hplc-ms/ms módszerek kidolgozása biológiailag aktív

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM

VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR

OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA

HPLC-MS/MS módszerek kidolgozása biológiailag aktív anyagok

mennyiségi meghatározására

Doktori értekezés

Szerző: Márta Zoltán

Témavezető: Dr. Szabó Pál, tudományos főmunkatárs

MTA-TTK, Műszercentrum, MS Metabolomika Kutatólaboratórium

Konzulens: Dr. Fekete Jenő, egyetemi tanár

BME-VBK, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék, HPLC Laboratórium

Dr. Horváth Viola

MTA-BME Számításvezérelt Kémiai Kutatócsoport

2019

2

Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom Dr. Szabó Pál témavezetőmnek útmutatásaiért, hogy kiemelkedő szakmai

tudásával, tapasztalataival és tanácsaival végigkísérte doktori munkám és disszertációm

elkészítését. Példaként szolgál számomra szakmai és emberi tevékenysége.

Köszönet illeti csoportom, az MTA-TTK MS Metabolomika Kutatólaboratórium tagjait, Imre

Tímeát, Magda Balázst, Németh Krisztinát, Sütő Pétert a mindennapokban nyújtott önzetlen

segítségekért és a feledhetetlen vidám, barátságos légkörért.

Hálával tartozom belső konzulensemnek, Dr. Fekete Jenőnek, aki lehetőséget adott a doktori

iskola elkezdéséhez, továbbá mentorálta a kromatográfiához köthető problémák megoldásait.

Köszönöm Dr. Horváth Violának, hogy vállalta későbbi belső konzulensi felkérésem, segítségét

a doktori munka befejezésében.

Szeretnék köszönetet mondani barátomnak, Dr. Bobály Balázsnak, aki példaként előttem járt

és bátran fordulhattam hozzá kérdésekkel, segített a cikkek megírásánál.

Hálás vagyok Dr. Mészáros Katalinnak és Dr. Patócs Attilának (MTA-SE Lendület Örökletes

Endokrin Daganatok Kutatócsoport), akik az orvosi kérdések megválaszolásában és a

szteroidhormonok témakörben nyújtottak kiemelkedő segítséget.

Szerzőtársaim munkáját külön köszönet illeti, mely nélkül a dolgozat nem jöhetett volna létre.

Hálával tartozom családomnak, Édesanyámnak, Édesapámnak, Testvéremnek, akik

példamutatásukkal, szeretettel és türelemmel bátorítottak és támogattak a tanulmányaim

elvégzésében.

Szeretnék köszönetet mondani Dr. Balla József egyetemi tanárnak, első mentoromnak, aki

megtanított az alázatos kitartó munkára és bevezetett a mérnöki problémamegoldó kutatás

rejtelmeibe.

Kiemelném Czuppon Györgyné középiskolai kémiatanárom fontosságát, aki megszerettette

velem a kémia tudományát és biztatott a pályaválasztásnál.

3

Tartalomjegyzék

Rövidítésjegyzék ................................................................................................................ 5

1. Bevezetés.......................................................................................................................... 7

2. Irodalmi áttekintés ............................................................................................................ 9

2.1. Tömegspektrometria ................................................................................................. 9

2.1.1. Ionizációs módszerek ..................................................................................... 10

2.1.2. Tömegspektrometriás analizátorok ................................................................. 12

2.2. Folyadékkromatográfia ........................................................................................... 14

2.3. Szteroidhormonok .................................................................................................. 18

2.3.1. Szteroidhormonok analitikai meghatározása .................................................. 21

2.4. Nem-szteroid gyulladáscsökkentők ......................................................................... 23

2.4.1. Nem-szteroid gyulladáscsökkentők analitikai meghatározása ......................... 25

2.5. Teljesítményjellemzők validálása ........................................................................... 26

3. Felhasznált anyagok és készülékek ................................................................................. 28

3.1. Felhasznált anyagok ............................................................................................... 28

3.2. Szteroidmentes szérum készítése ............................................................................ 28

3.3. Felhasznált készülékek ........................................................................................... 29

4. Célkitűzés ....................................................................................................................... 30

5. Kísérleti rész ................................................................................................................... 31

5.1. A mikro LC szerepe az érzékenységnövelésben és a mintahígítás hatása nagy

mintatérfogat injektálása esetén ........................................................................................ 31

5.1.1. A kutatás háttere ............................................................................................ 31

5.1.2. Törzs-, kalibrációs- és tesztoldatok készítése ................................................. 32

5.1.3. Szérumminták és kalibrációs szérumoldatok készítése ................................... 33

5.1.4. Mikro UHPLC körülmények .......................................................................... 33

5.1.5. Tömegspektrometriás körülmények ............................................................... 33

5.1.6. Injektálási körülmények ................................................................................. 34

5.1.7. Eredmények és értékelésük ............................................................................ 34

5.1.8. Összefoglalás ................................................................................................. 44

5.2. A mikro LC rendszer érzékenységének továbbfejlesztése on-line SPE technikával . 45


5.2.2. Törzs-, kalibrációs- és belső standard oldat készítése ..................................... 45



4



5.2.7. Összefoglalás ................................................................................................. 60

5.3. Tömegspektrometriás érzékenységnövelés lehetőségei mikro UHPLC-MS/MS

vizsgálatoknál .................................................................................................................. 61


5.3.2. Törzs-, kalibrációs- és mátrixhatás vizsgálati oldatok készítése ...................... 62

5.3.3. Mátrix kalibrációs oldatok és környezeti minták készítése.............................. 62




5.3.7. Összefoglalás ................................................................................................. 76

5.4. Mikro UHPLC - konvencionális HPLC és ESI - APCI összehasonlítása ................. 77


5.4.2. Törzs-, kalibrációsoldatok készítése ............................................................... 77

5.4.3. Származékképzési reakció ............................................................................. 78

5.4.4. Származékképzési reakció standard oldatsorozattal ........................................ 78


5.4.6. Folyadékkromatográfiás körülmények ........................................................... 79



5.4.9. Összefoglalás ................................................................................................. 91

6. A doktori értekezés összefoglalása .................................................................................. 93

Irodalomjegyzék .............................................................................................................. 94

5

Rövidítésjegyzék

ACN Acetonitril (Acetonitrile)

APCI Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

APPI Atmoszférikus nyomású fotoionizáció (Atmospheric Pressure Photo Ionization)

CE Ütközési energia (Collision Energy)

CPS Beütésszám (Count Per Second)

CUR Gázfüggöny (Curtain Gas)

CV Szórás, variációs koefficiens (Coefficient of Variation)

CXP Ütközési cella kilépési potenciál (Collision Cell Exit Potential)

DAD Diódasoros detektor (Diode Array Detector)

DP Klasztermentesítő feszültség (Declustering Potential)

E1 Ösztron (Estrone)

E2 Ösztradiol (Estradiol)

E3 Ösztriol (Estriol)

EIA Enzim immunoassay (Enzyme Immunoassay)

EP Belépési potenciál (Entrance Potential)

EPA Környezetvédelmi Hivatal (Environmental Protection Agency)

ESI Elektroporlasztásos ionizáció (Electrospray Ionization)

FDA Élelmiszerbiztonsági és Gyógyszerészeti Hivatal (Food and Drug Administration)

FLD Fluoreszcens detektor (Fluorescence Detector)

GC Gázkromatográfia (Gas Chromatography)

GC-MS Gázkromatográfia-tömegspektrometria (Gas Chromatography-Mass Spectrometry)

GS1 Porlasztó gáz (Nebulizer Gas)

GS2 Szárító gáz (Drying Gas)

HILIC Hidrofil kölcsönhatású kromatográfia (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

HPLC Nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography)

IS Ionizációs feszültség (Ionspray Voltage)

k* Gradiens retenciós tényező (Gradient Retention Factor)

LC Folyadékkromatográfia (Liquid Chromatography)

LC-MS Folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)

LC-MS/MS Folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria (Liquid Chromatography-Tandem Mass

Spectrometry)

LLE Folyadék-folyadék extrakció (Liquid-liquid Extraction)

LOD Legkisebb detektálható mennyiség (Limit Of Detection)

LOQ Mennyiségi meghatározás alsó határa (Limit Of Quantitation)

6

MeOH Metanol (Methanol)

MRM Reakciócsatornák követése (Multiple Reaction Monitoring)

MS Tömegspektrometria (Mass Spectrometry)

NMR Mágneses magrezonancia spektrometer (Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer)

NSAID Nem-szteroid gyulladáscsökkentő szerek (Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug)

Q Kvadrupól (Quadrupole)

QC A rendszer alkalmasságát vizsgáló minta (Quality Control)

QTRAP Kvadrupól-Lineáris ioncsapda analizátor (Quadrupole-Linear Ion Trap)

RE Relatív hiba (Relative Error)

RIA Radio immunoassay (Radio Immunoassay)

RSD Relatív szórás (Relative Standard Deviation)

S/N Jel/zaj arány (Signal to Noise Ratio)

SPE Szilárd fázisú extrakció (Solid Phase Extraction)

UHPLC Ultra nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (Ultra High Performance Liquid

Chromatography)

W0,5h Csúcs félérték szélesség (Peak Widht at Half Height)

7

1. Bevezetés

Az orvostudomány, a gyógyszerkutatás és a biológiai tudományok robbanásszerű fejlődése

megkövetelte az analitikai kémia, azon belül is a műszeres analitika fejlődését. Az azonosítási

elvárások, olyan kihívásokat támasztanak az analitikai meghatározások felé, aminek csak

komplexebb technikák képesek megfelelni. Ezért szerves vegyületek vizsgálatánál előtérbe

kerültek a kapcsolt technikák, kiemelkedő szerepet kapott a folyadékkromatográfhoz kapcsolt

tömegspektrométer.

Az analitikai feladatok közül elkülöníthetjük a minőségi azonosítást a mennyiségi

meghatározásoktól. Az előbbi esetén ismeretlen komponens szerkezete, az utóbbinál ismert

komponens mennyisége a kérdés. A feladatok a molekula mérete alapján nagymolekulás (1000

Da felett) és kismolekulás (1000 Da alatti) meghatározásokra oszthatók. A változatos kihívások

különböző megközelítéseket követelnek, ami behatárolja a csatolt folyadékkromatográf (LC) -

tömegspektrométer (MS) technika paramétereit, típusát, illetőleg használatának módját.

Dolgozatomban kismolekulák mennyiségi meghatározásával kapcsolatos megoldásokat

tárgyalok. Ezeknél a feladatoknál gyakran az elegendően alacsony detektálási és meghatározás

határ elérése jelenti a kihívást. Az érzékeny mennyiségi meghatározások legelterjedtebb

megoldása a folyadékkromatográfhoz kapcsolt hármas kvadrupól tömegspektrométer (LC-

MS/MS) felépítésű rendszer.

Doktori munkámban olyan analitikai problémákra keresek megoldást, ahol a kérdéses

molekulák kis mennyiségben vannak jelen vagy nehezen vizsgálhatók. Így esett a választásom

szteroidhormonok meghatározására. Szteroidhormonok vizsgálata vérből több okból kritikus.

Apoláris szerkezetük miatt nehezen ionizálódnak, illetőleg általában alacsony a

koncentrációjuk. A másik általam bemutatott analitikai probléma a gyulladáscsökkentők

meghatározása ívóvízből, felszíni vízből és szennyvízből. A nem-szteroid típusú

gyulladáscsökkentők a legnagyobb számban forgalmazott gyógyszermolekulák közé tartoznak.

A nagy mennyiségben való felhasználás következtében aktív molekulaként kis mennyiségben

megtalálhatók a környezetben is. A különböző hatásmechanizmusú vegyületek szerkezete

változatos, ezért egyidejű meghatározásuk nehézkes. Vizsgálatukra egy olyan módszer

kidolgozása szükséges, amivel a komponensek egymás mellett kis mennyiségben

meghatározhatók.

8

Az LC-MS/MS érzékenységnövelésének célja kis koncentrációk meghatározása vagy a minta-

előkészítés leegyszerűsítése, a dúsítási lépések elhagyása. A minta-előkészítés lépéseinek

redukálása idő- és költségcsökkenéssel jár, illetőleg javíthatja a módszer teljesítményjellemzőit

(megbízhatóság, ismételhetőség, robusztusság, stb.). Módszereim kidolgozásában ezeket a

célokat tartottam fontosnak és ennek megfelelően vizsgáltam az eljárások alkalmazhatóságát.

9

2. Irodalmi áttekintés

2.1. Tömegspektrometria

A tömegspektrometria napjainkban egyre nagyobb felületet fed le a szerves és szervetlen

vegyületek analitikájában, kiemelkedő a szerepe a mennyiségi és minőségi azonosításban.

Elterjedésének kulcsa, hogy sokféle analitikai probléma megoldására alkalmas. Számos

vegyület egyszerűen és gyorsan meghatározható vele, akár nagyon kis mennyiségben is.

Könnyen kapcsolható elválasztástechnikai eszközökhöz, illetve egyéb bonyolultabb

mintabevitelt ellátó készülékhez (termoanalitikai, atomspektroszkópiai) vagy online többféle

detektálású rendszerhez (LC-NMR-MS, LC-DAD-MS, LC-FLD-MS). A kapcsolt rendszerek

segítségével sok komponenst tartalmazó bonyolult mátrixú minta vizsgálata válik lehetővé.

A tömegspektrometriában ionizált részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre

eső tömegük, m/z) szerint csökkentett nyomáson, elektrosztatikus, vagy mágneses mezők

segítségével. Az elválasztott ionok intenzitását folyamatosan mérjük, és így egy ionáram

intenzitás – fajlagos tömeg függvénykapcsolathoz, a tömegspektrumhoz jutunk. A berendezés

fő részei a mintabeviteli egység, interfész, ionforrás, analizátor, detektor, vákuumrendszer,

adatfeldolgozó- és vezérlőegység (1. ábra).

1. Ábra. A tömegspektrométer felépítése.

A tömegspektrométerbe történő mintabevitel lehetséges közvetlenül, direkt módon gáz,

folyadék, vagy szilárd halmazállapotban (off line MS kapcsolás), illetve közvetetten,

kromatográfiás elválasztás (gázkromatográfia, LC, kapilláris elektroforézis) alkalmazásával.

Az ionforrás ionizálja a vizsgálandó molekulákat és eljuttatja azokat az analizátorba. Az

10

analizátor végzi az ionforrásból érkező ionok szétválasztását fajlagos tömegük szerint. A

detektor feladata, hogy az analizátorból kilépő ionok számával arányos intenzitású jelet adjon.

Fontos részét képezi a készüléknek a vákuumrendszer, ami az ionok repüléséhez szükséges

szabad úthosszt biztosítja és minimalizálja az ion-molekula ütközések számát.

Az alábbiakban bemutatom az általam alkalmazott kapcsolt rendszer felépítését és

tulajdonságait illetőleg módszereim irodalmi hátterét.

2.1.1. Ionizációs módszerek

Az ionforrás feladata az, hogy a vizsgálandó molekulából valamilyen gerjesztő energia

(kinetikus, fény, elektromos, stb.) segítségével ionokat hozzon létre és ezeket az ionokat

lehetőleg azonos kinetikus energiával, egy nyalábban, gyorsítva juttassa az analizátorba. Az

ionoptika biztosítja az ionok fókuszálását, az ionnyaláb létrehozását, illetve terelését az

analizátorba. Az alkalmazott gerjesztési energiaformától függően többféle ionforrás létezik,

melyekkel ma már szinte minden vegyület vizsgálata lehetséges. Az elterjedtebb ionizációs

módszerek közé tartozik az elektroporlasztásos ionizáció (electrospray, ESI), valamint az

atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (atmospheric pressure chemical ionization, APCI),

amiket folyadékkromatográfiás kapcsolásnál alkalmaznak. Interfészként egyszerre biztosítja az

oldószer elpárologtatását és az ionizációt.

Az elektroporlasztásos ionizációs technikánál a vizsgálandó komponenst tartalmazó folyadék

egy nagyfeszültségre kapcsolt fém kapillárison keresztül érkezik az ionforrásba. A statikus

nagyfeszültség és a porlasztógáz kis cseppekből álló, elektromosan töltött aeroszolt hoz létre.

Az aeroszol nagy felületi töltéssel rendelkező cseppjei feszültségkülönbség következtében az

analizátor felé haladnak. A folyamatos oldószerpárolgást nitrogén gáz áram és fűtés segíti. Egy

bizonyos cseppméret elérésekor a felületi töltések közötti taszítás nagyobb, mint a cseppet

összetartó feszültség (Raylight-határ), a csepp szétrobban (Coulomb robbanás) és kisebb

cseppek keletkeznek (2. ábra) [1] . A gázfázisú ionok képződésére két fő elmélet létezik. Az

egyik az ion elpárolgási modell (IEM: ion evaporation model), amely szerint a cseppek mérete

addig csökken, míg a felületi töltéstöbblet képes lesz az oldott ionokat a gáztérbe taszítani, azaz

a csepp felszínéről gázfázisú ionok emittálódnak [2,3]. A töltött maradék modell (CRM:

charged residue model) szerint pedig a Coulomb robbanások addig folytatódnak, míg már csak

egy ion marad egy cseppecskében, ebből pedig az oldószer elpárolgása következtében jön létre

a vizsgálandó ion [4,5]. Lágy ionizációs technika, mivel az ionizáció során enyhén

gerjesztődnek a molekulák és kismértékben fragmentálódnak. Ionos, poláris és polarizálható

11

vegyületek vizsgálatára alkalmas, pozitív és negatív ionok előállítására egyaránt képes.

Többnyire protonált vagy protonvesztett molekulaionok keletkeznek, de egyesesetekben

adduktok, forrás fragmens és többszörösen töltött ionok is megfigyelhetők a

tömegspektrumban. Az így keletkezett spektrumból elsősorban molekulatömeg információ

nyerhető.

2. Ábra. ESI technika.

Az APCI ionizációnál a mintakomponenseket szállító folyadékáram egy kapillárison keresztül

érkezik az ionforrásba. A kapillárist körülvevő fűtött térben az elegy nagy hő hatására és

nitrogén porlasztógáz segítségével gázfázisba kerül. A gáz halmazállapotú molekulákat

koronakisülés ionizálja (3. ábra) [6]. A kisülés hatására először a jelenlévő nitrogén molekulák

ionizálódnak (primer folyamat). A nitrogén molekulaionok ütközések által átadják töltésüket

az oldószer molekuláknak (szekunder folyamat) és azok pedig a minta komponenseinek [7]. Az

ionizációban kiemelt szerepe van az oldószer molekuláknak, így a folyadékáram betáplálásnak,

ezért a megfelelő működéshez minimum 100 µl/perc eluens áramlási sebesség szükséges. Ennél

a technikánál is többségében protonált és deprotonált molekulaionok képződnek az

ionforrásban, a keletkező spektrumból molekulatömeg információ nyerhető. Az APCI a kisebb

polaritású molekulák vizsgálatára alkalmas.

12

3. Ábra. APCI technika.

2.1.2. Tömegspektrometriás analizátorok

Az ionforrásból érkező ionok fajlagos tömeg szerinti elválasztásáért az analizátor a felelős. Az

elválasztás többféle elv alapján történhet, méréseimhez Q TRAP rendszerű tandem

tömegspetrometriás készüléket használtam, ami kvadrupól (Q) és ioncsapda (Ion trap) ötvözete,

hibrid analizátorként magában hordozza a kvadrupól és az ioncsapda előnyeit (4. ábra).

4. ábra Q TRAP analizátor felépítése.

A kvadrupól analizátor négy párhuzamosan elhelyezkedő kör vagy hiperbolikus

keresztmetszetű rúdból áll, amikre működés közben egyen- és váltófeszültséget kapcsolnak. A

folyamatosan változó feszültség következtében, olyan elektromos tér alakul ki a rudak között,

ahol az ionok spírális pályán rezegve haladnak. Pályájuk függ m/z arányuktól, az egyenáram

értékétől és a váltóáram frekvenciájától. Az analizátor elektromos terén csak azok az ionok

képesek átjutni (a rudakba ütközés nélkül), amik pályája stabil az adott feszültség értéken. Ezért

a kvadrupól egy adott időpillanatban csak adott m/z értékű ion számára biztosít stabil áthaladást.

A feszültségeket meghatározott értékek között változtatva egy tömegtartomány végig

pásztázható. Felső tömeghatára 2000 Da, felbontása egységnyi.

A Q TRAP tandem tömegspektrometriás (MS/MS) készülékekben három egymás után

elhelyezkedő kvadrupól található, melyek közül az utolsó (Q3) ioncsapdává alakítható. Az

13

ioncsapda összegyűjti és képes tárolni az ionokat. A teljes tömegtartományban érzékeny és

többszörös fragmentációval lehetőséget ad a szerkezetkutatásra (MSn). Az első (Q1) és a

harmadik (Q3) kvadrupól képes pásztázásra (SCAN) és szelektív kiválasztásra (SIM) is, a

második (q2) kvadrupól ütközési cellaként funkcionál. Az ütközési cellában ütközéses

aktivációval fragmentációra késztetik a kiválasztott ionokat. Az ütközési cellában az

elektrosztatikus térrel felgyorsított ionok semleges gázmolekulákkal (esetünkben nitrogénnel)

ütköznek, az ütközésekkel belső energiájuk nő és az energiatöbblet hatására darabokra

hasadnak. A fragmentáció befolyásolható az ütközési energia mértékével, ami az ionok

sebességével arányos, ez pedig az ütközési cella gyorsító feszültségétől függ. Minél nagyobb

az ütközési energia értéke annál több kisebb tömegű fragmension keletkezik, hiszen a nagyobb

tömegű ionok instabilabbá válnak.

A kvadrupólok különböző módú beállításával a hármas kvadrupól rendszer lehetőséget ad

különböző mérési módokra és ezzel változatos szerkezetazonosításra és mennyiségi

meghatározásra alkalmas információt szolgáltat. Q1 vagy Q3 kvadrupólokon végezhetünk

SCAN üzemmódban normál pásztázást, ilyenkor az általunk megadott tartományon végigfutva

megkapjuk a teljes ionáram kromatogramot (TIC, Total Ion Chromatogram). Az idő-intenzitás

diagramból kiválasztva egy pontot kinyerhetjük a tömegspektrumot. Ioncsapda módban

ugyanez a funkció az Enhanced MS Scan (EMS). Kiválaszthatunk szelektíven több iont is

vizsgálatra, ez a Selected Ion Monitoring (SIM), ebben a funkcióban csak a bizonyos általunk

megadott tömegeket engedi át a kvadrupól rendszer. Az utóbbi módszer előnye

érzékenységében rejlik, mert az egész észlelési időtartam alatt csak ezt a pár iont vizsgáljuk,

így több idő jut egy tömegre, több ion jut el a detektorig az adott tömegű ionból, így jóval

kedvezőbb jel/zaj viszony mellett mérünk. Product Ion Scan (PI), illetőleg ioncsapdás

megfelelője Enhanced Product Ion Scan (EPI) módban a Q1 által kiválasztott ionokat az

ütközési cellában ütközőgáz és feszültség segítségével fragmentáljuk, majd a keletkezett

ionokat a Q3 kvadrupólban SCAN funkcióval a teljes tömegtartományon vizsgáljuk (5. ábra).

A módszer alkalmas szerkezetkutatási vizsgálatokra, valamint a mennyiségi meghatározáshoz

elengedhetetlen MRM módszer előkísérleteit képezi.

14

5. Ábra. A product ion scan és enhanced product ion scan módszerek összehasonlítása.

A mennyiségi meghatározások alapját képező egy vagy több kiválasztott fragmentációs út

monitorozása (Selected Reaction Monitoring- SRM, vagy Multiple Reaction Monitoring-

MRM) esetében a Q1 kiválaszt egy „anyaiont”, amit a q2-ben fragmentálunk, majd a Q3 is csak

egy kiválasztott, a vegyületre jellemző fragmensiont enged át (6. ábra). A kétfokozatú szűrés

(anya- és leányion) következtében a kvadrupól rendszer szelektivitása megnő, ezért javul a

jel/zaj viszony, ami miatt nő az érzékenység. Az MRM módszer kedvező érzékenysége

következtében válik a mennyiségi meghatározás legelterjedtebb technikájává.

6. Ábra. Az MRM módszer.

Az érzékenysége tovább javítható kromatográfiás rendszerhez történő kapcsolással. A nem

illékony vegyületek mennyiségi meghatározásának jelentős részét a folyadékkromatográfhoz

illesztett kvadrupól alapú MS/MS módszerek képezik.

2.2. Folyadékkromatográfia

A kromatográfia olyan elválasztási módszer, amelynél a vizsgálandó minta alkotóinak

elválasztása egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező mozgó, fluid fázis közötti

anyagátmeneten, valamint az egyes alkotóknak az állófázissal (és a mozgófázissal) való eltérő

kölcsönhatásán alapszik. A fázisok közötti anyagátmenet hajtóerejét a mintaalkotó két fázisbeli

kémiai potenciálkülönbsége biztosítja. A minta alkotói megoszlanak az állófázis és a

mozgófázis között. Az eltérő erősségű kölcsönhatások, amik lehetnek adszorpció, abszorpció,

15

sav-bázis kölcsönhatások, komplexképzés, H-hidas kölcsönhatás, stb., okozzák a kémiailag

különböző alkotók elválását az állófázison.

A kromatográfiás berendezés általános felépítése: mintaadagoló egység („autosampler”),

folyamatos eluensáramlást biztosító pumpa, kromatográfiás oszlop (ami az állófázist

tartalmazza), jelképző egység (detektor). A kromatográfiás elválasztás eredményeként

megkapjuk a kromatogramot, mely kvalitatív és kvantitatív információkat hordoz. A retenciós

idő, ami az adott komponens injektálásától a detektorba érkezéséig eltelt idő, tartalmazza a

minőségi információt, míg a csúcs alatti terület a mennyiségi információ hordozója. A

mozgófázis halmazállapotától függően beszélhetünk gáz, folyadék vagy szuperkritikus fluid

kromatográfiáról.

A folyadékkromatográfiában a mozgófázis folyadék. Az elválasztás megoszlási hányadosa nem

csak az állófázis minőségétől függ, hanem a folyadékban történő oldhatóságtól is. A

folyadékkromatográfiás módszerek osztályba sorolása történhet az álló- és mozgófázis

minősége alapján. Normál fázisú kromatográfiáról beszélünk, ha az állófázis polárisabb mint a

mozgófázis. Ha a mozgófázis polárisabb az állófázisnál, akkor az a fordított fázisú

kromatográfia.

Gyorskromatográfia

A gyorskromatográfiás (UHPLC) eljárások képezik az elválasztások egyre nagyobb hányadát.

A módszerek elsődleges célja a kromatográfiás idő csökkentése, amit a hatékonyság

növelésével érnek el. Hatékony elválasztást a töltetátmérő csökkentésével, a rövidebb

meghatározási időt pedig a kolonna hossz csökkentésével vagy az eluens lineáris áramlási

sebességének növelésével lehet megvalósítani. Az új rövid kolonnák hossza 2-10 cm, a

kolonnaátmérő 1-3 mm között változik, a töltetek átmérője 3 µm alá csökken és megjelennek a

héjszerű töltetek. A lineáris áramlási sebesség növelésének, a kolonnahossz és a kolonnaátmérő

csökkentésének (térfogati csökkenés) további előnye (a rövidebb mérési időn túl), hogy a

vizsgálandó komponens kevesebb időt tölt a kolonnán, ezért kisebb mértékű a longitudinális

diffúzió. A redukált kolonnatérfogat és szemcseátmérő miatt kisebb a holttérfogat, ami

kevesebb mozgófázis mennyiséget jelent, ez is a mozgófázisban lévő diffúziós úthossz

csökkenéséhez vezet [8]. A diffúziós érték csökkenése következtében az UHPLC-s rendszerek

elválasztásai keskenyebb csúcsokat eredményeznek. A keskeny csúcsokban nagyobb a

csúcsmaximumbeli komponenskoncentráció, kedvezőbb a jel/zaj viszony, ami alacsonyabb

LOQ/LOD elérést eredményez. A héjszerű töltetek alkalmazásával tovább javítható a

hatékonyság. A töltetszerkezetnek köszönhetően jobb a töltet homogenitása, kisebb mértékű a

16

hosszirányú diffúzió, valamint lecsökken a komponensek diffúziós úthossza a vékony porózus

rétegben, ennek következtében gyorsabb a részecskén belüli anyagátadás, összességében tehát

csökken a zónaszélesedés [9]. Hátrányként megemlíthető, hogy a porózus állófázis

mennyiségének csökkentése miatt ezek a rendszerek kisebb visszatartással bírnak és kevésbé

terhelhetők. A technika kapcsolása tandem tömegspektrometriás detektorral nagyszámú

komponens érzékeny meghatározását teszi lehetővé szimultán módon, egymás mellett, rövid

(pár perces) módszerekkel.

A gyorskromatográfiás rendszerek egy új irányát képezik a mikro UHPLC-s elválasztások, a

fejlesztés eredménye: a szűkebb átmérő, még keskenyebbek csúcsok, illetve magasabb az

injektált térfogat - eluens mennyiségarány. A szűk keresztmetszet tovább csökkenti a retenciós

térfogatot, növeli a csúcsmaximumban lévő komponens koncentrációt, ebből kifolyólag jóval

érzékenyebb módszerek kidolgozása lehetséges. A mikro LC kolonnák átmérője 0,3-1,0 mm

között változik, hosszuk 5-15 cm és az alkalmazott áramlási sebesség 1-100 µl/perc (7. ábra).

A gyorskromatográfiás elválasztás és a relatív magas áramlási sebesség rövid (3-5 perc), ezzel

szemben nagy tányérszámmal rendelkező elválasztást biztosít. Egyéb előnye, hogy az MS

detektor ESI ionforrásában csökkenti az ionszuppressziót és javítja az ionizációs hatásfokot

[10–12]. A tömegspektrométer ESI ionizációs érzékenységének növelésével tovább javítható a

kimutatási határ. Viszont APCI technika nem használható, mert a csökkentett áramlási sebesség

nem elegendő az ionizációhoz.

7. Ábra. A különböző kromatográfiás elválasztások geometriai méret alapján történő csoportba sorolása [13].

