identificacion de las bacterias corineformes
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Identificación de las
bacterias
CorineformesJanet Salazar L.
Bacterióloga
IUCMde A.
BACILOS GRAM POSITIVOS
NO FORMADORES DE
ESPORAS
CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS
●Reino: Móneras.
miembros son Procariotas (celulas sin núcleo)
●Phylum: BXIV Actinobacteria
●Clase: I Actinobacteria
●Subclase: V Actinobacteridae
●Orden: I Actinomicetales
●Suborden: VII Corynebacterienae
●Familia: I Corynebacteriaceae
●Genero: Corynebacerium
BACILOS GRAM POSITIVOS
CORYNEFORMES
●Genero korynebacterium
Del Griego Koryne, “porra o clava”;
bakterion “ bacilos pequeños”.
●Está compuesto por 59 especies, de las cuales solo 36 son de importancia médica.
●La pared celular de las corynebacterias
arabinosa, galactosa, ácido Meso-diaminopimelico y cadenas cortas de ácido
micolico.
Los gránulos meta cromáticos (inclusiones de
polifosfato) pueden ser vistos con coloraciones
especiales (Azul de metileno).
Las corynebacterias son AE o ANA facultativas.
Fermentan carbohidratos, produciendo ácido
Láctico.
Los organismos son no móviles y catalasa positivo
crecen lentamente en medios enriquecidos.
1.Tincion de Gram
2.Catalasa
3.Prueba de
fermentacion u
oxidacion en medio
semisolido CTA ( agar
cistina tripticasa) o en
agar triple azucar hierro
movilidad
4. Reduccion de los
nitratos
5. Hidrólisis de la urea
1.Hidrólisis de la
esculina
2.Produccion de acido
partir de la glucosa,
maltosa, sacarosa,
manitol, y xilosa
3.Reaccion de CAMP
●En la tinción de Gram:
Bacilos Gram positivos
Algunos ligeramente
curvados, con lados no
paralelos, forma tipica de
porra o clava.
●A partir de un medio líquido
se ven:
Solos, en pares, en forma de
V o Y, en palizadas o en
grupos ( letras chinas).
Corynebacterium diphtheriae
CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE
TOMA DE MUESTRA●El Dx. de la difteria es ante todo clínico.●La mta. se toma con aplicador de algodón
o dacron de varias áreas inflamadas de la naso-
faringe.●Si la membrana esta presente y pude ser
removida, esta mta. Es de mayor valor. ●Colocar en un medio de transporte
semisólido (Amies). Enviar rápidamente al lab. para cultivo.
●Hacer un extendido y debeser teñido con azul de metileno de Loeffler. La sensibilidad del examen microscópico es limitada.
CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE
●Es un bacilo pleomorfico, Gram
positivo, irregular, con gránulos
meta cromáticos, inmóvil, no
capsulado, no esporulado, con
una pared rica en lípidos.●El aislamiento primario puede ser
AS plus (conteniendo 100 ug de
fosfomicina). Cto. A 35gc a las 48 h.
En atmosfera de CO2.
Los medios selectivos empleados
son el As Cystine-Tellurite o Agar
Tinsdale Tellurite.
El Tellurite inhibe el cto. de las
otras corinebacterias.
CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE
●El AS Cystine-Tellurite
(CTBA) no es especifico
parael C. diphteriae ya que
muchas corinebacterias
reducen el Tellurito de K.
●El mejor medio para el
cultivo directo de el C.
diphteriae es el medio
deTinsdale modificado.
Limitación: vida media corta <
de 4 semanas suero de
caballo.
C. diphteriae
EVALUACIÓN DE LOS CULTIVOS:
●Si el aplicador viene seco o en silica gel, caldo Tood-
Hewitt con sangre de conejo ésteril al 3% Incube por una
noche.
●Inocule los medios a 35 gc AE y en una atmosfera de
CO2.
●Si hay colonias sospechosas haga un coloración con
Azul de metileno de Loeffler Por un minuto. Lave con
agua y deje secar.
(Coloración: disolver 0.3 gs de azul de metileno en 30
ml de ethanol adicione 100ml de KOH al 0.01%.)
EVALUACIÓN DE LOS CULTIVOS
●Si la morfología celular es típica de C. diphteriae envie un
reporte preliminar: “ El examen microscópico es presuntivo de
C. diphteriae. Esta tinción no es especifica para este
organismo”.
●Después de 24-48 h. subcultive a una segunda
caja de CTBA para reaislar.
