T.C.

ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ

TIP FAKÜLTESĠ

ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI

ANABĠLĠM DALI

NEONATOLOJĠ BĠLĠM DALI

HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT

MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ

ÜZERĠNE ETKĠSĠ

Dr. Erdal TAġKIN

NEONATOLOJĠ YANDAL UZMANLIK TEZĠ

TEZ DANIġMANI

Prof. Dr. Mehmet SATAR

ADANA–2010

T.C.

ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ

TIP FAKÜLTESĠ

ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI

ANABĠLĠM DALI

NEONATOLOJĠ BĠLĠM DALI

HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT

MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ

ÜZERĠNE ETKĠSĠ

Dr. Erdal TAġKIN

NEONATOLOJĠ YANDAL UZMANLIK TEZĠ

TEZ DANIġMANI

Prof. Dr. Mehmet SATAR

ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ

ARAġTIRMA FONU

TARAFINDAN DESTEKLENMĠġTĠR.

PROJE NO: TF-2006/LTP-32

ADANA-2010

I

TEġEKKÜR

Neonatolojii yan dal eğitimim süresince yardımlarını ve deneyimlerini esirgemeyen değerli hocam ve

tez danıĢmanım Prof. Dr. Mehmet SATAR‟a ve birlikte çalıĢmaktan zevk duyduğum Prof. Dr. Nejat NARLI‟ya,

Doç. Dr. Hacer YAPICIOĞLU YILDIZDAġ‟a, tezime yardımlarından dolayı Patoloji Ananbilim Dalı‟ndan

Prof. Dr. Suzan ZORLUDEMĠR‟e, arkadaĢlarım Uzm. Kenan ÖZCAN‟a, Uzm. Dr. Ferda ÖZLÜ‟ye ve

Yenidoğan Kliniği çalıĢanlarına teĢekkür ederim.

Ayrıca yan dal ihtisasım süresince desteğini esirgemeyen eĢim Berrin TAġKIN‟a, sevgili çocuklarım

Zeynep TAġKIN ve Beril TAġKIN‟a teĢekkür ederim.

II

ĠÇĠNDEKĠLER

TEġEKKÜR II

ĠÇĠNDEKĠLER III

TABLO LĠSTESĠ V

ġEKĠL LĠSTESĠ VI

KISALTMA LĠSTESĠ VII

ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER VIII

ABSTRACT- KEYWORDS IX

1. GĠRĠġ 1

2. GENEL BĠLGĠLER 2

2.1. Perinatal Asfiksi ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati 2

2.1.1.Tanım 2

2.1.2. Ġnsidans 2

2.1.3. Asfiksi Tipleri 3

2.1.3.1. Kronik Kısmi Asfiksi 3

2.1.3.2. Akut Tama Yakın Asfiksi 5

2.1.4. Patoloji 6

2.1.4.1.Selektif Nöronal Nekroz 8

2.1.4.2. Status Marmoratus 8

2.1.4.3. Parasagital Serebral Hasar 8

2.1.4.4. Periventriküler Lökomalazi 8

2.1.4.5. Periventriküler Hemorajik Ġnfarkt 9

2.1.4.6. Fokal ve Multifokal Ġskemik Beyin Hasarı 9

2.1.5. Perinatal Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi 10

2.1.5.1. Hipoksemi 12

2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi 12

2.1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma 13

2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü 13

2.1.5.3.2. Ġntrasellüler asidoz 14

2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması 14

2.1.5.3.4. Ġntrasellüler kalsiyum birikimi 17

2.1.5.3.5. Serbest radikaller 19

2.1.5.3.6. Sitokinler 20

2.1.5.3.8. Apopitoz 20

2.1.5.3.8.1. Nekroz ve Apopitozda Hücresel DeğiĢiklikler 23

2.1.5.3.8.2. Ekstrinsik Apopitotik Yolak 24

2.1.5.3.8.3. Ġntrinsik Apopitotik Yolak 25

2.1.5.3.8.4. Kapspaz Bağımsız Apopitoz Aktivasyonu 25

2.1.5.3.8.5. Kaspaz Bağımlı Apopitoz aktivasyonu 25

2.1.6. Hipoksik iskemik beyin hasarının önlenmesine yönelik giriĢimler 26

2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması 26

2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu 27

2.1.6.3. Glutamat geri alımındaki bozukluğun iyileĢtirilmesi 27

2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi 29

2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu 29

2.1.6.6. Ġntrasellüler olayların akıĢının bloke edilmesi 30

2.2. Eikozanoidler (AraĢidonik asid metabolitleri) ve Otakoidler 31

III

2.2.1.Eikozanoid Biyosentezi 31

2.2.1.1. Siklooksijenaz Ürünleri 31

2.2.1.2. Lipooksijenaz Ürünleri 32

2.2.1.3. Eikozanoid Metabolizması 33

2.2.1.5. Eikozanoidlerin Etki Mekanizması 33

2.2.2. Fosfolipaz A2 ve Hipoksik Ġskemik Serebral Hasar 34

2.3. Ġnflamatuvar Merdiyatörler ve Neonatal Beyin Hasarı 35

2.3.1. Prostaglandin ve Hipoksik-iskemik Beyin Hasarı 36

3. GEREÇ ve YÖNTEM 38

3.1.Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag® Peroxidase Uygulanması 40

3.2. Histopatolojik değerlendirme 42

3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme 42

4. BULGULAR 43

5. TARTIġMA 48

6. SONUÇLAR 52

7. KAYNAKLAR 53

8. ÖZGEÇMĠġ 62

IV

TABLO LĠSTESĠ

Tablo no Sayfa no

Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri 3

Tablo 2. Hipoksik iskemik ensefalopatide etkilenen organlar 4

Tablo 3. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı 7

Tablo 4. HĠE‟li yenidoğanda nöropatolojik özellikler 7

Tablo 5. Nekroz ve apopitoz arasında anatomik ve iĢlevsel farklılıklar 23

Tablo 6. Apopitozun moleküler düzenlenmesi 24

Tablo 7. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki mevcut değerli giriĢimler 28

