INDICE

• Bromuro di Etidio

• Trizol

• Cloroformio -mercaptoetanolo

• Guanidina tiocianato

• Dimetilsulfossido

• Diaminobenzidina (DAB)

Elettroforesi

L’elettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare frammenti di DNA

Il gel può essere costituito da agarosio o da poliacrilamide

I gel di poliacrilamide sono usati per separare frammenti di DNA < 500 bp e hanno un’elevata risoluzione, ma sono più difficili e pericolosi da maneggiare rispetto ai gel di agarosio

I gel di agarosio sono semplici da preparare e sono tipicamente usati per separare frammenti di dimensioni variabili da poche centinaia di basi a 20 kb. Vengono largamente utilizzati per la maggior parte delle analisi routinarie su DNA/RNA

L’agarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’agarosio

ReagentiTBE: tampone più comunemente usato per l’elettroforesi

T Tris,consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione

E EDTA, chela i cationi bivalenti, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasi richiede cationi bivalenti per

funzionare

B Borico che fornisce l’appropriata forza ionica al tampone

Bromuro di Etidio

Uno dei coloranti più utilizzati è il bromuro di etidio, molecola organica aromatica planare, altamente tossica, cancerogena e mutagena, in grado di intercalarsi tra le basi azotate e di emettere luce arancio se eccitata da radiazione UV con compresa tra 254 e 306 nm. Questo colorante è in grado di evidenziare quantitativi di acidi nucleici fino a 50 ng [Old e Primrose, 1994]

Agenti cancerogeni o mutageniIn base al Dlgs 626/94 si deve intendere per “agente cancerogeno” una sostanza o un preparato che, in base alle disposizioni CEE (direttiva 67/548/CEE, direttiva 88/379/CEE) deve riportare la codifica R45 (può provocare il cancro) o R49 (può provocare il cancro per inalazione)

Se la sostituzione dell’agente cancerogeno non e’ possibile, dovrà essere utilizzato in un sistema chiuso; in tutti i casi e’ necessario accertarsi che l’esposizione all’agente nocivo sia limitata

In base all’art. 64, qualora si usino agenti cancerogeni si devono applicare le seguenti misure:

•Limitazione delle quantità nell’ambiente di lavoro

•Attuazione delle norme igieniche

•Massima riduzione possibile del numero di soggetti esposti

•Raccolta e smaltimento dei residui in condizioni di sicurezza

Dispositivi di protezione individuali

•Occhiali

•Indumenti di protezione (camice)

•Guanti protettivi

•Maschere di protezione

L’operatore può proteggersi con mezzi di prevenzione individuale,

ma l’uso di questi non può sostituire l’uso di una cappa efficiente,

ma solo integrarlo, per diminuire ulteriormente il rischio di danni

Bromuro di Etidio

T+ Molto tossico

Proprietà fisiche e chimicheStato: SolidoColore: Rosso scuroOdore: Quasi inodore

Frasi-R: 22-26-36/37/38-68 Nocivo per ingestione. Molto tossico per inalazione. Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Possibilità di effetti irreversibili

Frasi-S: 26-28-36/37-45 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente

con acqua e consultare un medico. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente ed abbondantemente con acqua e sapone. Usare indumenti protettivi e guanti adatti.

Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

Frasi-R Frasi-S

• Sono chiamate frasi R alcune frasi convenzionali che descrivono i rischi per la salute umana, animale ed ambientale connessi alla manipolazione di sostanze chimiche

• Sono chiamate frasi S alcune frasi convenzionali che descrivono i consigli di prudenza cui attenersi in caso di manipolazione di sostanze chimiche

• Sono frasi codificate dall'Unione Europea nella direttiva 88/379/CEE.

• Ad ogni frase è associato un codice univoco composto dalla lettera R seguita da un numero. Ad ogni codice corrispondono le diverse traduzioni della frase in ogni lingua ufficiale dell'Unione Europea.

• È previsto dalle attuali normative che ogni confezione di prodotto chimico rechi sulla propria etichetta le frasi R e le frasi S corrispondenti al prodotto chimico ivi contenuto.

