Identification de facteurs

impliqués dans la

Mécanosensibilité colique.Alison Accarie / 1er année de thèse

Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny

Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid

UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur

U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur

prise en charge insuffisante des douleurs chroniques

Introduction

Axe : Douleur viscérale

Douleurs abdominales

• Première cause de consultation en gastroentérologie

• Symptôme commun au SII et MICI en période de rémission

Douleurs coliques

SII : syndrome intestin irritableMICI : maladie inflammatoire chroniques de l’intestin

Introduction

hypersensibilité colique

Douleurs coliques

2/3 des cas

Introduction

Intégration centrale

Introduction

Mécanosensibilité colique : implication de canaux ioniques

ASIC (Acid sensing ion channels): sensible au pHTRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) : sensible au chaudTRPA (Transient Receptor Potential family A): sensible au stretch, température et irritants

Senseurs périphériques? Pas de rôle clair.

Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010

Introduction

Identification d’un nouveau Facteur de Transcription dans cas de stimulation mécanique des tiges chez Arabidopsis & Popular sp. (Equipe MECA, UMR PIAF)

PtaZFP2

Expression précoce

Motif doigt de zinc

Mécanosenseurs présents aussi chez les plantes, avec équivalent génique chez l’animal

Introduction

Martin, 2009

Cinétique d’expression courte

Induit pour une stimulation

Phénomène de sensibilisation

NGF1-C/egr-4 équivalent génique de PtaZFP2 chez la souris

Introduction

Famille Egr :

4 sous types

Facteur de transcription / Gène de réponse précoce

Structure à doigt de zinc liaison à l’ADN Cys2-His2

Modulation d’expression de gènes lors de la transmission nerveuses

Même séquence de reconnaissance de l’ADN : GCC G/TGG GCG

Induction par NGF (culture cellulaire )

Zhican Qu 1998Impliqué dans stimuli douloureux

Egr-4 :

Deux principales études

Impliqué dans mecanosensation (vibris et cortex somata-sensoriel) suite à un stimulus mécanique physiologique

Introduction

(Mack et al., 1995).

PCR ARNm egr-4

Objectif de la thèse

Implications et rôles du facteur de transcription

EGR-4 en tant mécano senseur

Objectifs

Egr-4 impliqué dans Hypersensibilité colique chez l’animal?

Quels sont ces partenaires?

Par quels mécanismes cela passe-t-il?

Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant que

mécanosenseurs

Plan de travail

Souris saines

Rôle dans Mécanosensibilité viscérale?

Quels sont les partenaires?

Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent?

Caractérisation de la cible

Plan de travail

Souris saines

Rôle dans Mécanosensibilité viscérale?

Implication dans hypersensibilité colique?

Quels sont les partenaires?

Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent?

Caractérisation de la cible

Modèle post-infectieux

Modèle stress

Modification d’expression?

Changement de partenaires?

Cinétique différente?

Protocole

Souris wt sans traitement.

Distension à 100 µL pendant 10 s.

Prélèvement 30 min, 1h30 et 3h30 après distension.

Colon

• Partie distendue

Moelle

DRG viscéraux

• L6 et S1

seringue + sonde rectale

Premiers résultats IHC

Anticorps au point pour les trois structure

Colocalisation avec des fibres nerveuses plus précisement sensitives

Egr-4 nucléaire et/ou cytoplasmique

ParaffineAnti-NGFI-C 1:500Anti-goat (secondaire) 1:1000

Premiers résultats IHC

Colon

seringue + sonde rectale

Colon

Premiers résultats IHC

DRG cytoplasme DRG noyau

Colon

Premiers résultats IHC

Corne dorsale de la moelle épinière

DRG cytoplasme

DRG noyau

Egr-4 colon souris distendus vs non distendus

C 30 1h30

COLON

ARNmprotéine

baisse d’expression de egr 4 au niveau colique

Egr-4 DRG souris distendus vs non distendus

C 30 1h30

DRG

ARNm protéine

baisse d’expression de egr 4 dans les DRG

Egr-4 moelle souris distendus vs non distendus

Moelle

C 30 1h30

ARNm

protéine

augmentation de EGR4 dans la moelle.

Conclusion

Outils d’études (PCR, WB, IHC) disponibles et mis au point

Résultats avec des tendances différentes de ceux obtenus chez la plante et au niveau cérébral chez la souris (confirmation en cours).

Confirmation de l’intérêt de l’étude de cette cible dans la mécanosensibilité

Suite du travail

Cinétique d’expression du facteur.

DCR 30 (45) 1h (1h15) 1h30

DCR (1h) 1h30 (2h) 2h30 (3h) 3h30

ARNm

Proteine

Suite du travail

Cinétique d’expression du facteur.

Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount).

Suite du travail

Cinétique d’expression du facteur.

Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount).

Identification des cibles et partenaires.

choc osmotique

qPCR

Culture cellulaireMODE-K

WBmicroarray

Merci de votre attention

Corrélation volume de distension-expression egr-4 ARN m et protéine

qPCR

Western Blot

Prélèvements au temps choisis

Distension des animaux avec différents volumes :

20 µl

40 µl

60 µl

80 µl

100 µl

120 µl

J-3 J-2 J0 J1 J2 J3 J9

Administration néomycine (2 g/mL) dans eau de boisson

Gavage PBS ou 109 CFU/souris

(AIEC LF82 ouMG1655)

Distension colorectale

Modèle post-infectieux

Souris KI pour le gène humain ceacam6 : site de liaison LF82

meilleure implantation des bactéries

Implantation électrodes

0 20 40 60 80 1000.0

0.5

1.0

1.5 WT ControlWT + LF82

*: significant vs non infected

WT + MG1655

Distension Volume (µL)

VM

R (

mV

/s)

0 20 40 60 80 1000.0

0.5

1.0

1.5 Ceacam6 ControlCeacam6 + LF82Ceacam6 + MG1655

*: significant vs non infected

*

*

Distension Volume (µL)

VM

R (

mV

/s)

DCR J9

Résultats modèle post-infectieux

Résultats modèle stress

Réponse moyenne de sensibilité colique DCR réalisée à l’age adulte