Tablo 8. Deneysel modellerde perinatal hipoksik iskemik beyin hasarında inflamasyon

ve sitokinler 30

Tablo 9. Gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı 43

Tablo 10. Gruplara göre apoptotik hücre dağılımı 44

V

ġEKĠL LĠSTESĠ

ġekil no Sayfa no

ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakıĢ 11

ġekil-2. Akson terminalinden salınan glutamatın postsinaptik dentrit ve

astrosit içerisindeki döngüsü, reseptörleri ve iyon kanalları 15

ġekil-3. Hücre içi kalsiyum homeostazı 18

ġekil- 4. Reperfüzyon reoksijenizasyon döneminde serbest oksijen radikallerinin oluĢumu 19

ġekil 5. Sham grubunda az sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 45

ġekil 6. Hipoksik-iskemik hasar oluĢturulan grupta artan sayıda TUNEL pozitif

boyanan apoptotik hücreler 45

ġekil 7. Hipoksik-iskemik hasar öncesi 2mg/kg indometazin uygulanan grupta

TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 46

ġekil 8. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 2mg/kg indometazin verilen

grupta daha az sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 46

ġekil 9. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 4mg/kg indometazin uygulanan

grupta belirgin olarak azalan TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 47

VI

KISALTMALAR

ADP Adenozin difosfat

AMPA Alfa-amino-3.hidroksi-5.metil-4.izoksazol propionik asit

ATP Adenozin trifosfat

BOS Beyin omurilik sıvısı

Ca2+

Kalsiyum

COX Siklooksijenaz

DNA Deoksiribonükleik asit

EDRF Endotelden derive edilen gevĢetici faktör

eNOS Endoteliyal nitrik oksit sentaz

FAD Flavin adenin dinükleotit

GH Growth hormon

HĠE Hipoksik iskemik ensefalopati

IGF-1 Ġnsülin like growth faktör-1

ĠL-1 Ġnterlökin-1 beta

ĠL-6 Ġnterlökin-6

iNOS Ġndüklenen nitrik oksit sentaz

KA Kainat

MSS Merkezi sinir sistemi

NAD Nikotin adenin dinükleotit

NADP Nikotin adenin dinükleotit fosfat

NMDA N-Metil-D-Aspartat

nNOS Nöronal nitrik oksit sentaz

NO Nitrik oksit

NOS Nitrik oksit sentaz

O2 Oksijen

PG Prostaglandin

PVL Periventriküler lökomalazi

PVHĠ Periventriküler hemorajik infarkt

QA Kuiskalat A

TGFB Transforming growth faktör B

TNF- Tümör nekrozis faktör alfa

VII

ÖZET

Amaç: Siklooksijenaz yolağı ve prostaglandinler hipoksik-iskemik beyin hasarı patogenezinde ve gecikmiĢ

beyin hasarı mekanizmasında önemli rol oynar. Bu çalıĢmada hipoksik iskemik rat modelinde farklı dozlardaki

nonselektif siklooksijenaz inhibitörü olan indometazinin nöronal apopitoz üzerine etkisi araĢtırıldı.

Gereç ve Yöntem: Levine-Rice metoduna göre hipoksik iskemi oluĢturulan yedi günlük ratlar beĢ gruba ayrıldı.

Grup I (n: 15) ratlara serum fizyolojik verildi, arter ligasyonu ve hipoksi yapılmadı. Grup II (n: 15) ratlara

hipoksik-iskemiden sonra serum fizyolojik verildi. Grup III (n: 15) ratlara hiposik-iskemiden önce tek doz 2

mg/kg indometazin verildi. Grup IV (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra 12 saat arayla üç doz 2 mg/kg

indometazin verildi. Grup V (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra 12 saat arayla üç doz 4 mg/kg indometazin

verildi. Ratlar hipoksik-iskemiden 72 saat sonra dekapite edildi ve beyin hemisfer dokuları TUNEL yöntemi ile

değerlendirildi.

Bulgular: Hipoksik-iskemi öncesi ve sonrası verilen indometazin tedavisi hipoksik-iskemi sonrası serum

fizyolojik verilen grup ile karĢılaĢtırıldığında rat beynindeki apopitotik hücre sayısını önemli ölçüde azalttı

(p<0,001).

Sonuç: Bu sonuçlara göre indometazin tedavileri hipoksik iskemik beyin hasarı tedavisinde iyi bir seçenek

olabilir.

Anahtar kelimeler: Hipoksik-iskemi, beyin zedelenmesi, apopitozis, indometazin

VIII

THE EFFECTS OF INDOMETHACIN ON NEURONAL APOPTOSIS IN NEWBORN RATS WITH

HYPOXIC-ISCHEMIC BRAIN INJURY

ABSTRACT

Purpose: Cyclooxygenase pathway and prostaglandins plays an important role in the pathogenesis and delayed

mechanisms of hypoxic-ischemic brain injury. The aim of this study was to investigate the effect of different

doses of indomethacin, a nonselective cyclooxygenase inhibitor, on neuronal apoptosis in rats with hypoxic-

ischemic brain injury.

Material and Methods: Seven-day-old rat pups with the Rice model of hypoxic-ischemic cerebral injury were

randomly divided into five groups. Group I (n: 15) pups were given physiologic saline, but neither ligation nor

hypoxia were performed. Group II (n: 15) pups were treated with physiologic saline after hypoxic-ischemia.

