IDENTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Técnicas de hibridación

Southern blot

Northern blot

UNIVERSIDAD NACINAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

Dr. Juan C. Tantaleán V.

AMPLIFICACION DE ADN:

Reacción en cadena de la polimerasa

PCR

HIBRIDACION

• Apareamiento complementario de bases entre dos ácidosnucleicos de hebra simple producto de hebra doble.

RNA

DNA

DNA/DNA

RNA/RNA

DNA/RNA

IDENTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

1. DESNATURALIZACION DEL DNA:

Separación de las 2 hebras.

• pH > 13

• 90 - 100 ºC

2. RENATURALIZACION O HIBRIDACION DEL DNA

Recuperación del estado de 2 hebras.

• 55 - 65 ºC

A < temperatura < especificidad de renaturalización

Doble hebra

Factor

desnaturalizante

Doble hebraHebra simple

Condición de

renaturalización

Unión de secuencias

complementarias

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Porcentaje de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad entre hebras Largo de las hebras de polinucleótidos Concentración de sal en la solución de hibridación Temperatura de reacción Concentración de formamida en la solución de hibridación

Efecto del porcentaje de GC en la desnaturalización del ADN

Temperatura de “melting” (Tm): o de desnaturalización

HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS CON SONDAS

Sondas: hebras simples de DNA o RNA de 5 a más de 1000 nucleótidos, complementarias a secuencias específicas en el genoma.

Para su diseño se requiere conocer la secuencia nucleotídica a la cual debe unirse.

La sonda pequeña molécula de DNA o RNA, marcada, complementaria de la región específica que pretendemos detectar

HIBRIDACION CON SONDAS DE ARN

Aplicación del uso hibridación con sondas

Identificación de secuencias de ADN Identificación de ADN viral

TECNICAS QUE SE BASAN EN LA

HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

SOUTHERN BLOT: Hibridación de ADN

NORTHERN BLOT: Hibridación de ARN

SOUTHERN BLOT: Hibridación de DNA

• Identificar una secuencia de ADN.

• Ubicación de genes.

• Identificación de organismos.

• Caracterización molecular.

Procedimiento.

Corte del ADN genómico con enzimas de restricción

Separación electroforética de fragmentos de ADN en gel de agarosa.

Transferencia del ADN del gel hacia una membrana de nitrocelulosa o nylon.

Hibridación mediante una sonda específica con marca radiactiva (RNA, cDNA, oligonucleótido).

Autoradiografía.

Electroforesis de ADN

en gel de agarosa

Transferencia hacia

membrana de nitrocelulosa

o nylon

Southern blot: identificación de ADN

Esquema de Southern Blot

Esquema de Southern Blot

NORTHERN BLOT: Hibridación de RNA

• Permite detectar la presencia de un transcrito (ARN). Primer nivel de

expresión.

• Proporciona información de su tamaño y procesamiento.

Procedimiento

Extracción de ARN (total o mensajero), purificar.

Separación de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa.

Transferencia del ARN del gel hacia una membrana de

nitrocelulosa o nylon.

Hibridación mediante una sonda específica con marca radiactiva

(RNA, cDNA, oligonucleótido).

Autoradiografía.

Esquema de Northern blot

Esquema de Northern blot

AMPLIFICACION DE ADN

La reacción en cadena de la polimerasa

( PCR )

PCR: Polimerase chain reaction

1. Kary Mullis (1985) ..... Premio nobel de química en 1993

2. Base: Amplificación in vitro de secuencias específicas de DNA.

PCR

amplificación

DNA

(molécula sencilla)

Muchas

moléculas

El proceso, se controla con la temperatura

Si se repite el ciclo, se obtienen cuatro copias

Desnaturalización

95 C

Hibridización

50-60ºC

Extensión de

la cadena

72ºC

Primer Ciclo

2do Ciclo

95ºC

50 - 60ºC

72ºC

Los múltiples ciclos generan un incremento exponencial en el número de copias de ADN

AMPLIFICACIÓN DE UN SEGMENTO DE ADN

Componentes esenciales en el proceso standard de PCR

• ADN polimerasa termoestable• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)• Cationes divalentes (Mg++)• Buffer (para mantener el pH)• ADN molde (Templado)

Reacción:

• DNA templado

• Partidores o Primers

• Nucleótidos dNTP: (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

• Buffer o tampón, Mg++

• Taq Polimerasa (termoestable)

Aceite mineral

Temp.

