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TECNICHE IMMUNOLOGICHE

Immunologia e Immunologia Diagnostica

Tecniche di laboratorio

• La maggior parte delle tecniche di laboratorio biomedico si basano sull’utilizzo degli anticorpi.

• Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata specificità.

• Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola biologica o chimica:

- Proteine - Acidi nucleici - Lipidi - Polisaccaridi - Sostanze chimiche

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Applicazioni degli anticorpi monoclonali

• Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati: - Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica - Nei laboratori di diagnostica - Nelle terapie mediche

• Gli anticorpi monoclonali permettono di:

- Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo)

- Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo)

- Purificare l’antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere)


Concetto di antigene nelle applicazioni pratiche

Dal punto di vista biologico l’antigene è sempre una molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte sostanze presenti nel sangue:

 Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue

 Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni 2. Titolo anticorpale

 Marker tumorali = Diagnostica per immagini

 Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico Immunologia e Immunologia Diagnostica

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Proprietà pratiche nell’utilizzo degli anticorpi

Il riconiscimento dell’antigene da parte di un anticorpo è basato su legami chimici che determineranno:

 L’affinità dell’anticorpo

 L’avidità dell’anticorpo

 La specificità dell’anticorpo


Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab)

•  Legami non covalenti:

–  Legami Idrogeno –  Legami Elettrostatici –  Legami Idrofobici

•  Processo Reversibile

•  Molti legami tra Ag e Ab

•  Modello Chiave-Serratura Interazione Lisozima/Anti-Lisozima

H L

Ag


Affinita’ = Somma delle forze attrattive e repulsive

Ab

Ag

Alta Affinita’

Ab

Ag

Bassa Affinita’

Affinità Anticorpale •  La forza della reazione tra un singolo determinante

antigenico ed un singolo sito di legame dell’anticorpo


Avidità Anticorpale •  La forza totale del legame tra un Ag con molti determinanti

e Abs multivalenti

Keq = 104 Affinita’

106 Avidita’

1010 Avidita’


Specificità Anticorpale

•  La capacita’ per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico.

•  La capacita’ per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene.


Reazione Incrociata (Cross-Reazione)

•  La capacita’ di un singolo anticorpo di reagire contro piu’ determinanti antigenici.

•  La capacita’ di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu’ antigeni.

Anti-A Ab

Ag A

Anti-A Ab

Ag B

Epitopo condiviso

Anti-A Ab

Ag C

Epitopo simile

Cross-Reazioni


Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab

•  Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantita’ degli immuno-complessi.

•  Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l’antigene o l’anticorpo presenti nel campione.


Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA):

Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima

Principio dell’ELISA •  1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra

•  1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima

•  L’enzima (perossidasi) reagisce con il substrato

•  La reazione produce una colorazione misurabile

Piastra ELISA Ag

Ab specifico

Anti-Ig marcato

Substrato incolore

Substrato dopo la reazione

Enzima


ELISA Diretto per Ag

•  Rilevamento dell’Ag –  Immobilizare l’Ab –  Incubare con il campione

da misurare –  Aggiungere l’Ab marcato

con un enzima –  La quantita’ di Ab legato

e’ proporzionale alla quantita’ di Ag nel campione del paziente.

  Test Quantitativo

Fase Solida

Ag Immobilizato

Ag nel campione del paziente

Ab marcato


ELISA Diretto per Ab

•  Rilevamento dell’Ab –  Immobilizare l’Ag –  Incubare con il

campione da misurare –  Aggiungere l’anti-Ig

marcato con un enzima –  La quantita’ di anti-Ig

legato e’ proporzionale alla quantita’ di Ab nel campione del paziente.

  Test Quantitativo

Fase Solida

Ag Immobilizato

Ab nel campione del paziente

Anti-Ig marcato


Immunofluorescenzae

Citofluorimetria

Immunofluorescenza •  Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag

Antigeni sulla membrana citoplasmatica:

- direttamente accessibili

Antigeni intracellulari:

- inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione


Immunofluorescenza

•  Preparazione dei campioni → Marcatura Ab

Traccianti Fluorescenti:

-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag

- Fino a 4 traccianti diversi per un campione


Fluorescenza e Fluorocromi •  I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti:

-Assorbono l’energia della luce → Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile → Emissione

Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm)

Fluoresceina (FITC) 495 519

Rodammina 550 573

Ficoeritrina (PE)

565 578

Texas Red 589 615


Immunofluorescenza

•  Diretta: - L’anticorpo che riconosce l’antigene e’ marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente)

Ag

Ab marcato con fluorocromo

Sezione di un tessuto


Immunofluorescenza

•  Indiretta: -  L’Ab che riconosce l’Ag non e’ marcato -  Viene utilizzato un anti-Ig marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab.

 Test Qualitativo/Semi-Quantitativo

Ag

Anti-Ig marcato con fluorocromo

Sezione di un tessuto

Ab non marcato


Immunofluorescenza

Area T (Paracorticale)

Area B (Follicoli)

Linfociti T e B all’interno di un linfonodo


Immunofluorescenza

•  Analisi di Tessuti •  Analisi di Singole Cellule


Citofluorimetria •  Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag

Antigeni sulla membrana citoplasmatica:

- direttamente accessibili

Antigeni intracellulari:

- inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione


Citofluorimetria

•  Preparazione dei campioni → Marcatura Ab

Traccianti Fluorescenti:

-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag

- Fino a 8 traccianti diversi per un campione


Citofluorimetria •  La sospensione di cellule da analizzare viene marcata

con una molecola fluorescente. •  La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o

Indiretta. •  Il campione di cellule viene analizzato con un

citofluorimetro (FACS)


Citofluorimetria

•  Analisi del campione al FACS

Intensita’ Fluorescenza Verde

Num

ero

di C

ellu

le

Cellule non marcate

Cellule fluorescenti

Istogramma con 1 Parametro

Intensita’ Fluorescenza Rossa In

tens

ita’ F

luor

esce

nza

Verd

e

Istogramma con 2 Parametri

1 2

3 4


Citofluorimetria •  Esempio: Analisi cellule da sangue periferico

-  Miscela di linfociti, monociti e granulociti

-  Colorazione con Ab monoclonali:

1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE)

2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC)



con 1 parametro

CD14=monociti

Intensita’ Fluorescenza

CD14 PE

CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3)

CD45 FITC

1 2

3



con 2 parametri

CD45 FITC

CD

14 P

E

CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti

R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti)


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