Impacto del 16S rRNA gen Anlisis de secuencias para la identificacin deLas bacterias en Microbiologa Clnica y Enfermedades InfecciosasJill E. Clarridge III *Departamento de Medicina de Laboratorio de la Universidad de Washington, y de Patologa y LaboratorioServicio de Medicina, Veterans Affairs Medical Center, Seattle, Washington

INTRODUCCINUn rea dentro de la prctica de la microbiologa clnica es laarte de poner nombres cientficos de los aislados microbianos. Este esgeneralmente se hace con la intencin de dar una idea de la etiolgicoagente causante de una enfermedad infecciosa, incluyendo patolgicaasociaciones y posible terapia antimicrobiana efectiva. losmtodo histrico para la realizacin de esta tarea depende de lacomparacin de un morfolgica precisa y descripcin fenotpicade cepas de tipo o cepas tpicas con la precisamorfolgica y fenotpica Descripcin del aislado para seridentificado. Microbilogos autora referencias estndar talescomo el Manual de Bergey de Bacteriologa Sistemtica de o en el Manual deMicrobiologa Clnica o compilar los resultados de bien caracterizadocepas, tales como las que se encuentran en los Centros de EnfermedadesControl y la Prevencin o la Coleccin Americana de Cultivos Tipo(ATCC) publicara cuadros que resumen las caractersticasde cada especie de bacterias (35, 54, 60). Microbilogos clnicossera tratar de igualar los resultados para su desconocidacepa clnica con un grupo en estas tablas. No pocas veces,no habra partido perfecto y un juicio tendra queser hechas sobre la identificacin ms probable. A pesar de quediversos programas de esquema y de la computadora se disearon para ayudar aen estos juicios, la identificacin podra variar entre los laboratorios(96).En la dcada de 1980, comenz un nuevo estndar para la identificacin de bacteriasa desarrollar. En los laboratorios de Woese y otros,se demostr que las relaciones filogenticas de las bacterias, y,de hecho, todas las formas de vida, se pudo determinar mediante la comparacin de unparte estable del cdigo gentico (111, 113). Los candidatos para esterea de gentica en bacterias incluye los genes que codifican para la5S, 16S (tambin llamada la subunidad pequea), y el 23S rRNAy los espacios entre estos genes. La parte de la DNA ahorams comnmente usado para los propsitos taxonmicos para las bacterias seel gen 16S rRNA (7, 36, 44, 52, 64, 101). El ARNr 16Sgen tambin se designa 16S rDNA, y los trminos han sidoutilizan indistintamente: poltica ASM actual es que "16S rRNAser utilizado gen ". El gen 16S rRNA se puede comparar no sloentre todas las bacterias, sino tambin con el gen 16S rRNA de arqueobacteriasy el gen 18S rRNA de eucariotas. Figura 1muestra la relacin de las principales ramas de la vida, las arqueas,Las bacterias (procariotas), y Eucarya, as como el mayorramas dentro de los procariotas basados en estas secuencias de genes(62, 64, 111, 113).El objetivo de esta revisin es describir no slo el mecanismo

y los lmites de rRNA 16S bacteriano anlisis de la secuencia de genes, peroTambin el impacto y la contribucin potencial que el 16S rRNAanlisis de secuencias de genes puede aportar a la comprensin de la clnicamicrobiologa y enfermedades infecciosas. Se espera que estepromover el reconocimiento de que la identificacin correcta o taxonmicoasignacin de nombre puede hacer una diferencia en nuestra comprensindel proceso patognico y en el resultado clnico. LAms objetivo es ayudar al microbilogo clnico aventar laenorme cantidad de informacin taxonmica ahora est generandocon el fin de promover significativo y cientficamente exactacomunicaciones con colegas clnicos.MECNICA DEL PROCESOEleccin del 16S rRNA gen como el gen a secuenciaEn la dcada de 1960, Dubnau et al. (28) seal la conservacin en el16S rRNA relaciones de secuencia gnica en Bacillus spp. ExtendidoEl uso de este secuencia del gen para la identificacin bacterianay taxonoma sigui una obra pionera de Woese,quien defini propiedades importantes. La ms importante es el hecho de que separece comportarse como un cronmetro molecular, como se seala enun excelente artculo de revisin por Woese (113). El grado deSe supone que el resultado de la conservacin de la importancia de la16S rRNA como un componente crtico de la funcin celular. Esto est encontraste con los genes necesarios para hacer las enzimas. Las mutaciones enestos genes por lo general se pueden tolerar ms frecuencia ya quepuede afectar las estructuras no como nicos y esenciales como ARNr (si unbacteria no tiene el gen para hacer las enzimas necesariaspara utilizar la lactosa, se puede usar un azcar alternativo o protena comouna fuente de energa). Por lo tanto, algunos otros genes altamente conservados como secomo el gen 16S rRNA. Aunque la tasa absoluta decambio en la secuencia del gen 16S rRNA no se conoce, lo hacemarca de la distancia evolutiva y la relacin de los organismos (44,49, 62, 100). Los problemas en la asignacin de un valor numrico a estatasa de cambio incluyen la posibilidad de que esta tasa de cambio de

CLARRIDGEGen 16S rRNA puede no ser idntico para todos los organismos (diferentegrupos taxonmicos podran tener diferentes tasas de cambio), eltasas podran variar a veces durante la evolucin, y las tasas de inters podranser diferente en diferentes sitios a lo largo del gen 16S rRNA.No son los llamados "puntos calientes" que muestran un mayor nmero demutaciones (101, 104); estas reas no son las mismas para todosespecies. 16S rRNA es tambin el objetivo de varios antimicrobianosagentes. Como tal, las mutaciones en el gen 16S rRNA pueden afectar a lala susceptibilidad del organismo a estos agentes y los 16Ssecuencia del gen rRNA puede distinguir resistencia fenotpica aagentes antimicrobianos (69, 70). Sin embargo, estas caractersticasno obviar o afectar el uso de la secuencia del gen 16S rRNA deidentificacin bacteriana o cesin de las relaciones cercanas enel nivel de gnero y especie, tal como se utiliza en microbiologa clnica.Ellos pueden tener un mayor impacto en la asignacin de las relacionesde las ramas ms profundas (ms alejadas) (36).La secuencia del gen 16S rRNA es de aproximadamente 1.550 pb de largo y escompuesta de ambas regiones variables y conservadas. El gen eslo suficientemente grande, con suficientes polimorfismos interespecficos deGen 16S rRNA, para ofrecer distintiva y estadsticamente vlidamediciones. Cebadores universales suelen ser elegidos como complementariosa las regiones conservadas en el comienzo de lagen y, ya sea en la regin de 540 pb o al final de la totalidadsecuencia (sobre la regin 1.550 pb), y la secuencia de laregin variable en el medio se utiliza para la taxonoma comparativa(11, 75). Aunque 500 y 1500 pb son longitudes comunespara secuenciar y comparar, secuencias en bases de datos pueden ser devarias longitudes.La secuencia del gen 16S rRNA se ha determinado para unagran nmero de cepas. GenBank, el mayor banco de datos desecuencias de nucletidos, cuenta con ms de 20 millones de secuencias depositadas,de los cuales ms de 90.000 son de gen 16S rRNA. Esto significa esohay muchas secuencias previamente depositadas contra la cualpara comparar la secuencia de una cepa desconocida.Por ltimo, el gen 16S rRNA es universal en las bacterias, y por lo tantorelaciones se pueden medir entre todas las bacterias (111, 113)(Figura 2). En general, la comparacin del gen 16S rRNAsecuencias permite la diferenciacin entre los organismos a nivel de gneronivelar en todos los principales phyla de bacterias, adems de la clasificacincepas en mltiples niveles, incluyendo lo que hoy llamamos la especiey subespecies de nivel. Las excepciones ocasionales a la utilidaddel 16S rRNA secuenciacin de genes por lo general se refieren a ms de unaespecies que tienen las mismas o muy similares secuencias bien conocido.Tambin es importante considerar si es necesariosecuenciar toda la longitud de 1.500 pb o si el comnmentereportados secuencias ms cortas pueden proporcionar informacin comparable.A veces la secuenciacin de toda la regin de 1500 pb que es necesariodistinguir entre determinados taxones o cepas (84, 85).La secuenciacin de toda la secuencia de 1500 pb que tambin es deseabley por lo general se requiere cuando se describe una nueva especie. Sin embargo,para la mayora de bacterias clnica aislados de la secuencia inicial de 500 pbproporciona diferenciacin adecuada para la identificacin y de hechopuede proporcionar una mayor diferencia por ciento entre cepas debidola regin muestra un poco ms de la diversidad por kilobasessecuenciado. Kattar et al. (48) encontraron que 66% de la variabilidaden la secuencia del gen 16S rRNA entre las especies de Bordetella eraen los primeros 500 pb. Las evaluaciones publicadas en la literatura,realizado utilizando la base de datos MicroSeq (Applied Biosystems Inc.[ABI], Foster City, Calif.), Se basan por lo general en los 500 pbsecuencia (42, 66, 97, 98). Otros investigadores han hecho identificacionesel uso de secuencias de aproximadamente 400 pb (6) o incluso menos de200 pb (109). Los datos en las cifras y clculos en esta revisinreferirse a la longitud 500-bp menos que se indique lo contrario. Desde elBases de datos MicroSeq de ms de 1.400 organismos, tanto para el 500-y longitudes de 1.500 pb, se compararon los 500 y 1500 pbsecuencias para 100 organismos mediante el uso de cada longitud para generardendrogramas y encontr las relaciones de las especies a ser bsicamentela misma, ya sea con longitud. Por ejemplo, la Fig. 3 muestraque generaron dendrogramas utilizando 16S 1500 pbsecuencia de rRNA gen (parte izquierda de la figura) o 16S 500 pbsecuencia del gen rRNA (lado derecho de la figura) de un grupo de clnicay cepas de tipo de Brevibacteria son similares pero no idnticos.En una nota prctica, la generacin de la secuencia de 500 pb es menorcostoso y ms fcil ya que tiene ms reacciones de secuenciacinpara generar la secuencia de 1500 pb.Muchas otras regiones genmicas tambin se han utilizado para examinarlas relaciones filogenticas entre las bacterias. Todo el genomaEl anlisis se ha intentado, pero esto es muy difcil porque elgenomas son de este tipo de tamaos diferentes y debido a la duplicacin de genes,la transferencia de genes, delecin del gen, gen de fusin, y la divisin genson comunes; en la actualidad hay menos de 100 enteragenomas para comparar (3, 112). Sin embargo, se ha observadoque los rboles basados en el anlisis de todo el genoma y los 16SrRNA rboles de genes son similares (3). Otras reas del rRNAgen tambin se han utilizado para el estudio de las relaciones filogenticasentre las bacterias. Roth et al. utilizado el gen 16S rRNA 23S-internos secuencias transcritas separadores para distinguir entreMycobacterium spp., Encontrando particularmente til para las especiesque eran indistinguibles por 16S rRNA secuencias de genes (82).Otros han encontrado que el uso de 23S rRNA secuencias tiles endistinguir entre Streptococcus spp. (72). Aunque algunoslos investigadores a encontrar que un robustez general del mtodo essugerido porque los principales puntos de ramificacin de la filogenticarbol se conserva cuando sea el 16S rRNA o 16S-Se utilizaron 23S rRNA secuencias de genes (82), otros encuentran 16Ssecuencia del gen rRNA mucho ms til para el anlisis filogenticode la regin del gen rRNA 16S-23S (89). En cualquier caso, elmtodo no se utiliza ampliamente, y hay pocos comparativasecuencias. Para micobacterias, el gen que codifica la 65-kDaprotena de choque trmico est altamente conservada y tambin se ha utilizadopara definir las relaciones taxonmicas (63, 79, 101). Aunque elgen que codifica la 65-kDa secuencias de protenas de choque trmico sonfilogenticamente til, muchos menos de ellos estn disponibles en bases de datos.rboles filogenticos obtenidos usando la protena-codificacincomparacin de secuencias de genes no parecen revelar arraigadarelaciones taxonmicas y evolutivas tan fiable como losobtenido usando el gen 16S rRNA (36,40, 55).En general, si se quiere comparar las cepas para epidemiolgicapropsitos o para detectar una cepa que tiene una virulencia especialfactorial, anlisis de genes 16S rRNA no suele ser adecuada existeno es suficiente variacin, y, obviamente, la regin no codificafactores de virulencia. Una excepcin a esto es la microheterogenietyen la secuencia del gen 16S rRNA encontrado por Sacchi et al.(85), que podra ser utilizado para realizar un seguimiento de cepas de Neisseria meningitidis.Adems, si uno est interesado slo en la diferenciacin de las especiesdentro de un gnero particular, un gen mejor que el rRNA 16Sgen podra ser encontrado para identificar las especies. Por ejemplo, elgen de la sintetasa citrato en los gneros Bartonella y Rickettsia(32, 73) parece ser nico para cada especie y por lo tanto es unexcelente herramienta en experimentos para diferenciarlos. Sin embargo,

