İmmunohistokimyasal Tanı Yöntemleri

Prof. Dr. Hasan YÜKSEL

hyukselefe@hotmail.com

www.cocukalerjiklinigi.com

www.cocukgogusklinigi.com

Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi

Pediatrik Alerji Bilim Dalı ve Çocuk Göğüs Bilim

Dalı

Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri

Herhangi bir çıkar çatışmam yoktur .

2

İmmunohistokimyasal (İHK) Tanı Yöntemleri

Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri

1. Deneysel modeller

2. Malignite vb in vivo tanı

3. Fonksiyonel proteinler (SPs,

CD…)

4. Patolojik (PAP, kollojen,…..)

5. …….

Astım, alerjik rinit, pnömoni, fibrozis, Tb, toksik...

Solunum Yolunda Deneysel Modeller

Solunum yolu epiteli, submukoza, parankim...

In Vivo Tanı

6

• Astımda alveollerin ve hücrelerin IM ve EM inceleme

farklılaşması

Işık ve Elektron Mikroskopik İnceleme

Floresan, peroksidaz yöntemle görüntüleme

İmmünohistokimya nedir ?

PAP

APAAP

(Strept) Avidin-Biotin

Polimer Bazlı Teknoloji

Eşzamanlı Birden Çok Doku Belirtecinin Boyanması (Double-Stain)

8

Double Stain: SARS-CoV ve sitokeratin.

İmmünohistokimyada Boyama Yöntemleri

Hücrelerdeki reaktivite membranöz, sitoplazmik ve/veya nükleer olabilir.

Boyanmanın genişliğine, yoğunluğuna ve/veya kombinasyonuna göre

reaktivite var bir aralıkta değerlendirilir (zayıf, orta, güçlü ; +, ++, +++ gibi…)

Kompüterize alan hesabı yapılabilir (Stereoloji …. vs) 9

membranözNükleer ve sitoplazmik

İmmünohistokimyasal Boyamanın Kantitasyonu

10

Deneysel Modellerde İHK

En sık kullanım.

Hava yolu İHK

Parankim İHK

BAL İHK

……

Tanı Kullanılan panel Yeğlenen panel

Karsinoma Pansitokeratin Pansitokeratin

Lenfoma CD45 CD45 + CD43

Melanoma S-100 S-100 ve Melan A

Sarkoma Vimentin Kollajen tip IV ve Vimentin

Panel seçiminde algoritm önemlidir

KHDAK Hastaları Çeşitli subtipler

Adenokarsinom Adenokarsinom dışı

Patolog

“Düşük risk” “Orta risk” “Yüksek risk” “Düşük risk” “Orta risk” “Yüksek risk”

In Vivo Tanıda Panel Seçimi

İmmunohistokimyasının western-

blot ile kantitatif hale

getirilmesi

Kök hücrenin

FISH ile gösterilmesi

İmmünohistokimyasal Yöntemlere Destek Yöntemler

Markırlar ile hücreler ve differansiasyon evreleri İHK olarak tanımlanır

İHK Yöntemler: Farklılaşan Hücrelerin Tanımlanmasında

14

Örnekleme

• Deney hayvanlarından

alınan dokular

• Hücre kültürü

• Aspirasyon materyalleri,

• Bronkoalveoler lavaj gibi

sıvılar

• Biyopsi

Patolojik Durumlarda İHK Yöntemler

Patolojik Durumlarda İHK Yöntemler

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

18

Astım/rinitte hücrelerin tipinin ve lokalizasyonunun saptanması.

Yapısal ve patolojik proteinlerin tipinin ve lokalizasyonunun saptanması.

İHK ile yapısal değişiklikler: Deneysel Modeller

Etiopatogeneze katkı İnflamasyonda hücre çeşitliliğinin ve birikme yerlerinin

saptanması Tedavinin şekillendirilmesi

İHK ile yapısal değişiklikler

• Akciğerdeki diffüz parenkimal

akciğer hastalıklarında,

• Astımve KOAH ….

• İnflamatuvar hücre çeşitleri ve

sayılarının saptanmasında,

• Akciğerin benign ve malign

neoplazmlarında,

• Patogenez ve tedaviye yönelik

deneysel çalışmalarda

kullanılmakta .

İHK ile yapısal değişiklikler

21

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

• Altın standard

Mukoza Biyopsisi

Ekspresyon oranları;

• FOXP3, T-bet, GATA-3,

• TGF-β1, IL-10 and

• TH1/ TH2 sitokin oranı (IFN-γ , IL-4, IL-5,

IL13)

N. Van Bruaene et al, JACI 2008.

Nazal polipde T-regulatör hücre düşüklüğü

İHK ile İnflamasyon

*

** *

*

Van Bruaene et al, submitted

Nazal polipde inhibitör T-hücre yanıtı

Kim Clin Exp Allergy 2005;35:591-7

Astımda BAL da ECP ve IL-8

27

28

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

www.alerjiklinigi.com

Astımda İnflamasyon

Kronik inflamasyon

Yapısal değişiklikler

Akut İnflamasyoneklenmesi

Zaman

Havayoluremodelingi

RBM kalınlaşması (neoanjiogenzis + fibrinoid) kas hücresi ve goblet hiperplazi kantitasyonu

İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi

Hoshino M. Gene expression of vascular endothelial growth factor and its receptors and angiogenesis in bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol 2001;107:1034-8.Neden nazal mukozada

AZ/YOK ?

Akciğerde bulunur

VEGF, endotel hücreler için çok spesifikmitojenik etkileri nedeniyle anjiogenezisisve lenfanjiyogenezisi tetikleyici etkileri olan bir moleküldür.