Group III (n: 15) pups were treated with indomethacin at a dose of 2 mg/kg per before hypoxic ischemia. Group

IV (n: 15) pups were treated with three doses of indomethacin at a dose of 2 mg/kg every 12 h after hypoxic-

ischemia. Group V (n: 15) pups were treated with three doses of indomethacin, at a dose of 4 mg/kg every 12 h

after hypoxic ischemia. After 72 hours, the rats were decapitated and each brain hemispheres tissues were

evaluated by using the TUNEL staining method.

Results: Indomethacin treatment either before or after hypoxia, results in a significant reduction in the numbers

of apoptotic cells in rat brains when it is compared with group treated with physiologic saline after hypoxic-

ischemia (p<0,001).

Conclusion: These results demonstrated that indomethacin administration either before or after hypoxic-

ischemia reduce neuronal apoptosis, and we propose that indomethacin may be a good option for the therapy of

hypoxic-ischemic brain injury.

Key Words: Hypoxic ischemia, brain injury, apoptosis, indomethacin

1

I. GĠRĠġ ve AMAÇ

Hipoksik Ġskemik Ensefalopati (HĠE) yenidoğan mortalitesine ve uzun dönemde

gözlenen serebral palsi, mental retardasyon ve epilepsi gibi morbiditeye neden olabilen

yenidoğanın önemli sorunlarından biridir.1,2

HĠE‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen süre olan ve terapotik pencere‟

olarak adlandırılan bu kritik dönemde oluĢan hücre ölümüne neden olan moleküler

olaylar kaskadının sonlandırılarak, programlanmıĢ hücre ölümü olarak bilinen nöronal

apopitozun önlenmesi HĠE‟nin tedavisinde güncel yaklaĢımların temelini

oluĢturmaktadır.3

AraĢidonik asit ve prostaglandinlerin (PG) HĠE etiyopatogenezinde önemli

rolleri olduğu bilinmektedir.4-6

Hipoksi-iskemi sonrasında intrasellüler kalsiyum

konsantrasyonunun artmasıyla fosfolipaz A2‟nin aktive olduğu, membran

fosfolipidlerinin yıkılmasıyla hücrede araĢidonik asid biriktiği, siklooksijenaz ve

lipooksigenaz enzimlerinin aktivasyonuyla prostoglandinler, tromboksan A2 ve

lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikallerinin açığa çıktığı bilinmektedir.2

Serbest

radikalllerin hücrelere veya makromoleküllere doğrudan zarar verebildiği gibi

proapopitotik genleri tetiklediği ve kaspaz-3 aktivasyonunu içeren ve hücreyi apopitoza

götüren hücre içi olaylar kaskadını uyardığı ileri sürülmüĢtür.3

Ġndometazin gibi PG üretiminin baskılanmasına yol açan bir siklooksijenaz

(COX) enzim inhibitörünün reperfüzyon-reoksijenasyon döneminden sonra

verilmesinin, postiskemik infarkt alanını küçültüğü hem de nöronal hasarı azalttığı

gösterilmiĢitir.7,8

Bu çalıĢmada nonselektif bir siklooksijenaz inhibitörü olan indometazinin

HĠE‟de nöroprotektif etki sağlayabileceği hipotezi öne sürülmüĢtür. Bu amaçla HĠE

oluĢturulan 7 günlük ratların beyin dokusunda TUNEL yöntemi kullanılarak farklı

dozlardaki indometazinin nöronal apopitozis üzerine olan etkisi araĢtırılmıĢtır.

2

II. GENEL BĠLGĠLER

2.1. Perinatal Asfiksi ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati

2.1.1. Tanım

Neonatoloji alanındaki ilerlemelere rağmen hipoksi ve asfiksi özellikle az

geliĢmiĢ ülkelerde sorun olmaya devam etmektedir. Perinatal hipoksi-iskemide kan ve

dokulardaki oksijen (O2) konsantrasyonu, pH değiĢiklikleri ve glikoz gibi metabolize

edilebilen substratların konsantrasyonlarındaki değiĢikliklere bağlı olarak geliĢen bir

takım olayların tanımına ihtiyaç vardır. Hipoksi (anoksi), bir veya birkaç organda

oksijenin kısmi veya tam yokluğudur. Hipoksemi ise kanda oksijen konsantrasyonunun

azalmasıdır. Asfiksi plasental veya pulmoner gaz değiĢiminin kesilmesi sonucu

hipoksemi ve hiperkapninin kombinasyonu sonucu oluĢan durumdur. Perinatal asfiksi

tanımı hemen her yerde farklı anlamlarda kullanılmaktadır. Asfiksinin kelime anlamı

"nabızsızlık" olup; ancak genel olarak perinatal asfiksi, doku zedelenmesine yol açacak

kadar dokuya oksijen verilmesinin bozulması (hipoksi-iskemi) sonucu hipoksemi ve

hiperkapninin birlikte olmasını tarifler. Ġskemi ise bir organdaki kan akımının azalması

veya kesilmesidir. Bu durumda sadece O2 değil, diğer substratlar da dokuya eriĢemez.