Bromuro di Etidio

Evitare la contaminazione personale anche con l’uso di dispositivi di protezione

personale (camice, guanti)

I residui non devono essere dispersi nell’ambiente, ma sottoposti ad

ossidazione, o assorbimento su resine o carbone attivo. Il responsabile del

laboratorio deve scegliere una zona in cui potrà essere maneggiata tale

sostanza

La zona scelta dovrà essere segnalata in modo visibile. Tutte le operazioni che

richiedono l’impiego del bromuro di etidio dovranno essere effettuate entro l’area

evitando così contaminazioni di altre porzioni dell’ambiente lavorativo.

AccorgimentiPer la preparazione del gel di agarosio, qualora sia possibile, bisogna utilizzare materiale monouso:

•Sciogliere l’agarosio in una beuta di vetro

•Versare il contenuto in un contenitore di plastica monouso

Sotto cappa chimica:

•Aggiungere il Bromuro di Etidio utilizzando puntale con filtro, che, dopo l’utilizzo deve essere gettato in contenitori appositi non perforabili presenti sotto cappa

•Fare attenzione a non sporcare la pipetta con il colorante durante questa operazione

•Richiudere il contenitore di plastica

•Gettarlo nell’apposito contenitore per lo smaltimento dei rifiuti fornito dall’Azienda

Durante tutta la preparazione del gel controllare che i guanti siano puliti per evitare qualsiasi tipo di contaminazione

Alternativa al BrEt (1)Ove sia tecnicamente possibile e’ obbligatorio sostituire eventuali agenti cancerogeni in uso, con altre sostanze o prodotti non nocivi o meno nocivi

Il blu di metilene rappresenta una alternativa al bromuro di etidio quando la concentrazione di acidi nucleici non è un fattore critico. L'unico vantaggio è rappresentato dalla scarsa tossicità della molecola utilizzata [Old e Primrose, 1994]

R 22: Nocivo in caso di ingestione

A temperatura ambiente si presenta come un solido blu scuro quasi inodore

Alternativa al BrEt (2)

• SYBR Green II RNA Gel Stain:è un colorante intercalante che si lega al prodotto di PCR producendo un segnale molto intenso

• Il prodotto non è codificato conformemente alle direttive CEE/norme sulle sostanze pericolose perché non contiene componenti pericolosi– Sulla pelle: non ha effetti irritanti

– Sugli occhi: non irritante

– Sensibilizzazione: non si conoscono effetti sensibilizzanti

• Nella manipolazione osservare le misure di sicurezza usuali impiegate nell’utilizzo di sostanze chimiche

Trizol• Reagente utilizzato per le estrazioni di RNA da sangue in toto, da cellule e

da tessuto• Permette l’estrazione contemporanea di DNA e di proteine dalla fase

organica• Soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato

Il prodotto è classificato ed etichettato secondo Direttiva 1999/45/CE

ClassificazioneIndicazione di pericolo

T Tossico

Frasi “R”R34-Provoca ustioniR26/27/28-Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione

Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

Cloroformio

R22: Nocivo per ingestione

R38: Irritante per la pelle

R40: Possibilità di effetti cancerogeni- prove insufficienti

(Direttiva2001/59/CE della commissione

R48/20/22: Nocivo: pericolo di gravi danni alla salute in caso di esposizione

prolungata per inalazione ed ingestione

S(02): (conservare fuori della portata dei bambini)

S36/37: Usare indumenti protettivi e guanti adatti

Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

Stato fisico; Aspetto:

Liquido incolore, con odore caratteristico

ß-mercaptoetanoloUtilizzo: Estrazione di RNA totale da cellule eucariotiche

T+ Molto TossicoN Pericoloso per l’ambiente

R22: Nocivo per ingestioneR24: Tossico a contatto con la pelleR34: Provoca ustioni

Forma: LiquidoColore: IncoloreOdore: Forte

Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

ß-mercaptoetanoloACCORGIMENTI

Essendo molto pericoloso, in caso di contatto cutaneo (corrosivo, assorbito attraverso la pelle), utilizzarlo sempre indossando camice, guanti protettivi e verificare che durante i singoli passaggi non si verifichi contaminazione degli stessi.