ningn gen ha mostrado como una amplia aplicabilidad sobre toda la taxonmicogrupos como el gen 16S rRNA. Por lo tanto, si el objetivo esidentificar un organismo desconocido sobre la base de ninguna a prioriconocimiento, la secuencia del gen 16S rRNA es un excelente yampliamente utilizado eleccin. La nueva edicin del Manual de BergeyBacteriologa Sistemtica, el ms utilizado y con autoridadreferencia en taxonoma bacteriana, se organiza usando 16S rRNAgen anlisis de la secuencia como la columna vertebral. Dos captulos de lasegunda edicin del Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey seespecialmente recomendado y dar una excelente visin general (36,55).Fundamentos de SecuenciacinMtodos de secuenciacin de cidos nucleicos han experimentado un enormelos avances en la ltima dcada. Estos rpidos avanceshan hecho posible que incluso un pequeo laboratorio para determinarla secuencia de millones de pares de bases de ADN por ao. loscalidad de los datos de secuencia ha mejorado con la velocidad ytecnologa disponible. Por lo tanto, se ve que en bases de datos pblicastales como GenBank, las secuencias del gen 16S rRNA depositados ena principios de 1990 tienen muchos ms incorrectos e indeterminadobases que hacer secuencias generadas recientemente. Esbozamos brevementelos pasos requeridos a continuacin y en la Tabla 1. La Tabla 1 tambin muestra latiempo aproximado necesario para cada paso del colorante terminador ABImtodo. Otras publicaciones dan estos pasos en msdetalle, junto con diagramas (52, 65, 98). En general, es posiblepara generar una secuencia en menos de 1,5 das de trabajo mediante el uso demenos de una colonia o directamente a partir de una muestra (9, 22, 98).Histricamente, ha habido varios mtodos para determinarSecuencia de ADN. Estos mtodos se detallan en la referencia 87(captulos 13 y 14). Se extrae ADN genmico bacterianoa partir de clulas enteras utilizando un mtodo estndar (87) o un comercialsistema (por ejemplo, reactivo de extraccin de ADN PrepMan; ABI).El ADN se utiliz como molde para la PCR para amplificar un segmentode alrededor de 500 o 1500 pb de la secuencia del gen 16S rRNA.De base amplia o cebadores universales complementarios a conservadaregiones se utilizan de manera que la regin puede ser amplificado a partir de cualquierbacterias. Los productos de PCR se purifican para eliminar el excesocebadores y nucletidos; varios kits comerciales son buenosdisponibles (por ejemplo, equipo de purificacin QiaQick PCR [Qiagen] yMicrocon-100 microconcentrador columnas Millipore []).El siguiente paso es un proceso llamado ciclo de secuenciacin. essimilar a la PCR en la que se utiliza el ADN (productos purificados de laprimer ciclo PCR) como molde. Tanto el avance y retrocesosecuencias se utilizan como molde en reacciones separadas ense utiliza que slo el cebador directo o inverso. Ciclo de secuenciacinTambin se diferencia de PCR en que ninguna nueva plantilla esformado (la misma plantilla se reutiliza durante tantos ciclos comoprogramado, por lo general 25 ciclos) y el producto es una mezcla deADN de diferentes longitudes. Esto se logra mediante la adicin especialmentebases marcadas llamados terminadores de tinte (junto con etiquetabases), que, cuando se incorporan al azar en estesegundo ciclo, terminar la secuencia. As, fragmentos de cadatamao se generan. Como cada uno de los cuatro aadido terminador marcadobases tiene diferentes colorante fluorescente, cada uno de los cuales absorbea una longitud de onda diferente, la base de terminales de cada fragmentopuede ser determinada por un fluormetro.Los productos se purifican para eliminar los terminadores de tinte no incorporados,y la longitud de cada capilar se determina utilizandoelectroforesis (por ejemplo, ABI PRISM 3100 analizador gentico con 16o capilares ABI PRISM 310 analizador gentico con 1 capilar)o electroforesis en gel (por ejemplo, el sistema Visible Genetics). Desde que nosotrosentonces conocer la longitud y la base de terminales de cada fragmento, elsecuencia de las bases se puede determinar. Las dos hebras de laADN se secuenci por separado, generando tanto hacia delante comorevertir secuencias (complementarios). Un electroferograma, unael rastreo de la deteccin de los fragmentos separados, ya que eluyende la columna (o estn separadas en el gel) en el que cada baseest representado por un color diferente, puede ser manual o automticamente editado. Es posible tener los fragmentos de diferentes longitudestan bien que separa cada base de una secuencia de 500 pb que puede serdeterminado. Cuando se producen ambigedades, la mayora de ellos pueden ser resueltospor reedicin visual del electroferograma.Hemos evaluado dos secuenciadores de ADN diferentes para la clnicaidentificaciones de microbiologa. El modelo 3100 secuenciador ABIera superior al modelo 310 secuenciador en la longitudde la secuencia fiable (520 y 460 pb, respectivamente), ademsa la superioridad publicada de facilidad de uso y el tiempo de ejecucin. Enel tiempo y el anlisis de costos, nuestro tiempo y por lo tanto nuestros costos sonsobre la base de datos usando el analizador gentico ABI PRISM 3100.Las secuencias de ADN generadas son por lo general ensamblados poralineando el avance y secuencias revertir. Esta secuencia de consensoa continuacin, se compara con una biblioteca de base de datos mediante el uso de anlisissoftware. Algunos sistemas permiten comparaciones de la sola hacia adelanteo revertir secuencias. Bases de datos bien conocidos de gen 16S rRNAsecuencias que se pueden consultar a travs de la World Wide Web sonGenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), la base de datos ribosomalProyecto (RDP-II) (http://rdp.cme.msu.edu/html/), el ribosomalBase de datos del proyecto European Molecular Biology Laboratory(http://www.ebi.ac.uk/embl/), inteligente Gen IDNS (http: // www.smartgene.ch) y ribosomal Diferenciacin de Microorganismos Mdicos(RIDOM) (http://www.ridom.com/). La propietariaMicroSeq 500 de base de datos bacteriana (versin 1.4.2) contienesecuencias para 1.434 especies o subespecies dentro de 235 gneros.ASIGNACIN DE UNA IDENTIFICACIN CON 16S RRNASECUENCIAS DE GENESINFORMACIN GENERAL SOBRE BACTERIANA IDENTIFICACIN Y TAXONMICACOLOCACIN USANDO 16S RRNA SECUENCIAS DE GENESEn la Fig. 2, las principales ramas de bacterias importantes encontradosen la prctica clnica se muestran en forma de dendrograma,mientras que en la Fig. 1, se muestran las principales divisiones de bacteriascon todas las dems formas de vida en una forma de estrella. Como referencia, notas ycomparar donde Bacillus, Clostridium, Escherichia y estn encada figura.La Figura 2 se gener por la eleccin de 62 genticamente ampliamentecepas diferentes que representan a los principales grupos taxonmicos oclados de inters mdico en la base de datos de MicroSeq. La clamidiatrachomatis es el grupo afuera. La lnea horizontal en lala parte superior (en este caso, 16,105%) se utiliza para proporcionar una medida aproximadade distancia gentica. Para ver la diferencia gentica aproximadaentre dos clados en la fig. 2, las dos distancias horizontalesentre las especies que deben evaluarse se aaden (la vertical,distancia no cuenta) y el total se compara con la parte superiorlinea horizontal. Por ejemplo, Nocardia asteroides y Corynebacteriumdiphtheriae diferir en aproximadamente un 10%, mientras que Treponemamedianas y Mycoplasma hominis difieren en aproximadamente28%. Los nmeros reales generados de esta manera no son muyprecisa, especialmente para los gneros que no estn estrechamente relacionados. losvalores tambin varan un poco con el programa informtico utilizado paragenerar el dendrograma. Sin embargo, son tiles para estimarrelacin relativa. La escala del dendrograma y de lanmero de organismos que faltan pueden apreciarse mejor sise observa que el organismo Escherichia coli representa la totalidadEnterobacteriaceae clado de ms de 50 especies y Vibrio cholerae esel organismo ms estrechamente relacionada representado en la Fig. 2. Ademsa dendrogramas, el porcentaje de similitud, porcentaje de disimilitud,alineacin de todo el gen, y la alineacin concisa se pueden utilizar paracomparar y evaluar secuencias.Problemas en la generacin de una secuenciaCon qu frecuencia son secuencias mal? Aunque la tecnologa esde tal manera que la lectura secuencia est recibiendo cada vez ms precisa,se estima que puede haber un error del operador en la edicin en1 en 5000 a 1 en 10.000 pb. Los errores en este nivel no hacen undiferencia en el nombre de la especie (44). Tambin hay una preguntasi la secuencia de ADN debe tener solapamiento que es exactao si una secuencia adecuada se podra obtener mediante el uso deslo la secuencia de avance o de retroceso. Varios grande e influyentelaboratorios utilizan slo la secuencia de avance (6). En unoestudio de 50 aislamientos, ya sea hacia adelante o secuencia inversa podraser utilizado para asignar una identificacin de la especie correcta, con menos de1% de diferencia entre las secuencias (JE Clarridge, Q. Zhang,y S. Heward, Abstr. 