induccion de inflamacion pulpar por mastocitos estimulados por sustancia p via alterna a nk1

INDUCCION DE INFLAMACION PULPAR POR MASTOCITOS ESTIMULADOS POR

SUSTANCIA P VIA ALTERNA A NK1

Residentes: David TanoCarlos TeránBiología Oral

Universidad El BosquePostgrado Odontología 2009

Presentado a: Dr. Juan Carlos Munévar

Tabla de Contenido Introduccioón Planteamiento Del Problema. Justificación. Marco Teórico. Situación Actual En El Área De Investigación Objetivo General. Objetivos Específicos. Metodología Del Diseño Experimental: Método Experimental Tamaño De La Muestra Recolección De La Información, Análisis De Los Datos Resultados Esperados. Generación De Nuevo Conocimiento: Cronograma Compromisos y estrategia de divulgación. Presupuesto. Bibliografía. Reflexión sobre impacto del proyecto. Reflexión sobre la pertinencia.

Membrana plasmática de las células diana

Sintetizados y liberados por las neuronas

Neuropéptido

Introducción

Cadenas polipeptídicas de 3-100 aminoácidos y hasta 50 veces más grande que los neurotransmisores clásicos, tienen

estructura tridimensional.

Sustancia P (SP).

Péptido relacionadas con el gen de la calcitonina (CGRP).

Neurocinina A (NKA).

Neuropéptido Y (NPY).

Polipéptido Vasoactivo intestinal (VIP).

Activación de receptores

Neuropeptides in Dental Pulp: The Silent Protagonists. Javier Caviedes-Bucheli, DDS, MSc, Hugo Roberto Muñoz, DDS, MSc, María Mercedes Azuero-Holguín, DDS, and Esteban Ulate, DDS JOE — Volume 34, Number 7, July

2008

SUSTANCIA P

En el cerebro SNP (iris, piel, y en la pulpa) En la mayor parte de las áreas del SNC Concentraciones elevadas hipotálamo y en el asta dorsal de la médula espinal

Distribución Se ha demostrado la presencia

de Sustancia P


2008

Introducción

SUSTANCIA P

La expresión del receptor de SP en el tejido pulpar de humanos es significativamente mayor durante el desarrollo clínico fenómenos inflamatorios

SP

Liberado por las neuronas en diversos tipos de estímulos nocivos y por estimulación eléctrica de las fibras C amielínicas aferentes


2008

Introducción

Planteamiento del problema

La pulpitis o inflamación del órgano pulpar es una patología que se produce por diversos estímulos que tiene como resultado el

aumento de permeabilidad del sistema circulatorio y el posterior edema, presentándose esta en una alta incidencia a nivel de la

población mundial. Es bien conocido el papel que juegan los neuropéptidos en la inflamación neurogénica y en los procesos

de inflamación pulpar lo cuales están determinados en alto porcentaje por la acción de las sustancia P sobre el endotelio

vascular provocando vasodilatación y edema pulpar.

Justificación

La caries dental es la principal, enfermedad que afecta los tejidos dentales y puede afectar al órgano pulpar desencadenando la inflamación pulpar; los neuropéptidos desempeñan un papel importante, en la producción de esta patología, debido a la acción directa sobre el endotelio vascular y las activación de células que promueven la vasodilatación, identificar los mecanismos que la producen y la inhibición de estos, la liberación de histamina por parte de los mastocitos está relacionada con el incremento de la vasodilatación; resulta importante en el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de las afecciones pulpares.

Objetivo General

Determinar la asociación entre el efecto de la sustancia p en el mastocito y su efecto en

la inflamación pulpar

Objetivos Específicos

Determinar la función del mastocito en el proceso de inflamación pulpar.

Determinar los mecanismo por los cuales la sustancia p actúa sobre el mastocito.

Conocer la repuesta del tejido pulpar cuando se inhibe el gen codificador de receptores NK1 en los mastocitos pulpares

Planteamiento del Problema

En que porcentaje disminuye la inflamación del tejido pulpar al suprimir el gen que codifica los receptores NK1 en los mastocitos.

Justificación

La caries dental es la principal enfermedad que afecta los tejidos dentales y esta puede afectar al órgano pulpar

desencadenando la inflamación pulpar; los neuropéptidos desempeñan un papel importante, en la producción de

esta patología, debido a la acción directa sobre el endotelio vascular y la activación de células que

promueven la vasodilatación , identificar los mecanismos que la producen y la inhibición de estos, resulta

importante en el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de las afecciones pulpares. La liberación de

histamina por parte de los mastocitos esta relacionada con el incremento de la vasodilatación.

