Identificación varietal en vid por técnicas de

Biología Molecular.

Lic. Luciana GarciaLic. Carolina Chiconofri

OBJETIVODesarrollar un banco de datos a partir de plantas de origenindudable y del uso de marcadores moleculares(microsatélites) que puedan ser utilizados para la identificaciónde variedades de alta calidad enológica y de gran importanciaen la vitivinicultura argentina. Ello permitirá a viveros yproductores locales asegurar la identidad genética de susmateriales.Siendo esta técnica complementaria a las determinaciones yaefectuadas por el Instituto Nacional de Vitivinicultura para laidentificación de cultivares en vid por ampelografía.

Identificación varietal en vid por técnicas de Biología Molecular

¿Qué es la Biología Molecular?

Estudia las interacciones de losdiferentes sistemas de la célula,incluyendo las relaciones entre elÁcido desoxirribonucleico (ADN),el Ácido ribonucleico (ARN), lasíntesis de proteínas y elmetabolismo; y cómo todas esasinteracciones son reguladas paraconseguir un correctofuncionamiento de la célula.

Identificación varietal en vid por técnicas de Biología Molecular

Identificación varietal en vid por técnicas de Biología Molecular

El dogma central de la biologíamolecular describe el proceso en dos pasos (transcripción y traducción) por el cual la información genética lleva ala producción de proteínas:DNA → RNA → proteína.

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•Ácido desoxirribonucleico (ADN)

El ADN tiene como papel principal elalmacenamiento de la información genéticade cada ser vivo.Desde el punto de vista químico, el ADN estáformado por nucleótidos, y cada nucleótido,a su vez, está formado por un azúcar (ladesoxirribosa), una base nitrogenada (quepuede ser adenina→A, timina→T,citosina→C o guanina→G) y un grupofosfato que actúa como puente de cadanucleótido.

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En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doblecadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidasentre sí por unas conexiones denominadas puentes dehidrógeno.

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•Replicación del ADN

Es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (sintetizaruna copia idéntica). De esta manera, de una molécula de ADNúnica, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Estaduplicación del material genético se produce de acuerdo conun mecanismo semiconservativo, lo que indica que las doscadenas complementarias del ADN original, al separarse,sirven de molde cada una para la síntesis de una nuevacadena complementaria de la cadena molde, de forma quecada nueva doble hélice contiene una de las cadenas delADN original.

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Gracias a la complementación entre las bases que forman lasecuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene laimportante propiedad de reproducirse idénticamente, lo quepermite que la información genética se transmita de unacélula madre a las células hijas y es la base de la herencia delmaterial genético.

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•Propiedades y función de las ADN polimerasas

Son enzimas que intervienen en el proceso de replicación del ADN.Llevan a cabo la síntesis de la nueva cadena de ADN emparejandolos desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) con losdesoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADNmolde. El crecimiento de la cadena se produce en dirección 5' →3‘.Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante elproceso de replicación. Además de participar en la elongación,desempeñan una función correctora y reparadora. Es importanteque existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrariolos errores producidos durante la copia del ADN darían lugar amutaciones.

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•Diferenciación varietal en vid

Existen diversos métodos para diferenciarvariedades de vid. El primero en utilizarse, para laidentificación de cultivares de vid fue laampelografía, basada en la descripción deelementos morfológicos de la planta, tales comobrote, baya, racimo, y fundamentalmente, hoja. Laventaja que tiene esta técnica es su rapidez, siendosu limitante la influencia que pueden ejercerfactores externos (eventos climáticos, plagas,enfermedades) sobre estos marcadores alterandosu morfología normal, y su falta de precisión encasos de individuos genéticamente similares.

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Otro método es el basado enel uso de marcadoresbioquímicos (proteínas porej.), pero presentan elinconveniente de serafectados también por elambiente y disponer deescasa cantidad de sistemasisoenzimáticos capaces dediferenciar la gran cantidadde variedades de vid queexisten.

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Las técnicas de Biología Molecular utilizanmarcadores moleculares, los cualesdetectan polimorfismo a nivel del ADN,permitiendo la identificación varietal enforma precisa. Tienen además la ventaja deno ser afectados por el ambiente, siendoentonces la mejor alternativa paradiferenciar variedades genéticamentesimilares. Los microsatélites (SSR) son losmarcadores moleculares más comunes enplantas y por lo tanto los más utilizadospara identificar variedades de vid.

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•Características de los microsatélites

Los microsatélites son secuencias de ADN en las que unfragmento (cuyo tamaño va desde dos hasta seis pares debases) se repite de manera consecutiva. Partiendo de estahipótesis se diseñan primers o iniciadores (fragmentos deADN que tienen la misma secuencia que los extremos de losmicrosatélites) para producir un alto número de copias de unmicrosatélite a través de una PCR (Reacción en Cadena de laPolimerasa).

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Los fragmentos amplificados son separados de acuerdo a su longitud en pares de base a través de una electroforesis.

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1. Extracción del ADN

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2. PCR

La propiedad de las enzimas ADNpolimerasas para replicar hebras deADN se utiliza para la reacción encadena de la polimerasa, conocidacomo PCR, para obtener un grannúmero de copias de un fragmentode ADN particular, amplificándolopara propósitos de investigación.

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En los procesos de PCR serequiere la utilización de enzimaspolimerasas termoestables, comola polimerasa Taq, debido a quees necesario aplicar altastemperaturas para desnaturalizarla molécula de ADN.

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3. Análisis de las amplificacionesSeparación de fragmentos de ADN por electroforesis

La molécula de ADN tiene carga eléctrica, los fosfatosproveen una carga neta negativa al ADN y esta carga eshomogénea a lo largo de toda la molécula.En un campo eléctrico, el ADN migra hacia el polo positivo.Si la migración se realiza en un medio semi-sólido (porejemplo agar, una especie de gel) ésta se dificulta, dado queel ADN debe pasar a través de poros en el gel.

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Como consecuencia de la necesidad de atravesar estosporos, las moléculas de ADN más grandes verán retrasadasu movilidad, mientras que las más pequeñas migrarán unamayor distancia en el mismo tiempo.En un mismo “gel” es posible evaluar distintas mezclas defragmentos (muestras).El ADN no es visible a simple vista, por lo que utilizandocolorantes como el bromuro de etidio (se intercala entre lasbases del ADN), es posible lograr que el ADN emitafluorescencia cuando es iluminado con luz ultravioleta.

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Sistema de electroforesis con microchip y capilar

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PROYECTO DE TRABAJO

Poner a punto las distintas técnicas.Realizar un banco de datos a partir de distintasvariedades de plantas de vitis vinífera de origenindudable.Analizar a lo largo de un año las distintas partes dela planta, para determinar cuales son las másadecuadas para realizar la extracción del ADN.

Identificación varietal en vid por técnicas de Biología Molecular

Complementar a las técnicas ya realizadas por elINV (Identificación varietal en vid por ampelografía ycaracterización varietal).Desarrollar los métodos para determinar lasenfermedades más comunes en vid por técnicas debiología molecular.

Subgerencia de Investigación para la

Fiscalización

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