar a atividade das ecto-nucleotidases e AChE diretamente. As

enzimas AChE e ecto-5´-nucleotidase não tiveram alterações induzidas por metanol nas

suas atividades. Por outro lado, a hidrólise do ATP e do ADP apresentou uma inibição

significativa em altas concentrações, que representam exatamente as doses em que o

metanol é empregado nos protocolos de vitrificação. Embora o metanol seja um importante

crioprotetor (ZHANG, et al., 2005), este álcool foi capaz de inibir outras atividades

90

enzimáticas, tais como LDH e G6PD (ROBLES et al, 2004). Metanol, quanto testado in

vitro na concentração de 3%, promoveu uma inibição na hidrólise de ATP e ADP.

Entretanto, a hidrólise de AMP e AChE não foram alteradas após a exposição in vitro.

Baseado nesses dados é possível sugerir que o metanol não atue diretamente nas NTPDases

e AChE cerebrais de zebrafish nas baixas concentrações testadas, levando a investigar um

possível mecanismo indireto que este composto foi capaz de induzir após a exposição in

vivo. Álcoois, devido as suas propriedades lipofílicas, podem ligar-se fortemente a

proteínas, alterando suas estruturas terciárias (NEUHAUS-STEINMETZ & RENSING,

1997), bem como características das membranas biológicas (CARMICHAEL, et al., 1991).

A atividade NTPDásica após o tratamento in vivo com etanol apresentou uma

inibição significativa, enquanto que alterações não foram observadas nos ensaios in vitro.

Estes resultados permitem concluir que o etanol pode não agir diretamente, mas

indiretamente através dos seus metabólitos, acetaldeído e acetato. A geração de radicais

livres do oxigênio e de aldeídos reativos, como conseqüência do consumo excessivo do

etanol, tem sido bem estabelecida e indica que o acetaldeído e produtos aldeídicos da

peroxidação lipídica podem ligar-se às proteínas nos tecidos dando forma a aductos estáveis

(NIEMELA, 2001). Além disso, as respostas neuronais ao álcool envolvem diversas vias

ativadas por hormônios e neurotransmissores, conduzindo mudanças sobre a expressão

gênica e na função neuronal a curto (agudo) e a longo prazo (crônico) (DIAMONT &

McINTIRE, 2002). Assim, o efeito inibitório in vivo observado nos parâmetros

transcricional e cinético podem estar associados à formação de toxicidade através de

aductos e dano oxidativo. Após o consumo de álcool, o etanol é metabolizado

primariamente no fígado através de diversos mecanismos, incluindo ADH, CYP2E1 e

catalase. Acetaldeído é hidrolidado através da ALDH formando acetato. Além disso, sabe-

91

se que o acetaldeído e o acetato têm um papel chave em mediar as ações do etanol no

cérebro (ISRAEL et al., 1994; DEITRICH, 2004; QUERTERMONT et al., 2005). Com o

objetivo de entender o possível efeito dos produtos da degradação do etanol, o efeito do

acetaldeído e acetato foram testados in vitro sobre a atividade das ecto-nucleotidases e

AChE. Acetaldeído promoveu uma inibição na atividade NTPDásica de maneira

concentração-dependente, enquanto que a atividade da ecto-5’-nucleotidase foi inibida

igualmente em todas as concentrações testadas. A atividade da AChE também foi inibida de

maneira concentração-dependente. O acetato é uma molécula que promove significativos

efeitos no SNC e pode tanto potenciar ou antagonizar os efeitos da molécula de etanol

(CARMICHAEL et al., 1991). Entretanto, acetato in vitro não foi capaz de modificar as

atividades das ecto-nucleotidases e da AChE.

Assim, estes resultados mostram as ações induzidas por metanol e etanol nas ecto-

nucleotidases e acetilcolinesterase em cérebro de zebrafish. Esta investigação avaliou a

relação entre estes álcoois, reconhecidos por agir na neurotransmissão, e as enzimas

responsáveis pela hidrólise nos neurotransmissores ACh e ATP. As alterações

transcricionais e cinéticas observadas nestas enzimas após o tratamento agudo com metanol

e etanol sugerem que os sistemas purinérgico e colinérgico são interessantes alvos para

potenciais estudos farmacológicos. Nossos resultados poderiam ajudar a esclarecer a

importância dos efeitos neuroquímicos desses influentes sistemas de neurotransmissão

associados ao consumo destes compostos.

92

III.2. Conclusão final

Com os resultados apresentados nesta Dissertação de Mestrado, nós podemos

concluir que as ectonucleotidases e a acetilcolinesterase são alteradas tanto na sua atividade

quanto na expressão gênica no padrão de expressão em cérebro de zebrafish. Essas

modificações mostram que essas enzimas são sensíveis à ação de metanol e etanol,

sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico parecem estar envolvidos na

neurotoxicidade mediada por estes álcoois.

Portanto, nosso trabalho contribui para um melhor esclarecimento sobre a

farmacologia destes álcoois e o papel destas enzimas nas respostas induzidas pelo

tratamento agudo do metanol e etanol no SNC de zebrafish.

93

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Anexos

Lista de Figuras:

Figura 1: Zebrafish (Danio rerio)........................................................................................07