Hipótesis

Hipótesis Nula

No existe diferencia en la inflamación pulpar con la expresión del receptor NK1 en los mastocitos

Hipótesis Alterna

Existe diferencia en la inflamaciónón Pulpar con la expresión del receptor NK1 en los mastocitos.

Marco Teórico

Neuropéptidos

•Sustancias de naturaleza proteica que se encuentran distribuidas en el sistema nervioso. •En la pulpa dental se ha reportado la presencia de tres neuropéptidos que se originan de fibras nerviosas sensoriales del ganglio trigeminal. •La sustancia P (SP), el péptido del gen relacionado con la calcitonina (CGRP) y la neurokinina A (NKA). •Neuropéptido Y (NPY), de origen simpático y el péptido intestinal vasoactivo (VIP) de probable origen parasimpático.

BOWLES WR, WITHROW JC, LEPINSKI AM, HARGREAVES KM. Tissue Levels of Inmmunoreactive Substance P are increased in Patients with Irreversible Pulpitis. J Endod 2003; 29: 265-67.

CLASIFICACION

Taquicininas(SP y NKA)

NPY

VIP

CAVIEDES J, MUÑOZ R, AZUERO M, ULATE E. Neuropeptides in Dental Pulp: The silent Protagonists. J Endod 2008; 34:773-88

Parte central de la pulpa

En la periferia

Las fibras SP atraviesan las proximidades de los vasos

sanguíneos

Están directamente relacionadas con los pequeños vasos sanguíneos

Se observan en la capa subodontoblastica donde se ramifican hacia predentina, con algunas fibras SP que penetrar en la

dentina.

SUSTANCIA P

SP (sustancia P)

Primer neuropéptido que se identifico en los tejidos dentales.


2008

Gen Codificador

• Preprotachykynin I (PPT-I) y Preprotachykinin II (PPT-II). gen •PPT-I puede expresar cuatro distintas formas de mARN a través de splicing alternativo•Formas b y g codifican la síntesis de sustancia P y neurokinina A•Formas a y d codifican para sustancia P únicamente.

O`CONNOR TM, O´CONELL J, O´BRIEN DI, GOODE T, SHANAHAN F. The role of substance P in inflammatory disease. J Cell Physiol 2004; 201: 167-180

Composición Química•La sustancia P pertenece a una familia de neuropéptidos conocidos como Tachykinins (Taquicininas), secuencia común carboxil- terminal. •Estructura es Phe- X- Gly- Leu- Met- NH2, donde X es un aminoácido aromático (Tyr o Phe) o hidrofóbico (Val o Ile)

En 1971, Chang y Leeman, identificaron la sustancia P como un undecapéptido (formado por 11 aminoácidos), y

fueron los primeros en sintetizar el compuesto.

Arg- Pro- Lys- Pro- Gln- Gln- Phe- Phe- Gly- Leu- Met- NH2

HÖKFELT T, PERNOW B, WAHREN J. Substance P: a pioneer amongst neuropeptids. Journal of Internal Medicine 2001; 249: 27-40

Actividades Biológicas

•Originada en las fibras nerviosas sensitivas van a generar un vasodilatación lo que va a dar inicio al aumento de la presión sanguínea local.

•Salida del fluido dentinal iniciando eventos de fuerzas hidrodinámicas y aumento de la presión local de los tejidos.

•Sitio de acción va a ser los vasos sanguíneos y las fibras nerviosas simpáticas.

M.R. Byers and M.V.O. Narhi. Dental Injury Models: Experimental Tools for Understanding Neuroinflammatory Interactions and polymodal nociceptors functions. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999; 10; 4


•Participa en varias respuestas de comportamiento.

•Regulación de la supervivencia y degeneración neuronal.

•Funciones cardiovascular y respiratoria y en la activación de los reflejos eméticos.

•Neurotransmisión del dolor y estímulos nocivos, y modula los reflejos autónomos.

•En el sistema nervioso periférico se localiza principalmente en las neuronas sensoriales y neuronas propias de los tractos gastrointestinal, genitourinario y respiratorio.

O`CONNOR TM, O´CONELL J, O´BRIEN DI, GOODE T, SHANAHAN F. The role of substance P in inflammatory disease. J Cell Physiol 2004; 201: 167-180.


Saban R, Gerard N, Nguyen N, De Boer D and Wershil B. Mast cells mediate substance p-induced bladder inflamation trough an Nk1 recptor independent mechanism. Am J Physiol 283:F616-F629, 2002.

•.

•Una via potencial que puede mediar la inflamación neurogenica es la interacción entre los mastocitos y el neuropéptido y sustancia P.