On-line SPE rendszer

A HPLC módszer érzékenysége - a gyorskromatográfiás elválasztás előnyeinek kihasználásán

túl - javítható az injektált térfogat növelésével, mivel a nagy mintatérfogat nagyobb

anyagmennyiséget eredményez a detektorban. A nagy térfogatú injektálást célszerű on-line SPE

- HPLC kapcsolással megoldani. Az on-line SPE technikánál egy rövidebb, nagy kapacitású

csapdázó kolonna párhuzamos elrendezéssel van kötve az analitikai kolonnával. A két kolonna

17

különböző időben, egymástól függetlenül végzi az elválasztást egy szelepváltó segítségével,

programozott feltételek mellett (8. ábra). A vizsgálandó mintát nagyobb térfogatban egy külön

pumpa segítségével a csapdázó kolonnára injektálják, aminek legfőbb szerepe az analizálandó

komponensek megkötése, fókuszálása és elkülönítése a zavaró mátrixkomponensektől. A

szorpciós lépést követően a megkötött komponenseket az analitikai kolonnára eluálják, ahol

megtörténik az elválasztásuk és végül a vele sorba kötött detektorral meghatározásuk. A

módszer előnye, hogy segítségével megkerülhetők a bonyolult, időigényes minta-előkészítési

lépések, úgy növeli a vizsgálandó komponensek mennyiségét, hogy közben csökken a

mátrixkomponensek mennyisége, azaz javítja a jel/zaj viszonyt, ezáltal az alsó kimutatási

határt. Mivel kevesebb szennyező komponens jut a készülékbe hosszabb távon robusztusabbak

a módszerek [14–17].

8. Ábra. On-line SPE technika felépítése.

A tömegspektrométer kapcsolása folyadékkromatográfhoz többkomponensű rendszerek

vizsgálatát teszi lehetővé, komplex mintából szimultán mennyiségi és minőségi meghatározásra

alkalmas. A kromatográfia végzi a mintaalkotók szétválasztását és elkülönítését a zavaró

komponensektől, ezt segíti az on-line SPE rendszer. A tömegspetrométer feladata a szerkezeti

és mennyiségi azonosítás. A kapcsolás érzékenysége és szelektivitása miatt kis mennyiségek

kimutatására képes, ezért fontos szerepet tölt be környezeti, élelmiszer-, gyógyszeripari és

egyéb más terület mintáinak elemzésében.

A következőkben szeretném bemutatni a dolgozatomban tárgyalt vegyületek irodalmi és

analitikai hátterét, vizsgálatukhoz fontos a megfelelő érzékenység, mert koncentrációjuk az

adott mátrixban rendkívül alacsony. Doktori munkámban ezeknek a vegyületeknek a

meghatározására dolgoztam ki módszereket.

18

2.3. Szteroidhormonok

A szervezet szabályozó mechanizmusait két nagy csoportba oszthatjuk: az ősibb, lassúbb

köthető a hormonrendszerhez, míg a fiatalabb, gyorsabb típusú reakcióválasz az idegrendszer

feladata. A hormonrendszer működését belsőelválasztású mirigyek szabályozzák, amik a sejtek

működését befolyásoló kémiai anyagokat (hormonok) juttatnak a vérbe. A hormonok

szerkezetük alapján három csoportba sorolhatók: peptidek, aminosav származékok és

szteroidok. Működési mechanizmusuk során a véráramban eljutnak a célsejthez, ahol a sejt

felszínén lévő receptorokhoz kötődve befolyásolják az adott sejt anyagcsere folyamatát,

lassítják vagy gyorsítják azt.

A szteroidhormonok a koleszterinből levezethető szteránvázas szerves vegyületek. A szervezet

különböző mirigyrendszerei (agyalapi mirigy, mellékvese, ivarmirigyek) állítják elő. A

szteroidok bioszintézisét a citokróm P450 (CYP) enzimek és a hidroxiszteroid dehidrogenázok

(HSD) végzik a sejtek mitokondriumában és a sima endoplazmás retikulumban [18] 9. ábra.

A szteroidhormonok fontos szerepet töltenek be az emberi test működésében, irányítják az

immunrendszert, a só és víz egyensúlyt, a gyulladáscsökkentésért felelős reakciókat, a

metabolizációt, a szexuális fejlődést és a test ellenálló képességét [19]. Fiziológiai hatásaik

miatt diagnosztikai jellegű vizsgálatuk képet adhat a szervezet állapotáról, markervegyületei

kritikus betegségeknek: veleszületett mellékvese-megnagyobbodás, mellékvese elégtelenség,

Cushing szindróma, hyperandrogenismus, korai adrenarche, hirsutizmus, különböző tumorok,

egyéb endokrin állapotok [20]. Külön stresszmarker vegyületként szokták vizsgálni a kortizont

és a kortizolt.

19

9. Ábra: A szteroidok bioszintézise. [18]

Nemi hormonok

A nemi hormonok olyan szteroid molekulák, amik elsősorban a nemi jelleg, a nemi jelleg

kifejlődése, a reprodukciós képesség és a növekedés kontrollálásában játszanak meghatározó

szerepet. A nemi hormonok közül kulcsfontosságú funkciókat rendelnek az ösztrogéneknek és

a tesztoszteronnak. Az ösztrogének a női nemi jellegért felelősek és három formában vannak

jelen: ösztron (E1), ösztradiol (E2) és ösztriol (E3). Az ösztrogének a petefészkekben, valamint

a mellékvesékben termelődnek, az androszténdion és a tesztoszteron átalakításával (10. ábra),

illetőleg az agy képes az ösztrogén előállítására koleszterinből endogén módon.

20

10. Ábra. Az ösztrogének bioszintézise.

Az ösztrogéneknek számos feladata ismert: hatással vannak az agy bioenergetikai rendszerére;

szerepük van a keringési rendszerben, az immunrendszer működésében, a bőr és csontok

növekedésében; a zsírok és szénhidrátok metabolizmusában, irányítják a szaporító szervek

fejlődését, a petefészek, méh és emlőmirigy működését; fontosak a terhesség lefolyása közben;

hozzájuk kapcsolható a csontfelszívódás mechanizmusa, az Alzheimer-kór, Parkinson-kór,

autoimmun betegségek, stroke megelőzése [21–24]. A tesztoszteron az egyik legfontosabb

androgén a férfiakban és a nőkben. A férfi fenotípus kifejlődésében és fenntartásában kiemelt

szerepe van, általános növekedési hormon, koncentrációszintje erősen meghatározza a

pszichológiai magatartásformát (agresszió, versengő magatartás, dominancia, nyitottság,

kalandvágy) [25–28].

A nemi hormonok nem megfelelő koncentrációja komoly betegségek kiindulópontja lehet, ezért

koncentrációjuk pontos ismerete és mérése kiemelkedően fontos a diagnosztikában és terápiás

kezelésekben. Hypogonadismus [29], policisztás ovárium szindróma [30], korai vagy késő

pubertás [31], nemiszervekhez köthető rákok [32], diabétesz, csontritkulás, szív és érrendszeri

megbetegedéseknél a vegyületek mennyiségének maghatározása igazolhatja vagy cáfolhatja a

diagnózist. Az endogén ösztrogének koncentrációja a szervezetben extrém alacsony értékeket

21

vesz fel (1. táblázat). A tesztoszteron mennyisége ezzel szemben betegségtől függően változhat,

egészséges referenciaszintje 2,4-9,5 ng/ml [33]. Az alacsony koncentrációszint, a szűk

egészséges tartomány érzékeny, pontos és megbízható analitikai eljárást indokolnak.

Vizsgálandó vegyület referenciatartomány (ng/ml)

Nők (menopauza után) Férfiak

Ösztradiol 0,03-300 (<15) 0,008-0,035

Ösztriol <0,08 <0,07

Ösztron 0,017-0,2 (0,007-0,04) 0,01-0,06

1. Táblázat. Az egészséges egyének özstrogén szérumszint referenciatartománya. Referencia tartomány a

Mayo Clinic (Mayo Medical Laboratories), Rochester 2017 Interpretive Handbook alapján [34].

2.3.1. Szteroidhormonok analitikai meghatározása

Az elmúlt évtizedekben számos tudományos cikk született ezeknek a komponenseknek, nyálból

(valós idejű szint), szérumból, vizeletből (napi – napszaki átlagos szint) és hajból (hosszabb

távú monitorozás) történő meghatározásával [14,35–47]. A vizsgálandó mátrix és a benne lévő

meghatározandó komponens mennyisége behatárolja a minta-előkészítés lépéseit és az

analitikai módszer elvárt teljesítményjellemzőit.

Az elterjedtebb technikák közül elsőként említeném az immunoassay módszereket. Az antitest-

antigén kölcsönhatás szelektivitását kihasználva mennyiségi meghatározáshoz enzim

immunoassay (enzyme immunoassay – EIA) és radio immunoassay (RIA) módszereket

találhatunk az irodalomban [48]. Az immunoassay módszerek előnye gyorsaságukban és

egyszerűségükben rejlik, hátrányuk viszont, hogy pontatlanok és a mérések ismételhetősége

rossz. Az esetek többségében interferenciával és fals pozitív eredménnyel szolgálnak, ez

különösen igaz, ha metabolitok is jelen vannak a rendszerben.

Hormonok mérésére az 1960-as évektől találunk GC-MS (gázkromatográfhoz kapcsolt

tömegspektrométer) módszereket. A GC technikával az illékony komponensek vizsgálhatók

(olyan vegyületek, amik az injektor hőmérsékletén kémiai változás nélkül elpárologtathatók),

mivel a vegyületek nem illékonyak, ezért gázkromatográfiás vizsgálatukhoz származékolás,

általában szililezés szükséges [49]. A szteroidok hidroxi csoportját származékolják trimetil-

szilil, egyéb alkil-szililéterek, N, O-bisz(trimetilszilil) trifluoroacetamid (BSTFA), N-metil-N-

(trimetilszilil)trifluoroacetamid (MSTFA) vagy a heptafluorobutil-anhidrid (HFBA)

vegyületekkel. A GC-MS módszerekkel elérhető kimutatási határ teljesíti az elvárt értékeket.

Az eljárások hátránya a munkaigényes és bonyolult minta-előkészítés, a származékolás és a

hosszú mérési idejű (30 perc) kromatográfiás elválasztás.

22

A korszerű eljárások közé tartozó HPLC-MS meghatározások teszik ki az irodalmi példák nagy

részét [18,50]. Az LC-MS/MS előnye az immunoassay technikákkal szemben, hogy 1)

kevesebb mátrix interferencia tapasztalható, 2) lehetséges egyszerre egyidőben több

komponens vizsgálata, 3) nagyobb a szelektivitása, az érzékenysége, a pontossága és a

precizitása [20,51,52]. A GC-MS módszereket a rövidebb vizsgálati idő és a származékolás

mellőzhetősége miatt előzi meg. Az LC-MS/MS alapú vizsgálatok minta-előkészítése

extrakcióból, tisztításból és koncentrálásból áll. Vér analízisnél az első lépése a fehérjekicsapás,

illetve a kötött szteroid forma felszabadítása. Ezt követi valamilyen extrakciós lépés, szilárd

fázisú extrakció (SPE) vagy folyadék-folyadék extrakció (LLE). Az LLE oldószerei etil-acetát,

metil-terc-butil-éter (MTBE), dietil-éter, diklórmetán vagy különböző szerves oldószerek

keveréke. Az SPE minta-előkészítésekhez hidrofób polimer tölteteket használnak hatékony

extrakciós tulajdonságaik miatt. Az elúciót illékony, könnyen elpárologtatható, apoláris

oldószerekkel végzik. A publikált módszerek alkalmasak kis koncentrációjú szteroidok

szimultán, szelektív kimutatására, de rendkívül alacsony mennyiségek meghatározása kihívást

jelent. Az extrém alacsony hormonkoncentrációk meghatározásának egyik módja a

komponensdúsítás. A meghatározandó komponens koncentreciója növelhető LLE [53–55]

vagy SPE utáni oldószer bepárlással. Az SPE előnye az LLE-val szemben a variabilitása és a

tisztítási hatékonysága, nagy mintatérfogat extrahálásával drasztikusan növelhető a mérendő

komponens koncentrációja [56–59]. Egy másik alternatíva a tömegspektrométer

érzékenységének növelése az ionizáció hatásfok javításával, ami speciálisabb ionizációs

technika alkalmazásával vagy a meghatározandó komponens reaktív átalakításával

(származékolás) lehetséges [60–62]. Az ESI-ben permanens töltéssel vagy könnyen ionizálható

csoporttal, APCI-ban nagy proton vagy elektron affinitású csoporttal bővítik a molekulákat. Az

ionizációs hatékonyság növelésére a szteroid molekulák fenolos hidroxilcsoportjának

pentafluorobenzil (PFB), piridil-3-szulfonil (PS), danzil (D), 2-pikolinoil (P), N-metil-2-

piridinil (NMP), N-metil-nikotinoil (NMN), 1-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-4,4-piperanizil

(MPPZ), 3-pentaflurobenzil-17β-piridinium (PFBPY) és 1,2-dimetilimidazol-5-szulfonil

(DMIS) reagensekkel történő származékolása nagyban javítja az érzékenységet [63–65]. APCI

és APPI körülmények között a szteroid molekulák nagy része intenzívebb válasz jelet

eredményez. Ezért számos cikkben az alacsony kimutatás határértéket APCI módszerek

kidolgozásával érik el. Az APPI egy viszonylag újabb ionizációs technika, az ionképződés egy

adalékanyag fotoionizációjával kezdődik, ami ionizálja a nem poláros molekulákat

protontranszferrel és töltésátadással. Ígéretes lehetőségeket kínál, de mivel az APPI kevésbé

23

elterjedt, ezért a publikált cikkek között is kevés alkalmazást találhatunk [66,67]. Az egészséges

egyének szérum hormonszint referencia tartományát tartalmazza a 2. táblázat.

Vizsgálandó vegyület referenciatartomány (ng/ml)

11-deoxikortikoszteron <0,1

11-deoxikortizol 0,1-0,79

17-hidroxiprogeszteron <2,2

21-deoxikortizol <0,05

aldoszteron 0,21

androszténdion 0,5-2,25

dihidrotesztoszteron <0,3

kortikoszteron 0,53-15,6

kortizol 50-250

kortizon 9-28

pregnenolon 0,33-2,48

progeszteron <0,2

tesztoszteron 2,4-9,5

2. Táblázat. Az egészséges egyének szérum hormonszint referenciatartománya. Referencia tartomány a Mayo

Clinic (Mayo Medical Laboratories), Rochester 2017 Interpretive Handbook alapján [34].

2.4. Nem-szteroid gyulladáscsökkentők

Az akut vagy krónikus gyulladás a szervezet komplex biológiai válasza különböző külső és

belső okok által kiváltott szövetkárosodásra. A gyulladás célja megakadályozni a

szövetkárosodás tovább terjedését, esetlegesen a kórokozó eltávolítása és ártalmatlanítása, a

károsodott szövetrészek eltávolítása és a gyógyulási folyamat elindítása. A szervezet gyulladási

mechanizmusa normál esteben hasznos és nélkülözhetetlen, azonban a szervezet túlzott,

krónikus gyulladt állapota káros hatású. A gyulladás káros hatásait gyulladáscsökkentők

segítségével lehet megakadályozni, amik közül a legelterjedtebbek a nem-szteroid

gyulladáscsökkentők (NSAID). A nem-szteroid gyulladáscsökkentőket a WHO által ellenőrzött

ATC rendszerben (Anatomical Therapeutic Chemical Classification System) az M01A jelzésű

„Nem-szteroid gyulladásgátlók és reumaellenes készítmények” között találhatjuk. Ide tartoznak

az ecetsav-származékok (indometakin, diklofenák), szalicilátok (acetilszalicilsav, szalicilsav),

oxicamok, propionsav-származékok (ibuprofén, naproxen, flurbiprofén, fenoprofén,

ketoprofén), antranilsav-származékok, coxibok és egyéb nem-szteroid gyulladáscsökkentők

(acetaminofen) (11. ábra).

24

11. Ábra: Nem-szteroid gyulladáscsökkentők

Hatásmechanizmusuk azon alapul, hogy blokkolják a ciklooxigenáz enzimeket (COX).

Gyulladásos inger esetén a sejtmembránban arachidonsav keletkezik foszfolipáz-A2 enzim

hatására. Az arachidonsavból a COX hatására prosztaglandinok (PGE2, PGF2, PGD2)

képződnek. A ciklooxigenáz enzimnek két fajtája van, a COX-1 és COX-2 enzim. A COX-1

enzim állandóan jelen van a szervezetben (pl. gyomornyálkahártya, thrombocyták, vese, erek)

és szintetizálja az élettani folyamatok szabályozásáért felelős prosztaglandinokat. A

prosztaglandinoknak komoly szerepük van a gyomor védelmében, vérlemezkék előállításában

és csökkentik a véralvadást. Ezért termelődésük gátlása növelheti a szívroham, a gyomorfekély

és a vérzés kialakulásának esélyét. A COX-2 a gyulladás helyén keletkezik gyulladásos

mediátorok hatására, a gyulladás, a fájdalom és a láz kialakulásában lényeges PGE2

prosztaglandin szintézisében van szerepe. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek

nem egyforma mértékben, de egyaránt gátolják a COX-1 és a COX-2 enzimeket, ezzel kifejtve

gyulladáscsökkentő, fájdalomcsillapító és lázcsökkentő hatásukat. A terápiás hatékonyság, a

mellékhatások és a tolerálhatóság jelentősen változó az egyének és a vegyületek között.

25

2.4.1. Nem-szteroid gyulladáscsökkentők analitikai meghatározása

A NSAID vegyületek, metabolitjaik és degradációs származékaik meghatározására különböző

módszereket változatos analitikai technikákkal találhatunk az irodalomban: spektrofotometriás

[68], spektrofluorimetriás [69], NMR [70], gázkromatográfiás és GC-MS [71], SFC-MS [72],

HPLC-MS [73–76]. A folyadékkromatográfhoz kapcsolt tömegspektrométer technika képes

teljesíteni az FDA és EPA iránymutatásai által előírt detektálási és meghatározási kritériumokat

megfelelő szelektivitással, pontossággal és megbízhatósággal gyógyszeripari (például klinikai

vizsgálatok) [73,77–79] és környezet analitikai (felszíni víz, felszín alatti víz, kezelt és

kezeletlen szennyvíz, ivóvíz, talaj) [74,75,80–84] vizsgálatoknál. A módszerek közül a

környezeti alkalmazások speciális analitikai teljesítményjellemzőket igényelnek, különösen az

érzékenység és a szelektivitás tekintetében, mivel rendkívül alacsony koncentrációszinteket

kell meghatározni általában erős zavaró mátrixhatás mellett. Környezeti minták

meghatározásakor a publikált alacsony kimutatási határral rendelkező analitikai módszerek

közül a legtöbb relatív nagy mintatérfogattal dolgozik és folyadék-folyadék extrakcióval (LLE)

vagy szilárd fázisú extrakcióval (SPE) dúsítja a vizsgálandó komponenst a minta-előkészítés

közben [81,85–91]. Az EPA 1694:2007 szabvány leírása foglalkozik környezeti minták

gyógyszermaradványainak meghatározásával. A folyadék halmazállapotú minták (felszíni víz,

kezelt szennyvíz, ivóvíz) elemzésénél 1 liter mintatérfogat kezelését és szilárd fázisú extrakciót

javasolnak minta-előkészítésként. A szabványban acetaminofen (LOQ: 200 ng/L), ibuprofén

(LOQ: 50 ng/L) és naproxen (10 ng/L) esetén határoznak meg LOQ értékeket [92].

26

2.5. Teljesítményjellemzők validálása

A kidolgozott módszerek teljesítményjellemzőit az általános analitikai validációs elvárások és

a Food and Drug Administration (FDA) “Guidance for Industry, Bioanalytical Method

Validation” [93] irányelveinek és kritériumrendszerének megfelelően jellemeztem és

validáltam. A validálás eredményeinek bemutatása a következő jellemzőkre: szelektivitás,

LOD, LOQ, megbízhatóság, visszanyerés, mátrixhatás és stabilitás korlátozódik.

Szelektivitás

A módszer szelektivitása az adott mátrix (háttér) és az LOQ szintjén addicionált mátrix

kalibrációs pont kromatogramjainak összehasonlításával határozható meg. A vizsgálandó

komponensek retenciós idejénél, a mátrixban tapasztalható zaj mértéke határozza meg a

szelektivitást, összevetve azt az addicionált mátrixszal, a jel/zaj viszonynak nagyobbnak kell

lennie mint 5. Az eredmény elfogadhatónak tekinthető, ha ez az arány legalább 5 mérésnél

teljesül.

Kalibrációs egyenes linearitása, LOD és LOQ

A kalibrációs egyenes pontjai ismert koncentrációban előállított oldatok csúcs alatti

területeinek értékelésével kaphatók, a területek koncentráció függvényében ábrázolva. A

mennyiségi meghatározáshoz használt kalibrációs egyenest a kalibrációs pontok halmaza

alkotja a teljes mérési intervallumban arányosan elosztva, 5 párhuzamos mérés átlagából

számítva. A kalibrációs pontok elfogadhatók, ha eltérésük a névleges koncentrációktól kisebb

mint 15%. Az egyenes lineárisnak és alkalmasnak tekinthető, ha a korrelációs együttható (R)

értéke meghaladta a 0,995-t. A detektálás alsó határaként (LOD) az a legkisebb koncentráció

definiálható, ahol teljesül a 3/1-es jel/zaj viszony. A mennyiségi meghatározás alsó határának

(LOQ) az a koncentráció tekinthető, ahol minimum 10/1 a jel/zaj viszony, valamint a mérés

relatív szórása maximum 20%, a kalibrációból visszaszámolt koncentrációnak a névleges

koncentrációtól való eltérése pedig relatív maximum 20%.

Helyesség és precizitás

A napon belüli és napok közötti szórás és precizitás vizsgálathoz 3 quality control (QC) minta

mérése szükséges különböző koncentrációszinten (alacsony, közepes, magas) 5 ismétléssel, egy

napon belül és négy egymást követő napon frissen előkészítve külön-külön. A napok közötti

QC minták koncentrációjának meghatározása csak friss, napi kalibrációval igazolható. A

módszer helyessége a relatív hibából (RE), a precizitás pedig a szórásból (CV) számolható.

27

Mátrixhatás és visszanyerés

A visszanyerés vizsgálatkor a minta-előkészítés közben bekövetkező anyagveszteség

mértékének és okának meghatározása a cél. A visszanyerés értékének megállapításához

összehasonlítandó egy előkészített mátrixhoz adott kalibrációs oldat csúcs alatti területe - egy

ugyanolyan koncentrációjú minta-előkészítés utáni kalibrációs oldat csúcs alatti területével. A

mátrixhatás tanulmányozásakor azonos koncentráció mellett kell összehasonlítani egy vizes

standard kalibrációs oldatot ̶ egy előkészített mátrixhoz adott kalibrációs oldattal. Mindkét

meghatározás 5-5 ismétlés átlagának eredménye. Amikor a csúcs alatti területek aránya 85 és

115% közötti értéket ad a mátrixhatás elhanyagolhatónak vehető.

Stabilitás

A komponensek stabilitásvizsgálatához a fent említett három koncentrációszinten elkészített

QC mátrixos minták használtók különböző tárolási körülmények között: rövidtávú stabilitás

(12 h) szobahőmérsékleten; hosszútávú stabilitás -20 °C-on 14 napig; három lefagyasztás –

felolvasztás ciklus utáni stabilitás; előkészített minták stabilitása 24 órán keresztül 20 °C-on (az

„autosampler” körülményei között). A különböző tárolási körülményeknél 5 párhuzamos

kísérlet végzendő. A komponensek stabilaknak tekinthetők a mátrixban és előkészítve az

„autosampler”-ben, ha az eredmények a frissen készített kalibrációval mérve teljesítik a

nominális értéktől vett ±15%-os kritérium határt.

A módszerek teljesítményjellemzőinek minősítése és az eredmények megbízhatóságának

bizonyítása egyéb alternatív validálási megközelítéssel is lehetséges. Eltérések lehetnek a

validálási irányelvek között. Választásom azért esett az FDA kritériumrendszerére, mert

tartalmazza az általános validációs elvárásokat, illetőleg módszereim többsége közvetlenül

klinikai felhasználású.

Az „érzékenység” kifejezés egy adott mennyiség (vagy koncentráció) és arra adott válaszjel

hányadosaként definiálható, illetve az összefüggés ábrázolásánál az egyenes iránytangenseként

értelmezhető. Munkámban ezt a megközelítést kiegészítettem jel/zaj viszony tartalommal és az

„érzékenység”-et általános tág értelmezésben használom.

28

3. Felhasznált anyagok és készülékek

3.1. Felhasznált anyagok

A szteroidok meghatározásánál nagytisztaságú 11-deoxikortikoszteron, 11-deoxikortizol, 17-

hidroxiprogeszteron, 21-deoxikortizol, aldoszteron, androszténdion, dihidrotesztoszteron,

kortikoszteron, kortizol, kortizon, ösztron, ösztradiol, ösztriol, pregnenolon, progeszteron,

tesztoszteron és kortizol-D4 (≥98%, Sigma–Aldrich Chem. Co., St. Louis, MO, USA)

felhasználásával végeztem a kísérleteket. A vizsgálati alanyok vér mintáit az MTA-SE Lendület

Örökletes Endokrin Daganatok Kutatócsoport biztosította.

A gyulladáscsökkentők meghatározását nagytisztaságú acetaminofen, acetilszalicilsav,

diklofenák, fenoprofén, flurbiprofén, ibuprofén, indometakin, ketoprofén, naproxen, szalicilsav

(≥98%, Sigma–Aldrich Chem. Co., St. Louis, MO, USA) felhasználásával végeztem. Az ivóvíz

mintákat Budapest különböző pontjain a hálózati rendszerből vettem, a felszíni vizek Budapest

régiójában a Dunából származnak, a szennyvíz minták mintavételi helye a Nyírségvíz Zrt.

szennyvíztisztító telepe.

Eleuns készítéshez és az extrakciókhoz metanolt, acetonitrilt (VWR International,

Fontenaysous-Bois, France), hangyasavat, etil-acetátot, 25%-os ammónia oldatot (Reanal

Gyógyszer- és Finomvegyszergyár Zrt., Budapest, Hungary) és MilliQ készülékkel előállított

ultratiszta vizet (MilliQ Purification System from Millipore, Bedford, MA, USA) használtam.

Minden egyéb felhasznált anyag legalább analitikai tisztaságú és kereskedelmi forgalomban

kapható.

A származékolást ösztrogének meghatározásánál danzil-kloriddal végeztem (≥98%, Sigma–

Aldrich Chem. Co., St. Louis, Missouri, USA), Na2CO3 (Sigma–Aldrich Chem. Co., St. Louis,

Missouri, USA) jelenlétében.

3.2. Szteroidmentes szérum készítése

A szteroidmentes szérumot aktívszenes extrakció útján nyertem [94]. 0,8 g aktívszenet adtam

100 ml szérumhoz, 2 órán keresztül rázattam, majd 3 órán át 3000 rpm-on (1600 ×g)

centrifugáltam. A felülúszó szérumot végül 0,22 µm Millex-GS fecskendőszűrő segítségével

leszűrtem.

29

3.3. Felhasznált készülékek

Méréseimhez Perkin Elmer Series 200 micro HPLC rendszerhez (Perkin Elmer, Massachusetts,

USA); illetőleg 2 és 5 µl-es mintaadagoló hurokkal ellátott PAL System injektoros (CTC

Analytics, AG, Switzerland) Eksigent MicroLC 200 UHPLC-hez (Sciex, MA, USA) kapcsolt

QTRAP 6500 hármas kvadrupól – lineáris ioncsapdás tömegspektrométert (Sciex, MA, USA)

használtam. Az adatok értékelését és a készülék irányítását 4.1-es Eksigent Control szoftver

(Sciex, MA, USA) és 1.6.2. Analyst szoftver (Sciex, MA, USA) segítségével végeztem.

A kísérleteknél felhasznált egyéb vegyszereket és készülékeket, illetőleg a módszerek

paramétereit az adott kísérleti részben részletesen tárgyalom.

30

4. Célkitűzés

Doktori munkám elsődleges célja különböző érzékenységnövelő megoldások bemutatása

HPLC-MS/MS mennyiségi meghatározásoknál. Az LC-MS/MS rendszer érzékenységnövelése

új lehetőségeket teremt nagyon alacsony koncentrációjú komponensek elemzésére. Rutin

analitikai meghatározásoknál egyszerűsítheti a minta-előkészítést, aminek vizsgálati idő- és

költségcsökkentő vonzata van. Segíthet továbbá olyan esetben, amikor nem áll

rendelkezésünkre a legmodernebb technika, de a vizsgálati probléma megkívánja az alacsony

koncentrációban jelenlévő komponensek kimutatását. Az analitikai meghatározások kimutatási

és meghatározási határait ezért a HPLC-MS/MS rendszer felől közelítem, elsősorban

folyadékkromatográfiás és tömegspektrometriás fejlesztésekkel foglalkozom. A

kromatográfiás megoldásaim célja a vizsgálandó komponens koncentrációjának növelése a

kromatográfiás sávban és elválasztása a mátrixtól, a tömegspetrométerben pedig a maximális

iontranszmisszió elérése a célom.

Dolgozatom másodlagos célja az érzékenységnövelő megoldások gyakorlati felhasználása

validált módszerek kidolgozásához klinikai laboratóriumok számára. A publikált módszereknél

érzékenyebb, egyszerűbb és gyorsabb eljárások fejlesztése, amik teljesítik a rutin

laboratóriumok által megkövetelt megbízhatósági és reprodukálhatósági elvárásokat. Ezért

feladatnak tekintem a módszerek teljesítményjellemzőinek minősítését és igazolását.

Módszereim kidolgozásában ezeket a célokat tartottam fontosnak és ennek megfelelően

vizsgáltam az eljárások alkalmazhatóságát.

31

5. Kísérleti rész

5.1. A mikro LC szerepe az érzékenységnövelésben és a mintahígítás

hatása nagy mintatérfogat injektálása esetén

5.1.1. A kutatás háttere

Az elmúlt években rohamosan nő a mikro LC jelentősége és gyakorlati felhasználása klinikai,

élelmiszer, környezeti, proteomikai és gyógyszeripari meghatározások esetén [95–99]. Ahogy

azt már az általános irodalmi részben is említettem, legfőbb előnye, hogy alacsonyabb

kimutatási és meghatározási határok érhetők el vele, mert kisebb a minta hígulása a

kromatográfiás oszlopon. Ellenben a kolonna belső átmérőjének csökkentése kihatással van az

elválasztás kinetikai hatékonyságára és az injektálható mintatérfogatra [100–102]. Nagy

térfogat injektálása a mikro LC kolonnára széles csúcsokat eredményezhet, sőt erős

mintaoldószernél akár komponensáttörés is megfigyelhető, főleg olyan komponensek esetén,

amiknek kicsi az affinitásuk a kolonnához [103,104]. A kiszélesedett csúcsok csökkentik a

felbontást, integrálásuk nehézkes és pontatlan lehet, továbbá csökkentik az érzékenységet

hiszen romlik a jel/zaj viszony [105].