Fetus veya yenidoğandaki iskemi genellikle sistemik hipoksi-asidoz sonucunda

meydana gelir. Ayrıca kardiyovasküler fonksiyonun deprese olduğu durumlarda veya

okluzif vasküler hastalıklarda da iskemi oluĢabilir. Perinatal hipoksi-iskemiye maruz

kalan yenidoğan bebeklerde en önemli hasar santral sinir sisteminde olmak üzere buna

ek olarak bir veya birden fazla organ tutulumu olur.1,9,10

Yenidoğanda hipoksi-iskemi, çoğunlukla hipoksik iskemik ensefalopati (HĠE)

Ģeklinde bulgu verir ve yenidoğan bebeğin tüm hayatını etkileyebilen en önemli

sorunlardan biridir.1

2.1. 2. Ġnsidans

Hipoksik iskemik ensefalopatinin tanımlanmasındaki farklılıklar nedeniyle

gerçek insidansını belirlemek güçtür. Antepartum ve intrapartum fetal monitorizasyon

yöntemlerindeki geliĢmelere rağmen doğumu takiben geliĢen sistemik asfiksi insidansı

term bebeklerde halen 1000 canlı doğumda 2 ile 4 arasındadır.11

GeliĢmekte olan

ülkelerde bu oranın 1000 canlı doğumda 9 ile 18 gibi daha yüksek oranlara ulaĢtığı

3

bildirilmektedir. Asfiktik doğan bebeklerin % 15-20‟si yenidoğan döneminde

kaybedilmektedir. YaĢayanların % 25‟inde mental retardasyonun da eĢlik edebildiği

serebral palsi, öğrenme güçlüğü veya epilepsi gibi kalıcı nörolojik hasarlar

geliĢmektedir.11

Bu problemin önemi, serebral hipoksi iskemi riski altındaki fetus ve

yenidoğana uygun yaklaĢımı zorunlu hale getirmiĢtir.

2.1.3. Asfiksi tipleri

Perinatal asfiksi "kronik kısmi" veya "akut tam" asfiksi Ģeklinde iki ayrı tablo

halinde ortaya çıkmaktadır. Bu iki durum birbirinden klinik ve patolojik özellikler ile ayırt

edilebilir (Tablo 1).12

Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri12

Kronik – Kısmi Akut - Tam

Riskli durumlar Ablasyo plasenta, plasental

hipoperfüzyon, uterusta

hipertonisite

Ablasyo plasenta

Uterus rüptürü

Kordun tam obstrüksiyonu

Annenin kardiyo-respiratuvar

arresti

Asfiksi oluĢması için geçen süre 1–3 saat < 10 dk

Serebral kan akımında yeniden

düzenleme

OluĢmuĢ Yetersiz

Klinik bulguların çıkıĢı için sessiz

dönem (6 – 48 saat)

Var Yok

Beyin Ödemi Var Yok

Konvülziyonlar Var Var/Yok

Beyin sapı bulguları Yok Var

2.1.3.1. Kronik kısmi asfiksi

Hayvanlar üzerinde yapılan çalıĢmalarda maternal plasental hipoperfüzyon,

uterus hipertonisitesi, ablasyo plasenta, umblikal kord obstrüksiyonu ve fetal

hipoperfüzyon gibi nedenlerle oluĢan plasental perfüzyon bozukluklarında, olay bir saat

veya daha uzun sürmüĢse fetusta progresif hipoksemi ve asidoz geliĢtiği gösterilmiĢtir.

Bu durumu kompanse etmek için vücuttaki kan akımı yeniden düzenlenmekte, kan

4

akımı vital olmayan organlardan (böbrekler, gastrointestinal sistem, karaciğer, kas ve

deri), vital organlara (kalp, beyin ve adrenaller) yönlendirilmekte ve beyine giden kan

akımı belirgin Ģekilde artmaktadır. Bu uyum sırasında serebral perfüzyon oldukça iyi

korunmaktadır. Ancak fetal hipoksemi bir süre daha devam ederse, böyle bir

kompansasyon ile sağlanan serebral perfüzyon yetersiz kalır ve santral sinir sistemine

giden kan akımında yeni bir düzenleme ortaya çıkar.1

Serebral hemisferlerde kan akımında azalma olurken, bazal metabolizmanın en

fazla olduğu talamus, beyin sapı ve serebelluma daha fazla kan gönderilmeye çalıĢılır

(intraserebral Ģant). Bu durumda serebral hemisferler, özellikle perfüzyonun en uç

noktaları olan parasagittal korteks ve bunun altındaki beyaz cevher hipoksemiden

etkilenmeye baĢlar; küçük infarktlar veya lokal konvülziyon odakları geliĢir, olay daha

da ilerlerse bütün serebral hemisferleri etkileyen infarkt alanları ortaya çıkar. 1,13

Yenidoğan bebeklerde ortaya çıkan klinik bulgular kan akımındaki bu

değiĢikliklere bağlı olmakta, birçok organda hipoksik-iskemik zedelenme görülmektedir

(Tablo 2). Olguların üçte ikisinde beynin yanı sıra en az iki organ da etkilenmiĢtir.

Tablo 2. Hipoksik iskemik ensefalopatide etkilenen organlar 1

Kardiyovasküler sistem

Miyokard iskemisi

Kalp yetmezliği

Solunum sistemi

Respiratuvar distres sendromu (RDS)

Apne

Pulmoner kanama

Pulmoner hipertansiyon

Santral sinir sistemi

Serebral ödem

Konvülziyonlar

Ġntrakraniyal kanama

Hipoksik-iskemik ensefalopati

Sıvı-elektrolit dengesi

Akut böbrek yetmezliği

Uygunsuz ADH Salgılanması

Metabolik

Hipotermi

Hipoglisemi

Hipokalsemi

Hiponatremi

Hiperpotasemi

Kanamalar

Dissemine intravasküler koagulasyon

Adrenal kanama

Gastrointestinal sistem

Nekrotizan enterokolit

Hematemez, melena

5

Nörolojik bulgular, hipoksik-iskemik zedelenmenin derecesine, süresine ve

dağılımına bağlıdır. Bebek doğumdan hemen sonra beyin zedelenmesi ve metabolik

asidoz nedeni ile depresedir. Hipotoni, letarji ve konvülziyonlar görülebilir. Hipotoni

çok ağır olabilir. Ancak dakikalar veya saatler içinde bebeğin aktivitesi ve tonusunda

artma olur, spontan ve uyarılarla tremorlar görülebilir. Konvülziyonlar genellikle 6-12

saat sonra ortaya çıkar, hemen her zaman hayatın ilk günü içinde görülür.

