immuno precipitatie
DESCRIPTION
Variabele deel bindt specifiek aan antigeen (Fab domein). Constante gedeelte (Fc domein). Immuno precipitatie. Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit). - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Immunoprecipitatie
• Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt
• Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit)
Variabele deelbindt specifiek aan antigeen(Fab domein)
Constante gedeelte(Fc domein)
Hoe wordt een antilichaam gemaakt?
• Dier (konijn, muis, kip) produceert antilichamen als reactie op inbrengen antigeen
• Antilichaam materiaal verzamelen (bloed, eieren) - bevat antilichamen tegen veel verschillende antigenen!!!
• Zuiveren antilichamen uit dit materiaal (slechts een bepaald percentage van de antilichamen bindt aan specifiek antigeen)
Immunoprecipitatie
• Techniek om eiwitcomplexen te identificeren
- hierdoor wordt duidelijker welke functie deze eiwitten hebben
• Een antilichaam herkent een van de eiwitten- vaak wordt een fusie eiwit gemaakt, bijv. met GFP
Eiwit 2Eiwit 1
GFP
Eiwit 3
anti-GFP
Voorbeeld immunoprecipitatie(uit onderzoeksgroep van Dolf Weijers)
Lokalisatieeiwit1-GFP
in vaatweefselplantenwortel
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
wild-typewortel
wortelzondereiwit 1
(mutant)
wortelzondereiwit 2
(mutant)
abnormaalvaatweefsel
Eiwitcomplex geeft informatie over de functie van het eiwit
Hoe voer je een immunoprecipitatie uit?
• weefsel met eiwit-GFP malen
• anti-GFP toevoegen aan cel extract
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Binden aan Protein A agarose
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
agarosebolletje
Eiwit 1GFP
Eiwit 2
Eiwit 1GFP
Eiwit 2Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
agarosebolletje
Protein A
Precipitatie eiwitcomplex door centrifugeren
vloeistof afpipetteren
bolletjes wassen
Eiwitcomplex denatureren en op gel laden
Eiwitbandjes scheiden door electroforese, kleuren en uitsnijden
Hoe voer je een immunoprecipitatie uit?
SDS-polyacrylamide gelelectroforese
Proteomics: identificatie van de eiwitten
Voorbehandeling met iodoacetaatom de vrije SH groepen (cysteines) van de eiwitten te blokkeren door carboxymethylering
Proteolyse
Eiwit in stukjes knippen met trypsine tot korte peptides
Voorbehandeling geëxtraheerde peptiden
De geëxtraheerde peptiden worden ontzout en gemengd met matrix oplossing.
Dit mengsel wordt op een plaatje gebracht en verdampt zodat er kristallen van het matrixmateriaal en peptiden overblijven.
Na bestraling door een laser en ionisatie (MALDI) worden de peptiden geanalyseerd met TOF mass spectrometrie.
MALDI-TOF spectrometer
De massa van een polypeptide keten kan bepaald worden met de MALDI-TOF techniek.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight
Identificatie van eiwitcomplex
Massaspectrum tryptisch digest
Massa en lading van elk peptide worden geregistreerd
Identificatie van de eiwitten
Voorwaarden voor succesvolle IP
Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
Eiwit 1
GFP
Eiwit 2
• Testen van kwaliteit antilichaampreparaat Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP
• Immunoprecipitatie en isolatie peptides
• Identificatie peptide(s) en
• Toekenning eiwitcomplex
Uitvoering experiment