immunophenotyping leukemia

FCA pada akut leukemia

spesimen

• BMP, darah tepi, jaringan limfoid• Harus diproses dalam 24 jam ditransport

dalam suhu ruang• Antikoagulan heparin atau EDTA• Populasi Sel berinti RBC dilisiskan dulu• Viabilitas : propidium iodine atau 7-

aminoactinomysin.

spesimen

• Ditambahkan koktail Mo Ab terkonjugasi fluorokrom

• Analisa interseluler perlu proses fiksasi dan permeabilisasi agar antibodo bisa memasuki membran sel.

• Belum ada konsensus standarisasi panel antibodi

Marker yang sering dipakai Lineage markers

Immature CD34CD117Terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt)

Granulocytic/monocytic

CD33CD13CD15CD14

Erythroid CD71Glycophorin A

Megakaryocytic CD41CD42CD61

B Lymphocyte CD19CD20CD22k light chainΛ light chain

T Lymphocyte CD2CD3CD4CD5CD7CD8

Marker yang direkomendasikan

Prinsip dan instrumentasi

• Poin utama: – Fluidic– Sumber cahaya (laser)– Sistem deteksi– Computer


• Fluidic – Suspensi sel diinjeksikan kedalam suatu aliran

dengan teknik hydrodinamic focusing masuk satu satu

• Laser (488nm)– Menerangi setiap sel yang lewat, yang telah

diwarnai dengan antibodi yang terkonjugasi fluorokrom tertentu


• Detektor– FCA selain memiliki FSD,SSD, juga memiliki beberapa

floresence detektor – Sel yang mengabsorbsi cahaya berflouresensi pada

warna dan panjang gelombang ttt– Ditangkap oleh photodetektor yang sesuai dengan

panjang gelombang yang dimiliki flouresens tadi• Computer– Data yang ditangkap detektor dirubah menjadi

bentuk digital (scaterplot)

Flourokrom

• FITC (flourescein isothiocyanate) 519nm (hijau)

• Phycoerythrin (PE) 575nm (oranye)• PerCP 694nm (merah)• APC 660nm (pink)

Direct versus indirect labeling of antigens

B or T Cell marker

B or T cell specific Ab

B or T cell specific Ab

B or T Cell marker

gating

• Gate : batasan elektronik oleh operator yang digunakan untuk menggambarkan suatu kelompok/kluster

• Proses gating : pemilihan suatu populasi berdasarkan parameter FCA menggunakan komputer oleh operator

• Gating : live atau saat analisis

Analisa data FCA

• Analisa scaterplot berdasar ukuran (FCS)dan kompleksitas(SSC)

• Ekspresi CD45 :– Limfosit : paling tinggi – Seri granulosit : sedang– Prekursor : redup-negatif

Identifikasi populasi sel

• Progenitor– CD34– CD117– CD38– HLA-DR– Semakin matur lama-lama hilang

Identifikasi populasi sel• Granulocytic lineage

– Myeloblast : CD34,CD38,HLA-DR,CD117– Pan myeloid marker : CD13,CD33– Promyelosit : CD34 (–) HLA-DR (-), CD 15– Semakin matur : CD11b, CD13 menghilang, penurunan CD33– Band stage : CD13 muncul lagi, CD16(+)

Identifikasi populasi sel• Monocytic lineage

– Monosit muda : peningkatan densitas CD13, CD33,CD11b– Transisi ke promonosit dan monosit matur : CD14 dan CD15– Berlawanan dengan seri granulosit : HLA –DR dan CD64 tetap kuat pada monosit matur

Identifikasi populasi sel• Erythroid lineage– Prekursor eritroid :Tidak mengekspresi CD45– Diferensiasi eritroid : CD71 (pronormoblast- semakin

hilang pada stage retikulosit)– Glycophorin A : pertama muncul pada basophilic

normoblast.