ºC

Tiempo (min)

1

2

3

1: desnaturalización; 2: annealing; 3: extensión

95

72

60

El ciclo de PCR Desnaturalización – 94 - 95°C por 45 segundos si G+C < 55%

Hibridización (Annealing) – calculada para cada par de primers

demasiado alta = poco o nada de producto

demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos

Extensión - a temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada

ej.: 72°C para Taq

Taq : 2000 pb/min

A partir del 3r ciclo se produce ADN de longitud deseada ( producto principal).

• Número de ciclos -

- >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN genómico DNA.

- algunos componentes limitantes > 30 ciclos (si inicio = 105 moléculas)

ADN molde (templado)

• Puede ser DNA de hebra simple o doble.

• ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal

• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej:

1 µg de humano

10 ng de levadura

1 ng de bacteriano

1 pg of plasmídico

• Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

ADN polimerasas termoestables

• Sintetizan ADN dependiente del ADN templado.• Estabilidad: Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C• Fidelidad: Taq: baja, Pfu: alta• Actividad transferasa terminal: en el extremo 3´, ej.

Taq agrega una A al exremo 3´, si en el extremo hay una CPwo y Tli generan extremos romos.

• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)• La más común = Taq ADN polimerasa

Taq : Thermus aquaticus,Pwo : Pyrococcus woesei, Pfu : Pyrococcus furiosus, Tli : Thermococcus littoralis

Oligonucleótidos iniciadores (primers)

• Se conoce su secuencia• Es el factor más importante para la eficiencia y la

especificidad del proceso• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 ciclos, 1 kb)• Requieren de un diseño cuidadoso• Reglas de diseño:

(a) longitud = 18-25

(b) Contenido de G+C entre 40-60%

(c) Evitar las secuencias repetidas

5´5´

3´3´

5´5´3´

3´

Dímero de primer

PCR

3´ repetido

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

5’-NNNNNNNNTATA-3’

3’-ATATNNNNNNNN-5’

5´5´

3´3´

no hay extensión

PCR

5´ repetido

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNN-3´

3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´5´

3´3´

5´

5´

3´

3´

Productos de PCR no deseados

PCR

Formación de horquillas

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

5’-NNNNNNNNNNNGCA

3’-CGT

5´3´

Variantes de la PCR

• Colony PCR: uso de colonias como fuente de DNA• Multiplex PCR: uso de varios partidores• Nested PCR: PCR en 2 etapas• RT- PCR: obtención de cDNA

IS TIME FOR TAKE A BRAKE…

SEE YOU IN TEN MINUTES…

PRACTICA

Discusión de las técnicas

Southern Blot y Northern Blot

SEPARACION

ELECTROFORETICA

DE FRAGMENTOS

DE ADN

TRANSFERENCIA

HACIA UNA

MEMBRANA DE

NYLON

AUTORADIOGRAFIA

IDENTIFICACION

DE DNA

SOUTHERN BLOT

NORTHERN BLOT: Identificación de RNA

4. Generación de una sonda marcada

pGEM-T

dATP

dGTPdTTP

dCTP

1. Extracción del RNA

2. Electroforesis del RNA

3. Transferencia a membrana

5. Hibridación

6. Autoradiografía

APLICACIONES

Diagnóstico y detección de patógenos

Clonamiento molecular

Mutagénesis.

Caracterización molecular.

Identificación de mutaciones.

Medicina forense.

Otros

PCR

St 1 2

1200 pb

Kb

23

4

2,2

1,3

1,1

0,6

Amplificación de genes mediante PCR

CLONACION DE GENES EN VECTORES T-A

3’-A

A-3’

T-3'

3'-TA

A

Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor

que ligamiento con extremos romos

ligamiento

Producto de PCR

usando TaqVector con cola-T

T-3'

3'-T

Mutaciones en iscS: deleciones por PCR del extremo 3’

Aa

399

369

349

329

Pb

1200

1107

1047

987

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

NH2 COOH

NH2

NH2

NH2

COOH

COOH

COOH

St 1 2 3 4 5 St

St: estandar; 1. pET21b; 2, pET1200;

3, pET1200-90; 4, pET1200-150; 5, pET1200-210

Digestiones NdeI/HindIII de plasmidos recombinantes

MUTAGENESIS POR DELECION

Dos 1ros

PCRs

separadas

Primer F Primer mutagénico directo (forward)

primer mutagénico inverso (reverse) Primer R

X

x

x

x

remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar

2do PCR

Mutagenesis con PCR- extension solapada

PCR: Amplificados para la generación de mutantes puntuales

Kb

1300

11001000

800600

400

St 1 2 3 4 5

iscS (1217 pb)

667 pb

592 pb

THANKS!