imunologia transplantului cardiac

8/7/2019 imunologia transplantului cardiac

1/40

Imunologia Transplantului Cardiac

Dr. Manuela Anda Andrei ( Radu Popescu) M. D., MSc.,

U.M.F. Carol Davila Bucureti

Cuprins

1. Scurt istoric

2. Antigenele de transplantare

3. Structura generala a complexului major de histocompatibilitate (CMH)4. Moleculele CMH de clasa I si II

5. Limfocitele T

6. Limfocitele B

7. Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT)

8. Celulele prezentatoare de antigen (CPA)

9. Citokinele

10. Inducerea raspunsului imunitar11. Tipizarea HLA (Human Leucocyte Antigens)

12. Sindroame clinice de rejet

13. Mecanismele de actiune ale imunosupresoarelor folosite in prevenirea si tratamentul rejetului

14. Xenotransplantul

15. n loc de concluzii .......

Bibliografie

Dr. Gill Strejan, Profesor Emeritus University of Western Ontario London, Canada

1. Scurt istoric

1


2/40

Primele organe au fost transplantate n secolul al XIX-lea, cnd stimulai de progresele n

tehnica suturii, chirurgii au exersat tehnica transplantului n laboratoarele de cercetare.

n anul 1905 Charles Guthrie mpreun cu Alexis Carrel realizeaz primul transplant heterotopic

canin44;45.

Douzeci de ani mai trziu conceptul de rejet al allogrefei cardiace a fost propus de Frank Mann

pentru a explica eecul allogrefei heterotopice canine152, descriind rejetul ca pe o

incompatibilitate biologic ntre donor i receptor, care se manifest printr-un proces de infiltrare

leucocitar.

Primele teorii despre mecanismul rejetului au fost sugerate de Paul Ehrlich n 190681.

n anul 1930 Karl Landsteiner primete premiul Nobel pentru descoperirea grupelor sanguine85.

nceputul erei moderne n transplant este anul 1943 cnd Medawar i Gibson au demonstrat c

rejetul este produs prin mecanisme imunologice101;180.Ray Owen a fost primul cercettor care a descris tolerana imunologic la vieii gemeni

neidentici195.

n anul 1958 Keith Reemtsma, demonstreaz c agenii imunosupresori prelungesc supravietuirea

dup transplantul cardiac, iar ntre 1963 i 1964 realizeaz primele xenogrefe transplantnd 13

rinichi de la cimpanzei la oameni93.

n anul 1960 Burnett mpreun cu Medawar au primit premiul Nobel pentru baza teoretic a

rejetului i a toleranei imunologice254.

Conceptul strii de toleran indus la organismele receptoare a organelor transplantate este i n

prezent o preocupare a cercettorilor.

Primul transplant cardiac ortotopic ncununat cu succes a fost practicat de catre Norman

Shumway i Richard Lower.

n anul 1960 ei au realizat o metod simpl de transplant cardiac ortotopic la cini folosind

tehnica butonului atrial anastomotic, asociat cu bypass-ul cardiopulmonar i conservarea grefei

prin hipotermie, ceea ce a determinat creterea duratei de supravieuire a receptorului ntre 6-21

zile la 5 din cei 8 cini147.

Dr. Christian Barnard16, n anul 1967, n Africa de Sud, realizeaz primul transplant de cord

folosind inima unui pacient n vrst de 25 ani decedat n urma unui accident rutier, care a fost

transplantat unei persone n vrst de 55 ani. Pacientul caruia i s-a transplantat cordul a

supravieuit doar 18 zile.

2


3/40

Dei din anul 1914 a fost recunoscut faptul c limfocitele infiltreaz grefa, cea mai dramatic

interacie ntre transplant i imunologie a fost descoperirea rolului complexului major de

histocompatibilitate (CMH) , cheia care determin reactivitatea imunologic.

n anul 1958, Dausset descrie primele antigene de histocompatibilitate umane evideniate pe

leucocite, denumite mai trziu Human Leucocyte Antigens (HLA)71.

Progrese importante privind tratamentul imunosupresiv, care au permis creterea ratei de

supravieuire, s-au realizat prin descoperirea ciclosporinei A de ctre Jean Borel n 197034;35.

La scurt timp dup aceasta primul anticorp monoclonal murinic fa de subunitatea de

transducie a semnalului de pe celulele T umane CD3, cunoscut sub denimirea de Orthoclone

OKT3 , a fost utilizat n transplant53.

OKT3 a fost pentru prima dat utilizat n tratamentul rejetului acut al allogrefei renale 62, fiind

superior terapiei steroidiene convenionale de stopare a rejetului i mbunataire a supravieuiriiallogrefei240;255.

OKT3 a fost, de asemenea, folosit n tratamentul rejetului acut n transplantul cardiac4.

Perioada 1984-1995 a fost caracterizat de descoperirea i folosirea n scop terapeutic a

tacrolimusului FK 506135 i a mycofenolat mofetilului6, cu rezultate bune n reducerea incidenei

episoadelor de rejet.

Efectele secundare ale tratamentului imunosupresiv prelungit determin creterea morbiditaii i

mortalitii posttransplant, de aceea scopul final rmne inducerea strii de toleran imunologic

pe termen lung i specific n absena unei terapii imunosupresive prelungite29.

n anul 1996 Peter Doherty i Rolf Zinkernagel191 au descoperit mecanismul prin care celule T

recunosc antigenele n combinaie cu CMH.

Progresele realizate n domeniul imunosupresiei, rejetului i chemoterapei anti-infecioase au

transformat ceea ce a fost doar o intervenie experimental ntr-un tratament aplicat n ntreaga

lume.

Astzi, succesul transplantului cardiac este apreciat nu numai prin supravieuirea dar i prin

mbunatirea calitaii vieii pacientului; aproape jumatate dintre pacienii transplantai

supravieuiesc peste 9 ani i ~ 25% triesc peste 17 ani252.

ntr-un studiu recent, publicat de Deuse et al. s-a semnalat o supravieuire de 20 ani a 12,5 %

dintre pacienii transplantai nainte de 1988247.

3


4/40

Cu toate aceste progrese realizate receptorii pot muri la intervale diferite de timp dup transplant

fie datorit rejetului (imunosupresie ineficient), fie infeciilor sau tumorilor (imunosupresie

agresiv)102;107;200.

Una dintre piedicile cele mai serioase n transplant este carena de donori111.

Pe lista de ateptare a UNOS (The United Network for Organ Transplantation) sunt nscrii n

prezent 94757 de candidai la grefe, iar pentru transplantul cardiac peste 2800 de pacieni259.

Disponibilul de donori de organe permite efectuarea doar a 150-160 de transplante cardiace

lunar 259.

n Canada sunt 4000 persoane nscrise pe lista de ateptare pentru transplant si se preconizeaz

c peste o jumtate dintre acetia vor muri nainte s se gseasc un donor datorit timpului prea

lung de ateptare102.

n Romnia, s-a efectuat primul transplant de cord la Spitalul Clinic de Urgena-Floreasca dinBucureti n anul 1999, beneficiarul fiind un tnar de 28 ani, pn n prezent fiind reuite 15

astfel de intervenii99;148;221;222;249-251.

Numrul mic de pacieni transplantai se datoreaz lipsei donorilor.

2. Antigenele de transplantare

Antigenele de transplantare produc un rspuns imunitar i constituie un mozaic antigenic

caracteristic fiecrui individ.

S-au descris trei tipuri de asemenea antigene de transplantare215:

de grup sanguin

de histocompatibilitate majore

de histocompatibilitate minore

Compatibilitatea de grup sanguin pentru antigenele de grup din sistemele ABO i Rh215 se

stabilete ca urmare a episoadelor de rejet hiperacut ce apar n cadrul transplantelor131;220.

Antigenele majore de histocompatibilitate sunt produsul genelor complexului major de

histocompatibilitate (CMH) care a fost identificat ca principalul locuscare determin rejetul sau

acceptarea grefelor tisulare ntre indivizi.

Pentru descoperirea CMH, Dausset, Snell i Benacerrafau primit premiul Nobel n anul 1980190.

Proprietatea sistemului imunitar de a rejeta grefele a fost la originea denumirii de complex major

de histocompatibilitate.

4


5/40

Cei doi termeni, complex i major, evoc pe deoparte numrul important de gene implicate

n reacie, violena i rapiditatea rejetului, iar histocompatibilitatea subliniaz recunoaterea

produselor CMH de ctre celulele imunitare i determin compatibilitatea sau incompatibilitatea

ntre donor i receptor.

CMH este definit, din punct de vedere genetic, ca regiunea cromozomial unde se gsesc genele

care controleaz structura i expresia moleculelor prezentatoare de antigen, iar din punct de

vedere funcional, ca ansamblul de molecule implicate n prezentarea peptidelor limfocitelor T.

Unele molecule, care particip la compoziia CMH de clasa I, de exemplu beta2-microglobulina,

sunt codificate n afara locusului CMH, n schimb TNF (Tumor Necrosis Factor), cu toate c este

codificat n aceiai regiune, pare sa nu aib nici o implicare n funcia de prezentare.