Friss kutatások gyakorlati megközelítéssel tárgyalják az összefüggéseket az injektálható

térfogat, kolonna térfogat, gradiensprofil és mintaoldószer erőssége között [106–108]. Az

injektálható térfogat függ a kolonna holttérfogatától és a vizsgálandó komponens mintaoldószer

és mozgófázisbeli oldhatósági viszonyától, illetőleg a kolonna előtti térben kialakult elegy

oldószererősségétől. A szemcsék minősége is kihat az injektálható térfogat mennyiségére, a

héjszerű töltetek kiváló hatékonysággal rendelkeznek a porózus töltetekkel szemben, a

kinetikus hatékonyság keskenyebb csúcsokat eredményez, de a lecsökkentett porózus térfogat

miatt érzékenyebbek a minta túlterhelésre [109]. Az injektálási térfogat hatását vizsgálták a

kinetikai hatékonyságra különböző hosszúságú (50, 100 és 150 mm) Kinetex UHPLC

kolonnákon és azt találták, hogy a rövidebb kolonnák elválasztási hatékonysága érzékenyebb a

mintatérfogat növelésére [110].

Az injektálási térfogat növelhető kolonna elején történő fókuszálással, ilyenkor a minta

oldószererőssége gyengébb mint a mozgófázisé [111–114]. Egy másik lehetőséget Gritti és

társai tanulmányoztak, ha az injektálást vízdugó követi, az fókuszálja a komponenseket a

kolonna elején és megakadályozza a csúcsszélesedést [115]. A „teljesítményoptimált injektálási

szekvencia” (POISe) technika egy különös megoldás a hagyományos technikákhoz képest, a

32

mintaoldatot egy gyenge oldószererősségű oldattal keverik össze az injektáláskor még a

kolonna előtt. Azt tapasztalták, hogy ha gyengébb oldószer meghatározott mennyiségben követi

a mintaoldatot az injektorban, szignifikánsan csökken a csúcsszélesség [116]. D’Ozario és

társai kapilláris kolonnákat töltöttek két különböző állófázissal, a kolonna elején egy rövid

szakasz szolgálta a minta komponensek fókuszálását, a második szakaszon pedig az elválasztást

végezték [117]. Lineáris gradiens [118] vagy ugrásszerű gradiens [119] alkalmazása is

fókuszáló hatású, ilyenkor gyenge erősségű eluensbe injektálva a mintát, a minta komponensei

fókuszálódnak a kolonna elején.

Ha ciszonylag nagy mintatérfogatot injektálunk erős oldószerből, még az előző technikák

alkalmazása mellett is kiszélesedett csúcsokat kaphatunk. Elegendően erős mintaoldószernél

nagy térfogat injektálásakor a mintadugó előtt és mögött haladó mozgófázis nem képes kellően

elegyedni és meghígítani a mintát, hogy megakadályozza a csúcsszélesedést. Az erősebb

oldószerben (mintadugóban) áramló komponensek kisebb retenciós idővel gyorsabban jutnak

végig a kolonnán, mint azok, amelyek a kihígult sávban az eluens összetételnek megfelelő

migrációs sebességgel haladnak [106]. A nagyobb retenciós faktorral rendelkező molekulák

erősebb affinitással rendelkeznek az állófázis irányába, így akár erősebb oldószernél is kellő

gyorsasággal képesek a mintaoldószer dugóból kijutni. Ezért ők kevésbé érzékenyek az előző

hatásokra. Tehát a később eluálódó komponensek nagyobb injektálási térfogatot tesznek

lehetővé [108,120,121].

Biológiai mátrixok extrakció utáni analízisekor a rendkívül alacsony koncentrációjú

komponensek meghatározása megkívánja a nagy mintatérfogat injektálását, akár erős

mintaoldószerből is. Ilyenkor különös figyelmet kell fordítani a megfelelő kolonna paraméterek

és elúciós körülmények meghatározására, hogy a legnagyobb vizsgálandó

komponensmennyiséget tudjuk koncentráltan eljuttatni a detektorig. A kutatás célja, a mikro

LC érzékenységnövelési lehetőségeinek feltárása és a mintaoldószer összetételének optimálása,

biológiai mintákból történő szteroidhormon meghatározásakor, a szerves oldószerrel végzett

fehérjekicsapást követően.

5.1.2. Törzs-, kalibrációs- és tesztoldatok készítése

A törzsoldatokat a különböző szteroidok (androszténdion, kortizol, progeszteron és

tesztoszteron) metanolban oldásával készítettem 1 mg/ml koncentrációban. A tesztoldatokat a

törzsoldatok összekeverésével és 4 lépcsőben vízzel, metanollal vagy acetonitrillel hígítva

állítottam elő 100-100 ng/ml koncentrációban. Ezekkel az oldatokkal végeztem a kolonnák

33

tesztelését. A kalibrációs oldatokat 10; 25; 100; 500; 1000; 5000 ng/ml koncentrációban a

törzsoldatok elegyítésével, majd vízzel hígítva készítettem.

5.1.3. Szérumminták és kalibrációs szérumoldatok készítése

A kalibrációs szérumoldatokat 10 µl kalibrációs oldat és 90 µl szteroidmentes szérum

összekeverésével majd 300 µl ACN vagy MeOH hozzáadásával készítettem. Kétszer egy percig

vortex segítségével kevertettem majd 12500 rpm (15000 ×g) fordulaton 20 percig

centrifugáltam és a felülúszót vizsgáltam. A szérumminták előkészítése az előbb bemutatott

módon ugyanúgy zajlott, 90 µl szérumhoz 10 µl vizet adtam.

5.1.4. Mikro UHPLC körülmények

A kromatográfiás elválasztást gradiens elúcióval végeztem, eluensként 0,1% hangyasavas vizet

(A eluens) és 0,1% hangyasavas acetonitrilt (B eluens) használtam. A program 0,2 perc 10% B

izokratikus szakasszal indult, 1,2 perc 90% B izokratikus szakasszal zárult. A köztes gradiens

szakasz a 150 mm hosszúságú kolonnánál 1,8 perc, az 50 mm hosszúságúnál 0,6 perc volt.

Végül a kezdeti izokratikus szakaszt visszaállítottam és ekvilibráltam a kolonnát 0,9 percen

keresztül. Az áramlási sebesség a 0,3 mm átmérőjű kolonnánál 15 µl/perc, a 0,5 mm átmérőnél

40 µl/perc volt. A kolonnatér hőmérsékletét 30 °C -ra állítottam. A kísérletekben Eksigent, 3

µm, ChromXP C18CL, 120 Å, 150 × 0,3 mm (KolonnaA); Eksigent, 2,7 µm, HALO Fused-

Core C18,90 Å, 50 × 0,3 mm (KolonnaB); Eksigent, 2,7 µm, HALO Fused-CorePhenyl Hexyl,

90 Å, 50 × 0,5 mm (KolonnaC) mikro kolonnák tulajdonságait vizsgáltam.

5.1.5. Tömegspektrometriás körülmények

A méréseket pozitív ESI körülmények között végeztem a következő ionforrás paraméterekkel:

gázfüggöny (curtain gas, CUR): 20 egység; ionizációs feszültség (ionspray voltage, IS): 5000

V; ionforrás hőmérséklet: 200 °C; porlasztó gáz (nebulizer gas, GS1): 15 egység; szárító gáz

(GS2): 20 egység. A tömegspektrometriás paraméterek optimálása után a komponenseket

MRM módban vizsgáltam 35 ms figyelési idővel (dwell time), 35 eV ütközési energiával,

ütközőgáznak nitrogént használtam. Az MRM átmenetek: kortizol m/z 363 → 267 és m/z 363

→ 159; tesztoszteron m/z 289 → 109 és m/z 289 → 97; androszténdion m/z 287 → 97 és m/z

287 → 109; progeszteron m/z 315 → 297 és m/z 315 → 109.

34

5.1.6. Injektálási körülmények

Különböző mintatérfogatokat 50 nl-től 5 µl-ig injektáltam víz, metanol és acetonitril

mintaoldószerekből. Azt vizsgáltam, hogy milyen hatással van az injektálási térfogat és az

oldószer erőssége a kromatográfiás csúcs félértékszélességére (W0,5h) és a csúcsalakra. Az

eredményeket három mérési adat átlagából képeztem.

5.1.7. Eredmények és értékelésük

A mintaoldószer erősség hatása különböző kolonnákon

A kísérletek első lépéseként a különböző kolonnákra injektálható mintatérfogat mennyiségét

vizsgáltam. Összefügést kerestem az új típusú mikro kolonnák terhelhetősége és az injektált

oldószer erőssége, mennyisége között. Kiindulási pontként standard körülmények között

vizsgáltam a különböző geometriájú kolonnák viselkedését, ezért a kezdeti optimális

kromatográfiás paramétereket vízből történő injektálással határoztam meg. A kromatográfiás

elválasztás kidolgozásánál fontosnak tartottam a detektálás érzékenységét, a legalacsonyabb

LOQ értékek keskeny magas csúcsokkal érhetők el, ahol a legkedvezőbb a jel/zaj viszony

(detektálási érzékenység megközelítés). Az előbbi elvárásnak a KolonnaC-n történő elválasztás

felel meg, a rövid kolonnahossz, a héjszerű töltet és az állófázis minősége keskenyebb és 4×

magasabb csúcsokat eredményezett mint a másik két kolonna (12. ábra). A kromatográfiás

elválasztás szempontjából viszont a retenciós tényező nagysága és a felbontás a mérvadó -

kifejezetten erős oldószerből történő injektálásnál -, hiszen a később eluálódó, nagyobb

retenciós faktorral rendelkező komponensek kevésbé érzékenyek a nagy mintatérfogat

injektálásra (elválasztási hatékonyság megközelítés). Az utóbbi elvárásnak a KolonnaA felel

meg leginkább, kromatogramján a komponensek nagyobb retenciós faktorral válnak el. Ennek

a nagyobb állófázis mennyiség az oka, ami a nagyobb kolonnatérfogat és a teljesen porózus

szemcsék következménye.

35

12. Ábra. Kolonnák összehasonlítása 2 µl 100 ng/ml vizes tesztoldat injektálásakor azonos intenzitású skálán. A

szagatott vonal jelzi az adott kolonnán alkalmazott gradiens programot (gradiens késéssel). KolonnaA:

Eksigent, 3 µm, ChromXP C18CL, 120 Å,150 × 0,3 mm; KolonnaB: Eksigent, 2,7 µm, HALO Fused-Core

C18, 90 Å, 50 × 0,3 mm; KolonnaC: Eksigent, 2,7 µm, HALO Fused-CorePhenyl Hexyl, 90 Å, 50 × 0,5 mm.

36

Következőnek a retenciós tényező (k*) hatását vizsgáltam az erős oldószerből injektálható

mennyiségre. A retenciós tényező nagysága egyenesen arányos a gradiensidő hosszúságával.

Ezért KolonnaA-n két különböző gradiensidővel (0,6 perc és 1,8 perc) a 4 tesztmolekulát:

kortizol, tesztoszteron, androszténdion, progeszteron, választottam el vízből, metanolból és

acetonitrilből különböző mennyiségeket (50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 5000 nl)

injektálva. A kromatogramok közötti szignifikáns különbséget a kapott csúcsok W0,5h

összehasonlításával bizonyítottam. A vízből injektálás nem okozott eltérést a kromatogramok

között. Ezzel szemben a másik két oldószer injektálásakor szignifikáns különbséget

tapasztaltam. A meredekebb gradiensprofilú elválasztás érzékenyebb a mintaoldószer

erősségre. A kisebb k*-vel rendelkező csúcsok kiszélesedése 500 nl feletti injektáláskor,

növelve az injektálási térfogatot gyorsabban bekövetkezett. 2 µl injektálása metanolból a

rövidebb gradiensnél csúcshasadást eredményezett, míg a hosszabb gradiensnél csak

csúcsszélesedést okozott (13. ábra). 1 µl acetonitriles injektálással hasonló eredményt kaptam.

Továbbá a 13. ábrán bemutatott csúcsok alakja bizonyítja, hogy a később eluálódó

komponensek kevésbé érzékenyek a csúcsdeformációra. Habár az ábra 2-es számú csúcsai sem

szabályosan szimmetrikusak, integrálásuk a tömegspektrometriás detektálás szelektivitásának

köszönhetőn lehetséges, akár az LOQ közelében is. Összefoglalva, a gradiensidő racionális

szintű növelése később eluálódó csúcsokat eredményez, amik kevésbé érzékenyek a

mintaoldószer erősségre és nagyobb injektálási térfogatot tesznek lehetővé. Ezáltal alacsonyabb

LOD/LOQ érhető el.

37

13. Ábra. Kromatográfiás csúcsalak 2 µl metanolos tesztoldat injektálásakor (KolonnaB). A felső sorban a

gradiensidő 0,6 perc, az alsó sorban 1,8 perc. A: kortizol, B: tesztoszteron, C: androszténdion, D:

progeszteron.

A kolonnageometriának és a töltet minőségének is jelentős hatása van az erős oldószerből

injektálható térfogatmennyiségre. Különböző mintatérfogatokat injektáltam a három oszlopra,

hogy megvizsgáljam, melyikkel érhető el a legalacsonyabb LOQ érték. A kísérletet az

„Injektálási körülmények” pontban leírtak szerint végeztem, eredményként a négy vizsgálandó

komponens három párhuzamos mérésből számolt szumma W0,5h átlagát ábrázoltam az

injektálási térfogat függvényében (14. ábra). Kis térfogatok injektálásánál a rövid és

héjszerkezetű töltettel rendelkező KolonnaB (W0,5h: 0,032 perc) és KolonnaC (W0,5h: 0,021

perc) keskenyebb, magasabb csúcsokat kisebb W0,5h értékekkel eredményezett mint KolonnaA

38

(W0,5h: 0,041 perc). A kolonna holttérfogatának hatását bizonyítja a legkisebb térfogattal

rendelkező KolonnaB elválasztás. Holtidőben rörténő elúció és csúcsszakadás tapasztalható

már 750 nl feletti erős oldószerből történő injektálásnál, ez a jelenség a másik két kolonnánál

nagyobb térfogat injektálásakor, 2 µl metanolnál és 1 µl acetonitrilnél jelentkezett. Az

eredményekből megállapítható, hogy célszerű metanollal végezni a minta-előkészítést, az

extrakciót, mert a metanol gyengébb oldószererőssége miatt nagyobb térfogatok injektálását

teszi lehetővé. Szerves oldószer injektálásakor a mintatérfogat növelése nagyobb

csúcsszélesedést okoz KolonnaA-n mint KolonnaC-n, a görbék felfutása KolonnaA-n

meredekebb. Ebből az következtethető, hogy KolonnaC kevésbé érzékeny az erős oldószerből

történő nagy térfogatú injektálásra, így továbbiakban ezzel a kolonnával célszerű végezni a

kísérleteket.

39

14. Ábra. Az injektálási térfogat növelésének hatása az átlagolt W0,5h-re különböző oldószerből injektálva,

illetőleg a csúcsalakok a maximálisan injektálható térfogatkor. A: KolonnaA, B: KolonnaB, C: KolonnaC.

40

Mintaoldószer hígítás hatásának vizsgálata

Az oldószererősség - injektálható térfogat összefüggés megértéséhez KolonnaC-n hígítási

tesztet végeztem. Állandó koncentráció mellett négy különböző oldószerösszetételt (100%,

75%, 50%, 0% szerves oldószertartalom) injektáltam és hasonlítottam össze egymással a

csúcsszélesség függvényében (15. ábra). Mills és munkatársai három faktor (mintaoldat

metanol mennyisége, injektálási térfogat, eluenserősség) egymásra gyakorolt hatását

vizsgálták, hogy megértsék, hogyan változik a csúcs alatti terület, a retenciós tényező és az

elválasztás hatékonysága a három tényező változtatásakor [111]. Indometakin izokratikus

elválasztásnál azt tapasztalták, hogy különböző arányú vizes mintahígítás megakadályozza a

csúcsszélesedést és nagyobb injektálási térfogatot tesz lehetővé. Az eredményeim bizonyítják,

hogy erős mintaoldószer hígítása vízzel megakadályozhatja a csúcstorzulást gradiens elúciós

elválasztáskor, metanol és acetonitril tartalmú minták vizsgálatánál. Metanolos minta 25%-os

vizes hígítása lehetővé tette a teljes mintahurok (5 µl) injektálását tűrhető csúcsdeformációval

KolonnaC-n történő elválasztásnál. Ez a kiindulási vizes 5 µl térfogatú injektáláshoz képest

1,5-szeres csúcsszélességet eredményezett kolonnaáttörés helyett. 50% metanol/víz arányú

mintaoldat injektálása gyakorlatilag ugyanazt a csúcsalakot és W0,5h értékeket eredményezte

mint vízből injektálva. Ez azt jelenti, hogy 50%-os hígítás lehetővé tette, hogy ne történjen

csúcsszélesedés 5 ul injektálásakor, ugyanehhez tiszta metanolból max. 500 nl-t lehetett

injektálni. Vagyis ötszörös anyagmennyiséget sikerült elérni a hígítással. Nagyobb térfogatú

mintahurok alkalmazásával, akár nagyobb térfogat is injektálható lenne, tovább csökkentve

ezzel a kimutatható anyagmennyiséget. Mivel az acetonitril erősebb oldószer mint a metanol,

minimum 50%-os hígítás tette lehetővé a maximum 5 µl teljes mintahurok térfogat injektálást.

Ennél kisebb hígítás komponensáttörést és nagy mértékű csúcs deformációt okozott nagyobb

mintatérfogat injektálásakor. Az elöl eluálódó csúcsok érzékenyebbek a csúcsszélesedésre,

ezért a módszer kidolgozásnál az injektálandó térfogat és a mintaoldószer optimálásánál

elegendő az első komponens vizsgálata.

41

15. Ábra. Hígítási hatásvizsgálat, a minta oldószererősség hatása az injektálható térfogatra KolonnaC-n.

Következtetésként levonható, a minták extrakció utáni direkt hígítása egy lehetőség, hogy

megnöveljük az injektálható térfogatot és ezzel alacsonyabb kimutatási értékeket érhessünk el.

A megfelelő hígítási aránnyal nagyobb anyagmennyiség injektálható, annak ellenére, hogy a

vizsgálandó komponens koncentrációját csökkentettük a mintában. Célszerű metanollal

végezni a fehérjekicsapást, mert kevésbé okoz csúcsdeformációt. A gradiens idő optimálása és

a nagyobb kolonna térfogat szintén növeli az injektálható térfogatot és oldószer erősséget, így

a módszer érzékenységét.

Szteroidhormon meghatározás humán szérummintákból

Az előzőekben elvégzett kísérletek eredményeit felhasználva módszert dolgoztam ki humán

szérum elemzésére. A szteroidok meghatározását metanolos és acetonitriles fehérjekicsapást

követően az optimált injektálási értékekkel (térfogat és mintaoldószer összetétel) KolonnaC-n

végeztem. A „Mintaoldószer hígítás hatásának vizsgálata” fejezetnek megfelelően a

42

kalibrációs oldatok és a minták injektálását a következőképpen végeztem: 5-5 µl

mintatérfogatot injektáltam a MeOH-os és a ACN-es fehérjekicsapást követően az oldatokból

(teljes mintahurok - erős oldószer) ; 1-1 µl mintamennyiséget az előző oldatokból (kísérletek

alapján tolerálható csúcsszélesedés); 5 µl-t az előző oldatok 25%-os (MeOH) és 50%-os

(ACN) vizes hígítását követően (teljes mintahurok, mintahígítással, tolerálható csúcsalakkal).

A módszereket a pontosság, a linearitás és az LOQ értékek alapján hasonlítottam össze. Az

LOQ meghatározásánál azt a kalibrációs pontot választottam, ahol teljesültek a „Validálás”

fejezetben leírt LOQ kritériumok. A vártaknak megfelelően azt tapasztaltam, hogy 5 µl

injektálása a hígítás nélküli mintákból holtidő elúciót okozott, a komponensek egy részét

elvesztettem, az adatokat nehezen lehetett értékelni. A másik négy kísérlet adatait a 3. táblázat

tartalmazza.

3. Táblázat. Különböző oldószerösszetételű és injektálási térfogatú kalibrációs egyenesek paraméterei és LOQ

értékei.

A legkisebb LOQ értéket 5 µl 25%-os hígítású oldat injektálásával kaptam mind a négy szteroid

molekulánál (3. táblázat). A minták hígításával 2-5-ször alacsonyabb meghatározási értékek

érhetők el, mint erős mintaoldószerből injektálva. A 10 ng/ml kalibrációs oldat és egy

szérumminta kromatogramját ábrázolja különböző injektált térfogattal és mintahígítással a 16.

ábra. Az extrahálás utáni hígítás vízzel magasabb és keskenyebb csúcsokat eredményezett

nagyobb komponenskoncentrációval, és megakadályozta a holtidőelúciót. Linearitásban és

pontosságban nem találtam szignifikáns eltérést az injektálási technikák között. Mindegyik

kalibrációs pont jól illeszkedett a kalibrációs egyenesre, az R2 értékek 0,995 felettiek.

Injektálási

paraméterek

Kortizol Tesztoszteron

Regr. egy. r2 LOQ (ng/ml) Regr. egy. r2 LOQ (ng/ml)

1ul MeOH y=51,7x+504 0,9996 20 y=954x-3,61e3 0,9997 5

1 ul ACN y=113x+1,55e3 0,9998 20 y=1,2e3x+8,54e3 0,9998 5

5ul 25% water/MeOH y=94,9x+2,73e3 0,9991 5 y=1,67e3x-1,48e3 0,9993 1

5ul 50% water/ACN y=160x+3,69e3 0,999 5 y=1,56e3x+4,14e3 0,9981 2,5

Androszténdion Progeszteron

Regr. egy. r2 LOQ (ng/ml) Regr. egy. r2 LOQ (ng/ml)

1ul MeOH y=799x+2,57e3 0,9996 5 y=302x-380 0,9989 10

1 ul ACN y=958x+1,42e4 0,9978 5 y=348x+1,46e3 0,9989 10

5ul 25% water/MeOH y=1,12e3x-298 0,9984 1 y=417x-1,07e3 0,9979 5 5ul 50% water/ACN y=932x-88,9 0,9992 1 y=424x+4,23e3 0,9985 5

43

16. Ábra. A hígítás hatása humán szérumminták mérésekor. 10 ng/ml-es metanolos szérum kalibrációs pont

kromatogramjai (balra), metanolos szérumminta kromatogramjai (jobbra) különböző térfogatú injektáláskor

és 25%-os vizes hígításnál. A: kortizol, B: tesztoszteron, C: androszténdion, D: progeszteron

kromatogramjai KolonnaC-n.

A mintaoldószer hígítással elért LOQ értékek összevetése az egészéges egyének referencia

tartományával arra enged következtetni, hogy a módszer alkalmas androszténdion, kortizol és

tesztoszteron hormonoknál az „egészséges/nem egészséges” kérdés megválaszolásához.

Ellenben a módszer csak megfelelő validálást követően használható hormonszint értékelésre.

A humán szérum elemzés elsődleges célja a minta oldószer hígítás és a technika

alkalmazhatóságának bemutatása volt.

44

5.1.8. Összefoglalás

Részletesen megvizsgáltam nagy mintatérfogat injektálásának lehetőségét mintahígítással

szteroidhormonok mikro LC technikával történő vizsgálatánál. Három különböző geometriájú

és állófázisú mikro kolonnán tanulmányoztam az injektálható térfogat és mintaoldószer erősség

hatását. A nagyobb térfogatú kolonna kevésbé érzékeny az injektált minta oldószererősségére,

ezért nagyobb mintatérfogat injektálást tesz lehetővé. Annak ellenére, hogy a héjszerkezetű

töltetek érzékenyebbek lehetnek a mintatérfogat túlterhelésre, hatékonyságuknak köszönhetően

alacsonyabb LOQ értékek érhetők el. A kolonna elején történő komponensfókuszálás, a

gradiensidő optimálása megoldásként szolgálhat a relatív nagy térfogatok injektálásakor

bekövetkező csúcsszélesedésre.

Az oldószererősség különbség miatt, metanol használata mintaoldószerként nagyobb injektálási

térfogatot tett lehetővé mint az acetonitril, ezáltal alacsonyabb LOQ értékeket értem el. 2 µl

metanolos mintaoldat injektálása pontosan értékelhető csúcsokat eredményezett, ami

acetonitrilnél csak 1 µl mintaoldat injektálásával érhető el. Bebizonyítottam, hogy a mintaoldat

vizes hígítása egy lehetséges megoldás a csúcsdeformáció elkerülésére. Metanolos oldat 25%-

os hígításával, acetonitriles oldat 50%-os hígításával teljes mintahurok (5 µl) injektálható egy

körülbelül 2 µl holttérfogattal (KolonnaB) és két körülbelül 6 µl holttérfogattal (KolonnaA,

KolonnaC) rendelkező kolonnákra. Az oldószererősség csökkentése lelassította a

komponensek migrációs sebességét és fókuszálta őket a kolonna elején.

Az előzőekben leírt eredmények felhasználásával sikeresen növeltem egy mikro UHPLC-

MS/MS módszer érzékenységét humán szérum szteroidhormon meghatározásában. A

mintaoldószer hígításával nagyobb térfogatot injektálhattam, 2-5 szoros érzékenységnövelést

értem el. Ha rendelkezésünkre áll nagyobb mintahurok, további érzékenységnövelés lehetséges

nagyobb térfogatok injektálásával. Eredményeink új lehetőséget teremtenek egyszerű, gyors és

érzékeny módszerek kidolgozására klinikai szteroidhormon meghatározásoknál.

45

5.2. A mikro LC rendszer érzékenységének továbbfejlesztése on-line

SPE technikával


A test hormonális állapotának feltárásában elengedhetetlen a hormonok szimultán mennyiségi

meghatározása [35]. A humán szérum alacsony szteroidhormon koncentrációja megköveteli az

LC-MS rendszer kiváló érzékenységét és szelektivitását. A rutin klinikai meghatározások ezen

felül elvárják a megfelelő precizitást és pontosságot. Az LC-MS/MS technika kiváló

érzékenysége ellenére az alacsony kimutatási határ eléréséhez elengedhetetlen dúsítási vagy

származékolási lépések alkalmazása. Ezek a megoldások többnyire összetett, időigényes

lépéseket tartalmaznak, nagy a szerves oldószer igényük, hibaforrásként pontatlanságot és

anyagveszteséget okozhatnak.

Ezzel szemben a mikro LC-MS kiegészítése on-line SPE rendszerrel egy újszerű megoldást

kínálhat az érzékenységi problémák javítására. A tömegspektrométer elé kapcsolt

folyadékkromatográf legfontosabb feladata, hogy maximalizálja a kromatográfiás sávban a

vizsgálandó komponens mennyiségét, illetőleg, hogy elválassza azokat a zavart okozó,

interferáló mátrixkomponensektől. Az on-line SPE mikro LC rendszerben a különösen nagy

mintatérfogat injektálása kis átmérőjű mikro kolonnára intenzív keskeny csúcsokat

eredményez. A kapcsolás előnye, hogy a nagy mintatérfogatú injektálás ellenére nem romlik a

mikro LC elválasztás minősége, elkerülhető a csúcsszélesedés és a kolonna, detektor fokozott

elszennyeződésének esélye. Továbbá nőhet a módszer érzékenysége és robusztussága,

miközben csökken a minta-előkészítés lépései és a vizsgálat ideje.

Kísérleteim elsődleges célja a mikro UHPLC-MS/MS rendszer érzékenységének további

javítása on-line SPE technika alkalmazásával, másodlagos célja egy gyors, megbízható mikro

UHPLC-MS/MS módszer kidolgozása extrém alacsony szintű szteroidhormon

meghatározására szérumból. Végeredményként szeretnék bemutatni egy olyan módszert, ami

mellőzi a bonyolult off-line SPE extrakciós lépéseket vagy származékképzést a minta-

előkészítés során.

5.2.2. Törzs-, kalibrációs- és belső standard oldat készítése

A törzsoldatokat a különböző szteroidok (11-deoxikortikoszteron, 11-deoxikortizol, 17-

hidroxiprogeszteron, 21-deoxikortizol, aldoszteron, androszténdion, dihidrotesztoszteron,

kortikoszteron, kortizol, kortizon, pregnenolon, progeszteron és tesztoszteron) metanolban

46

oldásával készítettem 0,5 mg/ml koncentrációban. A kalibrációs oldatok 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5;

5; 10; 25; 100; 250; 500; 1000; 2500; 5000 ng/ml koncentrációban a törzsoldatok elegyítésével,

majd vizes hígítással készültek. Belsőstandard oldat készítését kortizol-D4 0,5 mg/ml

metanolos oldatának 4 lépcsős vizes hígításával kaptam 100 ng/ml koncentrációban.


A módszer optimálásánál a mátrixkalibrációs szérumoldatokat 10 µl kalibrációs oldat és 90 µl

szteroidmentes szérum összekeverésével majd 300 µl MeOH hozzáadásával készítettem.

Kétszer egy percig vortex segítségével kevertettem az elegyet, majd 12500 rpm (15000 ×g)

fordulaton 20 percig centrifugáltam, a felülúszót vizsgáltam. A szérumminták előkészítése az

előbb bemutatott módon zajlott, 90 µl szérumhoz 10 µl vizet adtam.

A validált módszerben a mátrix kalibrációs szérumoldatokat 50 µl kalibrációsoldat, 10 µl

deuterált belső standard oldat és 440 µl szteroidmentes szérum összekeverésével készítettem.

Az elegyhez 1500 µl etil-acetátot adtam, az oldatot egy percig vortex segítségével kevertettem,

majd 10 percen keresztül extraháltam folyamatos kevertetés közben. A felülúszót szárazra

pároltam N2 áram segítségével, a maradványt 100 µl 90/10 (v/v) víz/ACN elegyével

visszaoldottam és vizsgáltam. A szérumminták előkészítése az előbb bemutatott módon zajlott,

440 µl szérumhoz 10 µl belső standard oldatot adtam és 50 µl vizet, majd extraháltam, szárazra

pároltam és visszaoldottam a kiindulási eluens összetételben.