•.

•La respuestas de la sustancia P son mediadas por receptores de neurokininas acoplados a la proteina G, el receptor NK1 es el subtipo de receptor predominante involucrado en los procesos inflamatorios y es expresado por celulas endoteliales, glandulas mucosas y leucocitos circulantes.



•.

•En a pulpa la extravasación del plasma inducida por la sustancia P parece ser modulada por los receptores NK1.

•La segregacion de histamina por parte de los mastocitos es mediada por la sustancia P.

Inflamación pulparLas causas del dolor dentinario no están de todo claras, los estudios han verificado que los dientes con caries que se

extienden hasta la dentina muestran pulpitis, la mayoría de estos dientes pueden estar asintomáticos, y las características

histológicas de esta patología incluyen el infiltrado de leucocitos y la extravasación del plasma de los vasos de la

pulpa, sin embargo dientes que posean estas características pueden mostrar rasgos clínicos diferentes, confundiendo el diagnostico, la duración del dolor es utililizada para medir si

existe una pulpitis irreversible en caso del que el dolor se prolongue en el tiempo, en caso contrario se sospecha de un edema pulpar, el cual pudiera ser un estadio reversible, esta

regla es algo burda e inexacta, pero en la actualidad no disponemos de métodos que sean mejores

COHEN S, HARGREAVES K. Vías de la Pulpa. 9na Edición. 2008 ELSEVIER, Madrid España.

Inflamación pulpar

La pulpitis es una inflamación de la pulpa dental que puede ocurrir cuando existe una injuria de este tejido mediante un estimulo ya sea la caries o sus derivados bacterianos que invaden la pulpa dental, lo que lleva a la infección, o por acción de traumas físicos ya sean fracturas o químicos por acción de agentes irritantes.

NGUYEN DH, MARTIN JT. Common Dental Infections in the Primary Care Setting. Am Fam Physician. 2008 Mar 15;77(6):797-802

Situación Actual En El Área De Investigación

Se ha comprobado que los mastocitos a través de la liberación de histamina pudiera ser una vía potencial para generar un

aumento de la permeabilidad vascular, y ha estudiado hasta la actualidad que estas células pudieran poseer un mecanismo

alterno independiente de los receptores de NK1 que produce la liberación de histamina, este hecho fue comprobado en un

experimento en la cuales e utilizaron ratones KO, en los cuales se bloquearon el gen codificador de receptor NK1, y se realizo una toma de muestra de tejido de la vejiga, y se demostró que

los mastocitos se degranulaban por una vía alterna independiente del receptor NK1.

Objetivo general

Determinar la asociación entre el efecto de la sustancia P en el mastocito y su efecto en

la inflamación pulpar

Objetivos especificos

•Determinar los cambios histológicos que se producen en el tejido pulpar por medio de la liberación de histamina por parte de los mastocitos en los procesos inflamatorios de la pulpa dental.

•Conocer si existe una vía de activación alterna para la liberación del histamina por parte del mastocito pulpar, cuando se suprime el gen del receptor NK1.

•Conocer la respuesta del Tejido Pulpar cuando se inhibe el gen codificador del receptor NK1 en los mastocitos pulpares.

Metodología Diseño Experimental

El presente proyecto corresponde a un estudio experimental controlado de tipo in Vivo, el cual se realizara en ratones siendo esta especie, común en sus genoma con el humano.

Animales: 2 grupos de ratones machos, de 10 a 12 semanas de nacidos. Grupo 1 Ratones Ko del Gen codificador receptor NK1, Grupo 2 Control ratones tipo Wild Type, cada grupo consta de 6 especímenes. Los ratones serán adquiridos a Jackson Laboratorios (Barharbor, ME, USA;. http://www.jax.org/).

Protocolo de sensibilización con Antígenos

Todos los animales de este estudio deben ser sensibilizados por vía intraperitoneal con un microgramo de DNP4-HSA en un miligramo de alumbre en los días 0, 7, 14 y 21. En los ratones normales este protocolo induce a valores sostenidos de anticuerpos IgE, hasta 56 días post sensibilización y una deficiencia de los mastocitos hasta desarrollar respuestas normales a la IgE. Una semana después de la sensibilización se inducirá a la inflamación pulpar.

Proceso de inducción a inflamación pulpar

Se realizara de la siguiente manera; anestesia con Isofluorano al 5 %, Inducción de Inflamación Pulpar en ambos grupos mediante exposición pulpar al medio oral a través de un cavidad realizada en la cara vestibular de las piezas dentarias con fresa de calibre ½ de carburo con pieza de mano de alta velocidad.Posterior a una semana, un veterinario realizara la eutanasia con Eutanex, lo cual genera un paro respiratorio. Posteriormente se realizara la extracción de los dientes, se procesaran las muestras y su posterior evaluación por medio de Cortes Histológicos, y extracción de RNAm.