Antigenele minore de histocompatibilitate sunt proteine polimorfe care difer ntre receptor i

donor, putnd avea un rol important n rejetul grefei105.Cel mai cunoscut set de proteine, care induc rejetul, este codificat de gene situate pe cromozomul

Y234.

Femeile nu exprim aceste gene care sunt specifice sexului masculin i vor dezvolta o reacie

imun faa de H-Y, determinnd rejetul transplantului chiar daca are genotip CMH identic.

3. Structura general a complexului CMH

Primul antigen uman CMH descoperit n anul 1958 a fost numit HLA ( human leucocyte

antigen)71, denumirea semnificnd faptul c moleculele sistemului au fost detectate iniial pe

suprafaa leucocitelor.

n anul 1970, complexul HLA a fost localizat la nivelul cromozomului 6258 prin metode

imunogenetice60.

Zece ani mai trziu complexul HLA a fost localizat cu mai mult precizie pe banda 21-3 a

braului scurt al cromozomului 6186.

Studiile care au urmat au dus la identificarea la om a urmtoarelor categorii de antigene de

histocompatibilitate:

antigenele de clasa Inumite HLA-A i HLA-B n 1968136 urmate de HLA-C, doar

A i B sunt implicate n transplant;

antigenele de clasa II numite DR, DQ i DP79 au fost descrise de ctre Van

Leeuwan et al.261 n anul 1973.

5


6/40

antigenele de clasa III258 sunt molecule solubile plasmatice i cuprind unele

componente

ale sistemului complement C4, C2, enzime (citocrom P-21 hidroxilaza) i alti factori

(TNF-alfa), care nu sunt implicai direct n histocompatibilitate.

La om CMH este mparit n trei regiuni:

regiunea de clasa I (CMH I) conine aproximativ 20 de gene, dintre care HLA-A, -

B i -Csunt exprimate; genele HLA-E,-F,-G i -Hsunt potenial exprimabile, dar numai

HLA-G a fost identificat pe suprafaa citotrofoblatilor.

regiunea de clasa II (CMH II) conine 23-25 gene i pseudogene, dou sau trei

codific moleculele HLA-DR(DRA i DRB), dou codific moleculele HLA-DQ(DQA i

DQB) i dou care codific HLA-DP (DPA i DPB).

regiunea de clasa III cuprinde gene care nu aparin CMH, genele complementului

(C2, Bf,

C4A, C4B), 21-hidroxilaza, TNF i proteine de oc termic.

Fiecare individ exprim ase alele ale CMH de clas I, cte o alel HLA-A, -B i -C provenind

de la fiecare printe, i cel puin ase alele ale CMH de clasa II2.

Fiecare individ exprim diferitele proteine ale CMH care vor fi recunoscute ca strine de ctre

sistemul imunitar al unui alt individ, n consecin moleculele CMH pot constitui inta n rejet,

chiar dac HLA-C i HLA-DP prezint un polimorfism limitat i sunt probabil de importanminor.

4. Moleculele CMH de clas I i II

Moleculele CMH de clas I i II sunt heterodimeri, alctuite din lanuri polipetidice diferite, alfa

i beta legate necovalent22.

Moleculele CMH de clas I

Moleculele CMH de clas I, respectiv HLA-A, -B i -C sunt produsul genelor HLA de clas I.

Structura moleculelor CMH de clas I (prezentare schematic - figura nr.1)270.

Caracteristici biochimice: moleculele CMH de clas I sunt glicoproteine

transmembranare a cror regiune COOH-terminal se gsete n citoplasm, iar cea

NH2-terminal este expus extracelular.

Au o structur de heterodimer31, fiind formate din:

un lan greu, lanul alfa (45kDa) care este codificat de CMH.

6


7/40

un lan uor, beta2-microglobulina (12kDa), care este codificat de o gen de pe

cromozomul 15, situat n afara CMH.

Lanul greu este alctuit din trei regiuni:

1) extracelular, hidrofil, care conine aproximativ 280 resturi de aminoacizi

2) transmembranar, hidrofob, care conine aproximativ 20 aminoacizi

3) intracitoplasmatic hidrofil, care conine aproximativ 30 aminoacizi.

Beta2-microglobulina este o protein neglicozilat, solubil.

Lanul greu se leag de beta2-microglobulin22 prin legturi necovalente.

figura nr.1- prezentare schematic CMH de clas I

Wikipedia (oferit domeniului public)

Structura tridimensional a CMH de clas I a fost elucidat pentru prima dat n anul 1987 196

(figura nr.2)48

Lanul alfa este alctuit din domeniile alfa-1, alfa-2 i alfa-3, compuse din aproximativ 30

aminoacizi, care sub aciunea papainei pot fi clivate de restul moleculei.

Domeniile NH2-terminale (alfa-1 i alfa-2) sunt alctuite din secvene de aminoacizi foarte

variabile de la celul la celul i de aceea sunt denumite domenii polimorfe ale CMH I.

Caracteristica moleculei de clas I const din asocierea celor dou domenii alfa-1 i alfa-2, care

formeaz o cavitate numit situs combinativ pentru antigen, n care este inclavat, n vederea

prezentrii sale, un anumit epitop32.

7


8/40

Domeniul alfa-3 are ca principal particularitate faptul c este alctuit dintr-o secven de

aminoacizi constant, care este prezent pe membrana tuturor celulelor.

Secvena de aminoacizi a -2-microglobulinei formeaz un singur domeniu avnd aceeai

structur la toi membrii aparinnd aceleiai specii.

CMH de clas I sunt molecule specializate n prezentarea antigenelor endogene, sunt recunoscute

n timpul cooperrii intercelulare de ctre CD8, ce este exprimat pe membranele limfocitelor

citotoxice sau supresoare i sunt implicate n declanarea reaciei de respingere a grefei.

Poriunea cea mai implicat este domeniul alfa-3 fiind cea mai imunogen126.

Cnd moleculele CMH de clas I sunt exprimate pe suprafaa celular, ele apar ntotdeuna legate

de cte o peptid, formnd complexul peptid-CMH.

Receptorul specific pentru antigen al limfocitului T (TCR=T cell receptor) recunoate att

antigenul strin, ct i molecula CMH proprie.

8


9/40

Distribuia moleculelor CMH de clas I

Moleculele CMH I sunt glicoproteine prezente pe membranele celulelor nucleate. Orice celul

nucleat posed toate cele trei tipuri de molecule de clas I 66, cu excepia celulelor sistemului

nervos central, endoteliului cornean i trofoblastului placentar vilos.

Interesul pentru distribuia moleculelor CMH s-a concretizat n numarul foarte mare de publicaii

pe aceast tem. Klein137 a identificat 523 publicaii referioare la acest subiect.

Exprimarea, att a moleculelor de clas I ct i II, poate fi indus de un numr de diferite

citokine, de exemplu interferon, TNF i altele18.

9


10/40

Moleculele CMH de clas I sunt adevrate certificate de identitate biochimic si genetic,

pentru fiecare organism, datorit polimorfismului lor foarte accentuat, devenind inta sistemului

imunitar dup grefarea esuturilor i organelor, care poart molecule incompatibile.

Moleculele CMH de clasa II

Moleculele CMH de clas II sunt codificate de regiunea cromozomal HLA-D, ce aparine

genelor clasei a II-a.

Structura moleculelor CMH de clas II (prezentare schematic-figura nr.3)271.

Caracteristici biochimice: moleculele CMH de clas II sunt glicoproteine transmembranare

heterodimerice, de 55-60 kDa alctuite din dou lanuri legate prin legturi necovalente129:

un lan greu, lanul alfa (30-34kDa)

un lan beta, lanul uor (26-29kDa)

Fiecare lan este format din trei segmente

1) extracelular, hidrofil, NH2-terminal (fiecare fiind alctuit din cte dou domenii, notate

alfa-1 i alfa-2, respectiv beta-1 i beta-2), care conin aproximativ 200 resturi de

aminoacizi

2) transmembranar, hidrofob, conine aproximativ 20-25 aminoacizi

3) intracitoplasmatic, hidrofil, COOH-terminal, conine aproximativ 8-15 aminoacizi

Domeniile NH2-terminale sunt alctuite din secvene de aminoacizi variabile, fiind numite

domenii polimorfe, iar cele dispuse ctre membrana celular conin secvene relativconstante, fiind numite domenii monomorfe.

figura nr.3- prezentare schematic CMH de clas II

Wikipedia (oferit domeniului public)

1


11/40

Prima structur tridimensional a unei molecule CMH II a fost aceea a HLA-DR138;242,

apoi alte trei molecule umane au fost studiate: DRB1*0301100, DRB1*040176 i DRB1*1501236,

structura lor fiind identic (figura nr.4)49.

Poriunile extracelulare ale ambelor lanuri formeaz dou bucle sau domenii cu aspect globular.