101a general Meet. Am Soc. Microbiol.2.001, abstr. C-44, 2001). Otros laboratorios generan secuenciasel uso de mltiples superposiciones, particularmente si microheterogeneidades importante (84, 85). Desde polimerasas de alta fidelidad concapacidad de correccin se hizo disponible, errores generados por PCRson muy bajos.En contraste con la precisin alcanzable hoy en da con laexcelente equipos y reactivos disponibles, algunas de las secuenciasdepositados en bases de datos pblicas tales como GenBank, en particularlas derivadas de hace ms de 10 aos, no son muy precisos(18). Esto suele ser debido a que algunas secuencias no eran claramentegenerada, a menudo debido a la mala separacin de los fragmentosen los pasos de electroforesis en gel. Al evaluar una secuenciagenerado en otro laboratorio u otra base de datos para queel electroferograma no est disponible, pistas sobre un mal ledo osecuencia generada son que tienen muchas bases ambiguas,que se indican como N, R, Y, W, M, S, o K (lo que significa que labase es desconocida, A o G, C o T, A o T, A o C, G o C, Go T, respectivamente). Tambin se pueden ver las letras B, D, H y V,representando ambigedades 3-base. Secuencias depositadas msrecientemente son mucho ms precisos.Vale la pena examinar la calidad de las secuencias antesutilizarlos. Durante un estudio de cepas de Actinomyces (17), sesecuencias comparadas desde una base de datos comercial (MicroSeq),una base de datos pblica (GenBank-EMBL), y nuestro propio interiorbase de datos generada. La cepa tipo de Actinomyces turicensisen la base de datos GenBank y las 12 cepas clnicas que nossecuenciado mostr mnima (no dos) diferencias y sinbases ambiguas, lo que indica que todos eran secuencias de buena calidad.La secuencia de la cepa tipo de A. meyeri desdeMicroSeq era tambin de alta calidad. Sin embargo, la cepa tipo deA. gravaenitzii en la base de datos GenBank era de peor calidad,con 25 N de 500 pb en secuenciado (5%). Por lo tanto, inicialmente aparecique el A. fenotpicamente similares gravaenitzii cepaseran genticamente ms heterogneo que el A. turicensiscepas, aunque esto no puede ser verdad.Aunque la mayora de las ambigedades pueden resolverse por una reedicin deel electroferograma original si disponibles (electroferogramasNo estn disponibles en GenBank y no vienen con los manuscritospara su revisin), tambin puede haber situaciones en las que no esposible determinar una base nica para una posicin particular.Por lo general, esto es debido a algn problema tcnico, por ejemplo, laespcimen original no era un cultivo puro, el rendimiento de marcadoproducto era demasiado bajo, o la columna estaba funcionando mal. En estocaso, por lo general hay muchas bases ilegibles y el todoprocedimiento de secuenciacin debe repetirse.Tambin es posible que los polimorfismos intracelulares podracausar dificultades para obtener una secuencia fcilmente interpretable;es decir, ya que hay mltiples copias del gen 16S rRNAdentro de un genoma de una sola clula, podra haber varios diferentessecuencias y de este modo podra haber dos pares de bases diferentes en unadada la ubicacin. La existencia de la variante 16S rRNA alelos del genen un solo genoma se ha demostrado de forma convincente envarios informes (38, 61, 74, 104, 110). La mayora de los documentadoheterogeneidades intracelulares son slo uno o dos polimorfismospor secuencia y no dara lugar a diferentes especiesidentificacin. Entre estos informes, la tasa ms alta de polimorfismosencontrado (104) fue con las culturas del stock de Streptomycesspp .; 2,5% de 475 cepas mostr la diversidad de ms de 1 de cada1.500 pb. La mayor diversidad de 14 pb, que se muestra por una cepa,es todava slo 1% del nmero total de pares de bases secuenciadas. EnStreptomyces spp., La mayora de los polimorfismos son intracelularesen el hipervariable? regin de hlice entre pb 173 a 195, lamisma regin del gen de ARNr 16S en el que el individuoEspecies de Streptomyces difieren ms (86). No todos los gneros tienenla misma regin hipervariable. Tambin hay un informe que comparasecuencias de todo el genoma que encuentra 16S muy disparesrRNA secuencias de genes en un solo clon (3), lo que sugiere largefragmentla transferencia de genes. La incidencia global de los polimorfismospuede ser reevaluado en el futuro mediante tcnicas quepodra detectar un alelo variante expresada en cantidades menores, pero por loeste punto no parece ser un problema para las identificaciones precisasen microbiologa clnica. Durante una revisin de cientosde anlisis de secuencias de nuestro laboratorio, se encontr quepolimorfismo intracelular no ha sido un problema y queslo unos pocos de Y o R han tenido que ser asignado. A pesar de que lapolimorfismos intracelulares pueden no ser suficientemente numerosospara generar un nombre de especie diferente en funcin de cada uno de lossecuencias, han de ser considerados y pueden ser tiles cuandoutilizando la secuencia del gen 16S rRNA para la cepa epidemiolgicaseguimiento (38, 85).Uno debe estar seguro de distinguir la existencia de dos (oms) variante 16S rRNA genes en un solo genoma de unmezcla de cepas estrechamente relacionadas pero distintas en la presuntacultivo puro. En nuestros estudios de la "Streptococcus milleri"grupo, se inform de esta segunda posibilidad, en la que hay unacultivo mixto de dos o ms separada pero altamente relacionadalas cepas de la misma muestra. Por ejemplo, dos cepas de S.anginosus (cepas VAMC 417-1 y 417-2, como se ha sealado en referencia13) se congelaron originalmente como una sola cepa, pero contrabajo preciso en la clasificacin de las ligeramente diferentes fenotipos,cada subcepa pudo aislarse en cultivo puro y se demostrque ser nico en el genotipo y el fenotipo. La diferencia en la secuenciaen los aislamientos fue slo 4 pb en la longitud de 500 pb, yno haba bases ambiguas. Si hubiramos secuenciado la mezcla,estas cuatro posiciones podran haber aparecido como tres R yuna Y, lo que algunos podran haber interpretado como polimorfismo intracelular.La situacin en la que la muestra original no esun cultivo puro, pero la cepa contaminante no est estrechamente relacionadoes ms fcil de resolver ya que no habra suelen ser mayores de 50 aosbases ambiguas; bajo estas circunstancias, el organismo (s)debe reaislado y resequenced.Generacin Dendrogramas y Secuencias ComparacinVarios paquetes de software de secuencia comparando estn disponibles.Generalmente usamos el software propietario que viene con elMtodo MicroSeq. Otros paquetes de software comunes sonPAUP (107), BLAST (1), y Phylip (30, 31; Filogenia InferenciaPaquete de la Universidad de Washington). BIBI, un bioinformat-ics herramienta de identificacin bacteriana, recientemente ha sido desarrollado parasimplificar y automatizar las identificaciones bacterianas usando secuencia de ADNanlisis (24); est disponible en http: //pbil.univ-lyon1.fr / bibi /. Un excelente sitio web que compara 194 de la filogeniapaquetes de software y 16 servidores libres que se utilizan engenerando dendrogramas as como abordar otros conceptoscubierto en esta revisin es http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html. Las comparaciones se muestran comnmente comodendrogramas y alineaciones lineales (por alineaciones lineales concisas,todos los pares de bases idnticas y slo se omiten ladiferencias se muestran).Mtodos comnmente utilizados para la generacin de dendrogramas sonel mtodo (vecino a participar) NJ, el UPGMA (no ponderadomtodo con promedios aritmticos grupo de pares), y elWPGMA (mtodo de grupo par ponderada con promedios aritmticos)(86, 107). Los mtodos son comparables, y el mayoragrupaciones se conservan si las cepas estn estrechamente relacionados.Sin embargo, cuando los taxones que se comparan son menos estrechamente relacionados,las relaciones dendrograma se ven ms fuertemente afectadospor el programa utilizado. La Figura 4 muestra los dendrogramas generadospor los mtodos NJ para algunos Streptococcus spp. Las Figuras 4Ay B son dendrogramas con diferentes grupos externos, es decir, el primariosecuencia contra la que se compara una secuencia. El mejoropcin para el grupo afuera es una cepa muy relacionada a las afuerasel grupo est estudiando. Cuando un grupo afuera es inapropiadoescogido, como en la Fig. 4A (Chlamydia trachomatis es demasiado distanterelacionada), las relaciones de los clados pueden ser oscurecidas. S.anginosus puede ser demasiado estrechamente relacionada pero es til en que ellas diferencias son claras (Fig. 4B). Una comparacin concisa de lamismos aislamientos se muestra en la Fig. 4C. Otro mtodo de comparacines lo que se llama una alineacin concisa: slo las diferenciasentre los se muestran las secuencias comparadas (Fig. 4C). losnmeros en la parte superior de la figura son la posicin base en elsecuencia y son para ser ledos en vertical; por ejemplo, la cepaVAMC5210 difiere de la cepa S7745 en las posiciones 137, 274, y487.La longitud de la secuencia analizada y la herramienta de alineacinutilice tambin puede influir la comparacin de secuencias. En la Fig. 3,a pesar de que las relaciones mostradas entre los Brevibacteriason similares, el dendrograma refleja el hecho de que los trestensiones en el grupo Brevibacterium mcbrellneri no muestran diferenciasen la primera secuencia de 500 pb, pero hay cinco o seisdiferencias en la ltima secuencia de 1000 pb. Este es un menos frecuenteocurrencia que en el caso donde hay ms heterogeneidad enel segmento inicial del gen (48). Sin embargo, si el clnicocepa VAMC3643 y B. epidermidis se comparan utilizando dosherramientas de alineacin (BLAST y el algoritmo de Needleman Wunsch),cuatro conjuntos idnticos de porcentajes disimilitud son generado. Para ambos tipos de comparaciones, las secuencias de 500 pbmostrar ms disimilitud. Ms importante es que los dos programasdar resultados algo diferentes; BLAST es ms rpido, pero menospreciso que el algoritmo de Needleman Wunsch. Por ejemplo,el porcentaje de disimilitud en toda la secuencia de 1500 pb entrecepa clnica VAMC3643 y B. epidermidis fue 0,8%usando el algoritmo de Needleman Wunsch y 1,5% usando elComparacin BLAST. Los mismos clculos basados en la primera500 pb son 1,8 y 2,8%, respectivamente. El orden de relacinera aproximadamente la misma para los cuatro conjuntos de clculos para elcepas estrechamente relacionadas. Sin embargo, esto no es cierto para los msespecies mostradas en la Fig lejanamente relacionadas. 