Konvülziyonların sıklığı giderek artar ve genellikle baĢlangıçta tedaviye dirençlidir. 2-5

gün sonra konvülziyonlar azalır veya tamamen ortadan kalkar ve ilaçla kontrol edilebilir

duruma gelir. Ağır zedelenme olan vakalarda Ģiddetli beyin ödemi bulguları vardır.

Kafa içi basınç artıĢı bulguları (fontanelde bombeleĢme, suturalarda açılma gibi)

genellikle 24 saat sonra baĢlar, 48. saatte en Ģiddetli düzeye eriĢir. Bu hastalarda

yeniden hipotoni geliĢir, bebeğin hareketleri azalır veya ortadan kalkar. Beyin sapı

disfonksiyonu bulguları (sabit pupiller ve apne gibi) vardır.1,15

Serebral hemisferlerdeki infarkt yaygınsa, özellikle beyin ödemi bulguları varsa,

lateral ventriküller kompresedir, serebral beyaz cevher ekojenitesinde difüz artma olur,

serebral gri cevher (korteks ve bazal ganglionlar) ile beyaz cevher arasındaki görünüm

farklılığı ortadan kalkar. Bir iki hafta sonra hemisferlerdeki nekroz alanları belirginleĢir

ve sonunda multikistik ensefalomalazi veya serebral hemisferlerin total obliterasyonu

olur; talamus, beyin sapı ve serebellum daha iyi korunmuĢtur.1,15

2.1.3.2. Akut tama yakın asfiksi

Bu durumda olay akuttur, hipoksemi ani ve Ģiddetlidir. Olay hızlı geliĢtiğinden

organlar arası ve beyin içindeki kan dolanımının yeniden düzenlenmesi yetersizdir.

Buna bağlı olarak hipoksik-iskemik zedelenme bulguları, metabolik aktivitenin fazla,

enerji depolarının az olduğu yerlerde daha fazla görülür. Talamus ve beyin sapı

nükleusları belirgin derecede etkilenirken, serebral hemisferler daha iyi korunmuĢtur,

beyin ödemi görülmez. Parsiyel asfiksidekinin tersine nörolojik bulguların (konvülziyon

ve beyin ödemi) ortaya çıkması için nisbeten sessiz geçen dönem görülmez. Hayvanlar

üzerinde yapılan çalıĢmalarda, olay on dakikadan kısa sürerse, beyin zedelenmesi

bulgularının tamamen düzeldiği gösterilmiĢtir. 10-25 dakika kadar sürdüğünde talamus

ve beyin sapı nükleuslarında ağır zedelenme görülür. 25 dakikadan uzun süren

6

durumlarda ise ağır kardiyak zedelenme de olduğu için geriye dönüĢümsüz vasküler

kollaps geliĢir.1

Ġnsanlarda tama yakın asfıksi çok seyrektir. Ancak tam ablasyo plasenta, akut

tam kord obstrüksiyonu, uterus rüptürü, maternal kardiyorespiratuvar arrest gibi

durumlarda görülebilir. Bazı vakalarda ise hiç bir neden bulunamaz. Bununla birlikte bu

vakaların bir çoğunda daha önceden baĢlamıĢ kısmi asfıksi bulguları da vardır. Ağır

derecede etkilenmiĢ bebekler doğduklarında deprese ve bradikardiktir, resüsitasyon

gerekir. Spontan solunumları uzun süre yoktur. Konvülziyonlar ve uzun süren stupor

görülür. Beyin ödemine bağlı kafa içi basınç artıĢı bulguları yoktur. Beyin sapı

disfonksiyonu bulguları 24 saat kadar sonra ortaya çıkar. Sabit pupiller, okulosefalik

refleks yokluğu (orta-beyin, pons zedelenmesi), kornea refleksi yokluğu (pons

zedelenmesi), öğürme refleksinin kaybı, dilde fasikülasyonlar (medulla spinalis

zedelenmesi) görülebilir. Bu bulgular bebeğin uyanık durumlarında biraz düzelme

gösterse bile genellikle kalıcıdır. Öğürme refleksinin azalması nedeni ile beslenme ve

yutma bozuklukları görülür, nazofarenkste biriken sekresyonlar sorun olur ve bu

nedenle bebeğin entübe edilmesi gerekebilir. Beyin-dıĢı organlardaki zedelenme

bulguları daha hafiftir.1

2.1.4. Patoloji

Hipoksi-iskemi ardından geliĢen serebral hasarın patolojik görünümü üniform

özellikte değildir. OluĢan beyin hasarının lokalizasyonu, yaygınlığı ve Ģiddeti Ģu

faktörlere bağlıdır:

1. Asfiksiye neden olan olayın Ģiddeti (total veya parsiyel),

2. Etiyolojik faktörün zamanı ve süresi (akut veya kronik)

3. Beynin geliĢimsel olgunluğu (prematüre veya term)

4. Beyinde bölgesel duyarlı bölümler [vasküler faktörler ve N-metil D-

aspartat (NMDA) reseptörlerinin dağılımı].1,26

Beyin zedelenmesinin ne zaman olduğu ile ilgili yapılmıĢ çalıĢmalar az olmakla

birlikte histolojik incelemelerle lezyonun yaĢı konusunda bilgi edinilebilir (Tablo 3).1