Segmentul extracelular al lanului beta este format din dou domenii alctuite din aproximativ

90-100 aminoacizi, ambele cu puni disulfurice, ns doar primul domeniu, cel NH2-terminal este

glicozilat.

Domeniile alfa-1 i beta-1 se asociaz pentru a forma o structur beta ca o platform

(asemntoare celei a moleculelor de clas I) pe care sunt plasate dou structuri cilindrice

alfa-helix, structuri ce las ntre ele un an.

Domeniile -2 i -2 prezint omologie a secvenei de aminoacizi cu domeniile moleculei de

imunoglobulin. Domeniul beta-2 nepolimorf conine site-ul de legatur cu coreceptorul CD4 al

limfocitelor T.

ntruct CD4 se leag de moleculele CMH de clas II, limfocitele T CD4+ nu pot s raspund

dect peptidelor prezentate de celule care exprim moleculele CMH de clas II.

1


12/40

Distribuia moleculelor HLA de clas II este mult mai restrictiv dect a celor de clas I, ele fiind

exprimate n special pe celulele dentritice, celulele prezentatoare de antigen, limfocitele B,

macrofage, monocite, endoteliul capilar i unele epitelii, n special cele de la nivelul sistemului

respirator, celulele Langherhans (din derm) i celulele Kupffer (din ficat).

Moleculele CMH de clas II sunt specializate n prezentarea antigenelor exogene, sunt

recunoscute de ctre receptorul CD4 i au o contribuiie minor la declanarea reaciei de

respingere a grefei.

12


13/40

Rolul moleculelor CMH

Moleculele CMH au rolul de a prezenta antigenele limfocitelor T260 i de a controla rejetul sau

acceptarea grefelor102.

Moleculele CMH, att cele de clas I ct i cele de clas II, au rolul de receptor pentru antigene,

recunoscnd anumite secvene structurale polipetidice pe care le fixeaz n anul dintre cele

dou alfa-helixuri ale structurii apicale.

Din motive structurale, moleculele clasei I au rol principal, iar moleculele clasei II au rol

secundar.

Fiecare tip de molecul are propria specificitate astfel nct un fragment polipetidic ignorat de o

molecul va fi acceptat de o alt molecul.

Diversele categorii de proteine antigenice sunt, ntr-o prim etap, scindate proteolitic n

interiorul proteozomilor, iar din liza lor parial rezult fragmente antigenice.Acestea la rndul lor sunt transferate n reticulul endoplasmatic rugos i ncarcate pe moleculele

CMH de clas I.

ntregul complex format este ulterior transferat la suprafat, epitopul astfel prezentat urmnd s

fie recunoscut de limfocitele T citotoxice sau supresoare.

Transplantul de organ nu este un proces fiziologic, ci o situaie artificial, rspunsul celulelor T

la oricare din moleculele CMH putnd genera un episod de rejet.

Proveniena antigenelor precum i modul n care sunt preluate i prezentate fragmentele de

antigen difer pentru cele dou clase de molecule CMH.

n timp ce moleculele CMH de clas I i II prezint antigenul celulelor T, exist o serie de

aspecte particulare care le diferentiaz: CMH I este prezent pe aproape toate celulele

organismului, iar CMH II sunt mult mai restrictiv distribuite.

CMH I prezint antigenul limfocitelor T CD8+274, n timp ce CMH II prezint antigenul

limfocitelor T CD4+.

Aceast specificitate reflect o a treia diferen care se refer la tipul antigenului prezentat, CMH

I prezint antigene endogene, (the cytosolic pathway), n timp ce CMH II prezint antigene

exogene, printr-un proces de endocitaz (the endocytic pathway)187.

Moleculele CMH de clas I primesc n situsul combinativ fragmente

polipeptidice rezultate n cursul degradrii intracelulare a moleculelor proprii sau a antigenelor

virale, bacteriene, fungice.

1


14/40

Moleculele CMH de clas I sunt elaborate n reticulul endoplasmatic rugos sub form de

componente separate, alfa i beta.

Ca urmare a fixrii lanului beta la lanul alfa, acesta din urm sufer modificri conformaionale

n urma crora el i disponibilizeaz situsul combinativ pentru antigen, situat ntre domeniile

alfa-1 i alfa-2. Doar n acest moment situsul combinativ pentru antigen devine capabil s fixeze

eventualele fragmente antigenice transferate n reticulul endoplasmatic rugos.

Moleculele CMH de clas II sunt implicate n recunoaterea specific a

antigenelor strine extracelulare fagocitate sau endocitate de CPA (celulele prezentatoare de

antigen); sunt prelucrate intracelular, fragmentate de ctre enzimele proteolitice ale CPA, iar

produii digestiei enzimatice sunt plasai n anul CMH II i prezentai la suprafaa CPA-ului

receptorilor specifici ai limfocitelor T (TCR) sub form de complex peptid-CMH II.

Dac peptidele sunt self, complexul format nu induce un rspuns imun, spre deosebire de

complexul format cu peptide non-self care genereaz activarea limfocitelor T helper datorit

recunoaterii specifice de ctre TCR.

Odat ce un limfocit T recunoate complexul CMH-peptid la suprafaa CPA formeaz o

sinaps cu CPA-ul (sinaps imunologic), care duce la o cooperare dintre celulele

imunocompetente: cooperarea dintre limfocitele T cu celulele dendritice (CD), celulele B,

monocite/macrofage i alte celule prezentatoare de antigen ca microglia sau celulele

Langerhans19;43

.Interaciunea CPA-limfocit determin activarea limfocitului T, care are urmtoarele consecine:

diviziunea i multiplicarea celulei T

maturarea i activarea limfocitelor T citotoxice

activarea mecanismelor inflamatorii responsabile de hipersensibilitatea

ntrziat

stimularea limfocitelor B n producerea anticorpilor specifici i activarea

macrofagelor.TCR (receptorul celulelor T) este un receptor heterodimeric transmembranar cu un situs de

legare pentru complexul CMH-peptide.

Receptorul este combinat cu o molecul accesorie (CD4 sau CD8) i un complex de semnalizare

transmembranar, cunoscut sub denumirea de CD3.

1


15/40

Mecanismul de transmitere a semnalului pn la nivelul sistemelor enzimatice

intracitoplasmatice este descris n capitolul 5.

5. Limfocitele T

Limfocitele T i n particular T helper (sunt cele mai numeroase, reprezentnd 60-65%

din numrul total de limfocite T ale organismului uman) au rol esenial n rspunsul imunitar

contra moleculelor CMH, care reprezint baza fenomenului de rejet10.

Aproximativ 1-10% din limfocitele T sunt alloreactive, de exemplu TCR prezint specificitate

pentru allo-CMH, deoarece TCR este genetic preprogramat s recunoasc preferenial CMH

allogenic i datorit TCR cross reactivitii (CMH propriu recunoate peptidele cross reactive ale

CMH strin prin dou ci: CMH dominant i peptid dominant)102.

Limfocitele T realizeaz urmtoarele funcii:

lizeaz celulele care exprim pe suprafaa lor molecule non-self, de origine

exogen, pe baza principiului de self-nonself discrimination

regleaz rspunsul imunitar

mediaz reaciile de hipersensibilitate ntarziat

ajut celulele B s produc anticorpi

activeaz macrofagele care i intensific producia de enzime proteolitice

intracelulare, de citokine inflamatorii ca TNF-alfa, i de radicali liberi de nitrogen i

oxigen

limfocitele sunt celule care recunosc specific antigenul i poart pe suprafaa lor,

molecule cu rol receptor, capabile s recunoasc specific determinanii antigenici .

O clasificare a limfocitelor, n funcie de capacitatea lor de a interaciona cu antigenul

specific:

native care nu au mai avut nici un contact n existena lor cu antigenul pentru care

sunt preprogramate, fiind din acest motiv celule fr memorie imunologic

cu memorie, aflate n contacte repetitive cu antigenul pentru care sunt

preprogramate i poart amprenta acestor experiene anterioare din existena lor.

n raport cu funcia pe care o ndeplinesc, se disting urmtoarele categorii de limfocite:

efectoare, cele care direct sau indirect, prin molecule efectoare, neutralizeaz

antigenul;

15


16/40

reglatoare, cele care realizeaz echilibrul optim al rspunsului imunitar.

Limfocitele T pot rspunde direct antigenelor implicate n transplant, prin legarea TCR de

moleculele CMH strine exprimate pe esuturile transplantate, sau indirect, prin ntlnirea cu

celule prezentatoare de antigen care au fagocitat fragmente din esuturile allogrefei i au procesat

antigenele pentru exprimarea la nivelul CMH propriu.

Legarea iniial a limfocitelor T de CPA sau de o celul endotelial este nespecific i mediat

prin moleculele de adeziune.

Aceste molecule (ICAM-1,VCAM-1, LFA-1 i alte molecule din familia integrinelor) sunt

suprareglate n funie de activarea CPA.