3. Ms precaucin debe serejercido en el uso de datos de secuencias para asignar taxonmica exactarelaciones entre los taxones superiores (36, 55).El dendrograma tambin se puede utilizar para evaluar un desconocidosecuencia. Para demostrar cmo se puede evaluar rpidamente un desconocidosecuencia desde cualquier base de datos, que import una secuencia,Leptotrichia buccalis L37788, que no est en la MicroSeqbase de datos, desde la base de datos GenBank y la incorpor ael dendrograma generado con las secuencias de la cepa de tipoBase de datos MicroSeq (Fig. 2). Se coloca adecuadamente en el-fusobacterias streptobacilli linaje. Adems, una cepa secuenciadaen nuestro laboratorio, Unknownsp01M1398, fue incorporadaen el dendrograma para demostrar la relacin deel organismo a otros grupos principales, a pesar de que no hayuna secuencia estrechamente relacionada con la que comparar en elbase de datos. Representa una novela, lnea gentica profundamente divergentesque es de aproximadamente 20% divergentes de cualquier bacteria en la MicroSeqbase de datos y los partidos solamente una cepa "uncultureable" en elBase de datos GenBank (estas bases de datos se discuten a continuacin).Ambas cepas son vistos a mitad de la dendrograma.Hay ciertos aspectos de relacin que son mejoresmostrado por dendrograma o por comparacin de alineacin concisaque por ciento disimilitud. En la Fig. 4B muestra el dendrogramaque las cepas S5366, S7377 y VAMC6703 no estn en el mismogenogrupo y la alineacin concisa muestra la base exactadiferencias, sin embargo, el porcentaje de disimilitud de la cepa 5366 detanto S7377 y VAMC6703 es 1,1%. As, por ejemplo, unono puede asumir que porque dos cepas son 1.1% dismil auna cepa particular, tienen una relacin ms estrecha entre s(en este caso son 1.2% dismiles entre s).Bases de datos de secuenciasPara las identificaciones fenotpicas de microorganismos, estamosdepende de una base de datos con un morfolgica precisa yDescripcin bioqumica de las cepas de tipo o cepas tpicas ymtodos estndar para determinar estas caractersticas para laaislar ser identificado. Del mismo modo, para la exacta gen 16S rRNAidentificacin de la secuencia de los organismos, somos dependientes desecuencias precisas en bases de datos, nombres apropiados asociadoscon esas secuencias, y una secuencia precisa para el aisladoser identificado.Hay varias razones por las bases de datos de secuencias pueden variary no puede enlazar con precisin un nombre con una secuencia y,Adems, con una colocacin relativa correcta de la secuenciaentre otras secuencias bacterianas. Podra ser que el tipo decepa o cepas en colecciones certificadas como ATCC fueronincorrectamente con nombre o clasificados por medios bioqumicos o quelas descripciones son simplemente incorrecto. Un ejemplo conocido de un organismode ser colocado en el gnero equivocado es "Corynebacteriumaquaticum ". Aunque" C. aquaticum "tiene, por encima, elmisma morfologa que el corinebacterias, es genticamente distantesDel gnero Corynebacterium y est ms estrechamente relacionado conorganismos en el gnero Microbacterium. Otro ejemplo esque al ser examinados por mtodos genotpicos, las cepas ATCCpreviamente depositado como Corynebacterium xerosis se encontr queser diversa e identificado incorrectamente (23). Hay numerososotros errores sencillos en taxonoma que se abordan enla nueva edicin del Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey(36).Tambin existe la mala colocacin de las especies bien definidas presumiblementedentro de un solo gnero, pero en realidad se encuentra en muchosgrupos taxonmicos. Las especies del gnero Enterobacter se encuentranasociado con cinco gneros diferentes. Enterobacter es una buenaejemplo de lo que se llama un gnero polifiltico, como es Citrobacter.En un intento de corregir esto, algunos de los Enterobacter histricospp. se les ha dado el nuevo nombre del gnero Pantoea (por ejemplo,P. agglomerans y P. aerogenes). Proteus es un monofilticognero con todas las especies en un solo clado.Una tercera razn para el error se aplica principalmente a las bases de datos no verificadostales como GenBank, que acepta cualquier nombre relacionado ysecuencia que se enva a ellos. En la investigacin de 1.995Secuencias de GenBank, una comparacin de secuencias para la presuntamisma especie mostr que casi el 20% tenan ms de2% de variabilidad, lo que indica que muchas cepas genticamente diferentesestaban siendo depositados bajo el mismo nombre de la especie (18). Enalgunas ocasiones, el nombre asociado con una secuencia dadapuede no ser correcta debido a las descripciones fenotpicas pobres oprueba defectuosa. Por ejemplo, las cepas depositadas de los gnerosAlcaligenes y Achromobacter se entremezclan, con las descripcionesy la secuencia de superposicin de ambos. En otras ocasiones,las secuencias depositadas en GenBank no estn completos o comoprecisa como podran ser. Por ejemplo, se compar lasecuencia de la cepa tipo de Mycobacterium szulgai generaen nuestro laboratorio para las secuencias en la base de datos GenBanky la base de datos MicroSeq (115). La secuencia de laBase de datos de MicroSeq y nuestra secuencia de acuerdo, mientras que la Gene-Secuencia Banco tena un nmero inaceptable de bases que erancatalogado como N o indeterminado.Wilck et al. Tambin han sealado que las bases de datos como GenBank,los cuales son muy amplio (es decir, contiene tanto patgenas y no patgenascepas de origen humano, animal, y el origen del medio ambiente)y no inter pares, suelen contener errores. Ellos sugierenque el uso de bases de datos revisadas por expertos para definir el16S rRNA secuencias de genes de bacterias que se encuentran en los seres humanos lo haramejorar la validez de este mtodo de identificacin organismoen el laboratorio de microbiologa clnica (109). Fue este tipo deconsideracin que impuls el desarrollo de la propiedadBase de datos de MicroSeq de cepas y el tipo verificadosBase de datos de RIDOM.Hay pocos trabajos sobre la evaluacin del GenBank,Bases de datos RDP-II (57), y RIDOM y programas basados en Internet.Para demostrar la calidad y la exactitud de los resultadosproporcionado las bases de datos disponibles, Turenne et al. presentado 79secuencias de cepa de tipo micobacteriana determinaron en su laboratoriopara el anlisis utilizando la base de datos GenBank, la RDP-II,y, ms recientemente, la base de datos RIDOM (103). Encontraronque todas las secuencias de cepa de tipo generaron tenan unasecuencia aceptacin idntica cuando se analiza por RIDOMmientras que slo el 23% de las especies tena una combinacin perfecta con secuenciasa partir de bases de datos GenBank segn lo determinado por BLASTy 25% de las especies tena una combinacin perfecta segn lo determinado porRDP-II. Esto significa que la calidad y / o el nmero de lasecuencias de micobacterias en RIDOM es mayor. Sin embargo aunquela base de datos RIDOM tiene una particular buena coleccinde secuencias de micobacterias, hay una gama de otros narrororganismos: en 2002 la base de datos tena slo 237 secuencias, delos cuales 158 eran de micobacterias. Turenne et al. encontrado que hayespecies no estaban presentes en otras bases de datos pblicas que eranpresente en la base de datos RIDOM (103). La base de datos RIDOMest ampliando y ampliando su base de datos con secuencias de calidad.El valor de la comparacin de secuencias desconocidas para varios diferentesbases de datos se dirige en la Tabla 2. La secuencia de unareciente aislado sangre que nos pareci un Streptococcus sp.(pero con la secuenciacin ha demostrado ser Gemella bergiae) eraidentificados mediante MicroSeq, GenBank, nuestra propia base de datos, yla RDP-II y bases de datos RIDOM (Tabla 2). En los tresprincipales bases de datos, el grado de relacin se expresa de forma diferente.Principal medida de GenBank es el porcentaje de identidad, de MicroSeqmedida es el porcentaje de disimilitud y medida de RDP-II es unvalor de la relacin algo cerca (pero menor que) la Gene-El porcentaje de identidad Bank. Basta sealar, sin compararmrito estadstico, que todos son vlidos. Un dendrograma da adicionalinformacin al mostrar que haemolysans Gemella yG. morbillorum son fcilmente distinguibles entre s, aunqueambos estn equidistantes del aislamiento desconocido (Gemellabergiae).El problema de la variabilidad intraespecfica, es decir, que todas las cepasdentro de una especie no tienen idnticas secuencias de genes 16S rRNA,requiere la deposicin de ms de una secuenciapara cada especie (18). Mediante el examen de mltiples secuencias disponiblesa travs de GenBank para la misma especie y sin contarel 20% con una variacin de ms de 2% que fueron mal clasificado,Clayton encontr todava haba una considerable variacin en la secuenciadentro de una especie (18). A medida que ms muestras clnicas sonsecuenciados, variabilidad gentica entre especies puede ser msobvio. Por otro lado, las cepas con menor variabilidad (menosdel 1%) a veces se dan designacin especies separadas.La importancia clnica de variacin menor est cada vez ms claroy se dirige a continuacin (ver "microheterogeneidad" en el 16Ssecuencia del gen rRNA es comn ").EL DILEMA DEL microbilogo clnico ENASIGNACIN DE UN NOMBRE gnero y especieDefiniciones comunes de gnero o especie derivados de 16SAnlisis de secuencia del gen RrnaA veces, y sobre todo cuando se compara con todos los avancesen biologa molecular, taxonoma ha sido pensado para seruna rama relativamente hmeda y oscura de la microbiologa. As,la asignacin taxn para un aislado podra ser considerado trivial:"Una rosa con cualquier otro nombre. . , ". Sin embargo en la prctica demicrobiologa clnica, la decisin del laboratorio en un nombre a menudoprecipita decisiones sobre el tratamiento clnico y la terapia.Adems, es difcil para dilucidar correctamente la patologa deorganismos o el proceso de la enfermedad si un complejo de organismos esreferido por un solo nombre o si muchos nombres se utilizan para unaespecies individuales.En este momento, no existe una definicin de consenso claro degnero o especies bacterianas por 16S rRNA secuencias de genes comparaciones.Esta es una preocupacin taxonmica fundamental, y un profundodiscusin est ms all del alcance de esta revisin (26, 33, 55, 56, 94,106, 108).Sin embargo, voy a esbozar algunas de las prcticas y problemasya que afectan a la microbiologa clnica. Aunque una propuesta deespecie y gnero que definen utilizando hibridacin ADN-ADN comoel "estndar de oro" ha sido publicado (108), DNA-DNAla hibridacin es una tcnica difcil, realizado en slo unos pocoslaboratorios, y no siempre se correlaciona con otras definicionesde las especies (32). La secuencia del gen 16S rRNA es muchoms fcil de determinar y por lo tanto se ha convertido en el nuevo estndar de oro(32, 44). A pesar de que existe un consenso ni en lagrado exacto de diferencia gentica que define una especie ni sobreel algoritmo matemtico utilizado para generar los datos (Fig. 3),en la prctica un intervalo de aproximadamente un 0,5 a 1% de diferencia (99 a 99,5%similitud) se utiliza a menudo (91). Bosshard et al. (6) que se utiliza? 99%similitud para definir una especie y? 95% a? 99% para definir unagnero. Fox et al. propuso que haya una diferencia de al menosDe 5 a 15 pb en toda la secuencia del gen 16S rRNA para definir unaespecies (33). Turenne et al. (103) designa el reportablevariar de una especie como? 0,8 a 2,0% y sugiri que unsecuencia obviamente podra ser llamado nico, es decir, representando unaorganismo cuya secuencia an no ha sido depositada y, por tantopodra ser una nueva especie, si hubo al menos 20 a 38 pbdiferencia en la secuencia. Esto le da una puntuacin correspondiente de0,961-0,916 en RDP-II (19, 103). Hall et al. adoptado unapuntuacin distancia de 0,00% a menos del 1,00% como criterio paraidentidad de la especie (42). Sin embargo, Tortoli encontr que Mycobacteriumespecies podran ser vlidamente nombrados con diferencias de 4 pb omenos (101). Tang et al. (97, 98) sugirieron una diferencia 0,5% comoel lmite para la designacin de las especies. A menudo, una cepa con una pequeadiferencia genotpica (menos de 0,5%) se ha considerado unasubespecies (10). Cuando hay una singularidad fenotpica claro,genogrupos con menos de 1,0% diferencias en la secuencia tienen enhecho ha nombrado como nueva especie (48, 83, 101). Para rickettsiaaislamientos, Fournier et al. proponer que los miembros de la mismaespecies y gnero tienen? 