A kromatográfiás elválasztást gradiens elúció és on-line SPE kombinációjával végeztem az

előző fejezetben tárgyalt eluensekkel. 90 µl mintát injektáltam közvetlenül a csapdázó

kolonnára egy 6 furatú szelepváltó segítségével. A csapdázó kolonnát az injektorban lévő

mintahurok helyére építettem be (17. ábra). A gradiensprogram 0,2 perc 10% B izokratikus

szakasszal indult, 1,2 perc 90% B izokratikus szakasszal zárult. A köztes lineáris gradiens

szakasz 0,6 perc volt. Végül a kezdeti izokratikus szakaszt visszaállítottam és ekvilibráltam a

kolonnát 0,9 percen keresztül. Az áramlási sebesség 40 µl/perc volt. A kolonnatér

hőmérsékletét 25◦C-ra állítottam. Az analitikai elválasztást Eksigent, 2,7 µm, HALO Fused-

CorePhenyl Hexyl, 90 Å, 50 × 0,5 mm (Sciex, MA, USA) kolonnán (KolonnaC) végeztem,

csapdázó kolonnának ProntoSIL 5 µm C18H, 120 Å, 10 × 0,5 mm (Dr. Maisch GmbH,

Ammerbuch, Germany) használtam.

47

17. Ábra. A mikro LC on-line SPE rendszer elvi felépítése.


A méréseket ESI körülmények között végeztem a következő ionforrás paraméterekkel:

gázfüggöny: 20 egység; ionizációs feszültség: 5000/-4000 V; ionforrás hőmérséklet: 200 °C;

porlasztó gáz: 15 egység; szárító gáz: 20 egység. A tömegspektrometriás paraméterek

optimálása után a komponenseket MRM módban vizsgáltam, ütközőgáznak nitrogént

használtam. Az MRM átmenetek (4. táblázat):

Ionizációs mód

Vegyület MRM quantifier átmenet (m/z)

Dwell time (msec)

DP (volt)

EP (volt)

CE (volt)

CXP (volt)

pozitív 11-deoxikortikoszteron 331/313 15 221 10 25 22

11-deoxikortizol 347/121 15 126 10 31 34

17-hidroxiprogeszteron 331/97 15 1 10 29 8

21-deoxikortizol 347/91 15 136 10 75 14

Aldoszteron 361/343 15 96 10 25 20

Androszténdion 287/97 15 116 10 27 12

Kortikoszteron 347/329 15 111 10 21 22

Dihidrotesztoszteron 291/255 15 11 10 19 22

Pregnenolon 317/97 15 46 10 27 8

Progeszteron 315/109 15 1 10 29 8

Tesztoszteron 289/97 15 100 10 30 15

negatív Kortizol 407/331 15 -55 -10 -22 -21

Kortizon 405/329 15 -35 -10 -20 -21 *DP: declustering potential, EP: entrance potential, CE: collision energy, CXP: collision cell exit potential

4. Táblázat. A vizsgálandó szteroidhormon komponensek MS/MS paraméterei.

48


Mikro UHPLC-MS/MS módszeroptimálás

Munkám első lépéseként egy pontos és érzékeny mikro LC-MS módszer fejlesztését végeztem

el 13 szteroidhormon szimultán meghatározására. A módszerfejlesztést a tömegspektrometriás

paraméterek optimálásával kezdtem. A szteroid molekulák nehezen ionizálhatók ESI

körülmények között, ezért a megfelelő érzékenység eléréséhez a készülék egységeinek

tökéletes hangoltsága szükséges. Minden egyes vegyületnél az ionforrás paramétereit és az

MRM átmenetek értékeit külön - külön optimáltam a törzsoldatok fecskendőpumpa

segítségével történő folyamatos áramoltatásával (4. táblázat). Az elválasztás fejlesztésénél

korábbi munkámból indultam ki, ami a kromatográfiás oszlopokat, és az injektálási

körülmények hatását vizsgálta [122]. A módszer továbbfejlesztésében közvetlenül a csapdázó

kolonnára történik a nagy térfogatú injektálás, ahol koncentrálódik a vizsgálandó komponens

és elválik a zavaró mátrixkomponensektől. Az SPE kolonnáról bináris puma segítségével,

gradiens elúcióval az analitikai kolonnára (KolonnaC) kerülnek a hormon vegyületek, ott

megtörténik az elválasztásuk, majd a detektorban a mennyiségi és minőségi azonosításuk (18.

ábra).

18. Ábra. A 13 szteroidhormon MRM kromatogramja 50 ng/ml kalibrációs oldat injektálásakor, a teljes futási

idő 3 perc. A: 11-deoxikortikoszteron, B: 11-deoxikortizol, C: 17-hidroxiprogeszteron, D: 21-deoxikortizol,

E: aldoszteron, F: androszténdion, G: kortikoszteron, H: kortizol, I: kortizon, J: dihidrotesztoszteron, K:

pregnenolon, L: progeszteron, M: tesztoszteron

49

Szteroid meghatározása humán szérumból

Ezt követően, optimáltam a módszert 13 szteroidhormon szimultán meghatározására humán

szérummintából. Az előző fejezet eredményeinek megfelelően a fehérjekicsapást metanollal

végeztem. A felülúszóból direkt injektálással vizsgáltam a komponenseket, amik holtidővel,

nehezen értékelhető csúcsokban eluálódtak magas LOQ értékekkel. Korábbi munkám alapján,

a minták vízzel való 50%-os hígítása megakadályozta a csúcsszélesedést és éles, intenzív

csúcsokat eredményezett (19. ábra). A hígított és a hígítatlan minta kromatogramjainak

összehasonlítása bizonyítja a hígítás hatását csapdázó kolonna alkalmazásánál. Az erős

oldószerből történő injektáláskor a minta komponenseinek csak kis hányada kötődött meg a

csapdázó kolonnán, illetőleg elkenődve adszorbeálódott az állófázison. Ezzel szemben a hígítás

következtében csökkent az oldószer erősség és elegendővé vált a molekulák adszorpciós

affinitása az állófázisra.

19. Ábra. 50 ng/ml szérum kalibrációs minta csúcsai tiszta metanolból (pontozott vonal) és 50%-ban vízzel

hígított metanolból injektálva (folytonos vonal) extrakciót követően. A: 11-deoxikortikoszteron, B: 11-

deoxikortizol, C: 17-hidroxiprogeszteron, D: 21-deoxikortizol, E: aldoszteron, F: androszténdion, G:

kortikoszteron, H: kortizol, I: kortizon, J: dihidrotesztoszteron, K: pregnenolon, L: progeszteron, M:

tesztoszteron

50

Annak ellenére, hogy a vizsgálandó komponens koncentrációja felére csökkent, körülbelül 10-

szeres érzékenységnövekedést okozott a hígítás (20. ábra). Az elöl, kis retencióval eluálódó

komponenseknél tapasztalható a legnagyobb a változás. A mintahígítással sikeresen növeltem

a módszer érzékenységét, de a klinikai alkalmazások ennél alacsonyabb meghatározási és

detektálási határokat kívánnak meg.

20. Ábra. LOQ értékek metanolos extrakció után tiszta és 50% vízzel hígított metanolból injektálva

A további LOQ csökkentés megköveteli a kiindulási mintamennyiség növelését, ami maga után

vonja a minta-előkészítés fejlesztését és komponensdúsítást. Ezért 450 µl szérum etil-acetátos

extrahálásának felülúszóját szárazra pároltam és a maradékot visszaoldottam 100 µl 10%-os

ACN-ben. Ez a több lépésből álló, de gyors minta-előkészítési procedúra (extrahálás, bepárlás,

oldószer csere) lehetővé tette, hogy nagy mintatérfogat injektálással és on-line SPE

használatával egyszerűbben (az irodalmi megoldásokban alkalmazott off-line SPE nélkül)

elérjem a klinikai meghatározás szükségleteit. Végezetül a kidolgozott módszer

teljesítményjellemzőit validálással meghatároztam 2.5. fejezetben leírtak szerint.

Módszervalidálás

Szelektivitás

A módszer szelektivitását a szteroidmentes szérum (háttér) és az LOQ szintjén addícionált

kalibrációs pont kromatogramok összehasonlításával határoztam meg öt különböző mérést

végezve (21. ábra). A biológiai mátrixból származó interferencia egyes szteroidok átmeneténél

a szteroid mentesítés nem 100%-os hatásfokának tulajdonítható. A retenciós idő és a „qualifier”

átmenet segíthet a pontos meghatározásban, a stabil retenciós idő kis koncentrációk

vizsgálatánál megkönnyítheti a csúcs azonosítását egy zajos kromatogramban. Például, kortizol

és kortizon esetén mátrix csúcs észlelhető a szteroidmentes szérum kormatogramján is, ezért a

51

„qualifier” átmenetek (kortizol 407/282 m/z, kortizon 405/137 m/z) segítségével korrigáltam

az LOQ értékekhez közeli kalibrációs pontokat. Az alacsonyabb pontoknál kivontam a mátrix

csúcs alatti területét, magasabb tartományokban elhanyagolhatónak tekintettem. A vizsgálandó

komponensek LOQ csúcsai megfelelő csúcsalakkal és csúcsalatti területtel kiemelkednek a zaj

szintjéből, könnyen integrálhatók. Egyes komponenseknél qualifier átmenettel történő

pontosításukkal teljesítik a szelektivitási kritériumot.

21. Ábra. A módszer szelektivitásának bemutatása a szteroidmentes szérum (szaggatott vonal) és az LOQ

szintjén addicionált kalibrációs pont (folytonos vonal) kromatogramok összehasonlításával. A: 11-

deoxikortikoszteron, B: 11-deoxikortizol, C: 17-hidroxiprogeszteron, D: 21-deoxikortizol, E: aldoszteron,

F: androszténdion, G: kortikoszteron, H: kortizol, I: kortizon, J: dihidrotesztoszteron, K: pregnenolon, L:

progeszteron, M: tesztoszteron „quantifier” átmenetei

52


A 15 különböző koncentrációból álló kalibrációs egyenes jól illeszkedett a kalibrációs pontokra

a teljes kalibrációs tartományban, a korrelációs együttható értéke 0,9961 és 0,999 közötti

értékeket adott (5. táblázat). A regressziós egyenes 1/x-es súlyozása kielégítő eredményt

szolgáltatott megfelelő pontossággal és precizitással (15% alatt) minden egyes kalibrációs

pontnál. Az LOD és LOQ értékek illeszkedtek az előírt FDA kritériumokhoz (2.5. fejezet), az

LOQ értékek teljesítették a 20%-os relatív hiba és szórás határt.

Vegyület Statisztikai változó Névleges koncentráció (ng/ml) R LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml)

0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0,5 1 2,5 5 10 25 50 100 250 500

11-deoxikortikoszteron Átlag (ng/ml)

1,82 2,72 5,29 9,4 23,3 49,7 97 256 500 0,9983 1 2,5

RE (%)

81,6 9,0 5,8 -6,3 -6,8 -0,5 -3,5 2,4 -0,1

CV (%)

11,7 4,6 2,5 3,0 1,7 4,0 2,3 4,8 7,1

11-deoxikortizol Átlag (ng/ml)

0,078 0,105 0,244 0,457 1,03 2,38 4,79 10,2 26,3 54,0 101 235 524 0,9985 0,05 0,1

RE (%)

56,3 5,5 -2,6 -8,5 2,8 -4,8 -4,3 1,7 5,2 8,0 0,9 -6,0 4,8

CV (%)

21,0 9,3 4,5 3,7 2,6 2,8 3,9 2,7 6,7 5,7 5,7 3,9 8,6

17-hidroxiprogeszteron Átlag (ng/ml)

0,166 0,273 0,501 0,97 2,41 4,43 9,2 24,4 54,8 95 255 498 0,9985 0,1 0,25

RE (%)

66,2 9,1 0,3 -2,6 -3,5 -11,4 -8,4 -2,2 9,5 -5,2 1,8 -0,4

CV (%)

8,8 1,7 4,3 3,1 3,3 2,6 2,7 3,0 3,0 4,5 6,4 6,3

21-deoxikortizol Átlag (ng/ml)

0,044 0,104 0,245 0,462 0,94 2,56 4,96 10,4 25,6 53,6 98 242 475 0,998 0,05 0,1

RE (%)

-12,0 4,2 -1,8 -7,7 -6,0 2,6 -0,8 3,6 2,3 7,2 -1,6 -3,4 -4,9

CV (%)

49,3 8,1 5,1 1,9 3,8 5,4 6,7 1,6 3,4 3,6 4,8 3,2 5,0

Aldoszteron Átlag (ng/ml)

0,112 0,256 0,476 0,97 2,53 5,07 10,3 25,6 48,6 104 243 514 0,9988 0,1 0,25

RE (%)

11,5 2,4 -4,9 -3,3 1,3 1,4 3,4 2,5 -2,8 4,0 -3,0 2,7

CV (%)

11,5 6,4 2,9 2,8 4,3 2,4 1,8 3,1 4,7 6,0 7,0 8,3

Androszténdion Átlag (ng/ml) 0,018 0,028 0,053 0,111 0,234 0,446 0,89 2,21 4,28 8,8 22,7 54,8 99 257 499 0,9979 0,01 0,025

RE (%) 80,2 10,8 6,9 11,4 -6,4 -10,8 -10,6 -11,6 -14,4 -12,0 -9,1 9,6 -1,0 2,8 -0,3

CV (%) 7,0 5,6 3,5 3,3 4,8 2,6 4,3 4,6 2,3 6,6 4,3 2,7 5,0 6,4 13,7

Kortikoszteron Átlag (ng/ml)

0,079 0,240 0,483 0,95 2,51 5,11 10,5 25,7 52,1 99 243 505 0,997 0,1 0,25

RE (%)

-20,8 -4,1 -3,3 -5,1 0,5 2,1 4,8 3,0 4,2 -0,5 -2,6 1,0

CV (%)

4,3 3,0 2,7 1,2 2,3 2,7 3,5 1,3 2,7 2,0 1,7 2,0

54

Vegyület Statisztikai változó Névleges koncentráció (ng/ml) R LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml)

0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0,5 1 2,5 5 10 25 50 100 250 500

Kortizol Átlag (ng/ml)

0,178 0,231 0,425 0,95 2,59 5,35 10,6 27,4 52,6 96 242 475 0,9986 0,1 0,25

RE (%)

78,2 -7,6 -15,0 -5,4 3,5 6,9 5,6 9,7 5,2 -4,5 -3,1 -4,8

CV (%)

51,6 1,0 10,2 5,9 3,2 6,3 1,6 1,2 5,4 2,5 4,7 6,0

Kortizon Átlag (ng/ml) 0,008 0,024 0,047 0,093 0,246 0,494 1,03 2,65 5,15 10,6 26,8 50,2 95 254 511 0,9989 0,01 0,025

RE (%) -18,0 -5,4 -5,7 -7,5 -1,6 -1,2 3,0 6,2 3,1 5,8 7,2 0,3 -5,4 1,4 2,3

CV (%) 58,7 4,8 2,7 2,1 2,4 5,4 2,4 1,1 5,9 3,5 1,4 6,2 3,2 4,3 4,6

Dihidrotesztoszteron Átlag (ng/ml)

0,042 0,115 0,265 0,459 0,94 2,36 4,55 9,6 25,3 57,8 100 258 482 0,9974 0,05 0,1

RE (%)

-16,6 14,6 5,9 -8,3 -6,0 -5,5 -9,1 -3,7 1,0 15,6 0,4 3,0 -3,7

CV (%) 44,7 3,5 7,7 6,9 4,4 6,4 5,9 6,9 3,8 2,9 4,3 5,8 6,9

Pregnenolon Átlag (ng/ml) 0,170 0,235 0,434 0,93 2,20 4,53 8,7 23,1 52,7 97 261 492 0,9962 0,1 0,25

RE (%) 70,2 -6,1 -13,2 -7,1 -12,1 -13,0 -13,4 -7,8 5,3 -2,5 4,5 -1,7

CV (%) 7,9 8,7 2,0 2,6 5,6 2,3 5,5 4,7 2,4 8,7 2,6 12,1

Progeszteron Átlag (ng/ml) 0,169 0,238 0,467 0,86 2,14 4,62 8,9 23,5 54,8 95 271 479 0,9961 0,1 0,25

RE (%) 69,3 -4,7 -6,6 -13,7 -14,3 -7,6 -11,3 -6,1 9,6 -4,8 8,4 -4,3

CV (%) 20,4 6,6 4,4 2,7 2,9 2,0 6,7 6,9 2,8 6,5 3,9 8,5

Tesztoszteron Átlag (ng/ml) 0,011 0,026 0,052 0,104 0,242 0,455 0,92 2,32 4,58 9,7 24,2 54,8 96 251 500 0,999 0,01 0,01

RE (%) 14,0 5,2 4,1 3,8 -3,4 -9,0 -7,8 -7,3 -8,3 -2,9 -3,4 9,5 -3,7 0,5 0,0

CV (%) 3,8 3,4 3,0 7,0 3,0 1,0 2,1 1,8 1,3 6,6 2,0 1,9 4,8 5,0 4,5

* RE%: percentage of relative error; CV%: percentage of coefficients of variation

5. Táblázat. A kalibrációs pontok statisztikai adatai, a kalibrációs egyenes linearitása, LOD és LOQ értékek.


A megbízhatóság vizsgálatok eredményei 3 különböző koncentrációszinten vizsgálva 5

párhuzamos mérés átlagaként (napon belüli) és 4 különböző napon (napok közötti) teljesítették

a ±15%-os kritériumszintet (6. táblázat). Az eredmények alapján a módszer megfelelőnek

tekinthető a validálás kritériumának, az RE értékek -6,4% és 7,9% között, a CV értékek 0,7%

és 7,7% között változnak.


A visszanyerés vizsgálathoz összehasonlítottam egy kalibrációs szérumminta csúcs alatti

területeit egy ugyanolyan koncentrációjú, szárazra párolt mátrixhoz adott kalibrációs oldat

csúcs alatti területeivel, azaz a szteroidmentes szérumot minta-előkészítés végeztével

addícionáltam standard kalibrációsoldattal, így azonos mátrixhatás mellett vizsgálhattam a

visszanyerést. A visszanyerés értékei 80 és 90% közötti értékeket adtak (6. táblázat). Az

extrakció visszanyerését is külön jellemeztem, újra extraháltam a már extrahált kalibrációs

mintákat. Körülbelül 10% anyagmennyiséget sikerült a második extrakcióval nyernem, így

valószínűsíthető, hogy az anyagveszteség zömében az extrakció útján keletkezik. A mátrixhatás

tanulmányozásakor azonos, 50 ng/ml koncentráció mellett hasonlítottam össze a standard

kalibrációs oldatot az extrahált és szárazra párolt szteroidmentes mátrixhoz adott kalibrációs

oldattal 5 párhuzamos mérést végezve. A mátrixkomponensek növelhetik vagy csökkenthetik

a komponensek intenzitás válaszjelét, ezért befolyásolhatják a mennyiségi meghatározást. A

mátrix tartalmú oldat jele a standard oldathoz képest 89,3% és 101,2% között változott, amely

bőven a 85%-115% elfogadási határon belül van, ezért a módszer mátrix érzékenysége

elhanyagolhatónak tekinthető (6. táblázat).

Stabilitás

A QC minták (3 különböző koncentrációszinten) felhasználásával végeztem el a

stabilitásvizsgálatokat. Különböző körülmények között mátrixban (rövidtávú stabilitás (12 h)

szobahőmérsékleten; hosszútávú stabilitás -20 °C-on 14 napig; három lefagyasztás –

felolvasztás ciklus stabilitás) és előkészített mintával injektálási körülményeknél (24 h-án

keresztül 20 °C-on) tanulmányoztam a vizsgálandó komponensek stabilitását (7. táblázat). Az

RE értékek az előbb felsoroltaknak megfelelően: (-6,7 – 6,9)%; (-4,1 – 2,8)%; (-3,8 – 5,6)%;

(-6,7 – 6,7)%. Megállapítható, hogy az elfogadható 15%-os eltérési tartományon belüli

eredményeket kaptam, a vizsgálandó komponensek stabilnak bizonyultak a különböző

körülmények között. Nem találtam koncentráció- vagy komponensfüggést a visszanyerésben.

Vegyület Névleges koncentráció (ng/ml)

Napon belüli (ng/ml, n=5) Napok közötti (ng/ml, n=4) Visszanyerés

(%, n=5)

Mátrixhatás

(%, n=5) Átlag RE (%) CV (%) Átlag RE (%) CV (%)

11-deoxikortikoszteron 0,75 <LOQ

<LOQ

89,3 93,6

7,5 7,98 6,5 7,3 7,69 2,6 4,2

75 80,12 6,8 5,0 78,03 4,0 4,8

11-deoxikortizol 0,75 0,72 -3,8 3,1 0,76 1,2 6,7 86,2 90,2

7,5 7,92 5,5 1,0 7,83 4,4 2,7

75 71,84 -4,2 3,9 74,29 -1,0 4,3

17-hidroxiprogeszteron 0,75 0,73 -2,3 3,8 0,78 4,2 4,5 91,2 89,3

7,5 7,46 -0,5 5,3 7,12 -5,1 3,5

75 78,44 4,6 3,3 74,41 -0,8 7,7

21-deoxikortizol 0,75 0,74 -1,0 2,9 0,74 -1,6 2,4 86,5 95,4

7,5 7,35 -2,0 0,7 7,45 -0,6 2,7

75 74,46 -0,7 2,5 72,54 -3,3 2,4

Aldoszteron 0,75 0,76 1,5 2,9 0,72 -3,6 3,6 93,2 89,7

7,5 7,44 -0,9 4,2 7,38 -1,6 4,0

75 70,70 -5,7 3,8 73,13 -2,5 5,7

Androszténdion 0,75 0,76 1,1 4,9 0,74 -1,2 4,0 87,5 101,2

7,5 7,47 -0,5 3,0 7,41 -1,2 4,1

75 80,92 7,9 0,9 78,83 5,1 2,9

Kortikoszteron 0,75 0,74 -1,1 2,2 0,76 1,9 3,6 83,4 93,7

7,5 7,53 0,3 5,0 7,81 4,1 3,3

75 71,04 -5,3 2,0 71,91 -4,1 1,1

57

Vegyület Névleges koncentráció (ng/ml)

Napon belüli (ng/ml, n=5) Napok közötti (ng/ml, n=4) Visszanyerés

(%, n=5)

Mátrixhatás

(%, n=5) Átlag RE (%) CV (%) Átlag RE (%) CV (%)

Kortizol 0,75 0,74 -1,1 5,1 0,75 -0,4 2,5 89,6 91,3

7,5 7,32 -2,4 6,8 7,44 -0,9 2,7

75 74,76 -0,3 4,3 76,07 1,4 6,3

Kortizon 0,75 0,72 -3,5 3,8 0,72 -4,4 0,6 87,2 90,8

7,5 7,56 0,8 1,2 7,45 -0,6 4,1

75 73,88 -1,5 3,0 73,85 -1,5 1,6

Dihidrotesztoszteron 0,75 0,75 -0,2 5,3 0,78 3,8 3,6 82,7 94,9

7,5 7,71 2,8 5,7 7,82 4,3 5,4

75 78,60 4,8 2,8 79,98 6,6 2,9

Pregnenolon 0,75 0,72 -3,7 4,3 0,71 -5,2 2,2 83,6 98,7

7,5 7,45 -0,6 3,8 7,14 -4,8 3,1

75 78,82 5,1 2,2 73,68 -1,8 5,3

Progeszteron 0,75 0,77 2,6 4,3 0,73 -2,9 5,3 86,8 97,1

7,5 7,37 -1,7 2,5 7,60 1,3 2,3

75 74,66 -0,5 3,0 78,09 4,1 3,2

Tesztoszteron 0,75 0,70 -6,4 2,5 0,74 -2,0 3,9 91,3 98,6

7,5 7,28 -3,0 2,9 7,40 -1,3 1,6

75 77,12 2,8 6,2 76,71 2,3 2,1


6. Táblázat. Napon belüli és napok közötti megbízhatóság értékek három különböző koncentráció szinten, a mátrixhatás és a visszanyerés.

Vegyület Rövidtávú stabilitás Hosszútávú stabilitás

Lefagyasztás – felolvasztás stabilitás

Injektor 24 h

Koncentráció

(átlag ± S.D., ng/ml)

RE (%)

Koncentráció


RE (%)

Koncentráció


RE (%)

Koncentráció


RE (%)

11-deoxikortikosz-teron

<LOQ

<LOQ

<LOQ

<LOQ

7,7 ± 0,30 2,5 7,36 ± 0,3 -1,8 7,42 ± 0,19 -1,1 7,6 ± 0,5 1,1

77,9 ± 2,0 3,4 76,8 ± 3,5 2,4 79,2 ± 1,1 5,6 74,7 ± 6,3 -0,4

11-deoxikortizol 0,79 ± 0,05 5,7 0,73 ± 0,03 -2,5 0,76 ± 0,02 1,4 0,78 ± 0,05 3,7

7,90 ± 0,25 5,2 7,51 ± 0,25 0,2 7,36 ± 0,25 -1,8 7,81 ± 0,36 4,2

74,1 ± 1,7 -1,3 72,3 ± 1,3 -3,6 72,6 ± 2,5 -3,2 74,2 ± 4,1 4,4

17-hidroxiprogesz-

teron

0,80 ± 0,02 6,9 0,77 ± 0,03 2,7 0,75 ± ,04 -0,7 0,76 ±0,05 2,0

7,63 ± 0,30 1,8 7,19 ± 0,54 -4,1 7,4 ± 0,2 -1,3 7 ± 0,22 -6,7

77,4 ± 3,9 3,2 76,1 ± 2,6 1,5 75,0 ± 2,3 0,0 70,6 ± 1,5 -5,8

21-deoxikortizol 0,73 ± 0,04 -2,2 0,75 ± 0,03 -0,4 0,74 ± 0,02 -0,8 0,73 ± 0,03 -2,8

7,45 ± 0,55 -0,7 7,55 ± 0,26 0,6 7,61 ± 0,20 1,5 7,32 ± 0,32 -2,2

72,4 ± 2,1 -3,5 73,5 ± 2,3 -1,9 72,9 ± 1,9 -2,8 70 ± 0,9 -6,6

Aldoszteron 0,74 ± 0,05 -1,3 0,76 ± 0,02 0,8 0,77 ± 0,02 2,4 0,745 ± 0,04 -0,7

7,44 ± 0,63 -0,8 7,56 ± 0,19 0,9 7,59 ± 0,14 1,2 7,75 ± 0,35 3,3

74,2 ± 2,3 -1,1 71,9 ± 1,8 -4,1 74,1 ± 3,6 -1,2 80,1 ± 4,8 6,7

Androszténdion 0,74 ± 0,04 -1,7 0,74 ± 0,02 -1,5 0,73 ± 0,02 -2,2 0,72 ± 0,04 -3,8

7,01 ± 0,15 -6,7 7,32 ± 0,07 -2,4 7,47 ± 0,25 -0,3 7,41 ± 0,36 -1,2

78,4 ± 2,8 4,5 77,1 ± 2,6 2,8 76,8 ± 1,8 2,4 77,4 ± 2,0 3,2

Kortikoszteron 0,74 ± 0,05 -1,4 0,76 ± 0,03 1,5 0,75 ± 0,02 0,0 0,75 ± 0,03 0,3

7,80 ± 0,41 4,3 7,53 ± 0,25 0,3 7,36 ± 0,28 -1,9 7,9 ± 0,36 6,2

75,1 ± 3,1 0,2 75,0 ± 2,6 0,1 74,3 ± 1,7 -1,0 72,5 ± 2,8 -3,3

59

Vegyület Rövidtávú stabilitás Hosszútávú stabilitás

Lefagyasztás – felolvasztás stabilitás

Injektor 24 h

Koncentráció


RE (%)

Koncentráció


RE (%)

Koncentráció


RE (%)

Koncentráció


RE (%)

Kortizol 0,76 ± 0,03 0,8 0,75 ± 0,03 -0,3 0,75 ± 0,02 -0,4 0,75 ± 0,04 0,0

7,31 ± 0,33 -2,5 7,33 ± 0,31 -2,3 7,21 ± 0,14 -3,8 7,16 ± 0,45 -4,5

76,9 ± 7,6 1,4 75,2 ± 4,1 0,3 76,4 ± 3,5 1,9 75,3 ± 6,2 0,4

Kortizon 0,74 ± 0,03 -1,4 0,75 ± 0,02 -0,3 0,74 ± 0,02 -0,8 0,71 ± 0,03 -4,7

7,25 ± 0,5 -2,7 7,47 ± 0,26 -0,3 7,45 ± 0,15 -0,7 7,3 ± 0,47 -2,7

71,6 ± 2,3 -4,5 75,7 ± 2,6 0,9 75,7 ± 2,6 1,0 71,7 ± 4,5 -4,4

Dihidro-tesztoszteron

0,78 ± 0,01 3,8 0,77 ± 0,02 2,2 0,78 ± 0,02 3,4 0,73 ± 0,04 -2,8

7,13 ± 0,36 -4,8 7,61 ± 0,29 1,5 7,40 ± 0,14 -1,4 7,7 ± 0,33 2,2

79,3 ± 3,1 5,7 75,9 ± 3,8 1,1 78,5 ± 1,6 4,6 77,5 ± 3,6 3,3

Pregnenolon 0,47 ± 0,02 -1,0 0,73 ± 0,02 -2,1 0,74 ± 0,02 -0,9 0,74 ± 0,02 -1,3

7,23 ± 0,40 -3,7 7,30 ± 0,22 -2,6 7,27 ± 0,17 -3,1 7,25 ± 0,5 -3,3

77,3 ± 2,0 3,1 75,2 ± 2,7 0,3 75,3 ± 3,8 0,4 76,8 ± 2,3 2,3

Progeszteron 0,71 ± 0,03 -5,8 0,74 ± 0,03 -0,7 0,74 ± 0,02 -0,9 0,72 ± 0,04 -4,1

7,31 ± 0,45 -2,6 7,40 ± 0,34 -1,4 7,66 ± 0,24 2,2 7,2 ± 0,3 -4,4

77,7 ± 1,9 3,6 75,5 ± 1,8 0,6 75,1 ± 2,9 0,1 76,8 ± 3,6 2,4

Testoszteron

0,73 ± 0,03 -3,2 0,74 ± 0,03 -1,6 0,74 ± 0,02 -1,4 0,74 ±0,02 -1,0

7,57 ± 0,31 1,0 7,62 ± 0,14 1,6 7,48 ± 0,26 -0,3 7,4 ± 0,69 -1,3

75,8 ± 3,7 1,1 73,2 ± 0,7 -2,4 75,6 ± 2,0 0,8 76,7 ± 5,8 2,3

* RE%: percentage of relative error, S.D.: standard deviation

7. Táblázat. Stabilitás különböző körülmények között.

Végezetül a validált módszert klinikai célú vizsgálatokban humán szérumminták

szteroidhormontartalmának meghatározásán teszteltem (30 - 40 minta). A minták az MTA-SE

Örökletes Endokrin Daganatok Kutatócsoporttól érkeztek. Az egészséges egyéneknél mért

értékek beleestek az elvárt egészséges referenciatartományba, ezzel bizonyítottam a módszer

alkalmazhatóságát (referenciatartomány (ng/ml); egészséges egyéneknél mért átlag érték

(ng/ml); egészéges egyéneknél mért legkisebb - legnagyobb érték (ng/ml)) (8. táblázat).