Datori lungimii extrem de reduse a segmentului intracitoplasmatic al TCR, semnalele

activatoare nu pot fi transmise n profunzime la nivelul sistemelor enzimatice efectorii. Funcia

de transmitere a semnalelor activatoare ctre sistemele enzimatice localizate n profunzimea

citoplasmei este indeplinit de complexul CD3 asociat la TCR.

La recunoaterea antigenului, alturi de receptorii descrii, mai particip nc doi coreceptori

reprezentai de CD4 sau CD8.

Activarea celulelor T parcurge dou etape distincte: prima fiind etapa antigen-independent i a

doua antigen-dependent.

Etapa antigen-independent are caracter nespecific deoarece are loc n permanen, adic i

atunci cnd CPA nu expun nici un antigen, ct i atunci cnd acestea expun antigenul dar nu aufost nc recunoscute de ctre TCR.

Etapa antigen-dependent const n stabilirea de legturi ntre complexul CMH-epitop prezent

pe membrana CPA i complexul TCR-CD4 sau TCR-CD8 de pe suprafaa limfocitului T(figura

nr.5)50.

1


17/40

n urma stabilirii acestor contacte sunt generate o serie de semnale care declaneaz cascada

fosfatidil - inozitolilor, cu eliberare de IP3 (inozitol trifosfat) i DAG (diacil glicerol).IP3 se leag de receptorii specifici de la nivelul reticulului endoplasmatic neted, ceea ce

determin elibeararea de ioni de Ca++, care reprezint momentul central al activrii

limfocitului T.

Titrul crescut de ioni de Ca++ activeaz calcineurina, care la rndul ei activeaz factorul nuclear

al limfocitelor T activate (NF-AT).

NF-AT activat ptrunde intranuclear i, pe deoparte, stimuleaz diviziunile mitotice, iar pe de

alt parte activeaz genele pentru interleukine

120

.DAG contribuie la activarea metabolismului limfoctului T i influeneaz unele funcii nucleare:

PKC (proteinkinaza C) fosforilnd inhibitorul NF-KB, activeaz acest factor care ptrunde

intranuclear i, la rndul lui, activeaz genele pentru IL-2 ct i pentru receptorul acesteia care

este CD25.

1


18/40

Odat activarea iniiat, citokinele IL-2 i IFN-gama creeaz un mediu propice recrutrii altor

celule T implicate n rspuns i potenrii expansiunii clonale.

Dac la cooperarea celular nu sunt prezente limfocitele B, atunci limfocitele Th-0 se transform

natural n limfocite Th-1, care sintetizeaz cantiti mari de IL-2, IL-3, IFN-gama i TNF-beta.

Dac la coperarea celular sunt prezente limfocitele B, atunci limfocitul Th-0 se transform n

Th-2, care secret cantiti mari de : IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 (dar nu secret IL-2) i stimuleaz

activitatea limfocitelor B i ajut n producia de anticorpi de tip IgG1, IgA i IgE 197;243.

n esen, limfocitele Th-2 sunt implicate n edificarea rspunsului imun mediat umoral, iar

limfocitele Th-1 au rol n edificarea unui rspuns imun mediat celular.

Prin toate aceste efecte, limfocitele Th sunt amplificatoare ale rspunsului imun.

Studii recente228 descriu fenomenul prin care limfocitele pot extrage molecule de suprafaa prin

sinapsa imunologic de la nivelul CAP cu care sunt conjugate, fenomen numit trogocytosis,care poate s fie important n inducerea i reglarearspunsului imun i n controlul altor sisteme

celulare88;217.

6. Limfocitele B

Reprezint 15-20% din totalul limfocitelor periferice, avnd o durat de via relativ

scurt, cea mai mare parte din ele fiind distribuit n ariile burso-dependente ale organelor

limfoide (cortexul ganglionar, PALS extern din pulpa alb a splinei).

Limfocitele B recunosc antigenul n forma sa nativ, fr a necesita transformarea i prezentarea

acestuia moleculelor CMH122.

Limfocitele B pot internaliza antigenele legate de anticorpii de suprafat i le transform pentru a

le prezenta celulelor T. Tot ele pot lega antigenul aflat n circulaie i pot iniia rspunsul

celulelor T fa de un antigen incorporat n esuturile corpului67.

Plasmocitele secret anticorpi cu specificitate unic.

Anticorpii faciliteaz distrugerea i ndeprtarea celulelor antigenice. Odat fixat de antigen,

anticorpul servete ca loc de ancorare a componentei C1q a complementului.

Pe calea clasic se produce activarea fraciunii C3, care n final va conduce la formarea

complexului membranar de atac (MAC), avd drept consecin ruperea membranei celulei int

i liza acesteia.

Evenimentul central al cascadei complementului este reprezentat de conversia zimogenului C3

ntr-un fragment C3b i un fragment C3a, sub aciunea C3 convertazelor.

1


19/40

Fragmentul C3a are efecte vasodilatatoare, chemoatractante, activator al leucocitelor i creterea

permeabilitaii capilare.

Fragentul C3b se ataaz de membranele acceptoare de complement (nonself) determinnd

opsonizarea acestora3.

Membranele self posed anumite categorii de receptori care se opun depozitrii pe suprafaa lor a

factorilor complementului.

Anticorpii legai de endoteliu i activarea ulterioar a complementului altereaz starea de

activare a celulelor endoteliale, conducnd astfel la retracia celular i expunerea matricei

subiacente, care poteneaz activarea i agregarea trombocitar123.

Activarea endotelial altereaz mediul su anticoagulant n favoarea unuia procoagulant.

Lezarea celulelor endoteliale determin eliberarea sulfatului de heparin i trombomodulin, care

inhib activarea proteinei C i interaciunea proteinei C activate cu proteina S, ducnd la apariiamicrotrombozei vasculare ce apare n rejetul hiperacut i rejetul vascular acut.

7. Receptorul de antigen al limfocitelor T

Receptorul de antigen al limfocitelor T (TCR) este un heterodimer transmembranar, cu

un situs de legare pentru complexul CMH-peptid.

S-au identificat dou forme distincte, una alcatuit din lanurile alfa i beta, cu o greutate

molecular de 49 i respectiv 43 kDa i alt form alctuit din lanurile gama (55 kDa) i delta

(40 kDa).

Heterodimerul format din polipeptidele alfa i beta, legate prin puni S-S, este prezent pe

suprafaa a circa 98-99% dintre limfocitele T, n schimb a doua form, cea alctuit din lanurile

gama i delta, dei sunt asemntoare structural, se gsete pe suprafaa 0,5-1,5% dintre

limfocitele T circulante umane, mai frecvent pe limfocitele intraepiteliale ale mucoasei

intestinale.

Situsul de combinare al TCR este alctuit din regiunile hipervariabile sau regiunile determinante

de complementaritate, trei ale catenei alfa i patru ale catenei beta i este aplatizat, fiind adaptat

funciei sale de a lega suprafaa aplatizat a moleculelor CMH96;124.

La om, TCR este asociat cu molecula CD3, o grupare de patru peptide (1 gamma, 1 delta i

2 epsylon) asociate prin legturi necovalente214.

n componea complexului CD3 se asociaz nc dou lanuri polipeltidice, numite zetta, bogate

n reziduuri de tirozin52.

19


20/40

Celulele self contaminate cu antigenele peptidice sunt identificate n scopul eliminrii lor din

organism, procesul de legare fiind ntrit de moleculele de adeziune, care stabilizeaz legturile

dintre dou celule, funcionnd ca un receptor la care ader o alt molecul numit ligand238.

Moleculele de adeziune au un rol important n trei etape ale rejetul allogrefei:

recunoaterea iniial a alloantigenului determin activarea celulelor T;

migrarea ulterioar a leucocitelor de la nivelul spaiului intravascular n esut;

injuriile miocitelor mediate de ctre leucocite87;239.

Interacia dintre ICAM-1 i LFA-1 este important n vederea prezentrii antigenului, activrii

celulelor T i extravazrii leucocitelor.

Funcionarea optim a celulelor T n vitro este dependent de interacia ICAM-1 i LFA-178;80,

liniile celulare mutante murine deficiente n exprimarea ICAM-1 evideniaz scderea abilitii

de a prezenta antigenele celulelor T, funcie care poate s fie restabilit prin transfecia acestor

celule cu ICAM-1 cDNA murin69.

Studiile rejetului cardiac uman i la maimue arat o cretere a expresiei ICAM-1 n timpul

rejetului90;209;248.

Recent, prin investigaii imunohistochimice, s-a evideniat c atorvastatinul, prin reducerea

expresiei TGF-beta i a moleculelor de adeziune, atenueaz infiltratul inflamator celular, ceea ce

sugereaz c poate fi eficient n prevenirea aterosclerozei asociat transplantului alturi de ali

ageni imunosupresivi233.