●Examine las cajas a 24 y 48 h. para colonias
tipicas de C. diphteriae que son catalasa positivas y exhiben una
morfología tipica en
el Gram, proceda a la Id. Por pruebas bioquimicas, enviar Lab.
Referencia para pruebas de toxigenecidad.
IDENTIFICACION Y SISTEMAS DE
TIPIFICACIÓN
●La tinción de Gram sirve para determinar el genero
correcto, según la morfología celular.
●La morfología, tamaño, pigmento, olor, y hemólisis de las
colonias son criterios importantes para la diferenciación
de bacterias corineformes.
●La prueba de la catalasa, prueba de fermentación
oxidación es mejor en agar cystina Tripticasa
(semisólido).
TIPIFICACIÓN●Varios tipos de sistemas comerciales se emplean
para la ID de las bacterias corineformes.●Sistema API coryne.●Paneles de MicroScan.●El sistemaCrystal de BBL.
●El sistema API coryne identifica 49 especies de
bacterias coryneformes.
PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN DE ELEK●Se basa en la doble difusión de la
toxina difterica y la antitoxina en un medio de agar.
●Una tirilla de papel de filtro saturada de la antitoxina es
colocada en el medio del cultivo y los aislamientos.
●Los aislamientos de C. diphteriae son inoculados en forma de raya en un angulo de 90 °C.
●La producción de la toxina difterica puede ser detectada a las 24 a 48 h. Banda de precipitación en el agar toxina antitoxina.
DETECCIÓN DE LA TOXINA DIFTERICA
Listeria
DESCRIPCIÓN DEL GENERO
●Las bacteria género Listeria son bacilos Gram positivos cortos, regulares, no esporulados ni ramificados.
●Se observan individual o formando cadenas cortas.
●En cultivos viejos forman filamentos de 6-20 mm de longitud.
●Presentan de 1 a 5 flagelos peritricos que les confieren movilidad a 28ºC.
COLECCIÓN, TRANSPORTE Y
ALMACENAJE DE LAS MUESTRAS
MUESTRAS CLÍNICAS:
1. Casi siempre es aislada de sitios estériles.
(Ej. Sangre, LCR, L. amniótico, placenta o
tejido fetal).
1.Cultivar de inmediato a 35°C o guardar a 4°C
hasta 48 h.
2.Las muestras de MF pueden ser inoculadas
en 100ml de un caldo selectivo o en (PALCAM): Polimixina-
acriflavin-cloruro de litio-ceftazidime –esculin y dejar a T°Am
hasta el envio. Si no es posible congelar o hielo seco hasta
el envio.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
●MICROSCOPIO:
Coloración de Gram:
En el LCR pueden no verse los organismos ya que estos están en concentraciones 100 a 1000 veces menos que otras bacterias que causan meningitis.
Hay que tener mucho cuidado con la interpretación del Gram ya que este organismo es semejante a Corynebacterium,
S. pneumoniae, Enterococo, o con haemophilus si queda decolorada la placa.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
CULTIVOS:
●La Listeria crece medios convencionales.
●Sobre AS en 1 a 2 días de incubación se
observa colonias redondas lisas y pequeñas.
●La hemólisis beta es débil por lo tanto no es
observada inicialmente.
●La movilidad característica en medio líquido
o agar semisólido ayuda para una ID. Preliminar.
●Todos los bacilos Gram positivos aislados de
sangre y LCR deben ser ID. Para diferenciar
entre Corynebacterium (presumiblemente contaminante) y Listeria.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
PRUEBA DE LA MOVILIDAD EN CALDOGota suspendida:
Método: ●Inocule 1 o dos colonias de la bacteria
sospechosa en 5 ml de caldo ( nutritivo oBHI).●Incube a temperatura de(22 a 25°C) por dos
o 3 horas o hasta que la turbidez sea vista.●Coloque vaselina en las 4 esquinas de una
laminilla y coloque en el centro una gota dela suspención bacteriana, e invierta la laminillasobre una lámina.●Examine los bordes de la gota. En 40x con la luz
reducida.
PRUEBA DE MOVILIDAD EN CALDO
Prueba de la gota suspendida:
●INTERPRETACIÓN:
●Las celulas de la L. monocytogenes giran en
círculos a su alrededor, voltearse-dejarse caer, y
dar volteretas demostrando un tipo de
movilidad característica.
DIAGNOSTICO DE
LABORATORIO
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
●DETECCIÓN RÁPIDA:
●Comercialmente hay pruebas disponibles para la
detección rápida de especies de Listeria de caldos enriquecidos de muestras de alimentos.