60

Vizsgálandó vegyület referenciatartomány

(ng/ml)

mért átlag érték

(ng/ml)

mért legkisebb - legnagyobb

érték (ng/ml)

11-deoxikortikoszteron <0,1 <LOQ <LOQ

11-deoxikortizol 0,1-0,79 0,6 0,13-0,76

17-hidroxiprogeszteron <2,2 0,49 0,15-1,2

21-deoxikortizol <0,05 <LOQ <LOQ

aldoszteron 0,21 <LOQ <LOQ

androszténdion 0,5-2,25 0,96 0,15-1,7

dihidrotesztoszteron <0,3 <LOQ <LOQ

kortikoszteron 0,53-15,6 7,81 3,62-14,8

kortizol 50-250 60,9 46,2-90,3

kortizon 9-28 8,94 4,3-15,2

pregnenolon 0,33-2,48 1,04 0,82-1,60

progeszteron <0,2 <LOQ <LOQ

tesztoszteron 2,4-9,5 3,16 1,85-6,2

8. Táblázat. Az egészséges egyének eredményeinek összevetése az egészséges referenciatartománnyal.

Referencia tartomány a Mayo Clinic (Mayo Medical Laboratories), Rochester 2017 Interpretive Handbook

alapján. [34].


A kutatás eredményeként sikeresen növeltem mikro LC rendszerem érzékenységét on-line SPE

technikával, elsők között vizsgáltam a kapcsolás lehetőségét mennyiségi meghatározásokban.

A nagy mintatérfogat injektálása on-line SPE alkalmazásával és a mikro LC lehetővé teszi sok

komponens szimultán, érzékeny meghatározását. Kidolgoztam és validáltam egy szelektív,

érzékeny és nagy áteresztőképességű módszert 13 szteroidhormon meghatározására humán

vérminták elemzéséhez. Sikerült elérnem az irodalomban publikált eljárások szintjét, egyes

vegyületeknél, akár felülmúlni azokat, a módszer megközelíti az 5-10 pg/ml méréshatárt éles

minták elemzésénél. Ezzel alkalmas a diagnosztikai és kutatási célú meghatározások által elvárt

kimutatási szintek eléréséhez. A gyors analitikai módszer (3 perc) és az egyszerűbb minta-

előkészítés (off-line SPE mellőzése) biztosítja nagy mintaszám rövid idő alatti meghatározását,

ez rutin laboratóriumok számára különösen fontos szempont. Az eljárás továbbá érdekes lehet

és megoldást nyújthat egyéb érzékeny módszerek kidolgozásában.

61

5.3. Tömegspektrometriás érzékenységnövelés lehetőségei mikro

UHPLC-MS/MS vizsgálatoknál


Az előző fejezetek tárgyalják a kromatográfiás érzékenységnövelés lehetőségeit és az

elválasztás hatását a módszer teljesítményjellemzőire. A kromatográfiás megoldásokon túl az

analitikai módszer érzékenységének növelését a kromatográfiás rendszer detektorának

oldaláról is megközelíthetjük. Az MS paramétereinek (ionforrás értékek, fókuszáló lencsék

feszültségei, ütközési energia, stb.) optimálása és a molekulákhoz illesztése javítja az

érzékenységet. A tömegspektrométer érzékenységét a detektorig eljutó ionok száma határozza

meg, az optimális értékek beállításával ezt a mennyiséget javítjuk. Az ionok mennyisége

befolyásolható képződésük hatásfokával, ezért az ionforrás szerepe rendkívül nagy. Az

ionképződés összefüggésben van a mátrixkomponensek és az eluensmódosítók minőségével és

mennyiségével, amik segíthetik vagy gátolhatják azt. Továbbá a forrásban létrejöhet

fragmentáció és adduktképződés, a keletkező forrás fragmensionok mennyisége és stabilitása

meghaladhatja a molekulaionét. Ezeknek az ionoknak a kiválasztása és mérése is nagy szerepet

játszhat az érzékenység javításában.

A NSAID családjába tartozó vegyületek a legnagyobb számban forgalmazott

gyógyszerkészítmények hatóanyagait képezik. A nagy mennyiségben való felhasználás, a

magas vízoldhatóság és az alacsony biológiai lebonthatóság miatt, és mivel a hagyományos

szennyvíztisztítás csak részlegesen képes csökkenteni jelenlétüket, indokolt környezeti

mennyiségük monitorozása. A környezeti minták elemzésére kidolgozott módszerekben az

érzékenység képezi a kritikus paramétert. Ezért a legtöbb módszer off-line vagy on-line

extrakciós komponens dúsítási lépést tartalmaz és nagy mintatérfogattal dolgozik

[74,90,91,123,124].

Munkám fő célja az érzékenységnövelés, a kimutatási és meghatározási határok javítása

tömegspektrometriás megoldásokkal. Eredményként szeretnék bemutatni egy gyors és

megbízható on-line SPE rendszerrel kiegészített mikro UHPLC-MS/MS módszert, ami extrém

alacsony NSAID koncentrációk meghatározására alkalmas különböző környezeti mintákból.

Szeretném végezetül bemutatni a 10 különböző gyulladáscsökkentő hatással rendelkező

gyógyszervegyület ivóvízből, felszíni vízből és szennyvízből történő szimultán

meghatározására kidolgozott módszer validálási eredményeit.

62

5.3.2. Törzs-, kalibrációs- és mátrixhatás vizsgálati oldatok készítése

A törzsoldatokat 9 NSAID acetonitrilben és a diklofenák vízben oldásával készítettem 0,5

mg/ml koncentrációban. A kalibrációs oldatokat 0,001; 0,0025; 0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1;

0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 100 ng/ml koncentrációban a törzsoldatok elegyítésével, majd vizes

hígításával készítettem. A mátrixhatás tanulmány oldatokat 10 ng/ml koncentrációban a

kalibrációs oldat ivóvizes, felszíni vizes és szennyvizes hígításával készítettem 99,9%, 50%,

20%, 10% mátrix arányban.

5.3.3. Mátrix kalibrációs oldatok és környezeti minták készítése

Az ivóvíz és felszíni víz mintavételét magam végeztem, 50 ml-es centrifuga csövekben

gyűjtöttem 30 ml térfogatú mintamennyiséget. A hálózati víz mintázásnál a háztartási csaptelep

megnyitását követően körülbelül 1 perc elteltével gyűjtöttem a mintát. A felszíni víz mintákat

a partszakasz mellett a vízfelszín közelében vettem. A szennyvíz minták 1 literes üvegekben

érkeztek, amikből szintén körülbelül 30 ml mintát gyűjtöttem homogenizálás után. A mintákat

hűtőben illetőleg fagyasztóban tároltam a vizsgálat idejéig. A környezeti és a NSAID mentes

környezeti minták előkészítését 12500 rpm (15000 ×g) fordulatszámon 15 perces

centrifugálással kezdtem, majd a mintákat 0,22 µm-es Millex-GS fecskendőszűrőn átszűrtem.

A szilárd szennyeződést nem tartalmazó mintákat a mátrixhatás vizsgálat eredményének

megfelelő arányban ultra tiszta vízzel hígítottam (ivóvíz hígítás nélkül, felszíni víz 20%-ra és

szennyvíz 10%-ra hígítva). A módszerfejlesztésnél a környezeti és a validációs mintákat,

illetőleg a mátrix kalibrációs oldatokat a megfelelően hígított mátrixoldat adott koncentrációra

addícionálásával készítettem. A mintákat hígítás után közvetlenül mértem. Az LOD alatti

NSAID tartalmú környezeti minták képezték a hátteret és a mátrix kalibráció oldószerét.


A kromatográfiás elválasztást gradiens elúció és on-line SPE kombinációjával végeztem,

eluensként 0,01% hangyasavas vizet (A eluens) és 0,01% hangyasavas acetonitrilt (B eluens)

használtam. 95 µl mintát injektáltam a csapdázó kolonnára egy 6 furatú szelepváltó segítségével

(17. ábra). A gradiens program 0,2 perc 10% B izokratikus szakasszal indult, 1,2 perc 90% B

izokratikus szakasszal zárult. A köztes lineáris gradiens szakasz 1,8 perc volt. Végül a kezdeti

izokratikus szakaszt 1,2 percig visszaállítottam és ekvilibráltam a kolonnát. Az áramlási

sebesség 20 µl/perc volt. A kolonnatér hőmérsékletét 25 °C-ra állítottam. Az analitikai

elválasztást Phenomenex 5 µm Luna C18, 100 Å, 150 × 0,3 mm, (Phenomenex, CA, USA)

63

kolonnán végeztem, csapdázó kolonnának ProntoSIL 5 µm C18H, 120 Å, 10 × 0,5 mm

(Dr.Maisch GmbH, Ammerbuch, Germany) használtam.


A méréseket pozitív és negatív ESI körülmények között végeztem a következő ionforrás

paraméterekkel: gázfüggöny: 20 egység; ionizációs feszültség: 5000/-4000 V; ionforrás

hőmérséklet: 200 °C; porlasztó gáz: 15 egység; szárító gáz: 20 egység. A tömegspektrometriás

paraméterek optimálása után a komponenseket MRM módban vizsgáltam, ütközőgáznak

nitrogént használtam. Az MRM átmenetek (9. táblázat):

Ionizációs mód

Vegyület MRM quantifier átmenetek

(m/z) Dwell time

(msec) DP

(volt) EP

(volt) CE

(volt) CXP (volt)

pozitív Acetaminofen 152,0/108,8 5 1 10 23 13

Diklofenák 296,0/214,0 5 96 10 47 18

Indometakin 358,1/138,9 5 11 10 21 22

negatív Acetilszalicilsav 178,9/136,8 5 -10 -10 -8 -11

Fenoprofén 197,1/92,9 5 -100 -10 -28 -11

Flurbiprofén 199,0/177,0 5 -100 -10 -28 -19

Ibuprofén 205,1/160,9 5 -125 -10 -10 -11

Ketoprofen 253,1/209,0 5 -15 -10 -10 -17

Naproxen 185,2/169,9 5 -70 -10 -12 -13

Szalicilsav 137,0/92,8 5 -30 -10 -22 -7

*DP: declustering potential, EP: entrance potential, CE: collision energy, CXP: collision cell exit potential

9. Táblázat. A vizsgálandó komponensek MS/MS paraméterei


MS/MS módszeroptimálás

Munkám első lépéseként az optimális MS paraméterek meghatározását végeztem el a

tömegspektrometriás érzékenység maximalizálása céljából. Minden egyes vegyületnél az

MRM átmenetek paramétereit (lencsék feszültsége, ütközési energia, Q1 és Q3 tömegértékek)

külön - külön optimáltam a törzsoldatok fecskendőpumpa segítségével történő folyamatos

áramoltatásával. A molekulák polaritásának megfelelően elektroporlasztásos ionizációval

végeztem a méréseket. A forrás paramétereit (gázfüggöny, porlasztás feszültsége,

forráshőmérséklet, ionizációs potenciál, porlasztó- és szárító gáz) a molekulák szerkezetéhez,

a mikro LC áramlási sebességéhez és az eluens összetételéhez igazítottam. A molekulák

ionizációjához alternálva pozitív és negatív ionizációs módban (egy ciklus pozitív módban, egy

másik ciklus negatív módban, amik egymást felváltva követik) építettem fel a

64

tömegspektrometriás módszert. Acetaminofen, diklofenák és indometakin molekulák

intenzívebb jelet adtak pozitív ionizációs körülmények között [M+H]+ molekulaionnal 152,

296, 358 m/z értékeknél. Ezek a molekulák bázikus N atomot tartalmaznak nemkötő

elektronpárral, ami képes H+ felvételére az ionforrásban pozitív molekulaiont képezve.

Acetilszalicilsav, ibuprofén, ketoprofen és szalicilsav negatív módban [M-H]- formában 179,

205, 253, 137 m/z értékeknél eredményeztek intenzív molekulaionokat, a korábbi

publikációkban leírtaknak megfelelően. A molekulák karboxil csoportja könnyedén veszít H+-

t és válik negatívvá az ionizáció közben. Fenoprofén, flurbiprofén és naproxen molekulák

negatív körülmények között ionizálódtak intenzívebben, a többi molekulától különbözően, a

protonvesztést követően a CO2 csoporthasadás intenzívebb iont eredményezett, mint az eddigi

irodalmakban használt [M-H]- molekulaion. Ez a három molekula megfelelő forrás

körülmények között COOH-t veszít az ionforrásban és 197, 199, 185 m/z tömegű ionokat ad

(molekula tömeg mínusz 45) (21. ábra).

Az MRM átmenetek anyaionjainak a forrásban keletkezett fragmensionokat kiválasztva 3-5-

szörös érzékenységnövekedést sikerült elérnem (22. ábra). Fenoprofén és naproxen forrás

fragmensionjai intenzívebb, magasabb csúcsokat eredményeztek a nagyobb ionizációs hatásfok

miatt. Flurbiprofénnél a kedvezőbb jel/zaj viszony miatt nőtt drasztikusan az érzékenység. Az

MRM átmenet Q3 „quantifier” és „qualifier” ionjait is optimáltam, az ütközési energiák és a

fókuszáló lencsék feszültség értékeinek finomhangolásával tovább javítottam az

érzékenységen.

65

21. Ábra. A forrás fragmensionok MS és leányion MS (beágyazott kép) spektrumjai. A: fenoprofén, B:

flurbiprofén, C: naproxen

66

22. Ábra. A fenoprofén, flurbiprofén és naproxen molekulaionjaiból (D,E,F) és a forrás fragmensionjaiból (A,

B, C) képzett MRM átmenetek kromatogramjainak összehasonlítása állandó koncentrációszint mellett. A:

fenoprofen (197,1/92,9 MRM átmenet), B: flurbiprofen (199,0/177,0 MRM átmenet), C: naproxen

(185,2/169,9 MRM átmenet), D: fenoprofen (241,0/197,1 MRM átmenet), E: flurbiprofen (243,0/199,0

MRM átmenet), F: naproxen (229,1/170,2 MRM átmenet)

Az ESI hatásfoka függ a molekulák polaritásától és az eluensmódosítók (például

pufferkomponens) minőségétől és viselkedésétől a forrásban. A 10 NSAID molekula

különböző poláris funkciós csoportokat tartalmaz (szekunder amin, tercier amin, karboxil). A

molekulák gyenge savak 3 és 5 közötti pKa értékekkel. A molekulák polaritása az eluens pH-

val befolyásolható ezeken a csoportokon keresztül (23. ábra), így növelhető vagy csökkenthető

az ionok intenzitása. Az eluens pH függvényében ezek a molekulák érkezhetnek az ionforrásba

semleges, vagy már eleve ionos formában.

23. Ábra. A vizsgálandó komponensek pH-tól függő LogD diagramja. Forrás: Pallas program által kalkulált

értékek.

67

Ebből az következik, hogy az eluens pH értéke hatással van az érzékenységre, segítségével akár

javítható a kimutatási határ. Ezért 2,7-9 pH tartományban megvizsgáltam a molekulák

válaszjelének intenzitását. A tömegspektrometriás detektor miatt csak illékony pH módosítókat

tartalmazhat az eluens, ezért hangyasavat vagy ecetsavat és ammónium-hidroxidot használtam

pH beállításhoz. Hangyasav alkalmazásával magasabb érzékenységet értem el mint az

ecetsavas sorozat esetében. A legtöbb NSAID molekula savas környezetben, alacsony pH-n

mutatott magasabb érzékenységet (24. ábra). A pH mellett hatása lehet az eluensmódosító

koncentrációjának is, mert ionszuppressziót okozhat. A savas környezetben általánosan

használt 0,1% hangyasavas pH módosító 10× hígítása 2-4 arányú érzékenységnövekedést

okozott. Ezért a végleges optimált módszerben 0,01% (pH 3,1) koncentrációban hangyasavat

adtam az eluensekhez.

24. Ábra. A vizsgálandó komponensek pH-tól függő relatív intenzitása hangyasavas környezetben (a legkisebb

értékre normálva).

Mikro UHPLC-MS/MS módszeroptimálás

Egy érzékeny és robusztus mikro LC-MS/MS módszert fejlesztettem a NSAID molekulák

extrém alacsony szintű meghatározására, ami a vizsgálandó komponens koncentrációtól és a

mátrix összetettségétől függően különböző minta-előkészítési technikákkal kombinálható. A

módszerfejlesztésénél különös figyelemmel kezeltem a kromatográfia érzékenységnövelő

lehetőségeit, ezért a mikro LC - on-line SPE rendszert, a nagy mintatérfogatú injektálást és a

gyorskromatográfiás mikro elválasztást optimáltam. A pH-logD diagram alacsony pH

értékeinél a logD nagyobb nullánál, ami fordítottfázisú elválasztást határoz meg. Ezért 0,01%

68

hangyasav jelenlétében C18-as kolonnán végeztem a komponensek kromatográfiáját (25. ábra).

Interferencia figyelhető meg 1,45 percnél, ahol az acetilszalicilsav intenzív csúcsot ad a

szalicilsav MRM átmeneténél (137,0/92,8 m/z). Az acetilszalicilsav COOH csoport vesztésével

keletkező forrás fragmensionja ugyanazt az anya/lány tömegű ionátmenetet képezi mint a

szalicilsav. A kromatográfiás elválasztás megfelelő felbontással elszeparálja a csúcsokat

egymástól, ezért a szalicilsav mennyiségi meghatározásánál nem okoz nehézségeket az

interferencia. Az acetilszalicilsav mennyiségi meghatározásához pedig az [M-H]- (178,9/136,8

m/z) molekulaion átmenetet választottam ki a kedvezőbb jel/zaj viszony miatt, ami alacsonyabb

LOQ érték elérést eredményez.

25. Ábra. A 10 NSAID MRM kromatogramja 1 ng/ml standard munkaoldat injektálásakor. A: acetaminofen, B:

acetilszalicilsav, C: diklofenák, D: fenoprofén, E: flurbiprofén, F: ibuprofén, G: indometakin, H:

ketoprofén, I: naproxen, J: szalicilsav

NSAID meghatározása környezeti mintákból és módszervalidáció

Célul tűztem ki olyan érzékeny módszer kidolgozását, mely alkalmas a NSAID molekulák

szimultán meghatározására bonyolult minta-előkészítés nélkül, direkt mintaelemzéssel

ivóvízből, felszíni vízből és szennyvízből. A minta-előkészítés elhagyása drasztikusan

csökkentheti a mérési folyamat idejét, javíthat a pontosságon és a reprodukálhatóságon,

ellenben komoly mátrixhatáshoz vezet, ami gyenge pontját képezheti az eljárásnak. Ez

kifejezetten kritikus lehet nagy mintatérfogat injektálásakor. A mátrixkomponensek javíthatják,

vagy ronthatják (többségében rontják) a vizsgálandó komponens ionizációs hatásfokát,

69

kihatással vannak a kromatográfiás elválasztásra, pontatlan elemzést eredményeznek. Az előző

okok miatt különös figyelmet fordítottam a módszerkidolgozásnál a mátrixhatás

tanulmányozására. A mátrixhatás elemzésénél a vizsgálati oldatok – 99,9%, 50% és 20%

ivóvíz; 50% és 20% felszíni víz; 20% és 10% szennyvíz tartalmú oldatok (NSAID mentes

mátrixot higítottam ultratiszta vízzel a megfelelő arányban) – válaszjelét, csúcsait hasonlítottam

össze ultratiszta vízzel hígított kalibrációs oldat válaszjelével 10 ng/ml koncentrációszinten öt

ismétlést végezve (10. táblázat). A különböző mátrixok megfelelő hígítási arányának

kiválasztásánál az LOQ-t (S/N) és a rendszer szennyeződését vettem figyelembe. Az

eredmények alapján az ivóvíz mátrixhatás változását elhanyagolhatónak tekintettem a hígítás

függvényében. A legnagyobb eltérés (10%) az acetaminofen, az indometacin és naproxen

vegyületeknél figyelhető meg. Az alacsony LOQ eléréséhez az ivóvíz meghatározást hígítás

nélkül végeztem. A másik két mátrix jelentős különbséget mutatott a különböző hígítási

arányoknál és nagyobb hatásuk van a készülék szennyezésében is. Így végül

kompromisszumként felszíni vizeknél 20%, szennyvizeknél 10% hígítási arányt állapítottam

meg. A módszervalidálást és a környezeti minták vizsgálatát ennek megfelelően végeztem el.

Vegyület Mátrixhatás (%)

Ivóvíz Felszíni víz Szennyvíz

20% 50% 100% 20% 50% 10% 20%

Acetaminofen 88,7 81 79,3 82,4 61,7 76,8 50,2

Acetilszalicilsav 40,4 38,6 37,5 45,2 41,3 47,2 40,9

Diklofenák 71,8 70,0 72,1 73,5 68,6 65,8 46,8

Fenoprofén 104 99,8 97,3 108 103,3 88,0 79,6

Flurbiprofén 102 104 101 109 103,9 90,0 82,6

Ibuprofén 104 97,3 99 107 104,8 83,8 76

Indometakin 71,8 66,8 60,3 82,8 67,3 65,2 44,9

Ketoprofén 102 99,9 94,6 102 99,9 96,5 76,9

Naproxen 91,5 84,4 79,9 98,3 88,2 74,0 64,2

Szalicilsav 46,0 43,5 41,7 48,3 43,7 52,4 54,7

10. Táblázat. Mátrixhatás vizsgálata a különböző mátrixokban eltérő hígítási arány mellett. 99,9%, 50% és

20% ivóvíz; 50% és 20% felszíni víz; 20% és 10% szennyvíz tartalmú oldatok csúcs alatti területeinek

összehasonlítása az ultratiszta vizes kalibrációs oldat csúcs alatti területeivel 10 ng/ml koncentrációszinten.

Módszervalidálás

Szelektivitás

A módszer szelektivitását a NSAID mentes mátrix minták (háttér) és az LOQ szintjén

addícionált mátrix kalibrációs minta kromatogramjainak összehasonlításával határoztam meg.

70

A jel/zaj viszony az LOQ értéknél a mátrixhoz viszonyítva nagyobb volt mint 5, ezért a módszer

sikeresen teljesítette a szelektivitási kritériumot.


A kalibrációs egyenesek jól illeszkedtek a 15 kalibrációs pontra a teljes kalibrációs

tartományban (0.001-100 ng/ml) 5 párhuzamos mérés átlagából számítva, az egyenesek

korrelációs együtthatói 0,9950 és 0,9995 közötti értékűek (11. táblázat). A regressziós

egyenesek 1/x-es súlyozása kielégítő eredményt adott megfelelő pontossággal és precizitással

(13% alatt) minden egyes kalibrációs pontnál. Az LOD és LOQ értékek illeszkedtek az előírt

FDA kritériumokhoz, az LOQ értékek teljesítették a 20%-os relatív hiba és szóráshatárt.

Vegyület ivóvíz felszíni víz szennyvíz

LOQ (ng/ml) LOD (ng/ml) R LOQ (ng/ml) LOD (ng/ml) R LOQ (ng/ml) LOD (ng/ml) R

Acetaminofen 0,05 0,025 0,9984 0,1 0,05 0,9991 0,25 0,1 0,9983

Acetilszalicilsav 0,1 0,05 0,9990 1 0,5 0,9979 2,5 1 0,9952

Diklofenák 0,05 0,025 0,9985 0,1 0,05 0,9981 0,25 0,1 0,9993

Fenoprofén 0,025 0,01 0,9954 0,05 0,025 0,9968 0,1 0,05 0,9987

Flurbiprofén 0,05 0,025 0,9954 0,25 0,1 0,9984 0,25 0,1 0,9981

Ibuprofén 0,05 0,01 0,9974 0,25 0,1 0,9956 0,5 0,25 0,9950

Indometakin 0,005 0,001 0,9956 0,01 0,005 0,9990 0,025 0,01 0,9992

Ketoprofén 0,025 0,01 0,9951 0,25 0,1 0,9994 0,5 0,1 0,9993

Naproxen 0,01 0,005 0,9982 0,025 0,01 0,9994 0,05 0,025 0,9995

Szalicilsav 0,05 0,025 0,9972 0,1 0,05 0,9987 0,5 0,25 0,9993

11. Táblázat. A 10 NSAID kalibrációs eredményei, LOQ, LOD és korrelációs együttható értékei.


A napon belüli és napok közötti helyesség és precizitás vizsgálatok 3 különböző

koncentrációszinten (alacsony, közepes, magas) vizsgálva 5 különböző mérés átlagaként

(napon belüli) 4 különböző napon (napok közötti), jó korrelációt mutattak, teljesítve a 15%-os

kritérium szintet (12. táblázat). A napon belüli RE és CV értékek ivóvíznél (-5,63 – 6,0) és

(1,43 – 9,58), felszíni víznél (-4,67 – 8) és (1,6 – 9,67), szennyvíznél (-5,19 – 7,77) és (0,75 –

10,0) intervallumban helyezkednek. A napok közötti helyesség és precizitás eredmények

ivóvíznél (-7,33 – 5,53) és (0,88 – 9,57), felszíni víznél (-9,36 – 6,08) és (0,31 – 8,35),

szennyvíznél (-9,33 – 7,37) és (0,23 – 10,0) intervallum közötti értékeket vesznek fel. Az

eredmények alapján a módszer megfelel a validálás kritériumának.

Vegyület Névleges koncentráció

(ng/ml)

Napon belüli (ng/ml, n=5) Napok közötti (ng/ml, n=4)

ivóvíz felszíni víz szennyvíz ivóvíz felszíni víz szennyvíz

Átlag RE% CV% Átlag RE% CV% Átlag RE% CV% Átlag RE% CV% Mean RE% CV% Mean RE% CV%

Acetaminofen 0,75 0,73 -2,40 2,25 0,79 4,67 9,06 0,80 6,00 1,07 0,75 0,53 6,27 0,74 -1,20 4,33 0,74 -1,87 2,38

7,5 7,82 4,31 3,84 7,36 -1,87 8,03 7,45 -0,67 1,91 7,57 0,96 5,53 6,80 -9,36 1,30 7,61 1,44 3,04

75 75,0 0,03 4,68 79,3 5,76 4,34 78,9 5,20 1,57 75,1 0,17 2,94 69,3 -7,66 2,96 78,5 4,70 7,17

Acetilszalicilsav 0,75 0,76 1,33 2,89 <LOQ

<LOQ

0,73 -2,67 3,67 <LOQ

<LOQ

7,5 7,65 2,03 2,40 7,87 4,93 7,49 7,14 -4,80 5,15 7,71 2,84 3,51 7,55 0,68 5,35 7,55 0,63 7,45

75 77,6 3,41 1,43 72,4 -3,53 5,69 71,1 -5,19 6,67 72,9 -2,76 6,25 79,6 6,08 0,31 80,3 7,02 3,88

Diklofenák 0,75 0,71 -5,07 5,63 0,72 -4,53 8,37 0,80 6,40 9,76 0,76 1,20 0,88 0,72 -3,60 5,24 0,74 -1,87 2,50

7,5 7,95 6,00 5,42 7,49 -0,13 4,38 7,30 -2,67 0,75 7,92 5,53 3,60 7,42 -1,05 6,90 7,62 1,57 4,79

75 75,1 0,19 3,36 75,0 0,01 2,96 75,0 0,02 4,91 74,5 -0,62 1,23 76,3 1,76 2,82 76,5 1,96 1,11

Fenoprofén 0,75 0,72 -4,41 8,31 0,72 -4,03 2,35 0,78 4,27 4,06 0,70 -7,33 3,52 0,76 1,33 2,60 0,74 -0,80 0,23

7,5 7,84 4,53 1,81 7,89 5,20 3,88 7,47 -0,47 1,91 7,30 -2,67 7,30 7,89 5,13 1,18 7,28 -2,93 6,22

75 75,4 0,58 9,58 76,9 2,52 6,78 71,1 -5,15 2,81 77,4 3,17 9,57 75,2 0,22 1,27 71,7 -4,37 9,51

Flurbiprofén 0,75 0,74 -1,87 6,80 0,81 8,00 2,73 0,77 2,64 9,97 0,76 1,73 6,54 0,73 -3,07 4,10 0,72 -4,27 10,0

7,5 7,11 -5,20 2,76 7,41 -1,20 5,99 7,68 2,40 3,77 7,25 -3,36 5,46 7,74 3,24 4,99 7,22 -3,69 9,58

75 75,1 0,09 4,64 75,0 0,04 5,78 73,2 -2,40 5,94 72,2 -3,78 5,63 73,9 -1,51 1,33 73,9 -1,52 9,54

72


(ng/ml)

Napon belüli (ng/ml, n=5) Napok közötti (ng/ml, n=4)

ivóvíz felszíni víz szennyvíz ivóvíz felszíni víz szennyvíz

Átlag RE% CV% Átlag RE% CV% Átlag RE% CV% Átlag RE% CV% Mean RE% CV% Mean RE% CV%

Ibuprofén 0,75 0,78 3,33 4,56 0,76 1,33 5,35 0,72 -4,53 1,81 0,73 -2,27 4,47 0,72 -4,00 4,71 0,68 -9,33 5,61

7,5 7,12 -5,07 2,22 7,81 4,13 7,25 7,82 4,27 9,53 7,51 0,11 5,86 7,47 -0,36 3,02 7,36 -1,88 5,86

75 75,0 0,04 4,16 73,5 -2,00 6,25 73,6 -1,87 3,48 75,8 1,01 4,47 75,4 0,57 5,08 75,4 0,58 4,81

Indometakin 0,75 0,79 5,20 3,65 0,78 4,40 5,01 0,72 -4,00 3,28 0,78 3,47 1,63 0,73 -3,20 5,78 0,72 -4,27 5,23

7,5 7,50 0,01 4,82 7,78 3,73 3,14 7,65 2,00 2,21 7,70 2,69 3,25 7,56 0,77 2,43 7,72 2,93 3,93

75 76,3 1,76 2,61 75,1 0,18 5,08 75,2 0,21 10,0 70,7 -5,75 4,34 70,7 -5,77 8,35 76,0 1,31 7,67

Ketoprofén 0,75 0,79 4,67 2,34 0,72 -4,67 2,90 0,79 5,49 6,83 0,72 -3,73 4,83 0,78 4,27 6,52 0,75 -0,67 8,53

7,5 7,23 -3,60 2,38 7,15 -4,67 4,51 7,16 -4,53 4,36 7,49 -0,16 8,95 7,54 0,57 3,00 7,56 0,75 4,34

75 70,8 -5,63 3,13 75,1 0,15 7,37 75,2 0,30 7,50 69,5 -7,32 3,89 75,1 0,09 7,42 72,0 -4,02 5,92

Naproxen 0,75 0,74 -0,87 2,99 0,74 -1,87 2,81 0,78 4,00 4,31 0,72 -3,47 6,71 0,72 -4,13 2,67 0,77 2,67 5,21

7,5 7,68 2,40 3,57 7,92 5,60 1,60 7,50 7,77 1,55 7,23 -3,56 7,51 7,65 2,05 2,28 7,35 -2,03 5,44

75 79,0 5,27 3,13 75,1 0,16 2,67 78,9 5,23 6,09 71,6 -4,53 8,81 76,7 2,32 5,51 73,5 -1,99 9,12

Szalicilsav 0,75 0,79 5,33 4,59 0,73 -2,80 9,67 0,76 1,33 9,16 0,73 -2,93 2,14 0,75 -0,13 5,56 0,74 -0,80 7,80

7,5 7,77 3,60 1,77 7,18 -4,27 2,45 7,69 2,53 6,42 7,73 3,03 5,40 7,59 1,24 3,51 8,05 7,37 3,68

75 75,0 0,05 4,55 79,2 5,60 1,74 75,1 0,20 8,68 75,2 0,26 4,99 71,1 -5,25 4,78 72,3 -3,59 7,99


12. Táblázat. Napon belüli és napok közötti megbízhatóság értékek három különböző koncentrációszinten.


A visszanyerés vizsgálattól eltekintettem a validálás során, mert extrakciót vagy egyéb

bonyolultabb minta-előkészítési lépést nem tartalmaz a validálni kívánt módszer.