8. Celulele prezentatoare de antigen

Celulele prezentatoare de antigen (CPA) au rol esenial n declanarea rspunsurilor

imune att umorale ct i celulare fa de antigenele T-dependente.

n funcie de eficiena cu care realizeaz funcia de prezentare a antigenului, CPA se clasific n:

CPA profesionale (macrofage, celule dendritice-CD, limfocitele B) i CPA ocazionale

(neutrofile, celule endoteliale, celule epiteliale i celule epidermice).

CPA declaneaz rspunsurile imune, ntrein n timp aceste rspunsuri i particip la controlulintensitii acestora.

n mod normal, limfocitele T sunt activate de ctre mici fragmente antigenice, care provin din

prelucrarea antigenelor native n CPA15.

De altfel, CPA sunt primele i unicele celule, care vin n contact cu antigenele native 213;246.

20


21/40

O particularitate unic a CD, ce permite o puternic imunostimulare, este emiterea a 3 semnale

ctre celulele T: semnalul antigen-specific (semnalul 1) produs de CMH-TCR, semnalul

costimulator (semnalul 2) produs de CD-40, CD 80 i CD 86 i un semnal diferenial

(semnalul 3) produs de interleukina 12 (IL-12) 112;150.

9. Citokinele

Citokinele,cunoscute sub denumirea i de interleukine,sunt proteine solubile, care pot fi

secretate de o multitudine de tipuri de celule din organism, inclusiv limfocite.

Citokinele sunt clasificate n urmtoarele grupe funcionale: CSF(Colony Stimulating Factors),

IL (Interleukine), IFN (Interferoni), TNF (Tumor Necrosis Factor), factori de cretere i

chemokine.

Cele mai importante citokine implicate n transplant includ: interleukinele (IL-1, IL-2, IL-4,

IL-6, IL-9, IL-10)95;145;201;278 i interferonii (de exemplu IFN-gama)106;114.Una dintre cele mai importante citokine implicat n rejetul acut celular este IL-2. Aceasta este

produs de ctre celule T activate i rolul su const n inducerea proliferrii i a diferenierii att

a celulelor T ct i a celulelor B30;125.

10. Inducerea rspunsului imunitar

Procesul prin care se realizeaz respingerea allogrefelor poate fi clasificat n dou etape:

aferent (de recunoatere a antigenelor strine)24;262 i a doua, eferent30 sau efectoare.

Elementele care intervin n lezarea grefei sunt: limfocite T citotoxice (LTc) alloreactive,

citokinele i anticorpii.

Exist ns i mecanisme care aparin sistemului imunitar natural (innate immunity), cum ar fi

procesele de ischemie-reperfuzie care atrag dup sine reacii ce nu au nici o legtur cu

sistemul imun adaptativ.

Manifestarile innate immunity n rejet36

Sistemul imunitar natural, ca prim linie de aprare, este implicat n rejetul grefei chiar i n

cazurile grefelor singenice.

Ischemia/Reperfuzia (I/R): distrugerea esutului ce activeaz sistemul imun nativ

i

declaneaz o cascad inflamatorie ce poate duce la respingerea grefei.

21


22/40

Ischemiaeste procesul prin care organul sau esutul ce urmeaz s fie grefat i pierde sursa de

snge, n timp ce este conservat ntr-o soluie special, din momentul prelevrii de la donor pn

la reconectarea la circulaia receptorului.

Reperfuzia const n reconectarea grefei la sursa de snge dup realizarea anastomozelor

vasculare.

Hipoxia i acidoza esutului sau organului transplantat sunt, n general, considerate principalii

triggeri ai procesului inflamator i ai disfunciei vasculare.

Reacia inflamatorie poate fi att de sever nct rspunsul legat de reperfuzie se poate manifesta

i n organele distale.

Efectele la distan ale I/R sunt cel mai frecvent observate n plamn, ficat i sistemul

cardiovascular i pot duce la apariia sindromului de rspuns inflamator sistemic (SIRS) i a

sindromului de disfuncie multipl de organe (MODS).Aceste efecte sunt cel mai frecvent observate dup transplantul de ficat i inim.

Aadar, o mai bun nelegere a proceselor implicate n injuria determinat de I/R poate oferi

informaii despre cum pot fi protejate esuturile de consecinele episoadelor de ischemie sau ale

evenimentelor ischemice acute.

Contribuia diferitelor molecule de adeziune la recrutarea leucocitelor, precum i rolul att al

citokinelor inflamatorii ct i al metaboliilor reactivi de oxigen i azot n medierea

permeabilitii vasculare crescute sunt exemple de beneficii rezultate din acest model al

inflamaiei.

Reperfuzia dup 10 minute de ischemie este de obicei mai nociv dect nsi ishemia deoarece

ischemia creeaz condiiile necesare pentru ca oxigenul s elibereze radicali liberi.

n reperfuzie apare o distrugere considerabil a membranei celulelor endoteliale, a trombocitelor,

leucocitelor i a altor celule sanguine.

Neutrofilele activate produc superoxid, care poate fi transformat n peroxid de hidrogen.

Mieloperoxidaza neutrofilelor convertete peroxidul de hidrogen n acid hipocloros.

Acesta poate reaciona cu superoxidul i produce radicali hidroxil.

Eicosanoidele generate de acidul arahidonic (n special leucotrienele) cresc mult adeziunea

leucocitelor i trombocitelor la pereii capilari. Superoxidul, de asemenea, crete adeziunea

leucocitelor la pereii vasculari.

22


23/40

Eicosanoidele (leukotrienele i prostaglandinele) i radicalii liberi de oxigen asociai cresc

permeabilitatea pereilor capilari, fapt care conduce la apariia edemului ce ngusteaza lumenul

capilarelor.

Aceste efecte devin foarte pronunate n reperfuzie i blocheaz complet capilarele91.

njuriile asociate reperfuziei (I/R) pot contribui la CAV, n schimb prin inhibarea I/R s-a

demonstrat reducerea vasculopatiei, att clinic ct i experimental72;113;142;204;227.

Complementul

Dei n majoritatea situaiilor complementul (C) se activeaz pe calea clasic, activarea

complementului se poate produce i n absena anticorpilor, prin ci alternative i MB-lectinice,

fiind implicat ca un mecanism umoral nnscut de rejet al grefei3;14;39;123;211;267;273 (figura nr.6)51.

Fenomenul de rejet se produce prin mecanisme umorale i celulare

Rejetul umoral este consecina anticorpilor IgM/IgG existeni n circulaie anterior expunerii sau

a anticorpilor dobndii dup expunere, prin legarea anticorpilor specifici de esutul provenit de

la donor, cu CMH diferit fa de gazd, cu activarea cascadei complementului i liz celular.

23


24/40


25/40

Testul limfocitoxicitii identific preexistena anticorpilor citotoxici anti-CMH n serul

receptorului nainte de transplant.

Se realizeaz prin recoltarea de ser de la donori cu anticorpi anti-CMH cu specificitate cunoscut

i se amestec cu limfocitele prelevate de la persoana testat.

Complementul obinut din serul de iepure este adugat mpreun cu un colorant de tipul

albastrului triptan, care nu ptrunde n celulele cu membrane intacte.

Dac anticorpii se leag de CMH, ei activeaz complementul, induc ruptura membranei celulare

i invazia colorantului intracelular186;253.

Examinarea microscopic a celulelor poate evidenia prezena antigenelor CMH la suprafaa

celulelor. Dezavantajul acestei metode const n faptul c este limitat de natura reactivilor

folosii.

Evidenierea citotoxicittii presupune un risc semnificativ pentru rejetul hiperacut.Supravieuirea grefelor poate fi dedus din gradul de asemnare CMH ntre donor i receptor.

n ultimii ani, n locul serurilor umane s-au folosit anticorpi monoclonali care au specificitate

unic. Testul a fost introdus n transplantul renal de ctre Patel i colaboratorii199.

Este demn de menionat c rejetul hiperacut este rar intlnit n transplantul cardiac245.

Diferenele antigenice dintre doi indivizi, determinate de moleculele CMH de clas II, se

evalueaz prin capacitatea lor de a iniia reacia limfocitar mixt (RLM)215.

n anul 1964 Bach i Hirschhorn12 au introdus metoda mixed leucocyte culture-MLC, prin care

limfocitele aparinnd a doi indivizi diferii din aceeai specie sunt cultivate n comun, n vitro70.

Limfocitele din cultur recunosc antigenele de histocompatibilitate i duc la transformare

blastic i proliferare celular, care se msoar prin gradul de incorporare al timidinei radioactive

(3H), n ADN-ul celulelor.

Cantitatea izotopului ncorporat este direct proporional cu sinteza ADN, deci cu diviziunea

celulelor.

n cazul n care ntre donor i receptor nu exist deosebiri ale CMH II, rspunsul proliferativ este

nul. Cu ct deosebirile antigenice sunt mai mari, cu att amplitudinea rspunsului pozitiv crete.

Condiia reactivitii limfocitare este diferena unei singure alele la locusul ce codific aceste

molecule.

Reacia limfocitar mixt se poate produce ntr-un singur sens13 : celul stimulatoare celul

reactiv sau n ambele direcii.