99,8% y? 98,1% 16S rRNA gende homologa, respectivamente (32).Adems, la cantidad total de la variabilidad intraespecfica para serTambin permitido no est claro. Por ejemplo, usando la directriz queuna cepa desconocida debe ser inferior a 1% diferente de latipo de cepa, que podra significar que la cepa hipottica 1 y la tensin2 de la misma especie son 2% diferentes entre s. Enen general, hay acuerdo en que todas las secuencias de cepas dentro dela misma especie deben estar cerca (no ms de 1 a 1,5%diferencia en la secuencia de pares de bases) (33, 91). En el siguiente ms altonivel, uno debe pensar en el establecimiento de un nuevo gnero si genogruposson ms de 5 a 7% divergente. En la siguiente seccindiscute lo bien que estas directrices se refieren a nuestro presentenomenclatura. Los principales desafos sern en la nomenclaturapara los organismos nombrados antes de que se revel su taxonoma correctapor 16S rRNA secuencias de genes comparaciones y en el tratocon microheterogeneidad, es decir, una diferencia de slo unos pocospares de bases en la secuencia.En resumen, no es posible dar una similitud definidao el valor de disimilitud para definir gnero y especie. Esto es en parteporque los diferentes valores son generados mediante el anlisis separadobases de datos y utilizando diferentes mtodos (Tabla 2; Fig. 3). losdiferencia porcentual puede variar si se calcula usando slo el primero500 pb o todos 1.500 pb y tambin pueden variar con el programa utilizadopara los clculos. Tambin es probable que un nico valor parala definicin de un gnero o especie sobre la base de los 16Ssecuencia del gen rRNA no es apropiado para todos los gneros (32, 44,101).Problemas con la nomenclatura actualAdems de los problemas fundamentales con tanto el fenotpicadefinicin de especies, que ha sido el estndar hastaesta vez, y la definicin genotpica de especies, que es elactual estndar de oro, hay problemas especiales para algunosorganismos en la resolucin de las relaciones entre el genotipo y elfenotipo. Esto es a menudo el caso con los gneros y bien conocidaespecies que fueron nombrados basan nicos criterios fenotpicos antes de lala disponibilidad de la secuencia del gen 16S rRNA.Ejemplos de problemas en la asignacin de taxones y en la bsqueda de uncorrespondencia significativa entre el genotipo y el fenotipose muestran en la Tabla 3. Las dos primeras categoras en la Tabla 3("Genotipo pero diferentes fenotipos mismas" y "genotipo similarespero diferentes fenotipos ") muestran un problema crtico parala prctica clnica y un inconveniente o deficiencia en el 16S rRNAgen mtodo de identificacin de secuencia: que para algunos de laespecie, una secuencia puede ser ambiguo, ya que no distingueentre dos estrechamente relacionados pero distintos y, a vecesespecies o fenotipos clnicamente importantes. Otra forma de deciresto es que no es ms de un fenotipo para un determinadogenotipo. Varios ejemplos importantes de los que tienen el mismogenotipo (o con slo unos pocos pares de bases que son diferentes), perodiferentes fenotipos son M. tuberculosis y M. bovis, M. aviumy M. paratuberculosis y M. kansasii y M. gastri (42, 103).De los bordetellae patgena, B. pertussis, B. parapertussis,y B. bronchiseptica no estn bien distingue por 16S rRNAsecuencia gnica (48). Otros tales organismos se enumeran en larevisin por Fredericks y Relman (34). Roth et al. mostr queen ocasiones, donde 16S rRNA secuencias de genes fueron indistinguibles,tal como, por M. kansasii y M. gastri, o altamentesimilar, tal como para M. malmoense y M. szulgai, 16S-23Sgenes rRNA secuencias espaciadoras transcritas internas eran un tilSuplemento para la diferenciacin de especies estrechamente relacionadas(82). Los casos de identificacin sin resolver por gen 16S rRNAanlisis de la secuencia tambin se puede distinguir por la adicin deunas pocas pruebas bioqumicas cuidadosamente seleccionados (42).Por algunas pautas, aislamientos con una pequea diferencia genotpica(ca. ,4 a 0,9%), pero una diferencia fenotpica definida tieneha considerado ninguna de las especies o subespecies distintas. En algunoscasos, los aislados se dan diferentes nombres (por ejemplo, S. pneumoniaey S. mitis), y en otros se les da la mismanombre de la especie (por ejemplo, algunos miembros de los subgrupos S. anginosus[13]). Sin embargo, existe una gran variabilidad en la prctica

(Tabla 3), ya que una comparacin de las secuencias de varias subespeciesmuestra unas diferencias de 1-14 pb.Tambin existe la categora "fenotipos similares pero diferentesgenotipo ". Otra forma de decir esto es que hay ms deun genotipo de un fenotipo dado o que el fenotipo espolifiltico, un problema molesto, pero no es raro que los 16SrRNA secuenciacin de genes est bien posicionada para resolver. Recientemente hemossecuenciado todas nuestras cepas Nocardia clnicos almacenados y fueronsorprendi al descubrir que esencialmente todas las cepas que,tiempos pasados, que habamos considerado como N. asteroides sobre la basede las caractersticas fenotpicas eran de hecho la mayora N. farcinicay unos pocos N. nova. Tambin se encontr que la coleccin de S. bovisconsista en dos genogrupos separados, aunque la clnicaimportancia de esto no se ha determinado (15, 45). A menudo, enms estudios, fenotipos distinguibles se encuentran.Tabla 3 tambin contiene las categoras "Demasiado lejos de ser elmisma especie o gnero "y" Demasiado cerca de tener diferentesnombres "y" Demasiado cerca para estar tres gneros diferentes. "Estil observar el nmero de diferencia de pares de bases y en la tabla4 para tener una comprensin de cmo interespecies variables ydistancias intergenus son en la prctica de hoy en da. Lo obviorazn por la cual hay una gran variacin en lo que llamamos un gnero yespecies, como las normas no se han aplicado de manera uniforme, es questos fueron nombrados antes del 16S rRNA secuenciacin de genes fuedisponible. La consideracin de las subespecies es problemtico desdela diferencia entre algunas subespecies es tan grande como laentre algunos gneros; la distancia entre la subespecieStreptococcus dysgalactiae subsp. y Streptococcus dysgalactiaesubsp dysgalactiae. equisimilis es mayor que entre muchosgneros. Hay varias categoras adicionales. Cuando el genotipoy la superposicin fenotipo, como con las cepas Afipia, puede serque las cepas se superponen porque hay tan pocos aislamientos que losDescripcin puede no ser suficientemente precisa. A veces, si ningunogenotipo fenotipo ni es distinta pero las cepas han sidodado diferentes nombres, podra ser debido a razones histricas,publicacin simultnea, o descuido por parte de lalos autores y los editores.Tabla 4 es una manera de presentar los datos que muestran la variabilidad genticadentro de diferentes gneros. Los datos se modifican desdelos presentados por Montgomery et al. (S. Montgomery, S.Anderson, M. Waddington, J. Bartell, G. Num, y P. Foxall,Abstr. IX Int. Congr. Appl bacterianas. Microbiol., Abstr. 54,1,999). La variabilidad entre especies para cada uno de los gneros enumeradoen la columna se ha calculado. El nmero de especies conocidasse da en la columna 2, y el porcentaje de especies conocidas queestn en la base de datos MicroSeq se muestran en la columna 3. Lagneros se clasifican sobre la base de aumentar interespecies promediola variabilidad, que oscila entre 0,5 a 17,3%. Los dos ltimoscolumnas pueden ser usados para evaluar gneros: indican quepuede haber problemas si la distancia mnima entre las especieses menos de aproximadamente 0,4 a 0,6% y la distancia mximaes superior a aproximadamente 5%. Por lo tanto, vemos que Arthrobacter, Bacillus,Lactobacillus, y Clostridium, por nombrar algunos de los ms atrocesejemplos, tienen al menos dos especies citadas que tienen lamisma secuencia 16S rRNA gen y al menos una especie que esmuy relacionado con otros en el mismo gnero. La mayora degneros en la primera mitad de la tabla errar nica, en todo caso, en tenerdos nombres para la misma especie o muy poca separacin entreespecies.Tabla 4 muestra las desigualdades en amplitud entretaxones. Un ejemplo bien conocido es que la diferencia gentica entrealgunos gneros que comprenden las enterobacterias esmenor que la diferencia entre algunas subespecies de Streptococcus(Tabla 3). Adems, esta diferencia es mucho menor queen el nico gnero Clostridium. Por lo tanto, por el Enterobacteriaceaelas normas relativas a los gneros que designan, muchas especies deClostridium se dara estatus gnero separado. En el otromano, por las normas de Clostridium, todos los miembros de la familia Enterobacteriaceaeadems de todo el Vibrio, Aeromonas, Haemophilus, yGrupos Pasteurella se considera que pertenecen a una solagnero (Fig. 2).En general, se observa una mayor variabilidad reportada en los 16SrRNA gen de especies que no estn tan bien descritos y de menorpatogenicidad que en las especies patgenas conocidas. Estaes simplemente porque los organismos de baja patogenicidad son por lo generalno tan bien descrito como patgenos. As, en nuestra falta justificabledel conocimiento, podemos estar agrupando genotpica y fenotpicamenteheterognea asla el plazo de un taxn. Como consecuencia,comensales o ambientales aislamientos con un determinadonombre tienden a tener ms variacin en su gen 16S rRNAsecuencia que qu bien descrito cepas altamente patgenas. Unejemplo de esto es que las cepas identificadas por motivos fenotpicascomo S. anginosus o M. flavescens tenderan a tener msvariacin en su secuencia del gen 16S rRNA de las cepas identificadaspor razones fenotpicas como S. aureus o M. tuberculosis.Microheterogeneidad en la secuencia 16S rRNA geneEs comnSequevars, la variacin intraespecfica y variantes subespecie genotiposson trminos que expresan el concepto de microheterogeneidaddentro de una especie. Por lo general, esto denota diferencias de menosde 0,5% o slo unos pocos pares de bases por secuencia del gen 16S rRNA.No hay un consenso sobre cmo nombrar organismogrupos mostrando microheterogeneidad. La importancia de microheterogeneidada los microbilogos clnicos es que parecepermitir la posibilidad de distinguir fenotipo importante,diferencias de patogenicidad y de nicho entre las cepas (10, 38,84, 85). Microheterogeneidad tambin se ha explotado para la cepaseguimiento y estudios epidemiolgicos (38, 85).16S rRNA secuencia del gen ha sido microheterogeneidadse encuentra en muchos taxones. En Nocardia, sustituciones de tan poco como 1o 2 pb correlacionado con un fenotipo nico (83). Sin embargo,grandes diferencias en los patrones de sensibilidad a los medicamentos, importante parala prctica clnica, no se encontraron en este nivel, pero se encuentra enel rango de 1% de diferencia. Microheterogeneidad similar se observadentro del gnero Mycobacterium (101, 103). Ms de 40 nuevas especiesse han detectado desde 1990, la mayora de los cuales se cultivarona partir de muestras clnicas y son potencialmente patgenos. Muchos deellos difieren entre s por slo unos pocos pares de bases, pero inclusopequeos cambios en la secuencia parecen estar correlacionados concaractersticas fenotpicas nicas, significacin clnica, ynicho (101). A veces se les llama sequevars (101). Porquenuevas secuencias se encuentran en casi todos los estudios de clnicacepas de micobacterias, la perspectiva es que muchas ms sequevarsser detectada, hinchazn el nmero de subespecies potencialesclados.Para los cuatro grupos que hemos estudiado, S. anginosus, S.constellatus, H. influenzae y H. parainfluenzae, la subespecieclado se ha correlacionado con una combinacin de bioqumicaperfil y nicho. Como ejemplo, 100 cepas clnicas de S.anginosus que hemos secuenciado clster en cerca de 13 gruposo clados. La mayora de los clados difieren slo 2 a 4 pb por 500-bpsecuencia a partir de la siguiente clado ms cercano, y muchos de los cladosdiferir entre s por 6 pb (Fig. 4C). Examinamos