7

Tablo 3. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı

Bulgu Gün

Reaktif astrositozis 0.5 - 4

Mikroglial proliferasyon 0.3-3

Nöronal karyoreksis 0.5-2

Makrofaj infiltrasyonu 4-6

Kapiller endotelyel reduplikasyon 5

Fibriller gliosis 6

Kist oluĢumu 10-42

HĠE‟de patolojik görünüm, serebral matürasyon ve dolayısıyla gestasyon yaĢı ile

farklılık göstermesi nedeniyle ayrı ayrı tartıĢılmaktadır (Tablo 4).10

Term bebekte

gözlenen hipoksik-iskemik beyin hasarında; selektif nöron nekrozu, parasagittal

zedelenme ve fokal iskemik beyin nekrozu görülür. Bunların arasında esas olan selektif

nöron nekrozudur. Prematür bebekte görülen oligodendroglial /beyaz cevher hasarı term

bebekte de görülmekle birlikte nöron hasarı daha baskındır.10

Hipoksik iskemik

ensefalopati esas olarak term bebeklerde geliĢtiği için burada daha çok nöron nekrozuna

neden olan patolojik biyokimyasal olaylardan bahsedilecektir.

Tablo 4. HĠE’li yenidoğanda nöropatolojik özellikler10

Matür yenidoğan Selektif nöronal nekroz

Bazal ganglia ve talamusun status

marmoratusu

Parasagital serebral hasar

Fokal ve multifokal iskemik serebral

nekroz

Prematüre yenidoğan Selektif nöronal nekroz

Periventriküler lökomalazi

Fokal ve multifokal iskemik serebral

nekroz

Periventriküler hemorajik infarkt

8

Hipoksik iskemik ensefalopati‟de geliĢebilen baĢlıca serebral lezyonlar: 1)

Selektif nöronal nekroz 2) Bazal ganglion ve talamusta status marmoratus Ģeklinde

lezyon 3) Parasagital serebral hasar 4) Periventriküler lökomalazi (PVL) 5)

Periventriküler-Ġntraventriküler kanama (PV-ĠVK) 6) Fokal ve multifokal iskemik beyin

lezyonlarıdır.1

2.1.4.1.Selektif nöronal nekroz

Miyadında doğan bebeklerde H-Ġ hasarın sık rastlanan bir tipi olan selektif

nöronal nekroz sıklıkla serebral korteks, talamus, beyin sapı ve spinal kordun ön boynuz

hücrelerini içerir. Bu tip hasara en yatkın bölge serebral korteks tabakaları ve

hipokampus bölgesidir. Lezyonlu bölgede sitoplazmik eozinofili ve nükleer kırılmalar

dikkati çeker. Kronik nöropatolojik değiĢiklikler, nöronal kayıp, astrositozis ve

multikistik ensefalomalazi ile sonuçlanır.26

2.1.4.2. Status Marmoratus

Hayvan modellerinde bu tip lezyon daha çok akut, tama yakın asfikside görülür.

Bazal ganglionlar ve talamusta nöronal kayıp, gliozis ve anormal miyelinizasyon ile bu

bölgeler mermerimsi bir görünüm alır.1,16

2.1.4.3. Parasagital Serebral Hasar

Daha çok serebral korteks ve subkortikal beyaz cevheri tutan bir lezyon tipidir.

Hasar genellikle bilateral ve simetriktir, lezyonlardan çoğunlukla hemoraji değil,

infarktlar sorumludur. BaĢlıca anterior, posterior ve median serebral arterlerin sulama

alanlarında yaygın nöron kaybı olur.16

2.1.4.4. Periventriküler Lökomalazi

Periventriküler lökomalazi (PVL) özellikle lateral ventriküllerin dorsal ve

laterallerinde serebral beyaz cevherin hipoksik-iskemik nekrozu Ģeklinde tanımlanır.

Serebral arteriyel anatomik farklılıklar nedeni ile ortaya çıkan tablo, bebeğin gestasyon

yaĢına göre değiĢir. Daha çok prematüre bebeklerde gözlenir ve oluĢan hasar,

koagülasyon nekrozu ve periventriküler beyaz maddenin infarktı ile sonuçlanır. Çok

9

düĢük doğum ağırlıklı (<1500 gr) bebeklerin % 25-40‟ında PVL görülür. Ön, orta ve

arka serebral arterlerin meningeal dallarındaki zengin interarteriel anastomozlara bağlı

olarak serebral korteks rölatif olarak korunur. Hastaların yaklaĢık % 25'inde

periventriküler infarkt alanlarında hemoraji görülür ve genellikle ağır intraventriküler

hemoraji ile birliktedir.1,16

Oligodendrosit hasarı geliĢen prematür bebeklerde 32 haftalık olduklarında

beklenen hızlı miyelinizasyon safhası olmaz ve miyelinizasyon artıĢına bağlı beyaz cevher

artıĢı görülmez. Buna bağlı olarak rölatif ventriküler dilatasyon geliĢir ki bu duruma

sıklıkla „ex vacuo‟ veya atrofik ventrikülomegali denir.1

2.1.4.5. Periventriküler Hemorajik Ġnfarkt

Periventriküler hemorajik infarkt (PVHI), prematürelerde sıklıkla ciddi IVH ile

birlikte ortaya çıkar. Genellikle bilateraldir. Daha çok venöz orijinlidir. Venöz infarkt

medüller ve terminal venlerin geniĢ subepandimal germinal matriks hemorajisi ile

tıkanması sonucu oluĢur.17

2.1.4.6. Fokal ve Multifokal Ġskemik Beyin Hasarı

Fokal nekroz, asfiktik bebeklerin % 5-20'sinde görülebilen ana serebral

arterlerden birinin tıkanması sonucu geliĢen bir iskemik beyin hasarıdır. Arteriyel

oklüzyonla iliĢkili fokal iskemik serebral lezyonlar prematürelerde daha az görülür.