A mátrixhatás tanulmányozásakor azonos koncentrációszinten hasonlítottam össze standard

kalibrációs oldatot a mátrixhoz adott és különböző arányban vízzel hígított kalibrációs oldattal.

Minden egyes mátrixnál 5 mérést végeztem 10 ng/ml koncentrációnál. Ivóvíznél hígítás nélküli

mátrixhatást vizsgáltam, felszíni víznél 20%-ra és szennyvíznél 10%-ra hígított mátrixnál

határoztam meg. Nagy érzékenységcsökkenést acetilszalicilsavnál (40-50%) és szalicilsavnál

(40-50%) tapasztaltam. A szennyvíz vizsgálatánál különösen magas mátrixhatást észleltem.

Acetaminofen, diklofenák és indometakin mutatott még releváns matrixhatást ívóvízben és

felszíni vízben, egyéb esetben kisebb volt a mátrixhatás mint 15%. Az eredményeket a 10.

táblázat vastagon szedett oszlopaiban foglaltam össze.

Stabilitás

A QC minták (3 különböző koncentrációszinten) felhasználásával végeztem el a

stabilitásvizsgálatokat. Különböző körülmények között mátrixban (rövidtávú stabilitás (12 h)

szobahőmérsékleten; hosszútávú stabilitás -20 °C-on 14 napig; három lefagyasztás –

felolvasztás ciklus stabilitás) és előkészített mintával injektálási körülményeknél (24 h-án

keresztül 20 °C-on) tanulmányoztam a vizsgálandó komponensek stabilitását (13. táblázat). Az

elfogadható tartományon belüli eredményeket kaptam, a vizsgálandó komponensek stabilnak

bizonyultak a különböző körülmények között. Nem találtam koncentráció- vagy

komponensfüggést a visszanyerésben. Az RE értékek az előző stabilitási sorrendnek

megfelelően ivóvíznél (-10,4 – 10,6); (-9,6 – 6,8); (-8,24 – 5,37), felszíni víznél (-10,9 – 8,08);

(-10,0 – 10,2); (-9,86 – 7,07) és szennyvíznél (-9,33 – 7,92); (-10,0 – 7,87); (-10,6 – 6,0)

intervallumok értékeit vették fel, teljesítve a 15%-os kritérium határt.


(ng/ml)

Injektor 24 h Hosszútávú stabilitás Lefagyasztás – felolvasztás stabilitás

ivóvíz felszíni víz szennyvíz ivóvíz szennyvíz ivóvíz ivóvíz felszíni víz szennyvíz

Koncentráció (átlag ± S.D. ng/ml)









Acetaminofen 0,75 0,8 ± 0,01 0,77 ± 0,08 0,77 ± 0,07 0,72 ± 0,02 0,75 ± 0,03 0,69 ± 0,05 0,78 ± 0,06 0,73 ± 0,05 0,78 ± 0,01

7,5 7,47 ± 0,16 6,94 ± 0,42 7,87 ± 0,30 7,07 ± 0,10 7,37 ± 0,53 7,29 ± 0,47 7,45 ± 0,22 7,11 ± 0,25 7,53 ± 0,43

75 70,3 ± 1,77 69,8 ± 3,47 72,9 ± 2,24 74,2 ± 1,91 68,8 ± 2,25 76,7 ± 3,51 75,6 ± 2,37 68,1 ± 2,55 78,5 ± 2,89

Acetilszalicilsav 0,75 0,77 ± 0,08 <LOQ <LOQ 0,69 ± 0,06 <LOQ <LOQ 0,72 ± 0,07 <LOQ <LOQ

7,5 7,45 ± 0,19 7,22 ± 0,58 8,09 ± 0,26 6,85 ± 0,40 6,81 ± 0,14 7,76 ± 0,14 6,9 ± 0,25 6,86 ± 0,32 6,95 ± 0,38

75 67,1 ± 1,09 69,1 ± 4,79 75,9 ± 5,68 67,8 ± 1,88 69,2 ± 3,24 71,5 ± 1,96 68,8 ± 2,87 67,6 ± 1,09 68,8 ± 1,95

Diklofenák 0,75 0,7 ± 0,04 0,67 ± 0,06 0,71 ± 0,03 0,77 ± 0,03 0,72 ± 0,04 0,76 ± 0,03 0,77 ± 0,04 0,75 ± 0,05 0,80 ± 0,02

7,5 7,8 ± 0,45 7,97 ± 0,51 7,43 ± 0,42 7,99 ± 0,17 7,95 ± 0,31 7,71 ± 0,26 7,81 ± 0,14 7,75 ± 1,05 7,87 ± 0,34

75 73,3 ± 5,78 81,1 ± 2,70 77,1 ± 1,78 71,2 ± 1,49 80,8 ± 5,77 75,8 ± 8,36 74,9 ± 2,04 80,3 ± 1,93 79,4 ± 3,73

Fenoprofén 0,75 0,7 ± 0,08 0,68 ± 0,04 0,69 ± 0,02 0,69 ± 0,07 0,68 ± 0,06 0,68 ± 0,03 0,69 ± 0,01 0,69 ± 0,06 0,70 ± 0,06

7,5 8,0 ± 0,14 7,81 ± 0,60 6,88 ± 0,18 7,68 ± 0,23 6,97 ± 1,64 8,09 ± 0,37 7,65 ± 0,21 6,83 ± 0,29 7,23 ± 0,03

75 73,2 ± 3,96 76,9 ± 4,11 68,0 ± 1,44 69,8 ± 1,56 72,1 ± 1,64 72,1 ± 5,28 69,3 ± 1,06 69,3 ± 2,64 68,4 ± 0,73

Flurbiprofén 0,75 0,7 ± 0,01 0,69 ± 0,00 0,74 ± 0,11 0,68 ± 0,04 0,71 ± 0,17 0,70 ± 0,04 0,74 ± 0,03 0,68 ± 0,18 0,69 ± 0,24

7,5 8,0 ± 0,23 7,42 ± 0,72 6,95 ± 0,14 7,31 ± 0,48 7,35 ± 1,02 7,34 ± 0,41 7,25 ± 0,15 6,76 ± 0,23 6,91 ± 0,65

75 78,9 ± 4,47 76,1 ± 3,09 68,7 ± 2,88 70,4 ± 1,36 77,3 ± 5,50 75,6 ± 4,66 69,3 ± 4,23 70,4 ± 1,07 67,7 ± 4,81

75


(ng/ml)

Injektor 24 h Hosszútávú stabilitás Lefagyasztás – felolvasztás stabilitás

ivóvíz felszíni víz szennyvíz ivóvíz szennyvíz ivóvíz ivóvíz felszíni víz szennyvíz










Ibuprofén 0,75 0,7 ± 0,03 0,70 ± 0,09 0,68 ± 0,08 0,71 ± 0,02 0,68 ± 0,03 0,73 ± 0,03 0,77 ± 0,03 0,71 ± 0,07 0,76 ± 0,05

7,5 8,2 ± 0,16 7,42 ± 0,26 6,99 ± 0,13 7,62 ± 0,07 6,97 ± 0,25 7,40 ± 0,25 7,69 ± 0,27 7,93 ± 0,27 7,77 ± 0,20

75 82,9 ± 0,44 72,1 ± 4,66 71,5 ± 5,20 76,8 ± 5,82 71,3 ± 0,74 69,6 ± 3,98 79,0 ± 0,94 80,1 ± 1,89 76,8 ± 3,74

Indometakin 0,75 0,8 ± 0,02 0,68 ± 0,04 0,70 ± 0,02 0,80 ± 0,02 0,75 ± 0,06 0,72 ± 0,04 0,78 ± 0,01 0,71 ± 0,04 0,70 ± 0,02

7,5 8,0 ± 0,17 7,74 ± 0,39 7,85 ± 0,53 7,65 ± 0,17 7,55 ± 1,08 7,37 ± 0,57 7,80 ± 0,04 7,51 ± 1,10 7,30 ± 0,32

75 70,9 ± 4,17 72,0 ± 3,23 77,5 ± 0,22 71,2 ± 3,94 73,7 ± 4,47 71,6 ± 1,10 69,4 ± 3,66 68,8 ± 6,30 75,0 ± 5,56

Ketoprofén 0,75 0,7 ± 0,07 0,77 ± 0,04 0,74 ± 0,10 0,73 ± 0,02 0,71 ± 0,04 0,68 ± 0,04 0,75 ± 0,05 0,71 ± 0,06 0,69 ± 1,00

7,5 7,9 ± 0,11 7,54 ± 0,51 6,99 ± 0,12 7,22 ± 0,14 7,36 ± 0,30 6,75 ± 0,65 7,88 ± 0,25 7,76 ± 0,42 7,11 ± 0,21

75 68,9 ± 3,28 77,7 ± 4,02 71,1 ± 3,64 70,6 ± 2,47 82,6 ± 0,80 70,1 ± 4,29 72,5 ± 3,54 78,0 ± 0,44 68,2 ± 1,73

Naproxen 0,75 0,72 ± 0,09 0,71 ± 0,02 0,69 ± 0,02 0,69 ± 0,01 0,70 ± 0,09 0,71 ± 0,17 0,72 ± 0,01 0,69 ± 0,08 0,69 ± 0,17

7,5 8,0 ± 0,14 7,91 ± 0,35 6,93 ± 0,26 7,65 ± 0,31 6,75 ± 2,46 6,82 ± 0,29 7,85 ± 0,07 7,92 ± 0,26 6,98 ± 0,19

75 72,1 ± 2,63 79,4 ± 2,58 69,3 ± 1,05 68,7 ± 1,18 69,8 ± 2,46 70,8 ± 1,32 71,0 ± 1,70 70,2 ± 2,66 67,1 ± 2,75

Szalicilsav 0,75 0,71 ± 0,04 0,72 ± 0,04 0,72 ± 0,03 0,76 ± 0,05 0,72 ± 0,03 0,71 ± 0,04 0,73 ± 0,03 0,76 ± 0,07 0,69 ± 0,07

7,5 7,9 ± 0,24 7,25 ± 0,62 7,60 ± 0,49 7,35 ± 0,15 7,02 ± 0,32 7,09 ± 0,80 7,26 ± 0,21 7,52 ± 0,36 7,33 ± 0,49

75 75,8 ± 1,36 73,0 ± 1,78 68,3 ± 4,35 77,5 ± 0,57 69,0 ± 0,69 68,3 ± 4,77 75,4 ± 2,73 70,7 ± 2,54 70,0 ± 1,89

* S.D.: standard deviation

13. Táblázat. Stabilitás különböző körülmények között.

Környezeti minták vizsgálata

A validált módszert környezeti minták elemzésére és értékelésére használtam fel. Ivóvízből és

felszíni vízből a detektálás alsó határánál magasabb koncentrációban jelenlévő

gyulladáscsökkentő vegyületeket nem mutattam ki. Naproxen, ketoprofen, ibuprofen,

diklofenák jelenlétét 0,31-21,7 ng/ml koncentrációs tartományban szennyvízi mintákból

sikeresen kimutattam. A minták elemzését szennyvíztisztítási folyamat jellemzéséhez végeztem

el, a biológiai tisztítás előtt a szennyvíz a fent említett tartományban tartalmazta a

komponenseket, amik a tisztítási eljárás után a kimutatási határérték alá csökkentek. Az ivóvíz

minták Budapest hálózati rendszeréből származnak 10 különböző helyről. A felszíni vizeket

Budapest régiójában a Dunából 4 különböző ponton vettem. Szennyvíz esetén 50 minta

elemzését végeztem el.


Kidolgoztam és validáltam egy on-line SPE mikro UHPLC-MS/MS módszert 10 különböző

NSAID szimultán meghatározására ivóvízből, felszíni vízből és szennyvízből. A

módszerfejlesztés közben különös figyelmet fordítottam a kromatográfiás és

tömegspektrometriás paraméterek hatásának tanulmányozására és optimálására. Az

irodalomban még nem említett forrás fragmensionok kiválasztásával érzékeny detektálást értem

el. Vizsgáltam az érzékenység pH függését, savas környezetben tízszer intenzívebb jelet

kaptam, illetőleg az eluensmódosító tízszeres hígítása 2-4 szeres érzékenységnövekedést

eredményezett. A szelektív tömegspektrométer érzékenységét mikro UHPLC és csapdázó

kolonna alkalmazásával tovább növeltem, ezzel sikerült elérnem nagyon alacsony 1-10 pg/ml

meghatározási határt. A módszer legfőbb előnye, hogy nem igényel nagy térfogatú

mintakezelést, rövid meghatározási idővel rendelkezik és egyszerű, könnyen reprodukálható

lépéseket tartalmaz. Ennek eredményeként egy nagy érzékenységű, szelektív és megbízható

validált módszert sikerült kidolgozni rutin analitikai felhasználásra. A módszer kibővítése

komplex minta-előkészítési lépésekkel tovább javíthatja az LOD és LOQ értékeket, alkalmassá

teheti egyéb mátrixok (például szilárd minták) elemzésére.

77

5.4. Mikro UHPLC - konvencionális HPLC és ESI - APCI

összehasonlítása


Ebben a fejezetben a konvencionális HPLC-t a mikro LC-vel hasonlítom össze az eddigi

kísérletek eredményeiből kiindulva, illetőleg különböző ionizációs technikák (ESI, APCI)

alkalmazhatóságát mutatom be apoláris molekulák vizsgálatához. Modellvegyületekként a

nemi hormonokat választottam.

A nemi hormonok fő komponensei, az ösztrogének meghatározása komoly kihívás a mai napig,

ESI ionizálhatóságuk jóval gyengébb és koncentrációjuk a humán szérumban sokkal

alacsonyabb mint egyéb szteroidhormonoké. Vizsgálatukhoz a minta-előkészítés, a

kromatográfiás elválasztás és az MS együttes érzékenységnövelése szükséges. A minta-

előkészítés általában dúsítási lépést tartalmaz a fehérjekicsapást és/vagy extrahálást követően.

Számos cikk foglalkozik folyadék-folyadék extrakcióval (LLE) [125–127] és sokan dolgoznak

szilárd fázisú extrakcióval [128–130]. A mintaszám ugrásszerű növekedése a rutin analitikai

eljárásoktól megköveteli a minél rövidebb meghatározási időt, illetve a szelektivitás,

érzékenység és robusztusság javítása érdekében egyre jobban előtérbe kerülnek az on-line SPE

megoldások is [126,127,131–133]. A minta-előkészítési és a kromatográfiás rendszeren kívül

az MS-ben is lehetőség van az érzékenység nagyságrendi növelésére. A vegyületek gyenge ESI

ionizációs hatásfoka javítható kémiai módosítással [125,128,134–139]. Az egyik

legelterjedtebb származékolószer a danzil-klorid az egyszerű, gyors és hatékony reakció miatt

[140,141]. Az általánosan alkalmazott ESI ionizációs technika mellett, az apoláris

vegyületekhez jobban illeszkedő APCI [142,143] és APPI [144] technikákkal is csökkenthető

az LOD és LOQ.

Munkám elsődleges célja LC-MS módszerek összehasonlítása az érzékenység tükrében az

elérhető legkisebb meghatározási és detektálási határok összevetésével. Másik célom az

eredmények felhasználásával a publikációkban leírtaknál érzékenyebb, egyszerűbb, gyorsabb

eljárás kidolgozása alacsony koncentrációjú nemi hormonok mennyiségi meghatározására

humán szérumból.

5.4.2. Törzs-, kalibrációsoldatok készítése

A törzsoldatokat a szteroidhormonok metanolban oldásával készítettem 0,5 mg/ml

koncentrációban. A kalibrációs oldatok 0,01-1000 ng/ml koncentrációs tartományban (az egyes

78

módszerektől függően) a törzsoldatok elegyítésével, majd vizes hígításával készítettem. A

kalibrációsoldatokat a szérumminták kalibrációs oldataihoz és a módszerek optimálásához

használtam fel.

5.4.3. Származékképzési reakció

A származékképzést danzil-kloriddal végeztem, ami az ösztrogének fenolos

hidroxilcsoportjával kvantitatívan reagál szulfonsavésztert képezve (26. ábra). A reakcióban az

ösztrogénhez bázikus amino csoport kapcsolódik, ami könnyen ionizálható és a forrásban

[M+danz+H]+ ionná válik. A reakciót Na2CO3 hozzáadása katalizálja [141,145,146].

26. Ábra. A danzil-kloriddal végzett származékképzési reakció.

5.4.4. Származékképzési reakció standard oldatsorozattal

A származékképzési reakcióhoz 1 mg/ml koncentrációban danzil-kloridot oldottam

acetonitrilben. 10 µl vizes kalibrációs oldathoz 50 µl danzil-klorid oldatot és 40 µl 1 mg/ml

Na2CO3 oldatot adtam. 10 másodperc kevertetés után az elegyet 10 percig 60ºC-on

melegítettem, ami alatt végbement a származékképzési reakció [146]. Végül 100 µl vizet adtam

hozzá és kipipettáztam az oldatot egy mintatartóba.


Származékképzés nélkül mért minták és kalibrációs oldatok készítéséhez 500, illetve 450 µl

szérumból indultam ki (kalibrációs oldatoknál a szteroidmentes szérumhoz adtam hozzá 50 µl

standard oldatot), amihez 1,5 ml etilacetátot pipettáztam, 10 percig kevertettem, majd a jobb

fáziselválás érdekében 12500 rpm (15000 ×g) fordulatszámon 10 percig centrifugáltam. A

szerves fázist N2 segítségével szárazra pároltam, 200 µl 80/20 V/V víz-acetonitril elegyével

újra oldottam.

Származékképzéssel mért minták és kalibrációs oldatok készítésénél a szárazra párolt

maradékhoz 50 µl danzil-klorid oldatot, majd 50 µl 1 mg/ml Na2CO3 oldatot adtam. 10

másodperc kevertetés után az oldatot 10 percig 60ºC-on melegítettem, ami alatt végbement a

79

származékképzési reakció. Végül 100 µl vizet adtam hozzá és mintatartóba pipettáztam az

oldatot.

5.4.6. Folyadékkromatográfiás körülmények

A módszer: Konvencionális HPLC elválasztásnál Thermo Scientific, 5 µm Beta-Basic C18,

120 Å, 50 × 2,1 mm kolonnát használtam. Eluensként 0,1% hangyasavas vizet és 0,1%

hangyasavas ACN-t használtam, a gradiens programot és az áramlási sebességet a 14. táblázat

tartalmazza.

A módszer B módszer C módszer D/E módszer

Eluens A (%)

Eluens B (%)

Idő (perc) Áramlási sebesség (µl/perc)

Idő (perc)

Áramlási sebesség (µl/perc)

Idő (perc)


Idő (perc)


0 90 10 0 800 0 800 0 800 0 35

1 90 10 0,5 800 1,5 800 3,5 800 0,2 35

2 10 90 3 800 4 800 5 800 0,8 35

3 10 90 5 800 6 800 7 800 2 35

4 90 10 5,1 800 6,1 800 7,5 800 2,1 35

5 90 10 9 800 10 800 8 800 3 35

14. Táblázat. Nemi hormonok kromatográfiás elválasztásának paraméterei különböző módszereknél.

B módszer: A konvencionális HPLC elválasztást kibővítettem on-line SPE csapdázó

kolonnával (Phenomenex, Strata 20 µm C18-E, 20 × 2 mm) (27. ábra). A mintaoldatot egy

különálló C nagynyomású pumpa (SPE pumpa) az injektorból a csapdázó kolonnára szállítja, a

minta apoláris komponensei megkötődnek az állófázison, a poláris mátrixkomponensek a

„waste”-be távoznak. C eluensként 95% víz, 5% metanol, 0,1% hangyasav elegyét használtam.

Az eluensprogramban izokratikus, állandó összetétel mellett 800 µl/perces áramlási

sebességgel 1,5 percig injektálási állásban az SPE ágon szállított, majd a szelepváltást követően

50 µl/perc áramlással az injektort mosta. Elválasztó kolonnának és mozgófázisnak az A

módszer-ben leírtakat alkalmaztam. A módszerhez Analyst szoftverrel vezérelt 6 furatú

szelepváltót használtam, ami az „a” kezdeti állásból 1,5 percnél „b” állásba váltott, majd 10

percnél a módszer végén vissza „a”-ba.

80

27. Ábra. On-line SPE elrendezés elvi ábrája.

C módszer: Az előző módszert kibővítettem többszörös injektálással. A mintahurok térfogatot

egymást követően háromszor injektáltam a csapdázó kolonnára, növelve a meghatározandó

komponens „on-column” mennyiségét. Ennek az előnye az egyszeri nagyobb mintatérfogat

injektálással szemben, hogy az injektálások között a folyamatos eluensáram mossa az SPE

kolonnát. Megváltoztattam a kromatográfiás gradiensprogramot a 28. ábra szerint, a módszer

mérési idejének csökkentése céljából a módszerek végén levő analitikai kolonna ekvilibrálási

szakaszát a mérés elejére építettem be, így az SPE kolonnára történő injektálás alatt a másik

ágon ekvilibrálom az analitikai kolonnát. Az injektálás 0; 1,25; 2,5 percnél történik és a

csapdázó kolonnán megkötött vizsgálandó komponenseket 3 perc után váltószelep segítségével

az analitikai kolonnára eluáltam. A rövid módszer kritikus pontja a holttérfogatok csökkentése,

ezért minimalizáltam az átkötő „PEEK csövek” hosszát.

28. Ábra. Többszörös injektálás módszer eluensprogram ábrája. A, B: gradiens eluensek, C: SPE eluens.

81

D módszer: Mikro LC módszerben Eksigent, 2,7 µm, HALO Fused-CorePhenyl Hexyl, 90 Å,

50 × 0,5 mm kolonnát alkalmaztam. Eluensként 0,1% hangyasavas vizet és 0,1 % hangyasavas

ACN-t használtam, a gradiens programot és az áramlási sebességet a 14. táblázat tartalmazza.

E módszer: Az előző mikro LC módszert kibővítettem on-line SPE, csapdázó technikával a

nagyobb mintatérfogatú injektáláshoz. Az SPE kolonnát a mintahurok helyére kötöttem be, a

mintatérfogatot AB Sciex, Protonosil 120 C18, 10 × 0,5 mm, 5 µm kolonnára direkt injektáltam

(17. ábra).


A tömegspektrométer analizátorának paramétereit (DP, EP, CE, CXP) az egyes vegyületekre

optimáltam fecskendőpumpa segítségével. Ütközőgázként N2 használtam. Az ionforrás értékeit

(gázfüggöny, ionizációs potenciál, ionforrás hőmérséklet, porlasztógáz, szárítógáz) az adott

kromatográfiás rendszerhez és az eluens összetételéhez, áramlási sebességéhez illesztettem. A

„dwell time” értékeket az áramlási sebesség és a vizsgált komponensek MRM csatornáinak

száma adta meg. Az ESI tű átmérője normál HPLC-nél a gyakorlatban megszokott általános

100 µm keresztmetszetű volt, mikro LC-nél szűkebb 65 µm átmérőjű tűvel dolgoztam.

ESI módszer (I): Elektroporlasztásos ionizációs technikával negatív módban [M-H]-

molekulaionnal ionizálódtak az ösztrogének (ösztron, ösztriol, ösztradiol), pozitív módban

[M+H]+ molekulaionnal a tesztoszteron, az MRM átmeneteket a 15. táblázat tartalmazza.

APCI módszer (II): A vizsgálandó komponensek detektálásához és az érzékenység

növeléséhez kidolgoztam légköri nyomású kémiai ionizációs módszert is. Az APCI forrás

stabil, optimális működéséhez a minimális mozgófázis betáplálásnak el kell érnie a 100-200

µl/perc-es áramlási sebességet, ezért ezt a technikát csak konvencionális HPLC-vel összekötve

használtam. A forrásparaméterei: gázfüggöny (CUR): 40; tű áramerősség (NC): 4 mikroamper;

ionforrás hőmérséklet (TEM): 550 ºC; porlasztógáz (GS1): 40; szárítógáz (GS2): 0. A

vizsgálandó komponensek MRM átmeneteit a 15. táblázat tartalmazza.

Származékolásos módszer (III): A detektálási érzékenység további növelésére könnyen

ionizálható származékokat képeztem a vizsgálandó komponensekből. A polárisabb

vegyületeket ESI pozitív ionizációs módban vizsgáltam a 15. táblázatban feltüntetett MRM

átmenetekkel.

82

Vegyület ESI módszer APCI módszer Származékolás módszer

MRM átmenetek (m/z) MRM átmenetek (m/z) MRM átmenetek (m/z)

Ösztriol M=288g/mol

287/171 (-) 271/133 522/171

287/145 (-) 271/157 522/156

Ösztradiol M=272g/mol

271/145 (-) 255/159 506,5/171

271/183 (-) 255/144 506,5/156

Ösztron M=270g/mol

269/145 (-) 271/157 504,5/171

269/143 (-) 271/133 504,5/156

Tesztoszteron M=288g/mol

289/97 289/97 289/97

289/109 289/109 289/109

15. Táblázat. A nemi hormonok MRM átmenetei különböző mérési módszerekben. (-): negatív ionizáció.


Kísérleteimben különböző LC-MS technikákat hasonlítok össze érzékenységük alapján.

Megvizsgálom az elérhető legkisebb kimutatási/meghatározási értékeket, kitérek a módszerek

korlátaira, előnyire és hátrányaira. Összevetem a konvencionális HPLC és a mikro LC

eredményeit, kiegészítve őket on-line SPE rendszerrel és többszörös injektálással. Vizsgálom a

többszörös injektálás hatásfokát és érzékenységnövelő lehetőségét. Összemérem az ionizációs

technikák (ESI, APCI) érzékenységét, az ionizációs hatásfok növeléséhez származékolom a

meghatározandó vegyületeket. A következő módszereket dolgoztam ki vizes kalibrációs

oldatok vizsgálatához (16. táblázat):

konvencionális HPLC (A)

konvencionális HPLC/SPE (B)

konvencionális HPLC/SPE többszörös

injektálás (C)

mikro UHPLC (D)

mikro UHPLC/SPE (E)

ESI ionizáció (I) (A/I) (B/I) (C/I) (D/I) (E/I)

APCI ionizáció (II) (A/II) (B/II) (C/II)

Származékolás ESI ionizáció (III)

(A/III) (B/III) (D/III) (E/III)

16. Táblázat. Módszerkombinációk, különböző HPLC megoldások eltérő ionizációs technikákkal.

Tömegspektrometriás körülmények összehasonlítása

A vizsgálandó komponensek szerkezetének megfelelően (apolárisabb jelleg) a legtöbb

irodalom származékolást vagy APCI ionforrás alkalmazását javasolja a magasabb érzékenység

eléréséhez. A tesztoszteron az előbbi feltételezésekkel ellentétesen intenzívebb jelet adott ESI

körülmények között (29. ábra). A két kromatogramból kiolvasható, hogy ESI ionizációval

zajosabb a mérés, viszont másfélszer akkora jelet kaptam. Ennek ellenére az APCI módszerrel

alacsonyabb LOQ értékek érhetőek el a kedvezőbb jel/zaj viszony miatt.

83

29. Ábra. Tesztoszteron kromatogramjai ESI és APCI ionizációs technikával mért körülmények között azonos

HPLC rendszer, koncentráció és injektálási térfogatnál.