Evaluación Histológica de la Inflamación

Las muestras serán procesadas mediante la fijación en formaldehido, deshidratación en alcohol, fijación en parafina,

tinción con hematoxilina eosina o giemsa, cortes histológicos de 5 nm y observación en Microscopio Óptico, para evaluar la

presencia de inflamación pulpar. En las muestras se evaluara la presencia de edema, acumulación de células inflamatorias y número de mastocitos presentes. Los cortes serán evaluados usando una cámara digital Nikon (DXM1200) montada en un

microscopio Nikon(Eclipse E600) y el análisis de las imágenes se realizara usando el sistema de Imágenes Metamorph.

Preparación de la Muestra de los Segmentos de ADN complementario

Se realizara una homogeneización de los tejidos pulpares extraídos de las piezas dentarias inducidas a inflamación pulpar tanto del grupo control como del grupo experimental, disociando las células e inhibiendo las nucleasas, bajo temperaturas bajas, congelando la muestra en nitrógeno liquido, para luego pulverizarlo y centrifugarlo y obtener muestras de RNA total, y posterior aislamiento RNAm de la histamina, las cuales se obtendrán pasando la muestra por una columna que contiene poli-dt, quedando retenido en la fase solida. La cantidad de RNAm será medida mediante una espectrofotometría y posteriormente teñido con bromuro de etidio para su visualización. Luego se empleara una enzima transcriptasa reversa para obtener a partir del mRNA un cDNA o ADN complementario.

Tamaño de Muestra

La muestra se calculará de forma arbitraria, tomando como referencia estudios experimentales en lo que se utilizan este tipo de animales en los cuales el número de referencia es de seis animales como mínimo para cada grupo de estudio.

50´sRUSSELBURCH

Las 3 Rs

Reemplazo relativo

En caso de procedimientos que impliquen dolor o sufrimiento animal, se deben sedar o paralizar por métodos químicos, y cuando esto no sea posible, porque el experimento lo requiera, se deben tratar los animales como seres sensibles que sienten dolor, y en caso de invalidez, sufrimiento o incapacidad imposible de aliviar, se tomara la decisión de la eutanasia por métodos indoloros.

. Los animales que se tienen para experimentación deben provenir en lo posible de

bioterios.

Recolección de la Información

La información obtenida de la pruebas de observación de cortes histológicos será recopilada indicando que criterio de inflamación que le corresponda a cada una de las muestras, tanto para el grupo de control como para el grupo experimental. El numero de mastocitos presente y la presencia de degranulación será cuantificado y los resultados compilados en una tabla para luego determinar el porcentaje.

Nivel de inflamación Leve Moderado Severo

1

2

3

4

5

6

Nivel de inflamación Leve Moderado Severo123456

Cuadro No 1 Grupo de estudio

Cuadro No 2 Grupo control

Recolección de la Información

Para determinar los niveles de histamina expresados por los mastocitos de ambos grupos, se determinara si hubo expresión de DNA complementario, compilando la información en dos tablas que contienen cada uno de los especímenes para cada grupo y donde se señala si hubo o no expresión de esa molécula luego de someterse a la reacción de transquiptasa reversa.

Expresión de cDNA de histamina

Presencia Ausencia

1

2

3

4

5

6

Cuadro No 3 grupo de estudio

Expresión de cDNA de histamina

Presencia Ausencia

1

2

3

4

5

6

Cuadro No 4 grupo control

Análisis Estadístico

Una vez tabulados los resultados en sus respectivas tablas al análisis de los resultados de los cortes histológicos se le aplicara la prueba estadística del Chi2. En cuanto al análisis de los resultados de la obtención de cDNA, por ser variables dicotómicas cuantitativas se aplicara el porcentaje y el grado de signos variables de wilcoxon. Ambos datos serán procesados por el software estadístico SPPS versión 10(SPSS Inc. Chicago IL, USA).

Consideraciones Éticas

En caso de procedimientos que impliquen dolor o sufrimiento animal, se deben sedar o paralizar por métodos químicos, y cuando esto no sea posible, porque el experimento lo requiera, se deben tratar los animales como seres sensibles que sienten dolor, y en caso de invalidez, sufrimiento o incapacidad imposible de aliviar, se tomara la decisión de la eutanasia por métodos indoloros. Los animales que se tienen para experimentación deben provenir en lo posible de biotérios en donde un veterinario con experiencia en zootecnia de Laboratorio haya supervisado su crianza y desarrollo, en caso de animales silvestres, deben venir de criaderos especializados, si su adquisición no es contraria a políticas nacionales de conservación de fauna.