Identifikasi populasi sel• Megakaryocytic lineage

– Maturasinya belum dietahui – CD41 dan CD61 : Gp Iib/IIIa marker diferensiasi pertama– Pada populasi CD34+ dengan CD41/CD61 + megakarioblas– maturasi megakariositplatelet : CD42,CD62P,CD63

Identifikasi populasi sel• B-cell Lymphoid lineage

– Progenitor lymphoid : CD34, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dan HLA-DR– B-cell paling muda : CD19, cyCD22, cyCD79– Semakin matur : muncul CD10 B-cell matur : CD20 dan penurunan CD10

• T-cell Lymphoid lineage– Immature T-cell : CD34, TdT– Marker pertama T-cell : CD2, CD7, cyCD3– Cd 2,CD7 NK cell– Pada akhirnya: tinggal CD3 di permukaan sel, CD4 dan CD8 menghlang

Koktail

Bag. PK FK UGMFITC/FL1 PE/FL2 PerCP/FL3

igG1 (kontrol neg)

IgG2(kontrol neg)

CD45(blast)

CD3(T lymp)

CD10(lymp B)

CD45(blast)

CD7(lymph T)

CD33(myelo)

CD45(blast)

cyMPO(myelo)

CD34(progenitor)

CD45(blast)

cyCD3(T lymph)

cyCD79a(B lymph)

cyCD45(blast)

Jurnal • Panel primer :

– CD45 (blast)– CD19 (B lymp)– CD10 (B lymph CALLA(+))– CD3 (T lymp)– CD33 (Myelo)– CD7 (Lymp T)– CD34 (progenitor)– CD13 (Myelo)– Tambahan : CD14 dan CD41

• Panel sekunder :– CD117 (myelo)– CD14 (Mono)

Teori di jurnal

CD34• Immature hematopoietik• Normal BMP hanya <3%• Populasi leukemia :

– 45-65% AML : CD34+– 75%pre B-cell ALL : CD34+– B-cell ALL L3 : dim CD34, TdT -

B-cell ALL• 57,6% >20% CD19+

(earliest B-cell)• B-cell ALL CD19+,HLA-DR+• CD19- rule out B-cell ALL• Aguilera et al : marker B-cell

yang sensi-spesi paling baik : cyCD79a dan cyCD22

• Matur B-cell (ALL L3) CD10 and dim CD34

Teori di Jurnal

T-cell ALL• Aguilera et al : marker T-cell

paling baik sensi-spesi : cyCD3 CD7

• Penelitian lain: CD7 paling sensi-spesi

• CD7 + belum tentu T-cell ALL, diekspresi oleh : – B-cell– Myeloid lineage

• T-cell ALL CD7+, juga disertai marker T-cell lain (CD2,CD3,CD5)

CALLA (common ALL antigen)• CD10 + CALLA +• Biasa ditemukan pada B-cell

ALL pada leukemia anak• Penting pada :

– Dx pre-B cell ALL– Early relapse pre-B cell ALL

• CD 10+ prognosis lebih baik

• Berkorelasi dengan AbN kromosom

Teori di jurnal

AML• Jurnal : Dim CD45

dikombinasi CD34,CD33,CD13

• Aguilera et al : marker paling baik sensi-spesi untuk AML : cyMPO

• Kaleem et al : peling sensi CD33

AML dengan aberant ekspresi Ag

• 25% AML CD7+• Tidak signifikan secara klinis

dan respon thd terapi

Teori di jurnal

• 21,2% ALL CD13,CD33• 5,2% B-ALL CD7• Bradstock et al : – 30-45% B-ALL ekspresi Myeloid marker (My+ALL)

CD33,CD13,CD11b,CD7• Unal et al : ekspresi myeloid antigen pada kasus

ALL tidak signifikan terhadap klinis, angka kekambuhan dan survival rate.

• ALL dengan aberant myeloid antigen

Teori di jurnal

– Lihat skoring – >2 untuk myeloid dan >2 lymphoid biphenotypic

• Mixed lineage leukemia

KLASIFIKASI IMUNOLOGI

Penelitian di indonesia

immunophenotyping leukemia

Documents