●Las pruebas están basadas
en inmunoensayos que usan
anticuerpos monoclonales.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
IDENTIFICACIÓN:
IDENTIFICACIÓN DE GÉNERO
●Una ID simple esta basada en las siguientes
pruebas:
●Coloración de Gram.
●Movilidad en caldo y movilidad en medio
semisólido.
●Catalasa positiva.
●Hidrólisis de la Esculina positiva.
●VP y rojo de metilo son pruebas confirmatorias
●D glucosa positiva.
DIFERENCIACIÓN DE EL GÉNERO LISTERIA
DE OTROS GÉNEROS●Del género Streptococcus puede diferenciarse por la
tinción de Gram (bacilo gram-positivo), la movilidad (móvil), la prueba de la catalasa (positiva) y la sensibilidad a la gentamicina (sensible).
●De Erysipelothrix rhusiopathiae puede diferenciarse por el crecimiento a 4ºC (crece), catalasa (positiva), la movilidad (móvil) y la sensibilidad a la vancomicina (sensible).
●De las corinebacterias móviles, por la hidrólisis de la urea (negativa), Voges-Proskauer (positiva) y por la producción de ácido de la D-glucosa en condiciones estrictamente AE (positiva).
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE
●La identificación de especie es importante ya que todas los miembros del género Listeria son capaces de contaminar alimentos pero sólo L. monocytogenes produce patología en humanos.
●Dicha identificación se realiza mediante unas pocas reacciones bioquímicas y la capacidad de producir hemólisis característica esencial para distinguir L. monocytogenes de L. innocua, que es la especie no patógena aislada con más frecuencia.
HEMÓLISIS
●Sólo tres especies son hemolíticas, L. monocytogenes, L. seeligeri y L. ivanovii.
●Las dos primeras producen una estrecha zona de hemólisis, a veces limitada al diámetro de la colonia.
●L. ivanovii muestra una
hemólisis amplia. La
prueba de CAMP es
positiva para L.
monocytogenes y L.
seeligeri en la proximidad
de una estría de
Staphylococcus aureus,
mientras que L. ivanovii
sólo da positiva la prueba
de CAMP en presencia
de una estría de
Rhodococcus equi.
PRUEBA DE CAMP:●Se coloca una raya
de la cepa de la ATCC de S. aureus productor de la beta-toxina en el centro del AS.●Inocule simples rayas de la
Listeria perpendiculares alS. aureus.●Incubar AE a 35°C por una
noche o por 6 horas en CO2.●Observe si hay una zona de
incremento de la beta hemolisisen la union de la listeria y el S.aureus.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Diagrama de flujo para la identificacion de Listeria
monocytogenes
Identificacion a partir de un cultuiivo puro en agar sangre de cordero
(ASC)
Colonias beta hemoliticas
Coloracion de gram
Bacilos gram positivos
Catalasa Positiva
Motilidad a 22C: positiva(forma de sombrilla)
Motilidad a 37 C: positiva
Prueba de camp: positiva
TSI: A/A , gas(-), H2S (-)
Ureasa: negativa
Nitratos: negativo
Hidrólisis de esculina: positiva
Rojo de metilo: positivo
Fermentacion de: glucosa:postiva
maltosa:positiva
rammnosa:positiva
manitol:negativa
xilosa: variable salicina: positiva
ACTINOMICETOS
Nocardia
ACTINOMYCETES
●Bacilos Gram positivos,
catalasa positivos.
●Son aislados del suelo,
mat. vegetal
descomposición,
sistemas de ventilación y
colonizan: animales y
humanos.
●Algunos filamentos
similares a los hongos
(Mtas. Cultivos).
●Estructura de su pared celular
y su sensibilidad
Antimicrobiana (bacterias).
●Los miembros ácido Micolico
de este grupo son
tres familias:
- Corinebacteriaceae.
- Nocardiaceae.
- Micobacteriaceae.
●Hay 4 generos:
Nocardia, Rhodococcus,
Tsukamurella, y Gordona.
NOCARDIA●Es un organismo parcialmente
AAR.
●Esta característicale sirve para dif. De otros actinomicetos.
●Son catalasa positivos.
●Crecen en medios no selectivos.
●El aislamiento puede requerirmínimo una semana de incubación.
DX DE LABORATORIO
●Las muestras de las cuales se puede aislar Nocardia son: secreciones respiratorias , biopsias de piel o aspirados
●En el extendido se puede ver la bacterias filamentosas, ramificadas, Gram positivas, general/ acido resistentes
●Crece en los medios no selectivos de rutina pero se aumenta la probabilidad de su hallazgo utilizando agar Thayer martin con antibioticos
●Las colonias se ven de 3-5 dias. 1.Coloración de Gram.2.Nocardia spp., micobacterias de cto. Rápido, y algunos
Rhodococcus spp. Son positivos para lacoloración de kinyoun modificado.