Prematüre bebeklerde daha çok multipl küçük damarların tıkanması sonucu oluĢan çok

sayıda, küçük, dağılmıĢ infarktlar görülür. Tromboembolizm fokal beyin hasarının en

muhtemel nedeni olarak kabul edilir. Embolinin kaynağı genellikle plasental infarkt,

harabiyete uğramıĢ veya kateterize edilmiĢ damarlardır. Polisitemi, hiperkoagülabililite

(protein C ve S, antitrombin III eksikliği), yaygın damar içi koagülasyon diğer nedenler

arasındadır. Lezyon, vakaların yaklaĢık yarısında orta serebral arterin sulama alanında

gözlenir ve yaygındır. Bu tip lezyonlarda hücrenin tüm organellerinde nekroz oluĢur.

Anoksik nöronal değiĢiklikten 18–24 saat sonra ıĢık mikroskobunda değiĢiklikler

izlenmeye baĢlar. Bölgeye aktive monosit-makrofaj migrasyonu olur. 36–48 saat sonra

bu hücreler geniĢ, köpüksü makrofajlara dönüĢür. Bir süre sonra astrositik hipertrofi ve

proliferasyon geliĢir. Bazı lezyonlarda kalsifikasyon izlense de genellikle ventrikülle

bağlantılı veya bağlantısız kistik kavitasyon ile sonuçlanır. Kavite oluĢumuna bağlı

10

lezyon tek ve büyük bir boĢluk Ģeklinde olduğunda “porensefali” olarak tanımlanır.

“Hidranensefali”de ise bilateral masif nekroz oluĢur ve bu kavitelere beyin omurilik

sıvısı (BOS) dolar. Bir diğer lezyon “multikistik ensefalomalazi”de bilateral küçük

kavitasyon odakları geliĢir. Bu lezyon daha çok beyaz cevherde izlenir. Fokal ve

multifokal iskemik beyin lezyonları kraniyal USG, BBT ve MR ile diğer lezyonlara

göre daha kolay saptanabilirler.1,16,18

2.1.5. Perinatal Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi

Hipoksi-iskemi prematür ve matür bebeklerde farklı nöropatolojik olaylara yol

açar. Term bebeklerde esas olay nöron hasarı iken prematür bebeklerde

oligodendroglial/beyaz cevher hasarı daha hâkimdir. Hipoksik-iskemik serebral hasarın

önlenebilmesi, hücre yıkımına yol açan biyokimyasal olayların anlaĢılması ile mümkün

olabilir.10

Serebral hasar ile sonuçlanan hipoksik iskemik ensefalopati tablosunun

patogenezinden hipoksi ve iskeminin birlikteliği sonucunda meydana gelen bir dizi

biyokimyasal ve patolojik reaksiyonlar sorumludur. Tek baĢına hipoksi, iskemi ya da ATP

gibi enerji kaynağı olan moleküllerin azalmasının hipoksik-iskemik (H-Ġ) serebral hasar

oluĢması için yeterli olmadığı çok sayıda yapılan hayvan deneylerinde gösterilmiĢtir.1,19,20

H-Ġ beyin hasarının esas bulguları akut hipoksi-iskemi döneminde değil, daha

çok reperfüzyon ve reoksijenasyon döneminde ortaya çıkmaktadır. Ġlk oluĢan olay

glikoz ve oksijenin azalmasıdır. Hücre ölümüne neden olan olaylar hipoksik-iskemik

olayın sonlanmasından sonra ve reperfüzyon sırasında enerjide çok da fazla düĢüĢ

olmasını beklemeden oluĢur ve bunu glutamat reseptörlerinin aktivasyonu izler. Nöron

ölümüne neden olan diğer olaylar sitozolik kalsiyumun artması ve kalsiyuma bağlı

süperoksid anyon, hidroksi radikaller gibi serbest radikallerin ve nitrik oksit

derivelerinin oluĢması gibi çeĢitli zararlı olayların aktive olmasıdır. Nöron ölümüne

neden olan olaylar kaskadı hipoksik-iskemik hasarın sonlanmasından birkaç saat sonra

oluĢur. Bu nedenle bu dönemde beyin hasarını azaltabilecek veya daha kötü olmasını

engelleyebilecek önemli giriĢimler yapılabilir.10

HĠE‟de geliĢen patolojik mekanizmalar Ģematik olarak ġekil-1‟de gösterilmiĢtir.1

11

Primer nöron ölümü

ATP tükenişi

Nötrofil PAF+ Serbest

aktivasyonu eikosanoidler radikaller

Lipit peroksidasyonu

+

Mikrovasküler tıkanma Otoregülasyon Vazojenik

DNA kırılması kaybı ödem

DNA Lipaz Proteaz Yetersiz

Kırılması oksidatif

fosforilasyon

ATP tükeniĢi

Pompa Yetersizliği Hipoksantin

Serbest radikaller

Hipoksik İskemik Hasar

Sitotoksik ödem

Resusitasyon Reperfüzyon ve

Oksijenasyon

Serbest Radikaller

Glutamat Salınımı

Serebrovasküler disfonksiyon

NMDA

Kalsiyum

NĠTRĠK

OKSĠT

Apoptozis

SEKONDER NÖRONAL ÖLÜM

ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakıĢ 10

12

2.1.5.1. Hipoksemi

Intrauterin dönemde fetus, O2 basıncının 22-28 mmHg arasında olduğu fizyolojik

hipoksemik bir ortamdadır. PO2‟nin 15 mmHg‟e kadar düĢtüğü durumlarda normal

kardiyovasküler fonksiyonların bir kaç saat kadar devam edebildiği, kalp hızının ve

sistemik kan basıncının düĢmesi ile birlikte ilerleyici laktik asideminin oluĢtuğu

gösterilmiĢtir. Dokuda yüksek enerjili fosfat rezervleri (özellikle ATP), hipoksemi

esnasında oldukça iyi korunur. Ancak sistemik hipotansiyona hipoksemi eĢlik ediyorsa ve

serebral iskemi oluĢmuĢsa beyin hasarının meydana gelme Ģansı yüksektir.21,22

2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi

Hipoksinin meydana getirdiği beyin hasarında doku O2‟nin azalmasına ek olarak

bir veya daha fazla faktörün rol oynadığı düĢünülmektedir. Hayvanlardaki ilk çalıĢmalar