lacaractersticas fenotpicas y nicho para cada clado. Encontramosque las pequeas diferencias en la secuencia se reflejan en fenotpicay las diferencias de nicho. Parte de esta informacin esresume en la Tabla 5, donde los mtodos de presentacin de informes y lasignificacin de los ocho posibles diferencias en las posiciones 71, 97,137, 186, 274, 288, 463, y 487 se dirigen. Del mismo modo, Chenet al. encontrado que las subespecies genticas agrupaciones de Pasteurellamultocida podra tener significacin clnica (10).A medida que estos microheterogeneities se muestran cada vez ms comocorrelacionado con importantes caractersticas clnicas o fenotpicas,hay una necesidad de reconocerlos. Sin embargo, no est claroque la asignacin de un nuevo nombre sera el ms prctico oprctica informativo. Si se dan los nombres de especies de reconocercada microheterogeneidad, que puede enfrentarse a una pltorade los nuevos nombres que podran aadir confusin, en particular para elpracticante mdico. Una solucin provisional prctica podra ser el uso demodificadores de cuantificacin (es decir, la diferencia porcentual con el tipocepa) y descripciones patolgicas (el sitio ms comn deaislamiento) unido al nombre de la especie primaria (Tabla 5). LAse muestra el nmero de posibles esquemas de nomenclatura. La ventajade algunas de las posibles nomenclaturas es que permiten unainmediatamente evidente relacin con las especies ms conocidasdebe entenderse sin tener que hacer una bsqueda bibliogrfica conEl informe de cada paciente microbiologa clnica.MEJORAS EN CLNICA PRINCIPALESMICROBIOLOGA PRCTICA POR IDENTIFICARBACTERIAS DE SECUENCIA EN VEZ DE FENOTIPO16S rRNA secuencias de genes mejor pueden identificar malDescrito, Rara vez aislado, o FenotpicamenteLas cepas aberrantesDebido a 16S rRNA anlisis de la secuencia de genes puede discriminarmucho ms finamente entre las cepas de bacterias que es posible conmtodos fenotpicos, que pueden permitir una identificacin ms precisade mal descrito, raramente aislados, o fenotpicamente aberranteson. Esta es un rea en la que el gen 16S rRNA secuenciaidentificacin podra tener un impacto inmediato en la atencin al paciente.Por ejemplo, algunas especies de "viridans" estreptococos son muchoms propensos que otros a causar endocarditis (2, 8). Sin embargo,identificacin de estos organismos por mtodos fenotpicos esdifcil y sujeta a error. Por lo tanto, a juzgar la importancia deaislados de "viridans" estreptococos aislados de la sangre tienesido un problema para el mdico en enfermedades infecciosas. Sin embargo,16S rRNA anlisis de la secuencia de genes proporciona una identificacin precisaa nivel de especie y puede aclarar su importancia clnica(14, 34; SM Attorri, M. Waddington, y JE Clarridge,Abstr. 100a general Meet. A.m. Soc. Microbiol. 2000,abstr. C-348, 2000).Los errores en la identificacin de mal descrito, raramente aislados, ofenotpicamente cepas aberrantes son probablemente muy comunes enel laboratorio clnico de rutina. Incluso en grandes y complejoslaboratorios de investigacin y de referencia, que tienen ms tiempo ypruebas fenotpicas para la identificacin de bacterias, inusualbacterias a menudo no pueden ser identificados. Drancourt et al.public una lista de 177 tales organismos difciles (27). es interesanteque estos organismos se haban referido a la biodiversidadMe'rieux, Inc. (Marcy l'Etoile, Francia), el laboratorio de rutinalaboratorios y los intentos previos intensivos para identificar los organismospor mtodos bioqumicos se haba hecho sin xito.Por alrededor de 80% de los aislamientos, hubo un partido cerrado con unespecies descritas. Otro 10% representa una nueva especiedentro de un gnero descrito, y aproximadamente 10% de los organismosrepresentado taxones novela. (27). Tang et al. comparacin de una variedad desistemas de identificacin, incluyendo perfiles de cidos grasos celulares, carbnla utilizacin de la fuente, y la identificacin bioqumica convencionalcon la secuencia del gen 16S rRNA para evaluar tantobacilos y coyneform microorganismos gramnegativos aerobios inusualesaislado de muestras clnicas (97, 98). Ellos encontraron que16S rRNA secuencia del gen proporcionado ms rpida, sin ambigedadesidentificacin de la bacteriana difcil asla que hizo conventialmtodos y que esta identificacin se podra traducir amejora de los resultados clnicos (98). Bosshard et al. (6) encontr queslo una minora de los laboratorios clnicos aislados de aerbicabacilos gram-positivos pudieron ser identificados correctamente por fenotpicamtodos, mientras que la secuenciacin de genes rRNA es una excelentemtodo para identificar estos organismos, que son difciles deidentificar por mtodos convential. Woo et al. encontrado que laMicroSeq 500 16S rRNA identificacin bacteriana basada en los genessistema para cepas bacterianas clnicamente ms importantes con ambiguaperfiles bioqumicos estaba limitado slo por el grado deintegridad de la base de datos (114).Sin embargo, puede ser difcil para el laboratorio principal para contarsi un organismo es difcil de identificar o que es incorrectaidentificado. Por ejemplo, dos veces nos aislado de la sangre de un organismoque fue identificado constantemente por fenotpica utilizadomtodos como Neisseria meningitidis o Actinobacillus actinomycetemcomitanspero fue identificado inequvocamente porsecuenciacin como subsp Francisella tularensis. novicida (16). Ya estno fue una historia compatible con la tularemia. Desde dos cepasse han aislado de nuestros pacientes de los hospitales, pero ninguno reportadodesde el resto del mundo, es probable que otracepas pueden ser aislados, pero no correctamente identificados, ya queNo se cree que es "difcil" basado en pruebas de rutina ypor lo tanto no fueron secuenciados. Del mismo modo, se inform el aislamientode Actinomyces israelii de un cuello uterino y no creo que fue unorganismo difcil. Resultados posteriores de secuenciacin realizaron como separte de una encuesta de nuestra Actinomyces spp. mostr que sea Bifidobacterium boum, sin embargo, tena una colonia y perfil bioqumicosimilar a A. israelii y creci en el aire enriquecido con CO2,a pesar Bifidobacterium boum se describe como un anaerobio estrictoen la literatura.Algunas especies de Nocardia son difciles de distinguir fenotpicamentepero se identifican fcilmente por secuencia del gen 16S rRNA(83, 105). Secuencia de anlisis ha dado lugar a la reevaluacin delcepas que haban sido llamados N. asteroides y reasignacinde significacin clnica (83). En nuestro laboratorio, se encontr que todosde los aislamientos de N. asteroides presuntos asociado con el cerebroabsceso (tres) eran en realidad N. farcinica cuando se analiza por 16SrRNA secuenciacin de genes.16S rRNA genes secuencias pueden ser usados rutinariamente paraLa identificacin de micobacteriasLas micobacterias son, en general, de crecimiento lento y / o de difcilidentificar. Por lo tanto, eran un importante grupo de organismos enprimeros estudios importantes que establecen la utilidad del 16SrRNA secuenciacin de genes para microbiologa clnica (4, 5, 7, 29, 51,80, 81, 99). Ms recientemente, ha habido varios adicionalestudios que comparan la identificacin de micobacterias por 16Ssecuencia del gen rRNA y mtodos fenotpicos (19, 22, 42, 50,66, 92, 103). En todos estos estudios, la exactitud de rRNA 16Sla secuenciacin de genes en la identificacin a nivel de especie erajuzgado como global superior a los mtodos fenotpicos. En general,al prever la identificacin precisa de las especies en elbase de datos y la ubicacin taxonmica si no se completa identificacinde especies nuevas, anlisis de la secuencia del gen 16S rRNA demicobacterias parece ser el mtodo ms preciso disponible.Las excepciones son los casos conocidos en los que 16S rRNAla secuenciacin de genes no poda diferenciar entre un nmero limitadode las especies, por ejemplo, M. avium y M. paratuberculosis, M. chelonaey M. abscessus, y M. tuberculosis y otros en laGrupo de M. tuberculosis (19, 42, 66, 80). En una gran referencialaboratorio, Hall et al. encontrado que la secuencia del gen 16S rRNApodra identificar a 243 de 328 aislados clnicos con una puntuacin distanciade? 1% (42). En este grupo, el acuerdo con fenotpicaidentificacin fue del 90,1%, con los resultados discrepantes siendoaquellos en los grupos de los cuales la secuenciacin no se puede distinguir, comodado anteriormente. Las 85 cepas restantes tenan puntuaciones distanciapor encima del 1%, pero por debajo del 4% y por lo tanto estaban decididos a estar dentrodel gnero Mycobacterium: en este caso, ya sea nuevos o especiesespecies que exhiben divergencia significativa genotpica de unaorganismo en la base de datos con la coincidencia ms cercana. El poder deanlisis de la secuencia se demuestra desde los 85 organismos eran"Conocido por ser desconocido" por anlisis de la secuencia mientras que lala prueba fenotpica identific la mayora de estos incorrectamente comoespecies conocidas. Los autores recomendaron integracin de los nucleicosecuenciacin de cidos en el laboratorio micobacteriologa rutinadespus del uso de sondas genticas para los ms comunesespecies. El uso del MicroSeq 500 identificacin microbiana(Clnica Mayo) bases de datos internas que contienen adicional del sistema ysecuencias redujo significativamente el nmero de organismosque no pudieron ser identificados por mtodos fenotpicos. Nubeet al. Tambin se utiliza el sistema MicroSeq 500 y encontr que otrabase de datos (RIDOM) era necesaria para proporcionar secuencias deespecies adicionales (19). La mayora de los estudios recientes coinciden en que unapocos organismos conocidos como M. lentiflavum faltanla base de datos MicroSeq 500 y que aproximadamente 7 a 12% de laaislamientos eran nuevas cepas (18, 42). Patel et al. encontrado que 12 de113 cepas tenan sobre la diferencia del 0,9% de las cepas conocidas(66). No es sorprendente que estudios anteriores han encontrado un mayor porcentajecepas de no identificados debido a las menos extensas bases de datosdisponible en el momento (92). Un consorcio europeo, utilizando fenotpicalas pruebas, la cromatografa lquida de alta resolucin, y16S rRNA secuenciacin de genes, tambin encontr que alrededor del 7% deespecies nuevas cepas de micobacterias representados (102). Algunosejemplos de los muchos buenos papeles en los que la novela por micobacteriasespecies se describen utilizando tanto bioqumico y genotpicadescripciones y ms de una cepa estn incluidas en ellista de referencia (90, 91, 101)Anlisis de la secuencia 16S rRNA gen puede conducir a laDescubrimiento y descripcin de nuevos agentes patgenosEn la prctica, la microbiologa clnica, organismos nuevos son en generalprimero reconocido por un fenotipo aberrante o nicho. Siestas observaciones son seguidos por 16S rRNA secuenciacin de genes,la secuencia a menudo indica que el organismo es solamente una inusualfenotipo de un taxn conocido (Tabla 3). Sin embargo, en estetiempo, tal vez 10 a 20% de los aislamientos podra no coincidir con cualquierotro organismo descrito y por lo tanto podra ser una novela organismoy un porcentaje an mayor podra ser descrito previamenteorganismos, pero no cepas normalmente encontradas en la prctica clnica(25, 76, 102). A mediano a grande microbiologa clnicade laboratorio se puede esperar para aislar unos pocos organismos nuevos permes.Dnde hay que buscar nuevas especies? Buscamos novelaorganismos entre los grupos que estn mal descritos o difcilescrecer. Hemos encontrado que hay poco potencial paraencontrar nuevos genogrupos dentro de la bien estudiada importante patgenoespecie, ya que estos grupos taxonmicos han sido tan bieny descrito con precisin que hay poca confusin o variabilidaden su secuencia del gen 16S rRNA. Especies con estecaracterstica genticamente homognea que hemos probadoincluir M. tuberculosis, H. ducreyi, H. influenzae grupo b, Streptococcusdysgalactiae, S. pneumoniae (sangre aislamientos), yStaphylococcus aureus.Si se trazan todas las cepas conocidas en un dendrograma tal como enFig. 