Az ösztrogének sokkal gyengébb hatásfokkal ionizálódtak ESI-ben mint APCI-ban, több mint

százszoros érzékenységnövelést értem el az ESI ionforrás APCI-ra cserélésével. Az APCI

módszer optimálásakor az anyaion kiválasztásnál az ösztriol és az ösztradiol az ionforrásban

vizet veszít és az [M+H]+ ion mellett, sokkal intenzívebb [M-H2O+H]+ ion jelenik meg 271 m/z

és 255 m/z értékkel (30. ábra). Ezeket az ionokat kiválasztva és mérve fokoztam az

érzékenységet. Az ösztriol vízvesztése és így az MRM átmenetei az azonos tömegek miatt

interferenciát okoznak az ösztron átmeneteivel. A két molekula közötti polaritáskülönbség

kihasználásával megfelelő állófázison a két komponens elválasztható egymástól és eltérő

retenciós időkkel egyszerre vizsgálhatók (30. ábra).

84

30. Ábra. Az ösztriol, ösztron és ösztradiol MS anyaion spektruma (m/z (Da) – intenzitás (cps)) és

kromatográfiás elválasztása (idő (perc) – intenzitás (cps)) APCI ionizációs körülmények között

konvencionális HPLC-vel.

Az ösztrogének vizsgálata kritikus rendkívül alacsony koncentrációjuk miatt. Ezért a további

érzékenységnöveléshez szármézékképzéssel bővítettem a detektálást. Azonos kromatográfiás

rendszerrel, egyező „on-column” anyagmennyiségeket mérve a származékképzéssel a

kiindulási ESI ionizációhoz képest 1000×, az APCI-hoz képest 10× alacsonyabb kimutatási

értéket sikerült elérni.

Folyadékkromatográfiás körülmények összehasonlítása

Első megközelítésben az injektált térfogat növelésének hatását vizsgáltam a válaszjelre.

Konvencionális HPLC körülmények között injektáltam 20 µl és 180 µl vizes

kalibrációsoldatokat, összevetettem a két injektálással kapott csúcsmagasságokat 4

koncentrációnál 5 párhuzamost mérve (A módszer). Célszerűbb csúcsmagasságok alapján

értékelni az eredményeket, mert jobban szemlélteti az érzékenységet. Ösztradiol

meghatározásánál az intenzitásban is visszakaptam a kilencszeres különbséget a két injektálás

között (31. ábra).

85

31. Ábra. 20 µl és 180 µl térfogat injektálásának összehasonlítása standard vizes kalibrációs oldatok

konvencionális HPLC mérésénél, APCI ionizációs technikával, ösztradiol meghatározásakor.

Vizsgáltam a csapdázó kolonna használatának hatását is, a komponensfókuszálás miatt

növekszik a válaszjel intenzitása vagy anyagveszteség miatt csökken (B módszer). 180 µl vizes

kalibrációs oldatok injektálásánál, csapdázó kolonnával 10% intenzitásveszteséget tapasztaltam

(32. ábra). Viszont on-line SPE használatával az LC-MS kevésbé szennyeződik. A

kromatográfiás rendszer és az analizátor elszennyeződése érzékenységcsökkenéshez vezet, így

végül ez a 10% különbség csak a kezdeti időpillanatban áll fent a direkt injektálás javára.

Továbbá az on-line SPE paramétereinek finomhangolásával vagy egy másik csapdázó kolonna,

állófázis alkalmazásával ez a különbség csökkenthető.

32. Ábra. 180 µl térfogat injektálása vizes kalibrációs oldatokból standard (direkt) és on-line SPE körülmények

között, konvencionális HPLC és APCI ionizációnál, ösztradiol vizsgálatakor.

86

Nagy térfogatok többszörös injektálását jellemeztem 1×, 2× és 3× injektálva 180 µl-t. Az

injektálások számának növelésével nő a detektorig eljutó komponens mennyisége, ezért

alacsonyabb kimutatási értékek érhetők el (33. ábra). Többszörös injektálással tetszőleges

térfogatú mintamennyiség vizsgálata válik lehetővé függetlenül a mintahurok térfogatától.

Sikeresen csökkentettem a meghatározási határt 0,5 ng/ml-ről 0,05 ng/ml-re ösztradiol

vizsgálatánál.

33. Ábra. On-line SPE és többszörös injektálással elérhető kimutatási értékek konvencionális HPLC mérésnél,

ösztradiol vizes kalibrációs oldatok meghatározásakor, APCI ionizációs körülmények között. Illetőleg a

0,05ng/ml-es oldat kromatogramja 3×-os injektálásnál.

A kiindulásként alkalmazott (A módszer) 20 µl injektálási térfogattal elérhető 1 ng/ml-es

meghatározási határt sikerült lecsökkenteni 0,05 ng/ml értékre ösztradiol APCI ionizációs

meghatározásakor. A módszer mérési ideje számottevően nem változott (C módszer).

87

Összevetettem a konvencionális HPLC-vel (A módszer) és a mikro LC-vel (D módszer)

elérhető érzékenységi határokat, különböző koncentrációjú vizes kalibrációs oldatok 5-5 µl

térfogatú injektálásával. A csúcsmagasságok átlagát képeztem 5 mérésből. A tesztoszteron

vizsgálati eredményét mutatja a 34. ábra. Mikro LC csúcsai körülbelül 20× intenzívebbek, 5

ng/ml koncentrációjú oldat kromatogramjainak összehasonlítása bemutatja a nagyságrendi

jel/zaj viszony különbséget. Az eredmények igazolják a korábban leírtakat, miszerint az

alacsony LOD és LOQ értékek elérésében nagy segítséget nyújthat a mikro LC alkalmazása.

34. Ábra. 5 µl térfogat injektálásának összehasonlítása vizes kalibrációval konvencionális HPLC és mikro LC

körülmények között, tesztoszteron meghatározásakor (ESI ionizáció). A koncentrációknál mért

csúcsmagasságok közötti különbség, illetőleg a tesztoszteron kromatogramjai 5 ng/ml koncentrációjú oldat

injektálásakor Mikro LC-vel és konvencionális HPLC-vel.

88

Mikro LC-ben is összehasonlítottam a maximális injektálható mintahurok térfogatot (5 µl) (D

módszer) az on-line SPE kolonnára injektálható térfogattal (90 µl) (E módszer). A többszörös

vizsgálandó komponens anyagmennyiség jóval magasabb detektor válasz jelet eredményezett,

sikerült az LOQ értékét 10 pg/ml tartományig lecsökkenteni tesztoszteron vizes kalibrációs

oldatát injektálva (35. ábra).

35. Ábra. 5 µl és 90 µl térfogat injektálásának összehasonlítása standard és on-line SPE körülményeknél mikro

LC mérés esetén, tesztoszteron vizes kalibrációs oldatainak meghatározásakor (ESI ionizáció).

Végezetül összevetettem a konvencionális HPLC többszörös (3×) injektálás (C módszer) és a

mikro LC csapdázó kolonna (E módszer) eljárások eredményeit tesztoszteron vizes kalibrációs

oldatok mérésével. Mikro LC technikával érhetők el az alacsonyabb LOD és LOQ értékek (36.

ábra). A technika további előnye, hogy gyors, mindössze 3 perces módszer idejű, kevés az

oldószer igénye és kisebb a mintatérfogat, ami következtében kevesebb a készülékszennyezés.

89

36. On-line SPE mikro LC és többszörös injektálás konvencionális HPLC eredmények összehasonlítása

tesztoszteron vizes kalibrációs oldatainak meghatározásakor (ESI ionizáció). Illetőleg a 0,05 ng/ml oldat

kromatogramja mikro LC-vel vizsgálva.

Módszerek összehasonlítása és szérumminták vizsgálata

Alacsony kimutatási határok APCI ionizációs technikával vagy származékképzéssel kombinált

ESI ionizációval érhetők el. Tovább javítható az érzékenység csapdázó kolonnával ellátott

kromatográfiás rendszer kapcsolással és nagy térfogatú injektálás alkalmazásával. Ezért

ezekkel a rendszer kapcsolásokkal elemeztem szérumminták hormontartalmát. A mintákat

szteroidmentes szérum nemi hormonokkal történő addíciójával és a megfelelő minta-

előkészítéssel nyertem. A kalibrációs pontokból öt párhuzamost mértem a különböző

90

módszerekkel, ezek a pontok szolgáltatták a szérumminták kalibrációs pontjait (15. táblázat).

A konvencionális HPLC/SPE módszerben180 µl mintatérfogatot, mikro LC/SPE módszerben

90 µl mintatérfogatot injektáltam.

Az eredményeket érzékenység (LOQ, LOD), helyesség (RE %) és precizitás (CV %) értékeik

alapján jellemeztem (17. táblázat). Az E/III módszer (mikro LC/SPE – származékolás)

bizonyult a legérzékenyebbnek. A B/II módszer-hez képest bonyolultabb minta-előkészítést

igényel. A módszerrel tesztoszteron és ösztrogének mérhetők 5-10 pg/ml koncentráció

tartományban, megfelelő megbízhatósággal.

A bemutatott három módszerrel eredményesen elemeztem várandós nők vérmintáit, sikerült

meghatározni a jellegzetes emelkedett ösztrogének mennyiségét. A teljesítményjellemzők

validálását követően a módszerek felhasználhatók humán szérum nemi hormon mennyiségének

vizsgálatához rutin analitikai laboratóriumok számára.

91


(ng/ml)

B/II módszer B/III módszer E/III módszer

Átlag (ng/ml)

RE (%)

CV (%)

Átlag (ng/ml)

RE (%)

CV (%)

Átlag (ng/ml)

RE (%)

CV (%)

Ösztriol 0,01 0,01 -20,0 16,0 0,01 -15,0 20,1 0,01 -12,0 14,6

0,05 0,05 -10,0 9,86 0,05 6,00 6,32 0,05 -10,0 14,2

0,1 0,11 5,00 11,3 0,09 -10,0 7,91 0,11 5,00 8,90

0,5 0,49 -2,00 8,12 0,56 12,0 8,63 0,51 2,00 7,89

1 1,10 10,0 7,75 1,04 4,00 2,17 0,84 -16,0 2,32

5 5,38 7,60 3,50 5,21 4,20 0,69 4,70 -6,00 5,67

10 10,7 6,80 3,59 12,6 26,0 18,3 11,5 14,6 1,23

50 53,9 7,88 3,99 47,2 -5,60 6,35 55,3 10,6 8,70

Ösztradiol 0,01 0,01 -15,0 16,2 0,01 -15,0 30,6 0,01 10,0 11,3

0,05 0,05 -6,00 2,91 0,05 2,00 12,6 0,05 4,00 12,6

0,1 0,11 10,0 4,50 0,11 10,0 5,32 0,11 10,0 7,54

0,5 0,52 4,00 10,1 0,54 8,00 4,89 0,49 -2,00 6,52

1 1,05 5,00 5,09 0,93 -7,00 6,78 1,12 12,0 4,62

5 5,44 8,80 4,33 4,30 -14,0 5,70 4,98 -0,40 7,65

10 10,1 0,90 4,27 12,0 20,0 9,85 9,51 -4,90 8,32

50 54,9 9,72 5,39 49,2 -1,60 4,30 47,0 -6,00 1,23

Ösztron 0,01 0,02 36 23,6 0,01 11,0 35,3 0,01 -10,0 15,3

0,05 0,04 -12,0 9,65 0,06 12,0 20,2 0,05 -4,00 14,2

0,1 0,09 -10,0 6,05 0,10 -2,00 9,62 0,11 10,0 7,32

0,5 0,47 -6,00 7,66 0,60 20,0 3,52 0,44 -12,0 8,69

1 1,04 4,00 4,85 0,94 -6,00 1,65 0,91 -9,00 1,89

5 5,43 8,60 3,63 4,46 -10,8 5,63 5,30 6,00 2,65

10 10,1 1,10 3,48 12,2 22,0 4,26 10,6 5,60 4,85

50 54,5 9,00 4,60 48,4 -3,20 7,32 52,3 4,60 7,62

Tesztoszteron 0,01 0,01 -10,0 10,1 0,01 11,0 15,6 0,01 10,0 5,61

0,05 0,05 2,00 9,12 0,04 -8,6 11,2 0,05 1,60 7,62

0,1 0,10 -5,00 8,65 0,09 -10,0 3,56 0,10 3,00 8,56

0,5 0,52 4,00 8,04 0,40 -8,5 4,65 0,53 6,00 5,14

1 1,03 3,00 4,22 1,05 5,00 2,78 1,03 3,00 4,23

5 5,60 12,0 3,02 5,40 8,00 6,80 4,95 -1,00 3,54

10 9,89 -1,10 1,56 11,2 12,0 3,26 11,3 13,0 7,86

50 48,0 -4,04 4,76 48,5 -3,00 7,68 51,6 3,20 3,68

17. Táblázat. Konvencionális HPLC/SPE – APCI ionizáció (B/II módszer), konvencionális HPLC/SPE –

származékolás (B/III módszer) és mikro UHPLC/SPE – származékolás (E/III módszer) technikákkal mért

kalibrációs pontok összehasonlítása.


Elsőként vizsgáltam nemi hormonokat mikro LC on-line SPE technikával, a kapott

eredményeket összehasonlítottam a konvencionális HPLC-vel elérhető eredményekkel. Az

összevetés bizonyítja a különböző kromatográfiás rendszerek és ionizációs technikák előnyeit

és hátrányait, a mikro LC fontosságát az érzékenységnövelésben. Azonos térfogatok

injektálásakor mikro LC technikával 20×-os érzékenységnövelés érhető el. Bemutattam és

92

eredményekkel igazoltam az on-line SPE rendszerek és a többszörös injektálás jelentőségét. A

mikro LC módszer bővítése on-line SPE rendszerrel 10×-es érzékenységnövelést

eredményezett. Összevetettem a két legelterjedtebb ionizációs technikát (ESI, APCI). Az

ösztrogének APCI ionizációs technikával intenzívebb jelet adtak, az ösztriol és az ösztradiol

vízvesztett forrás fragmensionjait kiválasztva 100×-os érzékenységnövekedést tapasztaltam.

Végül a vegyületek származékolása danzil-kloriddal és a származékok vizsgálata tovább

csökkentette a méréshatárt, így sikerült elérnem nagyon alacsony kimutatási és meghatározási

értékeket (5-10pg/ml) egy rövid, 3 perces módszerrel.

93

6. A doktori értekezés összefoglalása

Doktori munkámban folyadékkromatográfiás és tömegspektrometriás érzékenységnövelő

megoldásokat dolgoztam ki LC-MS/MS módszerek kimutatási és meghatározási határának

csökkentésére. A kísérletek eredményeinek felhasználásával a publikált módszereknél

érzékenyebb, egyszerűbb és gyorsabb eljárásokat fejlesztettem rutin laboratóriumok számára.

A kidolgozott módszerek teljesítményjellemzőit megvizsgáltam és validáltam.

Dolgozatomban bizonyítottam a mikro LC technika alkalmazásának érzékenységnövelő

jelentőségét a mennyiségi meghatározásoknál. Igazoltam, hogy a nagyobb térfogatú mikro

kolonnák és a gradiensidő növelése nagyobb térfogatok injektálását teszi lehetővé erős

oldószerből. A biológiai minták szerves óldószeres minta-előkészítésénél a mintaoldat vizes

hígításával sikeresen növeltem az injektálható térfogatot csökkentve ezzel a kimutatási határt.

Következő lépésként kibővítettem a mikro LC rendszert on-line SPE technikával. A

kapcsolással tovább növeltem az injektált térfogatot és a módszer érzékenységét.

Végeredményként kidolgoztam és validáltam egy érzékeny és nagy áteresztő képességű

módszert 13 szteroidhormon szimultán meghatározására.

Az on-line SPE mikro LC-MS rendszer érzékenységét tömegspektrometriás megoldásokkal

javítottam. Poláris vegyületek (nem-szteroid gyulladáscsökkentők) meghatározásakor az

eluensmódosító pH-jának és koncentrációjának optimálásával, illetőleg az irodalomban még

nem említett forrás fragmensionok kiválasztásával növeltem az ionizáció hatásfokát. Sikerült

elérnem bonyolultabb minta-előkészítés nélkül, direkt mátrixból injektálással vagy a minták

hígítás utáni mérésével az elvárt kimutatási értékeket. Kidolgoztam és validáltam egy érzékeny

és gyors módszert gyulladáscsökkentők környezeti vizsgálatára.

Végezetül nemi hormonok meghatározásához összevetettem a mikro LC érzékenységnövelő

képességét a konvencionális HPLC-vel. A rendkívül alacsony koncentrációjú komponensek

ionizációs hatásfokának javításához elvégeztem az ESI és APCI technikák optimálását,

kibővítettem a módszerem danzil-kloridos származékképzéssel. Eredményül elsőként

dolgoztam ki alacsony meghatározási határokkal rendelkező mikro LC on-line SPE módszert

négy nemi hormon szimultán meghatározására.

Eredményeim új lehetőséget teremtenek egyszerű, gyors és érzékeny módszerek kidolgozására

klinikai és környezeti minták elemzéséhez. A dolgozatomban bemutatott eljárások és

megközelítések hasznosak lehetnek és megoldást nyújthatnak amikor különösen fontos a

módszerérzékenység. A validált módszerek alkalmasak a rutin analitikai laboratóriumok

igényeinek kiszolgálására.

94

Irodalomjegyzék

[1] P. Kebarle, SPECIAL FEATURE : COMMENTARY A brief overview of the present

status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry, 817 (2000) 804–

817.

[2] J. V. Iribarne, B.A. Thomson, On the evaporation of small ions from charged droplets,

J. Chem. Phys. 64 (1976) 2287. doi:10.1063/1.432536.

[3] B.A. Thomson, J. V. Iribarne, Field induced ion evaporation from liquid surfaces at

atmospheric pressure, J. Chem. Phys. 71 (1979) 4451–4463. doi:10.1063/1.438198.

[4] G. Schmelzeisen-Redeker, L. Bütfering, F.W. Röllgen, Desolvation of ions and

molecules in thermospray mass spectrometry, Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 90

(1989) 139–150. doi:10.1016/0168-1176(89)85004-9.

[5] H. Nehring, S. Thiebes, L. Bütfering, F.W. Röllgen, Cluster ion formation in

thermospray mass spectrometry of ammonium salts, Int. J. Mass Spectrom. Ion Process.

128 (1993) 123–132. doi:10.1016/0168-1176(93)87060-6.

[6] D.I. Carroll, I. Dzidic, R.N. Stillwell, K.D. Haegele, E.C. Horning, Atmospheric pressure

ionization mass spectrometry. Corona discharge ion source for use in a liquid

chromatograph-mass spectrometer-computer analytical system, Anal. Chem. 47 (1975)

2369–2373. doi:10.1021/ac60364a031.

[7] W.M.A. Niessen, A.P. Tinke, Liquid chromatography-mass spectrometry Third Edition,

1995. doi:10.1016/0021-9673(94)01198-N.

[8] S. Fekete, E. Oláh, J. Fekete, Fast liquid chromatography: The domination of core–shell

and very fine particles, J. Chromatogr. A. 1228 (2012) 57–71.

doi:10.1016/J.CHROMA.2011.09.050.

[9] R. Hayes, A. Ahmed, T. Edge, H. Zhang, Core–shell particles: Preparation, fundamentals

and applications in high performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 1357

(2014) 36–52. doi:10.1016/J.CHROMA.2014.05.010.

[10] A.E. Steuer, M. Poetzsch, M. Koenig, E. Tingelhoff, S.N. Staeheli, A.T. Roemmelt, T.

Kraemer, Comparison of conventional liquid chromatography-tandem mass

spectrometry versus microflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry

within the framework of full method validation for simultaneous quantification of 40

antidepressants and neuroleptics, J. Chromatogr. A. 1381 (2015) 87–100.

doi:10.1016/j.chroma.2014.12.084.

[11] C.C. Christianson, C.J.L. Johnson, S.R. Needham, The advantages of microflow LC-

MS/MS compared with conventional HPLC-MS/MS for the analysis of methotrexate

from human plasma., Bioanalysis. 5 (2013) 1387–96. doi:10.4155/bio.13.73.

[12] H. Wang, P. Bennett, Performance assessment of microflow LC combined with high-

resolution MS in bioanalysis., Bioanalysis. 5 (2013) 1249–67. doi:10.4155/bio.13.93.

[13] N.W. Smith, C. Legido-quigley, N.D. Marlin, V. Melin, Capillary Liquid

Chromatography Capillary and Micro ‐ High Performance Liquid Chromatography,

Encicl. Elsevier. (2004) 1–22.

[14] W. Gao, T. Stalder, P. Foley, M. Rauh, H. Deng, C. Kirschbaum, Quantitative analysis

of steroid hormones in human hair using a column-switching LC–APCI–MS/MS assay,

J. Chromatogr. B. 928 (2013) 1–8. doi:10.1016/j.jchromb.2013.03.008.

[15] J. Gervasoni, A. Schiattarella, A. Primiano, I. D’Addurno, A. Cocci, C. Zuppi, S.

95

Persichilli, Simultaneous quantification of 17-hydroxyprogesterone, androstenedione,

testosterone and cortisol in human serum by LC-MS/MS using TurboFlow online sample

extraction, Clin. Biochem. 49 (2016) 998–1003.

doi:10.1016/j.clinbiochem.2016.05.012.

[16] M. Rauh, M. Gröschl, W. Rascher, H.G. Dörr, Automated, fast and sensitive

quantification of 17??-hydroxy-progesterone, androstenedione and testosterone by

tandem mass spectrometry with on-line extraction, Steroids. 71 (2006) 450–458.

doi:10.1016/j.steroids.2006.01.015.

[17] M.M. Kushnir, T. Blamires, A.L. Rockwood, W.L. Roberts, B. Yue, E. Erdogan, A.M.

Bunker, A.W. Meikle, Liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for

androstenedione, dehydroepiandrosterone, and testosterone with pediatric and adult

reference intervals, Clin. Chem. 56 (2010). doi:10.1373/clinchem.2010.143222.

[18] I.A. Blair, Analysis of estrogens in serum and plasma from postmenopausal women: Past

present, and future, Steroids. 75 (2010) 297–306. doi:10.1016/j.steroids.2010.01.012.

[19] G.G. Ying, R.S. Kookana, Y.J. Ru, Occurrence and fate of hormone steroids in the

environment, Environ. Int. 28 (2002) 545–551. doi:10.1016/S0160-4120(02)00075-2.

[20] M.M. Kushnir, A.L. Rockwood, W.L. Roberts, B. Yue, J. Bergquist, A.W. Meikle,

Liquid chromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinical

laboratories, Clin. Biochem. 44 (2011) 77–88.

doi:10.1016/J.CLINBIOCHEM.2010.07.008.

[21] L.J. Ney, A. Matthews, R. Bruno, K.L. Felmingham, Modulation of the endocannabinoid

system by sex hormones: Implications for Posttraumatic Stress Disorder, Neurosci.

Biobehav. Rev. (2018). doi:10.1016/J.NEUBIOREV.2018.07.006.

[22] R. Holmdahl, L. Jansson, Estrogen-induced suppression of collagen arthritis: III. Adult

thymectomy does not affect the course of arthritis or the estrogen-mediated suppression

of T-cell immunity, Brain. Behav. Immun. 2 (1988) 123–132. doi:10.1016/0889-

1591(88)90013-X.

[23] M.E. Mendelsohn, Protective effects of estrogen on the cardiovascular system, Am. J.

Cardiol. 89 (2002) 12–17. doi:10.1016/S0002-9149(02)02405-0.

[24] S. Khosla, B.L. Riggs, Estrogen Effects on Bone in the Male Skeleton, Princ. Bone Biol.

(2002) 1467–1476. doi:10.1016/B978-012098652-1.50187-6.

[25] A. Alvergne, M. Jokela, C. Faurie, V. Lummaa, Personality and testosterone in men from

a high-fertility population, Pers. Individ. Dif. 49 (2010) 840–844.

doi:10.1016/J.PAID.2010.07.006.

[26] M.D. Reynolds, R. Tarter, L. Kirisci, G. Kirillova, S. Brown, D.B. Clark, J. Gavaler,

Testosterone Levels and Sexual Maturation Predict Substance Use Disorders in

Adolescent Boys: A Prospective Study, Biol. Psychiatry. 61 (2007) 1223–1227.

doi:10.1016/J.BIOPSYCH.2006.07.008.

[27] J. Archer, Testosterone and human aggression: an evaluation of the challenge hypothesis,

Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (2006) 319–345.

doi:10.1016/J.NEUBIOREV.2004.12.007.



laboratories, Clin. Biochem. 44 (2011) 77–88.

doi:10.1016/J.CLINBIOCHEM.2010.07.008.

96

[29] A.S. Dobs, The role of accurate testosterone testing in the treatment and management of

male hypogonadism, Steroids. 73 (2008) 1305–1310.

doi:10.1016/J.STEROIDS.2008.06.007.

[30] S. Robinson, D.A. Rodin, A. Deacon, M.J. Wheeler, R.N. Clayton, Which hormone tests

for the diagnosis of polycystic ovary syndrome?, Int. J. Gynecol. Obstet. 39 (1992) 361.

doi:10.1016/0020-7292(92)90286-R.

[31] J.W. Honour, E. Conway, R. Hodkinson, F. Lam, The evolution of methods for urinary

steroid metabolomics in clinical investigations particularly in childhood, J. Steroid

Biochem. Mol. Biol. 181 (2018) 28–51. doi:10.1016/J.JSBMB.2018.02.013.

[32] P. Gild, A.P. Cole, A. Krasnova, B.A. Dickerman, N. von Landenberg, M. Sun, L.A.

Mucci, S.R. Lipsitz, F.K.-H. Chun, P.L. Nguyen, A.S. Kibel, T.K. Choueiri, S. Basaria,

Q.-D. Trinh, Liver Disease in Men Undergoing Androgen Deprivation Therapy for

Prostate Cancer, J. Urol. 200 (2018) 573–581. doi:10.1016/J.JURO.2018.03.135.

[33] L.M. Demers, Testosterone and estradiol assays: Current and future trends, Steroids. 73

(2008) 1333–1338. doi:10.1016/J.STEROIDS.2008.05.002.

[34] S. By, T. Name, 2011 Interpretive Handbook, (2011).

[35] T. Koal, D. Schmiederer, H. Pham-Tuan, C. Röhring, M. Rauh, Standardized LC–

MS/MS based steroid hormone profile-analysis, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 129

(2012) 129–138. doi:10.1016/j.jsbmb.2011.12.001.

[36] M. Mezzullo, F. Fanelli, A. Fazzini, A. Gambineri, V. Vicennati, G. Di Dalmazi, C.

Pelusi, R. Mazza, U. Pagotto, R. Pasquali, Validation of an LC???MS/MS salivary assay

for glucocorticoid status assessment: Evaluation of the diurnal fluctuation of cortisol and

cortisone and of their association within and between serum and saliva, J. Steroid

Biochem. Mol. Biol. 163 (2016) 103–112. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.04.012.

[37] M. Rauh, Steroid measurement with LC-MS/MS in pediatric endocrinology, Mol. Cell.

Endocrinol. 301 (2009) 272–281. doi:10.1016/j.mce.2008.10.007.

[38] U. Knorr, M. Vinberg, L. V. Kessing, J. Wetterslev, Salivary cortisol in depressed

patients versus control persons: A systematic review and meta-analysis,

Psychoneuroendocrinology. 35 (2010) 1275–1286.

doi:10.1016/j.psyneuen.2010.04.001.

[39] B. Hauser, T. Deschner, C. Boesch, Development of a liquid chromatography-tandem

mass spectrometry method for the determination of 23 endogenous steroids in small

quantities of primate urine, J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 862

(2008) 100–112. doi:10.1016/j.jchromb.2007.11.009.

[40] G.-G. Ying, R.S. Kookana, Y.-J. Ru, Occurrence and fate of hormone steroids in the

environment, Environ. Int. 28 (2002) 545–551. doi:10.1016/S0160-4120(02)00075-2.

[41] A. Gaudl, J. Kratzsch, Y.J. Bae, W. Kiess, J. Thiery, U. Ceglarek, Liquid

chromatography quadrupole linear ion trap mass spectrometry for quantitative steroid

hormone analysis in plasma, urine, saliva and hair, J. Chromatogr. A. 1464 (2016) 64–

71. doi:10.1016/j.chroma.2016.07.087.

[42] V. Cirimele, P. Kintz, V. Dumestre, J.P. Goullé, B. Ludes, Identification of ten

corticosteroids in human hair by liquid chromatography–ionspray mass spectrometry[1]

V. Cirimele, P. Kintz, V. Dumestre, J.P. Goullé, B. Ludes, Identification of ten

corticosteroids in human hair by liquid chromatography–ionspray mas, Forensic Sci. Int.

107 (2000) 381–388. doi:10.1016/S0379-0738(99)00180-2.

97

[43] F. Bévalot, Y. Gaillard, M.A. Lhermitte, G. Pépin, Analysis of corticosteroids in hair by

liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry, J. Chromatogr. B

Biomed. Sci. Appl. 740 (2000) 227–236. doi:10.1016/S0378-4347(00)00085-2.

[44] T. Stalder, C. Kirschbaum, K. Heinze, S. Steudte, P. Foley, A. Tietze, L. Dettenborn,

Use of hair cortisol analysis to detect hypercortisolism during active drinking phases in

alcohol-dependent individuals, Biol. Psychol. 85 (2010) 357–360.

doi:10.1016/j.biopsycho.2010.08.005.

[45] W. Gao, C. Kirschbaum, J. Grass, T. Stalder, LC???MS based analysis of endogenous

steroid hormones in human hair, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 162 (2016) 92–99.

doi:10.1016/j.jsbmb.2015.12.022.

[46] D. Li, A. White, M. Pudek, Liquid chromatography–tandem mass spectrometry analysis

of salivary free cortisol: Validation and clinical application, Clin. Biochem. 41 (2008)

1273–1274. doi:10.1016/j.clinbiochem.2008.08.030.

[47] G. Antonelli, F. Ceccato, C. Artusi, M. Marinova, M. Plebani, Salivary cortisol and

cortisone by LC–MS/MS: validation, reference intervals and diagnostic accuracy in

Cushing’s syndrome, Clin. Chim. Acta. 451 (2015) 247–251.

doi:10.1016/j.cca.2015.10.004.

[48] J.F. Dorgan, T.R. Fears, R.P. McMahon, L. Aronson Friedman, B.H. Patterson, S.F.

Greenhut, Measurement of steroid sex hormones in serum: a comparison of

radioimmunoassay and mass spectrometry, Steroids. 67 (2002) 151–158.

doi:10.1016/S0039-128X(01)00147-7.