DX DE LABORATORIO
1.MORFOLOGÍA:- Streptomices, Actinomadura, y nocardiopsis spp.: bacterias filamentosas< 1 um.- Micobacterias de cto. Rápido y Nocardia spp., ramificaciones, fragmentos de filamentos y formas cocobacilares < 1 um.- Gránulos: filamentos ramificados entrelazadosque varían en textura y color dependiendo del agente etiológico.
MEDIOS DE CULTIVO
●PRIMARIOS:
- Medios:BHI agar con cloranfenicol y cicloheximide.- Agar CNA
●ANAEROBIOS:BAP ANA.THIOAgar CNA.
●MEDIOS DE RUTINA:Sabouraud dextrosa agar.ASBHITSA
MEDIOS DE CULTIVO
●OTROS MEDIOS:
Lowenstein-jensen
Middlebrook
Medio selectivo de
Middlebrook (7H10
7H11).
Medio selectivo Nocardia.
INCUBACIÓN:
Medios AE: 30°C por 14 a 21 dias.
Revisar cada 3 o 4 dias.
ANA 37°C 10 a 14 dias.
BACILOS GRAM POSITIVOS
FORMADORES DE ESPORAS
TAXONOMÍA
nueve géneros 1.Alicyclobacillus: 4 sp. Termoacidófilos
2.Paenibacillus: 27 sp.
P. polymyxa, P. macerans, P. alvei, P. pulvifaciens y P.
larvae ( las nuevas subsp. de P. larvae.)
3.Brevibacillus: 10 spp.
B. brevis y B. laterosporus.
4.Aneurinibacillus: con A. aneurinilyticus y
otras dos spp.
TAXONOMÍA
5. Virgibacillus: con V. pantothenticus y otra sp.
6. Gracilibacillus Cada una tiene dos spp.
de halófilos.
7. Salibacillus
1.Geobacillus: 8 sp. de termófilos B. stearothermophilus.
2.Ureibacillus: con dos sp. termofilicas.
GÉNERO BACILLUS
Contiene 70 sp.
Los más conocidos son:
B.subtilis, B. anthracis,
B.cereus, B. licheniformis,
B. megaterium, B. pumilus,
B. sphaericus, y el B.
thuringiensis.
Bacillus anthracisDIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
●Es importante investigar la historia laboral y de exposición.
●De las lesiones cutáneas tomar la muestra en medio de transporte con aplicador del fluido de la vesícula.
Cultivo AS para aislar el B. anthracis.
Coloración de Gram.: observando al microscopio los bacilos Gram. positivos grandes, formando cadenas.
●En la forma pulmonar:
Muestras de esputo o frotis faríngeo.
●LCR.
●Sangre.
BACILLUS ANTHRACIS
●Es no móvil.
●Reduce los nitratos a
nitritos.
●Voges proskauer
positivo.
●Sensible a la
penicilina.
●No fermentadores de:
xylosa, manitol, lactosa
y salicina.
●Son fermentadores
de: glucosa, sucrosa
y maltosa.
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
Cultivo Bacillus anthracis
●En AS de carnero las colonias son circulares y tienen aspecto de cabellera de medusa.
●Cada colonia es una hilera continua de bacilos con apariencia de vidrio pulido, alcanzando un diámetro de 3mm, después de 18 a 24 horas de incubación.
●Produce hemólisis ligera.
●Para que las esporas se produzcan se requiere de oxígeno y la temperatura óptima es de 25 a 28°C.
●Cuando la bacteria se
inocula en agar nutritivo
con bicarbonato al 0.7% y
se le cultiva toda la noche
a 37°C en atmósfera de
dióxido de carbono al 5-
20%, el germen puede
sintetizar su cápsula in
Vitro y las colonias
obtenidas son de aspecto
mucoide
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
Bacillus anthracis
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
Bacillus anthracis
IDENTIFICACIÓN
Antes de la ID. Se debe verificar si el bacilo es formador de esporas o tiene inclusiones.En el Gram. se ven espacios no teñidos sugestivos de esporas.Coloración de esporas:
Extender la muestra sobre la lámina.Secar y colocar en una plancha caliente.Adicionar verde de malaquita al 5% cubriendo la muestra.Dejar en la plancha caliente, hasta que el colorante se ponga rojo y se seque. Aproximadamente 45’.Sacar y lavar con abundante agua.Adicionar safranina al 10% dejar por 1’.Lavar y dejar secar.