2, veramos que algunos taxones son muy, muy concurrido. porejemplo, la familia Enterobacteriaceae tiene potencial para pobresalbergar nuevos tipos, ya que muchos fenotipos ya tienenha descrito. Sin embargo, otros grupos genticos no estn tan bienestudiado, y pocos han tenido el mayor nmero de especies distintas cultivadas,aislado, y se secuenci. En este momento, algunos otros taxones comoel grupo Leptotrichia-Streptobacillus-Fusobacterium permanecenbastante escasa. Es probable que muchos futuro asla en estegrupo puede representar nuevas especies. Otros potencialmente fructferataxones que estn empezando a ser ms plenamente descrito incluye laActinomyces-Actinobacillus gneros y la catalasa menos comncocos gram negativo-positivo (6, 17, 20, 21, 43, 89). UnoTambin puede examinar la Tabla 4; donde la diferencia entre especies esgrande, es probable que haya bacterias descubiertas en elgrupo. En una revisin reciente de los grupos taxonmicos de micobacterias,Tortoli (101) present la contribucin esencial de 16SrRNA secuenciacin de genes no slo para distinguir 42 especies nuevassino tambin para la realineacin de las especies clsicamente conocidos de lentay de crecimiento rpido en nuevas agrupaciones. Un gran nmero deanaerobios an no se han descrito (90, 91). Otra fructferarea es la de los organismos asociados con los animales; un aparentementegran porcentaje an no se han descrito bien (21).En los ltimos 15 aos, ha habido miles de publicacionesla utilizacin de 16S rRNA secuencia del gen como parte de una especiedescripcin. Algunas revistas representativas reflejan tanto lanmero de organismos nuevos que se describe y los usos deSecuenciacin 16S. En 2001 en Applied and Environmental Microbiology,hubo 116 denuncias de este tipo de estudios, muchos de los cualesusado secuenciacin del gen 16S rRNA para evaluar las proporciones deespecies en las poblaciones de bacterias en un ambiente particular(vase, por ejemplo, la referencia 88; vase tambin la referencia 46). En 2003,eran 181 los informes. En contraste, en el Journal of ClinicalMicrobiologa, muchas de las 94 citas de 2001 y 91 citasen 2003 se refera a la descripcin correcta de una novela potencialpatgeno (por ejemplo, Helicobacter winghamensis) (58). En 2003 en elRevista Internacional de Microbiologa Sistemtica y Evolutiva,alrededor de 300 especies nuevas fueron reportados con el 16S rRNAsecuencia del gen como parte de la descripcin.Anlisis de la secuencia 16S rRNA gen puede identificarLas bacterias culturalizadoAunque la secuencia del gen 16S rRNA es una parte esencialde la descripcin de una novela organismo, para muchos culturalizadobacterias que pueden ser la nica descripcin taxonmica (34, 76, 78).Dado que todos los organismos son, evidentemente, capaz de crecer bajo lacondiciones adecuadas, los trminos "culturalizado" o "no es fcil de culto"son preferibles a "no cultivable", que es a vecesutilizado. De hecho, recientemente hemos crecido y describimos una cepa (Fig. 2,cepa 01-1.398) cuya secuencia en GenBank fue identificado como"No cultivable".El mtodo bsico para obtener una secuencia para un culturalizadobacteria es utilizar cebadores universales contra el 16S rRNAregin del gen en una etapa de PCR para aumentar la cantidad de ADN ya continuacin, para secuenciar el amplicn (7, 11, 39, 72, 75, 77). Esto harfuncionar bien si slo hay un organismo a detectar. Una diferentese impone estrategia si hay una situacin en la que un mezcladola cultura es probable, como una muestra clnica de un no estrilsitio o una muestra ambiental.Hay razones vlidas por qu cepas bacterianas que podamosencuentro en la prctica clnica no se recuperan. Por ejemplo,tratamiento antibitico previo puede hacerlos inviables. Ya estson varias publicaciones interesantes en los que el etiolgicoagentes de endocarditis "cultivo negativo" (8, 9, 37, 39, 47, 109)se identificaron por anlisis molecular usando PCR de amplio rangocebadores complementarios al gen 16S rRNA, secuenciacin,y base de datos busca con un software diferente. Los organismospor lo general pueden ser cultivadas (por ejemplo, Streptococcus salivarius [109] yCanimorsus Capnocytophaga [nuestro laboratorio]), pero en estoscasos las muestras se presentaron una vez que el paciente estaba siendoantibiticos administrados.Una segunda razn es que los organismos pueden ser realmente durocrecer. Bartonella henselae, el agente causante de bacilarangiomatosis, fue identificado y principalmente asociado con elenfermedad de esta manera (77). Muchos de los informes de Whipplela enfermedad se basan exclusivamente en la amplificacin por PCR y la posteriorsecuenciacin de los genes 16S rRNA (9, 78), porque el etiolgicoagente, Tropheryma whipplei, ha exigentes requisitos de crecimientoms all de las capacidades de la mayora de los laboratorios clnicos.Es interesante que Celard et al. encontr T. whipplei como elagente causal en dos casos de endocarditis sin quesiendo la evidencia previa de enfermedad relacionada (9). Brouqui yRaoult (8), usando amplificacin por PCR de los 16S de base ampliagen rRNA, encontr que los agentes etiolgicos ms comunesasociada con endocarditis con cultivos negativos fueron Bartonellaquintana y Coxiella burnetii, los cuales requieren especialcondiciones para crecer. Rutinariamente congelamos en? 70 C una parte delas vlvulas retiradas si en ese momento nos son todava inciertos acercala causa de un caso de endocarditis. Si el patgeno no esposteriormente identificado por la cultura, sometemos el cultivo de sangrebotellas y vlvula para PCR con cebadores universales y realizaranlisis de la secuencia en el producto amplificado. En la mayora de los casos, lael proceso tiene xito slo si los organismos estn presentes en suficientenmeros para ser vistos por los electrones o microscopa de luz (37,109). En una excelente presentacin de 29 casos de histolgicamenteendocarditis infecciosa se confirma, la amplificacin directa y secuenciaanlisis fue confirmatoria en 21 casos y esencial parael diagnstico en 5 casos (37). Debido a que muchos Mycobacteriumspp. son de crecimiento lento y costoso para identificar, ha sido de utilidadpara identificarlos mediante secuenciacin directa de ADN amplificado (7,80).Una tercera situacin en la que estos mtodos son tiles es cuandohay esteras de organismos adherentes, diversos y desconocidos.La enfermedad periodontal y las biopelculas se han estudiado de esta manera(25). La diversidad de los organismos presentes en el subgingivalbolsillos de los pacientes con periodontitis y aguda necrotizantegingivitis ulcerosa se examin mediante la amplificacin de 16Sgen rRNA utilizando PCR con un cebador directo universal y un-espiroqueta selectiva cebador inverso. El ADN amplificado fueclonado en Escherichia coli. A continuacin, el segmento de ADN se secuenci,y las secuencias se compararon como se describearriba. Genotipos novedosos se encuentran comnmente, tales como lasen representacin de las especies Atopobium y un nuevo gnero, Olsenellagen. noviembre. (25).Estudios similares del entorno tambin estn dando una gran cantidadde nuevos organismos. El orden de importancia mdica Chlamydialesha sido considerado para contener unos pocos estrechamente relacionadosbacterias que se producen exclusivamente en animales y humanos. Sin embargo,empleando tcnicas similares a las descritas anteriormente,Hornos y Wagner (46) encontraron al menos cuatro novela evolutivalinajes de Chlamydiales en los lodos del medio ambiente. Estos hallazgossugieren que algunas plantas de tratamiento de aguas residuales representandepsitos para un conjunto diverso de clamidias ambientaly sugieren que el medio ambiente puede ser una fuente de novelaorganismos que podran tener consecuencias para la salud pblica.Instrumentos automticos utilizados para detectar el crecimiento en cultivo de sangrebotellas veces flag positivo en ausencia de aparentecrecimiento. Un uso nico de secuencia del gen 16S rRNA directaanlisis con cebadores universales era buscar culturalizadobacterias como fuente de la sangre presumiblemente falsos positivosculturas (71). Los investigadores no encontraron ninguna previamentebacteria no detectada como la causa de la sangre de falsos positivosculturas.COSTOS EN UN MICROBIOLOGA CLNICA DE RUTINALABORATORIOEn este momento, para identificaciones de rutina, gen ARNr 16Sanlisis de la secuencia es ms caro que la mayora identificacin tradicionalmtodos. Sin embargo para los organismos difciles, mltiple mtodos de identificacin a menudo deben utilizarse, lo que aumenta lacosto. Por lo tanto, Hall et al. (42) encontraron que para la identificacin demicobacterias inusual, anlisis de la secuencia era menos de $ 2 mscostoso que los mtodos estndar. Patel et al. estimado elcostos en $ 144 para un nico aislado pero slo la mitad de esecuando se analizaron mltiples especmenes al mismo tiempo (65,66). Wilck et al. publicado una cifra similar, encontrando que ellos costes de material, con exclusin de la mano de obra, ascendieron a $ 59 por ejemplar(esto incluye la desparafinacin y el ADN extraccin a partir dela pieza quirrgica, materiales para la PCR, la limpieza de PCR, secuenciacin,y el procesamiento de un control) (109). Cook et al.(22) encontraron an ms bajos costos para la identificacin de no tuberculosasmicobacterias: sin estimar los bienes de equipocargos, el costo de mano de obra y los materiales eran $ 48 canadiense(alrededor de $ 32 EE.UU.).Examinamos los costos para la identificacin microbiana basamos en16S rRNA secuencias de genes con un analizador de secuencia basada enel laboratorio de microbiologa clnica. Se utiliz el MicroSeqsoftware y dos secuencias de ADN diferentes. Modelo ABI 3100fue superior al modelo ABI 310 en la longitud de la secuencia fiable(520 y 460 pb, respectivamente), adems de la publicadasuperioridad de la facilidad de uso y el tiempo de ejecucin. Esta disminucinel tiempo de edicin e incluso permiti una correctaidentificacin con slo la secuencia hacia delante (Clarridge et al.,Abstr. 101a general Meet. A.m. Soc. Microbiol. 