25


26/40

n RLM, care are loc ntr-o singur direcie (donor receptor), celulele stimulatoare (de la

donor) sunt iradiate pentru a se evita proliferarea lor.

Metodelele genetice au fcut posibil investigarea polimorfismului genelor CMH177;277.

Polimorfismul fragmentului restrictiv(restriction fragment length polymorphism-RFLP)-

enzimele de restricie scindeaz molecula ADN rezultnd fragmente de ADN .

Prin metoda clasic RFLP25, ADN-ul este extras cu una sau mai multe enzime de restricie.

Fragmentele de ADN sunt separate prin electroforez n gel dup mrimea secvenei ADN-ului,

apoi ADN-ul este transferat pe o membran de nitroceluloz prin tehnica Southern-Blot237

i supus hibridizrii cu o prob radiomarcat.

Hibridizarea complet se produce n cazul n care structura celor dou ADN-uri este identic,

prin amplificarea segmentelor de gen putndu-se preciza secvena nucleotidelor pe care le

conine.

Hibridizarea oligonucleotidelor188;189 ct i amplificarea specific a unei alele

identific secvenele de ADN ce codific lanurile HLA, cu ajutorul reaciei n lan a polimerazei,

PCR (Polymerase Chain Reaction)193;223.

Metoda PCR-SSP este cea mai frecvent aplicat pentru determinarea moleculelor CMH II.

Tipizarea prin tehnici de biologie molecular prezint avantajul unui rezultat rapid i precis.

12. Sindroame clinice de rejet

Cordul transplantat este supus la patru tipuri de rejet: rejetul hiperacut, rejetul acut umoral(vascular), rejetul acut celular i rejetul cronic, clasificare care este asigurat de cte un tip

particular de rspuns imun.

Reacia hiperacutcea mai grav form de respingere a organului transplantat, apare la interval

foarte scurt dup transplant (minute pn la cteva ore dup restabilirea circulaiei i intrarea

sngelui receptorului n organul grefat) , datorit presensibilizrii la antigenele HLA ale

donorului sau incompatibilitii de grup sanguin ABO.

Anticorpii circulani din organismul receptorului257 apar n urma transfuziilor, naterilor sau

transplantelor anterioare.

Mecanismul este umoral, fiind ndreptat mpotriva antigenelor de pe membranele celulelor

grefate, n special mpotriva endoteliului vascular, ducnd la activarea complementului i

atragerea neutrofilelor care distrug endoteliul vascular; trombocitele se aglutineaz, ader de

pereii vaselor activnd coagularea, ceea ce precipit necroza grefei73.

26


27/40

Rejetul hiperacut nu este un fenomen frecvent deoarece fiecare receptor este testat pentru

prezena anticorpilor dirijai mpotriva celulelor potenialului donor245.

Inima grefat este compromis devenind flasc268, iar la examenul histologic se evideniaz

hemoragie global interstiial i edem fr infiltrat limfocitar.

Prin tehnica imunofluorescenei se evideniaz depozite de imunoglobuline i complement la

nivelul endoteliului vascular92.

Respingerea grefei se previne nu numai prin testarea grupelor sanguine ABO i Rh, dar i a

prezenei anticorpilor anti-HLA.

Tehnica pentru tipizarea serologic este cea de limfotoxicitate i evideniaz efectul citotoxic al

anticorpilor asupra limfocitelor n prezena complementului. Serurile specifice folosite n

tipizarea tisular provin de la femei multipare, politransfuzai, pacieni cu respingeri de gref n

antecedente.Ca alternativ mai recent, n locul serurilor anti-HLA sunt folosii anticorpii monoclonali.

Este important de tiut c spectrul de anticorpi reactivi ai receptorului se poate schimba n timp,

de aceea retestarea este necesar.

Rejetul acutapare n zile sau sptmni dup transplant i constituie principala cauz de eec.

Rejetul allogrefei cardiace este un rspuns normal la baza cruia stau dou mecanisme:

rejetul mediat delimfocitele Ti rejetul mediat de anticorpi.

Dac n respingerea hiperacut anticorpii sunt preformai n organismul receptorului, n

respingerea acut acetia sunt sintetizai de novo.

Mecanismul rejetului celular este un rspuns imunitar care implic macrofagele, celulele

dendritice, citokinele i limfocitele T.

Rejetul acut celular poate s apar n orice moment posttransplant, dar este mai frecvent n

primele 3 pn la 6 luni .

Este un rspuns mediat de celulele T, fiind evideniat prin apariia infiltratului de limfocite i

macrofage, conducnd n final la miocitoliz.

Stabilirea diagnosticului de certitudine n cazul rejetului cardiac acut se face pe baza biopsiei

endomiocardice272.

Aceasta permite diagnosticul fenomenului de rejet nainte de afectarea semnificativ a cordului

i apariia disfunciei acestuia, de aceea se recomand efectuarea lor in primele 6 luni

posttransplant, la fiecare 7-10 zile apoi la un interval de 3-6 luni.

27


28/40

Intensitatea infiltratului limfocitar i prezena sau absena necrozei miocitelor determin gradul

rejetului.

ISHLT (International Society of Heart and Lung Transplantation) a stabilit o clasificare

histologic pentru fenomenul de rejet cardiac acut, bazat pe intensitatea infiltratului limfocitar i

prezena sau absena necrozei miocitelor, clasificare sintetizat n tabelul nr.126;28;272.

Tabelul nr.1

Stadializarea histologic n rejetul cardiac acut (ISHLT*)26;28;272

*ISHLT = International Society of Heart and Lung Transplantation.

Interpretarea examenului histologic poate sa fie dificil n contextul n care infiltratul limfocitari fibroza perimiocitar sunt asociate terapiei cu ciclosporin58;130.

n cazul unui rezultat negativ al biopsiei, n prezena unei disfuncii a grefei, diagnosticul poate

s fie de rejet focal, fieocazional rejet vascular (mediat umoral).

Suspiciunea de rejet necesit o nou biopsie.

Rejetul moderatse caracterizeaz prin infiltrat celular mononuclear i miocitoliz.

n cazul rejetului sever n miocard apar zone de necroz miocitar, edem i hemoragie.

Tratamentul pacienilor cu rejet acut celular necesit corticosteroizi administrai intravenos sau

oral, angeni antilimfocitari monoclonali sau policlonali, sau creterea dozelor administrate sau

schimbarea n terapie oral.

Dac la nceputul anilor 1980, 70-85% dintre receptori dezvoltau rejet acut celular n primele 6

luni dup transplant, n prezent incidena acestui tip de rejet n primele 6 luni posttransplant este

ntre 40%-70%83;138.

28


29/40

Rejetul celular acut poate s apar i peste ase luni posttransplant, n urmatoarele situaii:

pacienii cu rejet instalat imediat posttransplant, accentuarea recent a imunosupresiei, infecii

intercurente, pacient necompliant.

ntre 80%-96% dintre episoade pot fi reversibile cu corticosteroizi116;182;265, cu toate acestea rejetul

este nc o cauz major de morbiditate n transplantul cardiac61;230.

Rejetul acut umoral (vascular)

Apare n cteva zile pn la sptmni posttransplant, fiind iniiat mai degarab de anticorpi

dect de limfocitele T108;181;183.

Alloanticorpii sunt direcionai mpotriva moleculelor HLA ale donorului sau a celulelor

endoteliale antigenice181.

Riscul crescut de rejet acut umoral este ntlnit la urmatoarele categorii de pacieni: femei,

pacieni cu status imunitar hiperreactiv i/sau testul cross-match pozitiv, receptori pozitivipentru cytomegalovirus i pacieni cu sensibilitate crescut la OKT3181.

Studii statistice au evideniat c rejetul mediat umoral, de asemenea numit i rejet vascular acut,

este mai puin frecvent dect rejetul celular, aprnd doar la 7% dintre pacienii transplantai181.

Diagnosticul rejetului acut vascular n cazul transplantului cardiac se stabilete pe baza biopsiei

endomiocardice, care evideniaz prezena anticorpilor i a complementului localizate

perivascular20;108 sau prezena edemului peretelui endotelial108;181.

Se recomand intensificarea terapiei imunosupresive, dar i o terapie direct, fie prin modularea

produciei de anticorpi, fie prin ndepartarea anticorpilor prin plasmaferez.

Datorit lezrii endoteliale, rejetul vascular este asociat cu un risc crescut de cronicizare181 .

Rejetul cronic

Este un fenomen insidios, care apare dup o perioad de luni sau ani posttransplant 21;276 .

CAV (coronary allograft vasculopathy) este o cauz major de deces la pacienii care au

supravieuit primului an posttransplant21;82;252;276, afectnd 22% din pacieni dup cinci ani de la

transplant118.

Mecanismul este incomplet cunoscut, iar etiologia este multifactorial, implicnd mecanisme

imunologice la nivelul endoteliului vascular coronarian i neimunologice.

Compoziia celulelor T-helper i n special producia de IFN- i TGF- poate juca un rol

important n reacia proliferativ n CAV149.