VEGF ailesi yeditane üye içerir:

VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PlGF.

Tüm üyeler VEGF homology parçası bulundururlar.

VEGF ve remodelling (neoanjiogenzis + fibrinoid)

İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi

Yuksel H et al, Increased exp. of tissue VEGF and flk-1R in seasonal allergic rhinitis and relevance to asthma component. Clin Exp Allergy 2007.

0

50

100

150

200

250

300

Kontrol AR AR+Astım0

5

10

15

20

25

Kontrol AR AR+Astım

VEGF

flk-1

Rem

od

eli

ng

Sistemik Allerjik Enflamasyonun Eş Zamanlı İki Doku Tutulumu

VEGF flk-1 (VEGF-R)

p < 0.05

p > 0.05

p < 0.05

p < 0.05

www.alerjiklinigi.com

H&E ile boyanmış akciğer kesitleri

Bronşiyolerde VEGF-pozitif hücreler

BAL sıvısındaVEGF-pozitif hücreler

Plasebo

TDI

TDI +

VEGFR inhibitörü Lee YC, et al.

J Immunol

2002;168:3595-600.

VEGF ve remodelling (neoanjiogenzis + fibrinoid) neden ÖNEMLİ ?

İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi

Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü

Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

0

0,5

1

1,5

2

2,5

eNOS iNOS

AR

Kontrol

p>0.05 p<0.05

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Kontrol AR AR+Astım

Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü

p<0.05

p<0.05iNOS Birleşik Hava Yolu

Hastalığı Patogenezi

İnhale NO

iNOS Ekspirasyonu

Enflamatuvar Potansiyel

Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

CoordinateGene

Expression

T -Cells (CD4+)–––

Eosinophils–––

Macrophages–––

Epithelial Cells–––

Smooth MuscleCells

Corticosteroids

GeneticFactors

EnvironmentalFactors

(Smoke, allergens)

GeneProducts

Cytokines–––

Chemokines–––Cell

AdhesionMolecules

–––Enzymes

Pathology

AcuteInflammation

–––Progressive

ChronicInflammation

–––Airway

Remodeling

Astım: Kronik hava yolu inflamasyonu ve mikroçevre değişiklikleri

İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi

Normal

Normal

Asthma

Asthma

COPD

COPD

Astım: DPP10 (dipeptidil peptidaz 10) nun astım ve koah daki mukozal lokalizasyonu.

İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi

Yuksel H, et al. Epithelial barrier dysfunction in pathogenesis of allergic rhinitis: Zonula Occludens-1 protein. VI. W Immune Reg. Meeting. March 2011. Abstr no 112.

7. Epiteliyal Bariyer Disfonksiyonu

Epiteliyal bariyer disfonksiyonu alerjik enflamasyondan önce var olan primer neden

olabilir !!!

n=10 n=10

Ko

ntro

lA

lerjik Rin

it

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

43

44

Astım: EGF-R, MUC5A, MUC5B değişiklikleri

İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi

Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü

Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

0

0,5

1

1,5

2

2,5

eNOS iNOS

AR

Kontrol

p>0.05 p<0.05

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Kontrol AR AR+Astım

Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü

p<0.05

p<0.05iNOS Birleşik Hava Yolu

Hastalığı Patogenezi

İnhale NO

iNOS Ekspirasyonu

Enflamatuvar Potansiyel

Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

1. Yapisal degisimler: Stereoloji, brons capı/mukoza oranı, alveol….)

2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…

3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla,

fibroz

4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg

5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..

6. Apopitozis, Efferositozis

7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar

İHK + EM ile Akciğerin Ultrastrüktürel Değerlendirilmesi

49

İHK + EM ile Akciğerin Ultrastrüktürel Değerlendirilmesi

Parankimal hücreler, Organeller, Parankimal yeniden şekillenme, Astım/Amfizem benzeri patholojilerde:

alveol tip II hücre hiperplazisi ve hipertrofisi hücreiçi sürfaktan değişiklikleri

değerlendirilebilir. Alveollerin sayıları ve alveolar açıklıkların

sayılarıAlveol yüzey alanı (Alveolar surface density :

ASD)Işık mikroskop altında sistematik rastgele- fiziksel disektor

kullanılarak hesaplanabilir.

Teoriden Nümerik Değere: Akciğerin Stereolojik İncelenmesi

Tarafsız Taraflı

A C

B D

Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele örneklem

BA

Basit Rastgele Örnekleme Sistematik Uniform Rastgele Örnekleme

Total Organ Örneklemi

Evre 1 Akciğer 1 Akciğer 2 Akciğer 3

Blok 2Blok 1 Blok 3Evre 2

Kesit 1 Kesit 2 Kesit 3

Alan 1 Alan 2 Alan 3

Evre 3

Evre 4

Evre 5 Değerlendirme –Kantitatif veya Kalitatif

Stereolojide Mikroskopi için çok taraflı örneklem

Organ Slicer Slice Selector

Field Selector

Stereolojide SUR Örneklemde Yardımcı Ekipman

Delesse Prensibi:

Relatif alandan relatif hacim ölçülebilir,

Pa

Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele örneklem ve nokta sayımı

Terry M Mayhew School of Biomedical Sciences University of Nottingham

P L

Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele interseksiyon ile nokta sayımı

Bilgisayar adapte !!!!

1 2

3

A

Stereoloji: Tarafsız sistemik rastgele transseksiyonseksiyon ile nokta sayımı

58