[49] K. Shimada, K. Mitamura, T. Higashi, Gas chromatography and high-performance liquid

chromatography of natural steroids, J. Chromatogr. A. 935 (2001) 141–172.

doi:10.1016/S0021-9673(01)00943-8.

[50] Measuring estrogens in women, men, and children: Recent advances 2012–2017, Clin.

Biochem. (2018). doi:10.1016/J.CLINBIOCHEM.2018.05.014.

[51] W. Gao, C. Kirschbaum, J. Grass, T. Stalder, LC–MS based analysis of endogenous

steroid hormones in human hair, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 162 (2016) 92–99.

doi:10.1016/j.jsbmb.2015.12.022.

[52] T.M. Penning, S.H. Lee, Y. Jin, A. Gutierrez, I.A. Blair, Liquid chromatography-mass

spectrometry (LC-MS) of steroid hormone metabolites and its applications, J. Steroid


[53] C. Meunier, D. Blondelle, P. Faure, J.-P. Baguet, C. Le Goff, O. Chabre, V. Ducros,

Development and validation of a method using supported liquid extraction for

aldosterone determination in human plasma by LC-MS/MS., Clin. Chim. Acta. 447

(2015) 8–15. doi:10.1016/j.cca.2015.05.007.

[54] W.A. Salameh, M.M. Redor-Goldman, N.J. Clarke, R. Mathur, R. Azziz, R.E. Reitz,

Specificity and predictive value of circulating testosterone assessed by tandem mass

spectrometry for the diagnosis of polycystic ovary syndrome by the National Institutes

of Health 1990 criteria, Fertil. Steril. 101 (2014) 1135-1141.e2.

doi:10.1016/j.fertnstert.2013.12.056.

[55] J.M. Lacey, C.Z. Minutti, M.J. Magera, A.L. Tauscher, B. Casetta, M. McCann, J. Lymp,

S.H. Hahn, P. Rinaldo, D. Matern, Improved Specificity of Newborn Screening for

Congenital Adrenal Hyperplasia by Second-Tier Steroid Profiling Using Tandem Mass

Spectrometry, Clin. Chem. 50 (2004). doi:10.1373/clinchem.2003.027193.

98

[56] V. Cirimele, P. Kintz, V. Dumestre, J.P. Goullé, B. Ludes, Identification of ten

corticosteroids in human hair by liquid chromatography–ionspray mass spectrometry,

Forensic Sci. Int. 107 (2000) 381–388. doi:10.1016/S0379-0738(99)00180-2.

[57] Z. Chen, J. Li, J. Zhang, X. Xing, W. Gao, Z. Lu, H. Deng, Simultaneous determination

of hair cortisol, cortisone and DHEAS with liquid chromatography-electrospray

ionization-tandem mass spectrometry in negative mode, J. Chromatogr. B Anal. Technol.

Biomed. Life Sci. 929 (2013) 187–194. doi:10.1016/j.jchromb.2013.04.026.

[58] Y. Shibayama, T. Higashi, K. Shimada, A. Odani, A. Mizokami, H. Konaka, E. Koh, M.

Namiki, Simultaneous determination of salivary testosterone and

dehydroepiandrosterone using LC-MS/MS: Method development and evaluation of

applicability for diagnosis and medication for late-onset hypogonadism, J. Chromatogr.

B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (2009) 2615–2623.

doi:10.1016/j.jchromb.2008.10.051.

[59] M.L. Etter, J. Eichhorst, D.C. Lehotay, Clinical determination of 17-

hydroxyprogesterone in serum by LC-MS/MS: Comparison to Coat-A-Count??? RIA

method, J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 840 (2006) 69–74.

doi:10.1016/j.jchromb.2006.04.038.

[60] P. Keski-Rahkonen, K. Huhtinen, M. Poutanen, S. Auriola, Fast and sensitive liquid

chromatography–mass spectrometry assay for seven androgenic and progestagenic

steroids in human serum, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 127 (2011) 396–404.

doi:10.1016/j.jsbmb.2011.06.006.

[61] H. Licea-Perez, S. Wang, M.E. Szapacs, E. Yang, Development of a highly sensitive and

selective UPLC/MS/MS method for the simultaneous determination of testosterone and

5??-dihydrotestosterone in human serum to support testosterone replacement therapy for

hypogonadism, Steroids. 73 (2008) 601–610. doi:10.1016/j.steroids.2008.01.018.

[62] K. Yamashita, M. Okuyama, R. Nakagawa, S. Honma, F. Satoh, R. Morimoto, S. Ito, M.

Takahashi, M. Numazawa, Development of sensitive derivatization method for

aldosterone in liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

of corticosteroids, J. Chromatogr. A. 1200 (2008) 114–121.

doi:10.1016/j.chroma.2008.05.034.

[63] P. Regal, B.I. Vázquez, C.M. Franco, A. Cepeda, C. Fente, Quantitative LC–MS/MS

method for the sensitive and simultaneous determination of natural hormones in bovine

serum, J. Chromatogr. B. 877 (2009) 2457–2464.

doi:10.1016/J.JCHROMB.2009.06.025.

[64] I. Athanasiadou, Y.S. Angelis, E. Lyris, C. Georgakopoulos, I. Athanasiadou, C.

Georgakopoulos, Chemical derivatization to enhance ionization of anabolic steroids in

LC-MS for doping-control analysis, TrAC Trends Anal. Chem. 42 (2013) 137–156.

doi:10.1016/J.TRAC.2012.10.003.

[65] T.M. Penning, S.-H. Lee, Y. Jin, A. Gutierrez, I.A. Blair, Liquid chromatography–mass

spectrometry (LC–MS) of steroid hormone metabolites and its applications, J. Steroid


[66] T. Guo, M. Chan, S.J. Soldin, Steroid profiles using liquid chromatography-tandem mass

sp[1] T. Guo, M. Chan, S.J. Soldin, Steroid profiles using liquid chromatography-tandem

mass spectrometry with atmospheric pressure photoionization source., Arch. Pathol.

Lab. Med. 128 (2004) 469–75, Arch. Pathol. Lab. Med. 128 (2004) 469–75.

doi:10.1043/1543-2165(2004)128<469:SPULCM>2.0.CO;2.

99

[67] A. Leinonen, T. Kuuranne, R. Kostiainen, Liquid chromatography/mass spectrometry in

anabolic steroid analysis?optimization and comparison of three ionization techniques:

electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization and atmospheric

pressure photoionization, J. Mass Spectrom. 37 (2002) 693–698. doi:10.1002/jms.328.

[68] Y.C. De Micalizzi, N.B. Pappano, N.B. Debattista, First and second order derivative

spectrophotometric determination of benzyl alcohol and diclofenac in pharmaceutical

forms, Talanta. 47 (1998) 525–530. doi:10.1016/S0039-9140(98)00080-0.

[69] L.A. Carreira, M. Rizk, Y. El-Shabrawy, N.A. Zakhari, S.S. Toubar, Europium(III) ion

probe spectrofluorometric determination of diclofenac sodium, J. Pharm. Biomed. Anal.

13 (1995) 1331–1337. doi:10.1016/0731-7085(95)01567-5.

[70] X. Li, Q. He, H. Li, X. Gao, M. Hu, S. Li, Q. Zhai, Y. Jiang, X. Wang, Bioconversion of

non-steroidal anti-inflammatory drugs diclofenac and naproxen by chloroperoxidase,

Biochem. Eng. J. 120 (2017) 7–16. doi:10.1016/j.bej.2016.12.018.

[71] M. Caban, K. Mioduszewska, P. Łukaszewicz, N. Migowska, P. Stepnowski, M.

Kwiatkowski, J. Kumirska, A new silylating reagent - dimethyl(3,3,3-

trifluoropropyl)silyldiethylamine - for the derivatisation of non-steroidal anti-

inflammatory drugs prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis, J.

Chromatogr. A. 1346 (2014) 107–116. doi:10.1016/j.chroma.2014.04.054.

[72] K. De Klerck, D. Mangelings, Y. Vander Heyden, Supercritical fluid chromatography

for the enantioseparation of pharmaceuticals, J. Pharm. Biomed. Anal. 69 (2012) 77–92.

doi:10.1016/j.jpba.2012.01.021.

[73] H.S. Lee, C.K. Jeong, S.J. Choi, S.B. Kim, M.H. Lee, G. Il Ko, D.H. Sohn, Simultaneous

determination of aceclofenac and diclofenac in human plasma by narrowbore HPLC

using column-switching, J. Pharm. Biomed. Anal. 23 (2000) 775–781.

doi:10.1016/S0731-7085(00)00381-2.

[74] P. Paíga, A. Lolić, F. Hellebuyck, L.H.M.L.M. Santos, M. Correia, C. Delerue-Matos,

Development of a SPE-UHPLC-MS/MS methodology for the determination of non-

steroidal anti-inflammatory and analgesic pharmaceuticals in seawater, J. Pharm.

Biomed. Anal. 106 (2015) 61–70. doi:10.1016/j.jpba.2014.06.017.

[75] J. Kumirska, N. Migowska, M. Caban, P. Łukaszewicz, P. Stepnowski, Simultaneous

determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs and oestrogenic hormones in

environmental solid samples, Sci. Total Environ. 508 (2015) 498–505.

doi:10.1016/j.scitotenv.2014.12.020.

[76] T. Nemoto, X.-P. Lee, T. Kumazawa, C. Hasegawa, M. Fujishiro, A. Marumo, Y. Shouji,

K. Inagaki, K. Sato, High-throughput determination of nonsteroidal anti-inflammatory

drugs in human plasma by HILIC-MS/MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 88 (2014) 71–80.

doi:10.1016/j.jpba.2013.08.023.

[77] J. Dvořák, R. Hájková, L. Matysová, L. Nováková, M.A. Koupparis, P. Solich,

Simultaneous HPLC determination of ketoprofen and its degradation products in the

presence of preservatives in pharmaceuticals, J. Pharm. Biomed. Anal. 36 (2004) 625–

629. doi:10.1016/j.jpba.2004.07.018.

[78] P.W. Elsinghorst, M. Kinzig, M. Rodamer, U. Holzgrabe, F. Sörgel, An LC-MS/MS

procedure for the quantification of naproxen in human plasma: Development, validation,

comparison with other methods, and application to a pharmacokinetic study, J.

Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 879 (2011) 1686–1696.

doi:10.1016/j.jchromb.2011.04.012.

100

[79] K.E. Pickl, C. Magnes, M. Bodenlenz, T.R. Pieber, F.M. Sinner, Rapid online-SPE-

MS/MS method for ketoprofen determination in dermal interstitial fluid samples from

rats obtained by microdialysis or open-flow microperfusion, J. Chromatogr. B Anal.

Technol. Biomed. Life Sci. 850 (2007) 432–439. doi:10.1016/j.jchromb.2006.12.026.

[80] S. Tanwar, M. Di Carro, E. Magi, Innovative sampling and extraction methods for the

determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in water, J. Pharm. Biomed. Anal.

106 (2015) 100–106. doi:10.1016/j.jpba.2014.10.027.

[81] P. Paíga, L.H.M.L.M. Santos, C. Delerue-Matos, Development of a multi-residue

method for the determination of human and veterinary pharmaceuticals and some of their

metabolites in aqueous environmental matrices by SPE-UHPLC–MS/MS, J. Pharm.

Biomed. Anal. 135 (2017) 75–86. doi:10.1016/j.jpba.2016.12.013.

[82] A. Lolić, P. Paíga, L.H.M.L.M. Santos, S. Ramos, M. Correia, C. Delerue-Matos,

Assessment of non-steroidal anti-inflammatory and analgesic pharmaceuticals in

seawaters of North of Portugal: Occurrence and environmental risk, Sci. Total Environ.

508 (2015) 240–250. doi:10.1016/j.scitotenv.2014.11.097.

[83] S.D. Kim, J. Cho, I.S. Kim, B.J. Vanderford, S.A. Snyder, Occurrence and removal of

pharmaceuticals and endocrine disruptors in South Korean surface , drinking , and waste

waters, 41 (2007) 1013–1021. doi:10.1016/j.watres.2006.06.034.

[84] I. Bragança, A. Plácido, P. Paíga, V.F. Domingues, C. Delerue-Matos, QuEChERS: A

new sample preparation approach for the determination of ibuprofen and its metabolites

in soils, Sci. Total Environ. 433 (2012) 281–289. doi:10.1016/j.scitotenv.2012.06.035.

[85] T. Martinez-Sena, S. Armenta, M. de la Guardia, F.A. Esteve-Turrillas, Determination

of non-steroidal anti-inflammatory drugs in water and urine using selective molecular

imprinted polymer extraction and liquid chromatography, J. Pharm. Biomed. Anal. 131

(2016) 48–53. doi:10.1016/j.jpba.2016.08.006.

[86] R. López-Serna, M. Petrović, D. Barceló, Development of a fast instrumental method for

the analysis of pharmaceuticals in environmental and wastewaters based on ultra high

performance liquid chromatography (UHPLC)-tandem mass spectrometry (MS/MS),

Chemosphere. 85 (2011) 1390–1399. doi:10.1016/j.chemosphere.2011.07.071.

[87] E. Gracia-Lor, J. V. Sancho, F. Hernández, Simultaneous determination of acidic, neutral

and basic pharmaceuticals in urban wastewater by ultra high-pressure liquid

chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A. 1217 (2010) 622–632.

doi:10.1016/j.chroma.2009.11.090.

[88] E. Gracia-Lor, J. V. Sancho, F. Hernández, Multi-class determination of around 50

pharmaceuticals, including 26 antibiotics, in environmental and wastewater samples by

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J.


[89] M. Gros, S. Rodríguez-Mozaz, D. Barceló, Rapid analysis of multiclass antibiotic

residues and some of their metabolites in hospital, urban wastewater and river water by

ultra-high-performance liquid chromatography coupled to quadrupole-linear ion trap

tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A. 1292 (2013) 173–188.

doi:10.1016/j.chroma.2012.12.072.

[90] J.Y. Pailler, A. Krein, L. Pfister, L. Hoffmann, C. Guignard, Solid phase extraction

coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of sulfonamides,

tetracyclines, analgesics and hormones in surface water and wastewater in Luxembourg,

Sci. Total Environ. 407 (2009) 4736–4743. doi:10.1016/j.scitotenv.2009.04.042.

101

[91] I. Tlili, G. Caria, B. Ouddane, I. Ghorbel-Abid, R. Ternane, M. Trabelsi-Ayadi, S. Net,

Simultaneous detection of antibiotics and other drug residues in the dissolved and

particulate phases of water by an off-line SPE combined with on-line SPE-LC-MS/MS:

Method development and application, Sci. Total Environ. 563–564 (2016) 424–433.

doi:10.1016/j.scitotenv.2016.04.101.

[92] Environmental Protection Agency (EPA), Method 1694 : Pharmaceuticals and Personal

Care Products in Water , Soil , Sediment , and Biosolids by HPLC / MS / MS, EPA

Method. (2007) 77.

[93] U.F.-U.S.F. and D. Administration, Guidance for Industry: Bioanalytical method

validation., 2013. doi:http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-

Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf.

[94] P. Magnisali, M.-B. Chalioti, T. Livadara, M. Mataragas, S. Paliatsiou, A. Malamitsi-

Puchner, P. Moutsatsou, Simultaneous quantification of 17α-OH progesterone, 11-

deoxycortisol, Δ4-androstenedione, cortisol and cortisone in newborn blood spots using

liquid chromatography–tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. B. 879 (2011) 1565–

1572. doi:10.1016/j.jchromb.2011.03.048.

[95] C.J. Broccardo, K.L. Schauer, W.M. Kohrt, R.S. Schwartz, J.P. Murphy, J.E. Prenni,

Multiplexed analysis of steroid hormones in human serum using novel microflow tile

technology and LC-MS/MS, J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 934

(2013) 16–21. doi:10.1016/j.jchromb.2013.06.031.

[96] M. Olkowicz, I. Rybakowska, S. Chlopicki, R.T. Smolenski, Development and analytical

comparison of microflow and nanoflow liquid chromatography/mass spectrometry

procedures for quantification of cardiac troponin T in mouse hearts, Talanta. 131 (2015)

510–520. doi:10.1016/j.talanta.2014.08.029.

[97] M. Concheiro, D. Lee, E. Lendoiro, M.A. Huestis, Simultaneous quantification of Δ9-

tetrahydrocannabinol, 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and

cannabinol in oral fluid by microflow-liquid chromatography–high resolution mass

spectrometry, J. Chromatogr. A. 1297 (2013) 123–130.

doi:10.1016/j.chroma.2013.04.071.

[98] X. Duan, B. Weinstock-Guttman, H. Wang, E. Bang, J. Li, M. Ramanathan, J. Qu,

Ultrasensitive quantification of serum vitamin D metabolites using selective solid-phase

extraction coupled to microflow liquid chromatography and isotope-dilution mass

spectrometry., Anal. Chem. 82 (2010) 2488–97. doi:10.1021/ac902869y.

[99] A. Cappiello, G. Famiglini, A. Berloni, Large volume injection of acidic pesticides by

reversed-phase micro high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 768

(1997) 215–222. doi:10.1016/S0021-9673(96)01094-1.

[100] F. Gritti, G. Guiochon, Rapid development of core-shell column technology: accurate

measurements of the intrinsic column efficiency of narrow-bore columns packed with

4.6 down to 1.3 μm superficially porous particles., J. Chromatogr. A. 1333 (2014) 60–9.

doi:10.1016/j.chroma.2014.01.061.

[101] F. Gritti, G. Guiochon, Kinetic investigation of the relationship between the efficiency

of columns and their diameter., J. Chromatogr. A. 1218 (2011) 1592–602.

doi:10.1016/j.chroma.2010.12.023.

[102] N. Wu, A.C. Bradley, Effect of column dimension on observed column efficiency in very

high pressure liquid chromatography., J. Chromatogr. A. 1261 (2012) 113–20.

doi:10.1016/j.chroma.2012.05.054.

102

[103] J. Layne, T. Farcas, I. Rustamov, F. Ahmed, Volume-load capacity in fast-gradient liquid

chromatography, J. Chromatogr. A. 913 (2001) 233–242. doi:10.1016/S0021-

9673(00)01199-7.

[104] D. Vukmanic, M. Chiba, Effect of organic solvents in sample solutions and injection

volumes on chromatographic peak profiles of analytes in reversed-phase high-

performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 483 (1989) 189–196.

doi:10.1016/S0021-9673(01)93121-8.

[105] S. Keunchkarian, M. Reta, L. Romero, C. Castells, Effect of sample solvent on the

chromatographic peak shape of analytes eluted under reversed-phase liquid

chromatogaphic conditions., J. Chromatogr. A. 1119 (2006) 20–8.

doi:10.1016/j.chroma.2006.02.006.

[106] J. Dolan, Distorted Peaks — A Case Study, LCGC North Eur. 28 (2015) 376–383.

http://www.chromatographyonline.com/distorted-peaks-case-study-0 (accessed

September 14, 2015).

[107] J.W. Dolan, How Much Can I Inject? Part I: Injecting in Mobile Phase, LCGC North

Am. 32 (2014) 780–785. http://www.chromatographyonline.com/how-much-can-i-

inject-part-i-injecting-mobile-phase (accessed September 14, 2015).

[108] J.W. Dolan, How Much Can I Inject? Part II: Injecting in Solvents Other than Mobile

Phase, LCGC North Am. 32 (2014). http://www.chromatographyonline.com/how-much-

can-i-inject-part-ii-injecting-solvents-other-mobile-phase (accessed September 14,

2015).

[109] F. Gritti, G. Guiochon, Overload behavior and apparent efficiencies in chromatography.,

J. Chromatogr. A. 1254 (2012) 30–42. doi:10.1016/j.chroma.2012.07.015.

[110] E. Oláh, M. Tarnai, J. Fekete, Possibility of large volume injection and band focusing in

UHPLC., J. Chromatogr. Sci. 51 (2013) 839–44. doi:10.1093/chromsci/bms179.

[111] M.J. Mills, J. Maltas, W. John Lough, Assessment of injection volume limits when using

on-column focusing with microbore liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 759

(1997) 1–11. doi:10.1016/S0021-9673(96)00753-4.

[112] M.E. León-González, N. Rosales-Conrado, L. V Pérez-Arribas, L.M. Polo-Díez, Large

injection volumes in capillary liquid chromatography: Study of the effect of focusing on

chromatographic performance., J. Chromatogr. A. 1217 (2010) 7507–13.

doi:10.1016/j.chroma.2010.09.076.

[113] K. Buonasera, G. D’Orazio, S. Fanali, P. Dugo, L. Mondello, Separation of

organophosphorus pesticides by using nano-liquid chromatography., J. Chromatogr. A.

1216 (2009) 3970–6. doi:10.1016/j.chroma.2009.03.005.

[114] J. Hernández-Borges, G. D’Orazio, Z. Aturki, S. Fanali, Nano-liquid chromatography

analysis of dansylated biogenic amines in wines., J. Chromatogr. A. 1147 (2007) 192–9.

doi:10.1016/j.chroma.2007.02.072.

[115] F. Gritti, C.A. Sanchez, T. Farkas, G. Guiochon, Achieving the full performance of

highly efficient columns by optimizing conventional benchmark high-performance

liquid chromatography instruments., J. Chromatogr. A. 1217 (2010) 3000–12.

doi:10.1016/j.chroma.2010.02.044.

[116] A.C. Sanchez, J.A. Anspach, T. Farkas, Performance optimizing injection sequence for

minimizing injection band broadening contributions in high efficiency liquid

chromatographic separations., J. Chromatogr. A. 1228 (2012) 338–48.

103

doi:10.1016/j.chroma.2012.01.038.

[117] G. D’Orazio, S. Fanali, Combination of two different stationary phases for on-line pre-

concentration and separation of basic drugs by using nano-liquid chromatography, J.


[118] F. Gritti, G. Guiochon, The ultimate band compression factor in gradient elution

chromatography., J. Chromatogr. A. 1178 (2008) 79–91.

doi:10.1016/j.chroma.2007.11.044.

[119] Y. Li, Y. Sun, F. Du, K. Yuan, C. Li, Pulse gradient, large-volume injection, high-

throughput ultra-performance liquid chromatographic/tandem mass spectrometry

bioanalysis for measurement of plasma amrubicin and its metabolite amrubicinol., J.


[120] M. Gilar, T.S. McDonald, J.S. Johnson, J.P. Murphy, J.W. Jorgenson, Wide injection

zone compression in gradient reversed-phase liquid chromatography., J. Chromatogr. A.

1390 (2015) 86–94. doi:10.1016/j.chroma.2015.02.057.

[121] M. Gilar, T.S. McDonald, G. Roman, J.S. Johnson, J.P. Murphy, J.W. Jorgenson,

Repetitive injection method: a tool for investigation of injection zone formation and its

compression in microfluidic liquid chromatography., J. Chromatogr. A. 1381 (2015)

110–7. doi:10.1016/j.chroma.2015.01.002.

[122] Z. Márta, B. Bobály, J. Fekete, B. Magda, T. Imre, K.V. Mészáros, P.T. Szabó, Pushing

quantitation limits in micro UHPLC–MS/MS analysis of steroid hormones by sample

dilution using high volume injection, J. Pharm. Biomed. Anal. 129 (2016) 135–141.

doi:10.1016/j.jpba.2016.06.024.

[123] M. Bourdat-Deschamps, S. Leang, N. Bernet, J.J. Daudin, S. Nélieu, Multi-residue

analysis of pharmaceuticals in aqueous environmental samples by online solid-phase

extraction-ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry:

Optimisation and matrix effects reduction by quick, easy, cheap, effective, , J.


[124] T. Anumol, S.A. Snyder, Rapid analysis of trace organic compounds in water by

automated online solid-phase extraction coupled to liquid chromatography-tandem mass

spectrometry, Talanta. 132 (2015) 77–86. doi:10.1016/j.talanta.2014.08.011.

[125] Q. Wang, K. Rangiah, C. Mesaros, N.W. Snyder, A. Vachani, H. Song, I.A. Blair,

Ultrasensitive quantification of serum estrogens in postmenopausal women and older

men by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Steroids. 96 (2015) 140–152.

doi:10.1016/j.steroids.2015.01.014.

[126] T. Fiers, B. Casetta, B. Bernaert, E. Vandersypt, M. Debock, J.M. Kaufman,

Development of a highly sensitive method for the quantification of estrone and estradiol

in serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry without derivatization, J.

Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 893–894 (2012) 57–62.

doi:10.1016/j.jchromb.2012.02.034.

[127] M.M. Kushnir, A.L. Rockwood, J. Bergquist, M. Varshavsky, W.L. Roberts, B. Yue,

A.M. Bunker, A.W. Meikle, High-sensitivity tandem mass spectrometry assay for serum

estrone and estradiol, Am. J. Clin. Pathol. 129 (2008) 530–539.

doi:10.1309/LC03BHQ5XJPJYEKG.

[128] A. Khedr, A.M. Alahdal, Liquid chromatography?tandem mass spectrometric analysis

of ten estrogen metabolites at sub-picogram levels in breast cancer women, J.

Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 1031 (2016) 181–188.

104

doi:10.1016/j.jchromb.2016.07.051.

[129] Simultaneous determination of three estrogens in human saliva without derivatization or

liquid-liquid extraction for routine testing via miniaturized solid phase extraction with

LC-MS/MS detection, Talanta. 178 (2018) 464–472.

doi:10.1016/J.TALANTA.2017.09.062.

[130] Simultaneous quantification of estrogens, their precursors and conjugated metabolites in

human breast cancer cells by LC–HRMS without derivatization, J. Pharm. Biomed.

Anal. 138 (2017) 344–350. doi:10.1016/J.JPBA.2017.02.033.

[131] S.X.L. Goh, A. Duarah, L. Zhang, S.A. Snyder, H.K. Lee, Online solid phase extraction

with liquid chromatography–tandem mass spectrometry for determination of estrogens

and glucocorticoids in water, J. Chromatogr. A. 1465 (2016) 9–19.

doi:10.1016/j.chroma.2016.08.040.

[132] Online solid phase extraction with liquid chromatography–tandem mass spectrometry

for determination of estrogens and glucocorticoids in water, J. Chromatogr. A. 1465

(2016) 9–19. doi:10.1016/J.CHROMA.2016.08.040.



laboratories, Clin. Biochem. 44 (2011) 77–88. doi:10.1016/j.clinbiochem.2010.07.008.

[134] K. Yamashita, M. Okuyama, Y. Watanabe, S. Honma, S. Kobayashi, M. Numazawa,

Highly sensitive determination of estrone and estradiol in human serum by liquid

chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Steroids. 72 (2007)

819–827. doi:10.1016/j.steroids.2007.07.003.

[135] T. Higashi, S. Ogawa, Chemical derivatization for enhancing sensitivity during LC/ESI–

MS/MS quantification of steroids in biological samples: a review, J. Steroid Biochem.

Mol. Biol. 162 (2016) 57–69. doi:10.1016/j.jsbmb.2015.10.003.

[136] Q. Wang, L. Bottalico, C. Mesaros, I.A. Blair, Analysis of estrogens and androgens in

postmenopausal serum and plasma by liquid chromatography-mass spectrometry,

Steroids. 99 (2015) 76–83. doi:10.1016/j.steroids.2014.08.012.

[137] Q. Wang, C. Mesaros, I.A. Blair, Ultra-high sensitivity analysis of estrogens for special

populations in serum and plasma by liquid chromatography–mass spectrometry: Assay

considerations and suggested practices, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 162 (2016) 70–

79. doi:10.1016/j.jsbmb.2016.01.002.

[138] Y. Ke, J. Bertin, R. Gonthier, J.N. Simard, F. Labrie, A sensitive, simple and robust LC-

MS/MS method for the simultaneous quantification of seven androgen- and estrogen-

related steroids in postmenopausal serum, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 144 (2014)

523–534. doi:10.1016/j.jsbmb.2014.08.015.

[139] A.M.M. Faqehi, D.F. Cobice, G. Naredo, T.C.S. Mak, R. Upreti, F.W. Gibb, G.J.

Beckett, B.R. Walker, N.Z.M. Homer, R. Andrew, Derivatization of estrogens enhances

specificity and sensitivity of analysis of human plasma and serum by liquid

chromatography tandem mass spectrometry, Talanta. 151 (2016) 148–156.

doi:10.1016/j.talanta.2015.12.062.

[140] N. Denver, S. Khan, N.Z.M. Homer, M.R. MacLean, R. Andrew, Current strategies for

quantification of estrogen in clinical research, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 192 (2019)

105373. doi:10.1016/j.jsbmb.2019.04.022.

[141] M.R. Anari, R. Bakhtiar, B. Zhu, S. Huskey, R.B. Franklin, D.C. Evans, Derivatization

105

of ethinylestradiol with dansyl chloride to enhance electrospray ionization: Application

in trace analysis of ethinylestradiol in rhesus monkey plasma, Anal. Chem. 74 (2002)

4136–4144. doi:10.1021/ac025712h.

[142] R.J. Singh, Validation of a high throughput method for serum/plasma testosterone using

liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS), Steroids. 73 (2008)

1339–1344. doi:10.1016/J.STEROIDS.2008.07.006.

[143] M. Rauh, M. Gröschl, W. Rascher, H.G. Dörr, Automated, fast and sensitive

quantification of 17α-hydroxy-progesterone, androstenedione and testosterone by

tandem mass spectrometry with on-line extraction, Steroids. 71 (2006) 450–458.

doi:10.1016/J.STEROIDS.2006.01.015.

[144] T. Guo, R.L. Taylor, R.J. Singh, S.J. Soldin, Simultaneous determination of 12 steroids

by isotope dilution liquid chromatography-photospray ionization tandem mass

spectrometry, Clin. Chim. Acta. 372 (2006) 76–82. doi:10.1016/J.CCA.2006.03.034.

[145] H. Chang, Y. Wan, J. Naile, X. Zhang, S. Wiseman, M. Hecker, M.H.W. Lam, J.P. Giesy,

P.D. Jones, Simultaneous quantification of multiple classes of phenolic compounds in

blood plasma by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry, J.


[146] J. Vitku, T. Chlupacova, L. Sosvorova, R. Hampl, M. Hill, J. Heracek, M. Bicikova, L.

Starka, Development and validation of LC-MS/MS method for quantification of

bisphenol A and estrogens in human plasma and seminal fluid, Talanta. 140 (2015) 62–

67. doi:10.1016/j.talanta.2015.03.013.

hplc-ms/ms módszerek kidolgozása biológiailag aktív

Documents