Resultados esperados:

En caso que se demuestre que la supresión del receptor no interfiere con la segregación de histamina por parte de los

mastocitos se puede descartar esta posibilidad y plantear nuevas hipótesis sobre como disminuir o inhibir la inflamación pulpar

resultante de una injuria a los tejidos dentales.

Evaluar en qué grado esto disminuye la inflamación pulpar ante una lesión, en la que se pueda desarrollar una afección

irreversible de la misma para así; evaluar las posibilidades de generar una droga capas de suprimir el receptor, o la unión del

ligando a este consiguiendo así disminuir los efectos de la inflamación sobre los tejidos pulpares impidiendo así la necrosis

de esta.

Actividad Semanas1 2 3 4 5 6

Crianza de ratones y sensibilización X X XInducción a inflamación pulpar XEutanasia y toma y procesamiento de muestras XEvaluación de las muestras XAnálisis de los resultados XPreparación de articulo final X

Cronograma de Actividades

Compromisos y estrategia de divulgación:

El presente estudio es de gran interés para la comunidad odontológica mas específicamente para la endodoncia por lo tanto este se debe divulgar por todos los medios posibles como artículos en revistas científicas, presentaciones en congresos nacionales e internacionales y charlas en diferentes centros universitarios. Ya sea que se adopte la hipótesis alterna o la nula de igual manera tiene interés científico para poder extrapolarlo a diferentes comunidades donde se quiera experimentar con los objetivos de este estudio.

BIBLIOGRAFIA•BOWLES WR, WITHROW JC, LEPINSKI AM, HARGREAVES KM. Tissue Levels of Inmmunoreactive Substance P are increased in Patients with Irreversible Pulpitis. J Endod 2003; 29: 265-67.

•CAVIEDES J, MUÑOZ R, AZUERO M, ULATE E. Neuropeptides in Dental Pulp: The silent Protagonists. J Endod 2008; 34:773-88.

•O`CONNOR TM, O´CONELL J, O´BRIEN DI, GOODE T, SHANAHAN F. The role of substance P in inflammatory disease. J Cell Physiol 2004; 201: 167-180.

•HÖKFELT T, PERNOW B, WAHREN J. Substance P: a pioneer amongst neuropeptids. Journal of Internal Medicine 2001; 249: 27-40.

•M.R. Byers and M.V.O. Narhi. Dental Injury Models: Experimental Tools for Understanding Neuroinflammatory Interactions and polymodal nociceptors functions. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999; 10; 4.

•PATEL T; PARK SH; LIN LM; CHIAPPELLI F; HUANG GT. Substance P induces interleukin-8 secretion from human dental pulp cells. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2003 Oct;96(4):478-85.

•Saban R, Gerard N, Nguyen N, De Boer D and Wershil B. Mastcells mediated substance p-induced bladder inflamation trough an NK1 receptor independent mecanism. Am J Physiol 283:F616-F629,2002.

•NGUYEN DH, MARTIN JT. Common Dental Infections in the Primary Care Setting. Am Fam Physician. 2008 Mar 15;77(6):797-802.

•COHEN S, HARGREAVES K. Vias de la Pulpa. 9na Edición. 2008 ELSEVIER, Madrid España.

Reflexión sobre el impacto del proyecto:

Actualmente muchas investigaciones están basadas en la regeneración de los tejidos ya sean órganos completos o tejidos

complejos como los dientes. En todo caso se quiere evitar la colocación de agentes extraños ya sean órganos trasplantados o prótesis para reemplazar tejidos dañados. También esto conlleva a la supresión de los sistemas inmunes del organismo para evitar

los efectos adversos que traen como consecuencia.

Reflexión sobre la pertinencia:

Actualmente en el campo de la endodoncia se están buscando nuevas alternativas al tratamiento de conductos radiculares ya sea mediante la revascularización de los tejidos pulpares como la regeneración de estos mediante células stem y factores de

crecimiento con resultados bastante alentadores.

Un paso importante en este campo seria el de disminuir la inflamación luego de una injuria mediante drogas que

inhiban el sistema inmune del organismo que conllevarían a la inflamación pulpar ya que este es el principal causal de la necrosis pulpar ante una injuria por invasión bacteriana o

lesión traumática

Presupuesto

induccion de inflamacion pulpar por mastocitos estimulados por sustancia p via alterna a nk1

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