2.001). Bottgersgrupo utiliza habitualmente una sola secuencia. Encontramos, sin incluirla compra de instrumentos, que el costo por aislado es sobre $ 44(costos de materiales de $ 20 y los costos de mano de obra de $ 24; los costos de mano de obrasubieron de la estimacin de 2001, en el resumen mencionadoarriba). Nuestros costos asumen cierta preparacin lote de muestras.Nuestros clculos se realizan sobre la base de utilizar elreactivos y material desechable para el ABI PRISM 3100 genticaanalizador (con 16 capilares), pero son comparables a lacosto para el analizador gentico ABI PRISM 3100-Avant (con 4capilares). No procesamos ejemplares adicionales como controlesya que el xito del proceso puede ser juzgado por la finalproducto. Si el instrumento est en un acuerdo de compra-reactivopara otras pruebas como la determinacin del genotipo del virus de inmunodeficiencia humana,costos de instrumentos pueden ser ms bajos. Cook et al. (22) calculaque para la identificacin de micobacterias no tuberculosas,uno tena que realizar 100 anlisis por mes para tener lacosto de identificacin, incluyendo el instrumento, sea inferior acoste de utilizacin de los mtodos de identificacin convencionales. En adicin,especialmente si un analizador de secuencia est disponible, se comparte, porejemplo, con las pruebas de genotipado virus de inmunodeficiencia humanao la investigacin, el anlisis puede ser ms costo-efectiva y oportuna.Si uno no tiene un analizador de secuencia de la casa, la secuenciaEl anlisis est disponible en muchos laboratorios centrales de la universidad. loscostos pueden ser alrededor de $ 30 a $ 50 para 500 pb si se enva el aisladoy $ 12 a $ 18 si se proporciona el ADN en un estado listo paraser puesto en el analizador. Estos costos incluyen tanto el delanteroy revertir secuencias. La calidad de las secuencias de talesinstituciones pueden variar considerablemente. Para ensamblar la secuenciay hacer una comparacin con las bases de datos con una evaluacin,por lo general hay un $ 50 a $ 80 costo adicional. Laboratoriosofrecer el servicio completo de identificacin de bacterias mediante la secuenciaanlisis por alrededor de $ 100 a $ 150.Todos los informes citados coinciden en que estos costes para el definitivoidentificacin proporcionada por 16S anlisis de la secuencia son razonablescuando los costos de mltiples investigaciones hechas en elintento de establecer una identificacin son considerados. En unoestudiar, el tiempo de respuesta para una identificacin de micobacteriasse acort a 24 h, y los resultados fueron reportados tantoanterior (42). Los costes adicionales de un posible paciente relacionadasecuelas debido a la inadecuada o la falta de identificacin de un aislamiento,tales como antibiticos de amplio espectro por va intravenosa o incorrectosdiagnstico, no se estima.NORMAS PARA EDITORES, revisores yLaboratoristasEsta seccin resume algunas de las normas que los colaboradores yeditores de revistas de microbiologa clnica y de enfermedades infecciosasy el personal de laboratorio clnico que pueden no estar activamente comprometidosen el anlisis de secuencia de s mismos tienen que ser conscientes de queevaluar los datos basados en la secuencia para uso en laboratorio o publicacin.(i) los organismos novedosos. La secuencia del gen 16S rRNA es unaparte esencial de la descripcin de una novela organismo. loslos autores deben ser obligados a incluir 16S secuencia de genes rRNAdatos en todas las publicaciones que describen una nueva cepa, preferiblementela secuencia del gen completa (94). Es til a los colaboradoressi esta informacin est disponible en formato electrnico. LAresumen de las diferencias de las cepas de tipo podra ser publicado,pero toda la secuencia no tiene por qu ser publicado, ya queespacio de desechos (68). La secuencia debe contener menos de 1%bases indeterminados sin una explicacin.(ii) los organismos pobremente descrita. La secuencia del gen 16S rRNAidentificacin se debe realizar (aunque no se inform)en aislamientos para los cuales las asociaciones de enfermedades poco comunes sonsiendo afirmado si el aislamiento no es muy bien conocida yfciles de identificar. Por ejemplo, es permisible para referirse a M.tuberculosis o para S. pyogenes sin datos de secuencia pero no aconsulte el rpido crecimiento de micobacterias ambientales o parala estreptococos viridans como un todo o la mayor parte de las especies quecomprender los estreptococos viridans o Actinomyces spp., porqueen estos grupos el fenotipo es a menudo polyphyletic ydescripciones pueden ser ambiguos. Los ejemplos de otros ambiguaidentificaciones se dan en la Tabla 3. Los cambios grandes en elnombres y descripciones de las barras y anaerobios grampositivoshacer la identificacin secuencia necesaria para cualquier publicacin enel que se alega una asociacin entre un microbio inusualy una enfermedad.(iii) Nmero de cepas. Es preferible que haya tres oms aislados similares para cualquier publicacin de una nueva especie,deformacin, o subespecies; algunos recomiendan que haya de cincocepas (12, 18). Sin embargo, los informes de una sola cepa de cepas rarasseguirn publicando. Debido a que el fenotipo sigueser muy importante para los microbilogos clnicos, fenotpicapruebas deben estar asociados con la secuencia. El mismo fenotpicapruebas para el nuevo aislado se deben realizar en elmismo laboratorio en varias cepas conocidas; es decir, no es derecho a lacomparar las pruebas realizadas en el laboratorio del investigador solamentede la cepa que se describe con valores de la literatura para el tipoo cepas con las que se compararon las cepas conocidas: lavalores de la literatura pueden estar equivocados, o los mtodos pueden no ser idnticarealizado.(iv) se necesita por lo menos 0,5% y, posiblemente, 1% de diferencia ajustificar un nuevo nombre de la especie. Como regla general, hasta ms firmereglas se propagan por los taxnomos, a menos que haya exceso abrumadora y razones fenotpicas bien documentados, haydebe haber una diferencia de al menos 1 por 100 pb bases secuenciaronpara justificar la asignacin de un nuevo nombre de la especie. Si no son clarasdiferencias fenotpicas, como poco como 0,5% pueden justificar un nuevonombre de la especie. Recordemos que los clculos utilizando matemticamentediferentes algoritmos de bsqueda como BLAST y NeedlemanWunsch no puede dar los mismos resultados. Cuando las diferencias entreaislamientos son mayores que 5%, se debe considerardado a la generacin de un nuevo nombre de gnero.(v) Secuencia triunfa sobre el fenotipo. Para una cepa desconocida,cuando la relacin de secuencia y bioqumico o morfolgicocaractersticas no estn de acuerdo, en general, la secuenciatriunfa sobre el fenotipo. Esto no significa que el genotipono pueden seguir siendo ambiguos, como se detalla en los primeros ejemplos detaxones estrechamente relacionados en la Tabla 3. Si el genotipo-fenotipodiscrepancia es un resultado inesperado, vale la pena volver a comprobar queLa secuencia y fenotpicas se han realizado estudios sobreexactamente la misma cepa.(vi) Qu necesita el laboratorio de secuenciacin de decirle al cliente.El informe del laboratorio que realiza el anlisis de la secuenciadebe incluir el nombre de la bacteria y el porcentajediferencia de la cepa tipo ms cercano en la base de datos utilizada. Sieste es un nuevo aislado o uno que no coincide estrechamente con untipo de cepa, sera til que la informacin sobre otros similaresasla y un alineamiento de la secuencia con ms cercana conocidacepa, mostrando slo las diferencias y la secuencia en un textoarchivo, tambin fueron incluidos. As, por ejemplo, el cliente puederecibir el siguiente informe Capnocytophaga canimorsis(2,46%) y un archivo de texto de la secuencia real. El cliente puedea continuacin, examinar la calidad de la secuencia. Si no est satisfecho (usandocriterios descritos anteriormente), el cliente puede solicitar una resecuenciacin.Si la calidad es buena, pero el cliente considera que el 2,46%la diferencia es demasiado grande, la secuencia en el archivo de texto puede seren comparacin con todas las secuencias en GenBank u otra base de datosutilizando el programa libre, BLAST, para ver si hay un ms cercapartido. Queremos realizar una bsqueda BLAST utilizando un pblicobase de datos en una secuencia con diferencia mayor que 1% a partir deuna cepa de tipo conocido. Si no haba ms cerca coincidencia para un tipo detensin, el organismo podra ser reportado como C. canimorsus (msmuy parecidas) o C. canimorsus, novela genotipo. Tabla 5muestra diferentes formas de presentacin de informes.CONCLUSIONESUn colega dijo una vez que l pens que era asombrosaque la simple mancha desarrollado por Gram tendra profundaimportancia estructural y taxonmica. Me parece notablee igualmente fortuito de que la secuencia del gen 16S rRNAtendra casi la cantidad exacta de la variabilidad de definir unespecies o al menos proporcionar una distincin entre clnicamente tilcepas bacterianas.Hemos visto que las bacterias que identifican aislados en el clnicolaboratorio mediante la secuencia en lugar de fenotipo puede mejorar clnicamicrobiologa mediante una mejor identificacin de mal descrito, raramentecepas aisladas, o bioqumicamente aberrante. Gen rRNA 16Ssecuencias permiten la identificacin bacteriana que es ms robusto,reproducible, y precisa que la obtenida por fenotpicapruebas. Los resultados de la prueba son menos subjetiva. Gen rRNA 16Sanlisis de la secuencia puede conducir al descubrimiento de nuevos agentes patgenos.16S rRNA anlisis de la secuencia de genes puede identificar culturalizadobacterias, lo que permite la independencia de las condiciones de crecimiento.La designacin correcta de los organismos es importante. Por ejemplo,cuando nos referimos a un complejo de organismos por un solonombrar y estos organismos tienen diferente potencial patognico,el proceso de la enfermedad es oscurecida. Como se reconoce que lataxonoma correcta o asignacin de nombres pueden hacer una diferencia enel resultado clnico, debe haber una demanda de ms generalizadouso de las identificaciones precisas ese gen 16S rRNAanlisis de la secuencia puede proporcionar.Una desventaja de mejor la discriminacin proporcionada por 16Sanlisis de la secuencia del gen rRNA es que introduce una comunicacinde dificultad, ya que hay muchas secuencias ms distintasque nombres o descripciones fenotpicas. Sin un-uno a uno correspondencia, no puede haber un problema en la asignacin denombres a las secuencias de una manera significativa. El adicionaldatos tambin pueden ser difciles de comunicarse plenamente a clnicacolegas. Un intento de hacer frente a esto se presenta en la Tabla 5.Adems, la informacin que 16S rRNA secuenciacin de genes tienepuesto a disposicin hasta el momento (y an ms en el futuro) se enfrentael microbilogo clnico con tener que cambiar algunosconceptos familiares de identificacin de especies.16S rRNA secuenciacin de genes tradicionalmente jug un limitadopapel en la identificacin de microorganismos en microbiologa clnicalaboratorios, principalmente debido a los altos costos, requisitos paragran habilidad tcnica, y la falta de comparativa de fcil usosoftware de anlisis de secuenciacin y las bases de datos validados. Sin embargo,la disponibilidad de la mejora de las tcnicas de secuenciacin de ADN,enormemente incrementado las bases de datos y los kits ms fcilmente disponibles ysoftware, hace que esta tecnologa una alternativa competitiva atcnicas de identificacin microbianas de rutina para algunos grupos deorganismos, tales como micobacterias. Los costos pueden ser tambin comparablea mtodos de identificacin tradicionales para otras slowgrowingy difciles de identificar organismos, en particular si unasecuenciador est disponible para mltiples tareas en otros sectores de lalaboratorio.Una funcin adicional importante para 16S rRNA secuenciacin de geneses proporcionar a lo