29


30/40


31/40

13. Mecanismele de aciune ale imunosupresoarelor folosite n prevenirea i tratamentul

rejetului

n absena supresiei sistemului imunitar allogrefele sunt distruse.

Imunosupresia este intens n perioada postoperatorie imediat i n stadiile urmatoare, numit

perioad de inducie a imunosupresiei.

Pe parcursul vieii, pentru prevenirea rejetului, pacientul primete imunosupresive de

meninere75.

Cu ajutorul acestui tratament se realizeaz o stare de imunosupresie, o lips de reactivitate imun

prin mecanisme care acioneaz la nivelul limfocitelor T i B.

Tratamentul cu imunosupresive poate fi influenat de o serie de factori imunologici, dar i

neimunologici, legai de donor, CMH matching, vrsta, sexul, rasa receptorului241;256.

Infeciile n transplantul cardiac sunt cauzate se contaminarea organului donor179, de tratamentulcu imunosupresive, de lipsa aplicrii msurilor de prevenire i control a infeciilor153-158;160-

166;169;171 i sunt produse de bacterii cu nalt rezisten la antibiotice168 ct i de bacterii

oportuniste (n special fungi, dar i alte bacterii din mediul nconjurator), care au creat serioase

probleme n evoluia pacienilor transplantai.148;159;167;172-176;194;206-208;210;229.

n trecut, tehnica de cultivare a produselor patologice recoltate de la pacientii cu infectie, pentru

detectarea de microorganisme a reprezentat metoda standard in laboratoare de microbiologie

clinic.

Recent, detectarea agentilor etiologici ai infectiilor prin tehnici moleculare de diagnostic , sunt

teste superioare ca performan (sensibilitate, specificitate, rapiditate etc), comparativ cu

metodele convenionale .

Pana in prezent, stabilirea diagnosticul microbiologic prin tehnici moleculare nu si-a gasit

aplicatie in sectiile de transplant din Romania170.

3


32/40

Mecanismele de aciune ale imunosupresoarelor folosite n tratamentul rejetului

Medicamente Mecanisme de aciune

Corticosteroizii Mecanismul efectului imunosupresiv al glucocorticoizilor nu a fost complet

elucidat198.

Ei se leag de un receptor intracelular dup ptrunderea n citoplasm,

complexul receptor-ligand ptrunde n nucleu, unde acioneaz ca o protein de

legare a ADN-ului i intensific transcripia ctorva gene, inhibnd funcionarea

NF-KB11;225, un activator al citokinelor proinflamatorii17 (inhib mecanismul

prin care limfocitele amplific rspunsul lor)226 deprim funcia celulelor

prezentatoare de antigen

216

, secreia de citokine

104

i proliferarea limfocitelor

89

.Glucocorticoizii influeneaz numrul, distribuia i funcia limfocitelor T i B,

granulocitelor, macrofagelor, monocitelor ca i a celulelor endoteliale57.Inhibitorii de

calcineurin

Cyclosporina

Ciclosporina-CSA este o polipeptid ciclic alctuit din 11 aminoacizi

derivat din fungii Tolypocladium inflatum.

n anul 1979 a fost raportat prima experiena clinic cu ciclosporina A42.

Mecanismul de aciune este datorat capaciti de legare a cyclophilinei, o

protein citoplasmatic.

Complexul cyclosporin-cyclophilin se leg cu afinitate crescut de complexulcalcineurin-calmodulin i blocheaz legarea Ca++ de calcineurin55, Ca++ care este

necesar pentru fosforilarea i activarea calcineurinei o fosfataz esenial n

activarea factorului de transcripie

NF-AT (nuclear factor of activated T cells) ceea ce duce la prevenirea

transcripiei genei pentru IL-2 i a altor gene obligatorii pentru activarea

celulelor T56;212;244.

CSA de asemenea stimuleaz sinteza TGF-beta (transforming growth factor-)

care accentueaz imunosupresia232.Inhibitorii

sintezei ADN

Azathioprina

Micofenolat mofetil

Azathioprina-AZA41a fost folosit n transplant de ctre Murray n 1963185.

Azatioprina este supus conversiei hepatice fiind transformat n

6-mercaptopurin, apoi n 6-tio-inozin monofosfat, derivai care inhib sinteza

ADN-ului prin alchilarea precursorilor ADN i inducerea alterrilor

32


33/40

cromozomiale prin interferena cu mecanismele de refacere a ADN-ului.

Acioneaz nu doar asupra proliferarii limfocitare i a PMN, ci i asupra

diviziunii rapide a celulelor77;144.

Micofenolat mofetilMMFa fost folosit n clinic nc din 1995. Este un ester

al acidului mycofenolic, un inhibitor necompetitiv al inozin monofosfat

dehidrogenazei, enzim cheie n sinteza de novo a guanin-nucleotidelor.

Acioneaz prin blocarea rspunsului proliferativ att al limfocitelor B, ct i al

celor de tip T, inhibarea sintezei anticorpilor i previne generarea celulelor T

citotoxice, suprim rspunsul in vitro al celulelor B cu memorie86.

M. mofetil pare mai selectiv pentru celulele T i B dect azatioprina5.Anticorpii

monoclonali ipoliclonali

OKT3

anticorpi anti CD25

anticorpi

policlonali

anti-limfocite

Primii anticorpi folosii n transplant au fost obinui prin injectarea de timocite

umane la animale.n anul 1980 a nceput folosirea anticorpilor monoclonali (mAb) produi prin

tehnica hibridizrii139.

OKT3-primul mAb folosit n clinic, este de provenien murin, se leag de

molecula complex a receptorului pentru antigen de pe membrana limfocitelor

T, adic complexul TCR-CD340, inducnd agregarea i endocitoza acestuia.

Dup administrarea anticorpilor se produce o scdere a limfocitelor T din snge

iar cele ce reapar sunt lipsite de complexul TCR-CD3 (modulaie antigenic) i

nu pot s rspund la alloantigenele grefei.

OKT3 a fost folosit n transplantul cardiac n tratamentul rejetului rezistent la

terapia cu steroizi37;97;110;115.

Anticorpii anti-CD25 (Daclizumab i Basiliximab), generai mpotriva

receptorului pentru interleukina-2, blocheaz receptorul exprimat de limfocitele

T activate, inhibnd proliferarea indus de IL-27;23;128.

Anticorpi policlonali anti-limfocite, cunoscui n prezent sunt ATGAM i

Thymoglobulin, determin scderea numrului de limfocite33, acionnd prinblocarea adeziunii intercelulare, inclusiv a adeziunii limfocitelor de endoteliul

vascular117.

Anticorpii anti CD45 - o protein implicat n activarea celulelor T, pot fi n

mod particular importani deoarece induc tolerana98.

3


34/40

Sunt folosii pentru inducerea i tratamentul pacienilor cu transplant cardiac

corticorezistent.Inhibitorii

semnalului de

transducie TOR

Tacrolimus

Rapamycin

n era modern a tratamentului imunosupresiv, sunt evaluate medicamentele

care inhib semnalul pentru proliferarea limfocitelor.

Inhibitorii TOR acioneaz blocnd serin-threonin-kinaza.

Tacrolimus TAC (FK506) este un macrolid produs de Streptomyces

tsukubaensis205 cu aciune analoag ciclosporinei.

Caracteristicile imunosupresive ale substanei au fost demonstrate in vitro n

1987134.

Mecanismul de aciune este asemanator ciclosporinei178, blocheaz activarea

calcineurinei55, deci efectele NF-AT, previn transcripia citokinelor212 i

blocheaz activarea celulelor T.inta intracelular este o imunofilin din aceeai familie ca cyclofilina cu

numele de FKBP-12, (FK-binding protein), efectul tacrolimusului fiind aditiv

efectului ciclosporinei.

De asemenea stimuleaz sinteza de TGF-beta133.

Sirolimus (SIR) sau Rapamycin a fost aprobat pentru folosire n clinic, iar

Everolimus sau RAD (Certican) este inc n investigaii clinice84.

SIR este un antibiotic din clasa macrolidelor, produs de Streptomyces

hygroscopicus263.

SIR are o structur similar Tacrolimusului, ambele interacioneaz cu proteina

citoplasmatic FKBP, nu afecteaz aciunea calcineurinei, dar mpiedic

semnalul transduciei la nivelul receptorului IL-2 (IL-2R) prin interaciunea

complexului rapamicina/FK-BP cu o protein citoplasmatic RAFT-1, o kinaz

esenial n activarea receptorului pentru IL-2 (IL-2R)94;141.

Pacienii transplantai, care primesc o perioad ndelungat inhibitori de

calcineurin, tind s dezvolte alterarea funciei renale mergnd pn lainsuficien renal cronic.

Unii pacienii care primesc timp ndelungat Sirolimus pot prezenta o cretere a

proteinuriei ( >1 g/zi) cu afectarea funciei renale1.