Utilizzare sempre puntali con filtro

Al termine dell’utilizzo, prima di chiudere la cappa chimica, verificare che il contenitore utilizzato per lo smaltimento dei rifiuti sia chiuso per evitare dispersione degli odori perché

Il ß-mercaptoetanolo è molto pericoloso in caso di inalazione (corrosivo per i polmoni)

Guanidina tiocianato

Nocivo

Frasi-R

R20/21/22: nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione

R32: a contatto con acidi libera gas altamente tossici

R36/38: irritante per gli occhi e la pelle

Frasi-S

S14: conservare lontano da acidi (forti)

S23: non respirare i vapori

S36/37: usare indumenti protettivi e guanti adatti

Dimetilsulfossido

Impieghi

Preparazione della soluzione di congelamento per criopreservazione:– Linee cellulari

– Sospensioni linfocitarie

– CSEP

– BM

Dimetilsulfossido

Frasi di Rischio

R36: Irritante per gli occhi

R37: Irritante per le vie respiratorie

R38: Irritante per la pelle

Frasi di Sicurezza

S23: non respirare i fumi

S26: in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico

S36/37: Indossare indumenti protettivi e guanti adatti

Xi Irritante

Dimetilsulfossido

Limite di esposizione personale

Non è stato definito alcun limite di esposizione

Dispositivi di protezione individuale

Protezione respiratoria: nessuna raccomandazione specifica

Protezione degli occhi: utilizzare gli occhiali di sicurezza

Protezione delle mani: utilizzare guanti adatti

Protezione della pelle: indossare indumenti protettivi adatti

Misure da adottare in caso di versamento accidentale

Precauzioni individuali: evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti

Metodi di pulizia: raccogliere quanto possibile in un recipiente pulito per lo

smaltimento. Sciacquare i residui con molta acqua

Diaminobenzidina (DAB)

La morfologia è il principale criterio per la diagnosi di LAL e per la differenziazione dalle LAM

Non sempre l’osservazione della morfologia delle cellule è sufficiente per inquadrare con esattezza l’origine linfoide o mieloide della leucemia perciò su di uno striscio di sangue midollare viene testata la reazione della PEROSSIDASI

La PEROSSIDASI è un enzima che appartiene alla classe delle ossidoriduzioni, cioè catalizza l’ossidazione di un substrato rimuovendo due atomi di idrogeno che vengono a combinarsi con una molecola di acqua ossigenata. Nel nostro caso il substrato è la DIAMINOBENZIDINA

Reazione di ossidoriduzione

Per azione della perossidasi contenuta nei lisosomi cellulari, la DAB si riduce formando un precipitato di colore giallo-bruno:

Perossidasi

+ H2O2 + 2 H2O

DAB (ossidato) DAB (ridotto)

Risultano positive a questa reazione le cellule che, sul vetrino, assumono una pigmentazione granulare giallo-bruna e ciò accade per le cellule della linea promielocitaria e monocitaria. Quando queste cellule sono presenti con una percentuale < 3% si valuta la leucemia di origine linfocitaria

DAB

Xn

Nocivo

Frasi-R

R40: possibilità di effetti irreversibili

Frasi-S

S36/37: usare indumenti protettivi e guanti adatti

Proprietà fisiche e chimiche

Forma: Liquido

Colore: Chiaro

Odore: Inodore

Detergente consigliato:

acqua eventualmente con l’aggiunta di detersivi

Manipolazione

Indicazioni per una manipolazione sicura:

Non sono richiesti provvedimenti particolari

Stoccaggio

4°C

Non conservare a contatto con ossidanti

DABACCORGIMENTI

• Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

• Utilizzare pasteur monouso e puntali con filtro

• Versare lo scarto in contenitori appositi per lo smaltimento dei rifiuti tossici facendo attenzione a non inalare eventuali aerosol

• Lavare la vetreria con abbondante acqua e detersivi