Tratamentul timpuriu posttransplant cu Rapamycin este asociat cu

3


35/40

mbuntirea fiziologiei arterei coronare235.Inhibiia maturrii

celulelor T i B

Deoxyspergualin

PG

LF15-0195

Deoxyspergualin-DSG a fost izolat din Bacillus laterosporus n anul 1981.

Principalul efect al DSG const n inhibarea prezentrii antigenului sau a

funciei costimulatorii a CPA132, deoarece pe deoparte inhib translocaia

nuclear a NF-KB probabil prin asociere cu proteinele ocului termic HSP 70 i

HSP 90, determinnd inhibarea eliberrii IkB, iar pe dealt parte IFN-gama

abolete efectul inhibitor al DSG asupra limfocitelor T citotoxice.

PG 490-88 este un extras de plante (Trypterygium wilfordii) utilizat n China de

peste 1000 de ani54, folosit n modelul allogrefei traheale heterotopice la

oarece, atenueaz boala obliterativ a cilor aeriene59.

Mecanismul prin care acioneaz triptolidul este diferit de al

imunosupresoarelor folosite curent, constnd n inducerea apoptozei celulelorT, blocarea proliferrii / maturarea fibroblatilor i inhibarea producerii

ARNm TGF-beta59.

Activitatea imunosupresiv a extractului PG27 din planta Trypterygium

wilfordii, n combinaie cu ciclosporina, crete supravieuirea allogrefelor

cardiace i renale n experimentele efectuate pe obolani266.

LF15-0195 (LF) este un imunosupresiv analog 15-deoxyspergualin-ului, mai

puin toxic, care previne rejetul grefei i induce toleran permanent n

transplantul cardiac119.

14. Xenotransplantul

35


36/40

Cu toate progresele n tehnica chirurgical, histocompatibilitea, metodele de pstrare i

imunosupresie, lipsa organelor reprezint un obstacol major n transplantul organelor solide.

Xenotransplantul, definit ca transplantul de organe i esuturi ntre specii diferite, ncearc s

rezolve problema numrului limitat de donori, comparativ cu necesitile tot mai crescute de

organe transplantate.

Primul caz raportat a fost acela al unui pacient n vrst de 68 ani a crui inim a fost nlocuit cu

una obinut de la un cimpanzeu109, dei rezultatul nu a fost un succes, cercetrile n acest

domeniu au continuat, iar astzi speranele sunt legate de ingineria genetic.

n cazul transplantelor xenogene se deosebesc dou tipuri: xenotransplantarea concordant

(transplante realizate ntre specii strns nrudite: baboon-cimpanzeu, cimpazeu-om) i

xenotransplantarea discordant (transplante realizate ntre specii ndeprtate filogenetic:

porc-maimu, porc-om).Cordul porcin a fost obiectul multor cercetri experimentale n xenotransplantul cardiac i

pulmonar, iar n anul 1992 s-a raportat cea mai recent xenogref clinic folosit n transplantul

cardiac65.

Reaciile de rejetare se aseamn cu cele observate n allotransplante, dar incidena i severitatea

sunt mult mai mari103.

S-au descris n cazul xenotransplantului urmtoarele tipuri de rejet: rejetul hiperacut, rejetul acut

vascular i rejetul mediat celular.

n declanarea rejetului sunt implicate mecanisme imune nnscute i dobndite: anticorpii

xenoreactivi, activarea complementului, ineficiena proteinelor membranare de reglare a

complementului din xenogref n faa fraciunilor complementului receptorului i aciunea

celulelor NK ale receptorului asupra vaselor sanguine din grefon203.

Principalii anticorpi naturali, umani xenoreactivi care iniiaz rejetul hiperacut (n cazul

xenotransplantului discordant, folosind cordul de porc)127 sunt direcionai mpotriva

carbohidratului alfa 1-3-Galactosyl-galactosa (alfa-Gal)202.

Folosind calea clasic de activare, legarea anticorpilor IgM xenoreactivi de endoteliul porcin,

produce activarea necontrolat a complementului.

Coagularea intravascular se poate produce i n lipsa complementului prin aciunea endoteliului.

Celulele endoteliale produc un anticogulant care, prin aciune local, previne tromboza.

3


37/40

Complementul este controlat prin inhibitori cum ar fi DAF (decay accelerating factor), factor

prezent la nivelul endotelului celular.

Acest factor este specific de specie, de exemplu organele porcului care conin DAF la nivelul

endoteliului, perfuzate cu snge uman nu vor preveni activarea complementului uman.

Cu toate acestea a fost sugerat c un porc transgenic cu nivele ridicate de DAF uman la nivelul

endoteliului celular ar trebui s fie capabil s previn activarea cascadei complementului de ctre

anticorpii xenoreactivi, n special dac nivelurile acestor anticorpi au fost reduse prin

plasmaferez68.

White, Pedor i Platt au propus dezvoltarea porcilor transgenici pentru fraciunile

complementului uman DAF si CD-59.

Prin supraexprimareafraciunilor complementului uman, DAF i CD-59, organele transgenice au

evitat rejetul hiperacut n cazul xenotransplantului renal, de cord i pulmonar, de la porc laprimate63;143;269.

Depleia temporar pretransplant a complementului cu venin de cobra9 i folosirea anticorpilor

anti-GAL au deschis calea unor viitoare succese mpotriva rejetului hiperacut140.

Reactia acut vascular - se declanaz n urma legrii anticorpilor provenii de la receptor la

suprafaa endoteliului grefei, ceea ce determin activarea complementului prin intemediul

complexului de atac al memebranei (MAC), urmat de anafilatoxine C3a, C5a i citokine

inflamatorii, care mediaz alte modificri la nivelul suprafeei endoteliului, pn la apariia unei

puternice stri procoagulante (activare de tip 2).

Toate aceste schimbri includ inducerea factorului tisular procoagulant, eliberarea PAI

(plasminogen activator inhibitor), scderea activatorului plasminogenului n esuturi i pierderea

activitii trombomodulinei.

Trombomodulina este exprimat la nivelul suprafeei endoteliului vascular i intervine n

diminuarea procesului trombotic prin activarea proteinei C231.

Rejetul mediat celular - studiul rejetului xenogrefei evideniaz aciunea celulelor NK ale

receptorului asupra vaselor sanguine din grefon184.

Examenul histologic evideniaz n rejetul organelor i esuturilor din xenotransplantele

concordante infiltraie celular, hemoragie, tromboz, modificri vasculare severe i prezena

celulelor fagocitare n infiltrat.

3


38/40

Prezena depozitelor de imunoglobuline i complement demonstreaz clar implicarea imunitii

umorale alturi de imunitatea celular.

n cazul xenogrefelor, reacia celular este secundar i apare dac grefa este meninut mai mult

de 4-5 zile.

De obicei, n absena proteciei cu medicamente sau reactivi imunologici ca anticorpii anti-CD45

sau imunolglobulina anti-celule T, rejetul umoral este att de rapid nct celulele T nu au timp s

se activeze.

Prevenirea rejetului xenogrefei concordante ar necesita inducia cu ageni biologici specifici

celulelor T i supresie celular cronic, incluznd inhibitorii calcineurinei (mycofenolat

mofetilului) i steroizi.

15. n loc de concluzii ...

n ultimul deceniu n transplantul cardiac s-au realizat progrese remarcabile, cu toate acestea seateapt noi provocri pentru a mbunti supravieuirea pacienilor transplantai.

Un factor major legat de supravieuirea pe termen lung este respingerea grefei si implicit efectele

imunosupresiei.

Dezvoltarea unor noi tehnici noinvazive de diagnostic va permite efectuarea evalurilor

frecvente, diagnosticarea timpurie a rejetului i monitorizarea eficienei terapiei

imunosupresoare.

Aplicarea in laboratoarele clinice de microbiologie din Romania a tehnicilor moleculare in

diagnosticul microbiologic264.

Testele moleculare gene expression profoling74 - ar putea fi n curnd disponibile i ar oferi cea

mai bun opiune de diagnostic noninvaziv.

Rejetul rmne cea mai mare provocare i n xenotransplant. Aproape toate celulele de mamifere

au markeri care permit sistemului imunitar s le recunoasc ca fiind strine.

3


39/40

Unele companii cerceteaz n prezent animalele transgenice, cum ar fi porcii, pentru a ncerca

s diminueze ansele de apariie a rejetului.

Rspndirea xenozoonozelor, boli infecioase ce apar n xenotransplant este nc o problem

nerezolvat. Un exemplu l reprezint PERVs (retrovirusurile endogene porcine) care sunt imune

la porci, dar pot infecta celulele umane izolate n culturi celulare.

Sunt necesare investigaii suplimentare pentru a depi obstacolele prezente si a mbunti pe

termen lung calitatea vieii i supravieuirea pacienilor transplantai.

Recunotina mea i alese mulumiri Dr-ului Gill Strejan, Profesor Emeritus,

University of Western Ontario London, Canada pentru sfaturile acordate

n elaborarea acestui capitol i revizuirea lui.

39


40/40

imunologia transplantului cardiac

Documents