Myers ve arkadaĢları tarafından yapılmıĢtır.5 Annelerinin abdominal aortası sıkıĢtırılarak

asfiksi yaratılan term maymun fetüslerinde iyileĢmeyi takiben esas olarak serebral

hemisferlerde zararlanma olduğu gösterilmiĢtir. Ayrıca kortikal gri cevherde atrofi, beyaz

cevherde skleroz ve bazal gangliyonlarda status marmoratus Ģeklinde hasarlanma

gözlenmiĢtir. Benzer lezyonlar perinatal periyotta serebral hipoksi-iskemi meydana gelip

yaĢayan bebeklerde de saptanmıĢtır. Bu çalıĢmalara ek olarak Brann ve Myers, gaz

anestezik ve halotan ile annelerinde hipotansiyon yaratarak parsiyel intrauterin asfiksiye

maruz bıraktıkları termindeki maymun fetüslerinde ağır hipoksemi ile birlikte kombine

metabolik ve respiratuvar asidoz oluĢtuğunu tespit etmiĢlerdir. Doğumu ve resüsitasyonu

izleyen dönemde maymunların mekanik ventilasyona gereksinim duydukları, konvülziyon

geçirdikleri ve 96 saatten önce stabilize olmadıkları görülmüĢtür. Yapılan nöropatolojik

incelemelerde yaygın beyin ödemi ve soluklukla birlikte, hemorajik nekrozun özellikle

serebral korteks ve subkortikal beyaz cevherde oluĢtuğu gösterilmiĢtir. Sistemik kan

basıncı daha düĢük olan maymunlarda asfiksinin daha ağır beyin hasarına yol açtığı

görülmüĢtür. Hipoksik kardiyovasküler depresyon sonucu sistemik hipotansiyon oluĢması

için O2 basıncının %40 veya altında olması gerekmektedir. Hipoksemi esnasında kan

basıncı daha düĢük olduğunda serebral iskemi daha da artmakta ve beyin hasarı daha ağır

olmaktadır.5,21

13

Beyin hasarının oluĢabilmesi için serebral hipoksi-iskeminin minimum ne kadar

sürmesi gerektiği sorusu en önemli sorudur. Bu sorunun yanıtı serebral hipoksi-iskeminin

ağırlığına, olayın olduğu zamanki beynin anatomik ve fonksiyonel maturasyonuna

bağlıdır. Hipoksi-iskemi esnasında daha matür hayvanlarda daha kısa total asfiksi

süresinde beyin hasarı meydana gelmektedir. Parsiyel serebral H-Ġ‟de bu süre daha uzun

olmaktadır. Hayvanlarda yapılan deneylerde bu süre muhtemelen üç saatten daha fazla

değildir. Üç saatten daha az hipoksi-iskemiye maruz kalan hayvanların baĢarılı bir Ģekilde

canlandırıldığı görülmüĢtür.21

Deneysel verilere ek olarak klinikte de sistemik hipoksemiye

bağlı serebral iskeminin meydana getirdiği beyin hasarı radyografik bulgular, prognoz ve

postmortem sonuçlar ile değerlendirilmiĢtir. Yapılan çalıĢmalarda hipoksemi ile birlikte

sistemik hipotansiyonun özellikle prematür bebeklerde subkortikal veya periventriküler

lökomalaziye neden olduğu tespit edilmiĢtir. Miall-Allen ve arkadaĢları, 31 haftanın

altındaki 33 yenidoğan bebekte ortalama arteriyel kan basıncının bir saatten daha fazla 30

mmHg‟nın altında seyretmesi durumunda periventriküler beyaz cevherde ağır hemorajik

infarkt veya iskemi geliĢtiğini göstermiĢtir. Ortalama arteriyel kan basıncı 30 mmHg

üzerinde olan bebeklerde ise daha az lezyon geliĢmiĢtir.5

2.1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma

2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü

Ġrreversibl doku hasarına neden olan serebral H-Ġ‟de beynin enerji durumunda

belirgin değiĢiklikler söz konusudur. Hipoksiye ilk metabolik yanıt anaerobik

glikolizdir. Doku O2 basıncı kritik bir değer altına indiğinde (<0.1 mmHg)

mitokondrilerin sitokrom sistemleri ansatüre hale gelir. Redükte ajanlar (NADH,

FADH) birikmeye baĢlar. Oksidatif fosforilasyonla oluĢan ATP üretimi durur. ATP, tüm

hücrelerde olduğu gibi nöronlarda da primer enerji kaynağıdır. Ġki yüksek enerjili fosfat

bağı biyokimyasal reaksiyonlar ve fizyolojik olaylarla yakından iliĢkilidir. ATP enerji

tüketen reaksiyonlarda ve iyon pompalanması gibi fizyolojik iĢlemlerde önemli rol oynar.

ATP‟ye bağımlı Na+ pompası ve değiĢimi, Na

+‟un intrasellüler birikimine neden olarak

sitotoksik ödeme yol açar.23

Aerobik ortamda mitokondriumlarda gerçekleĢen oksidatif fosforilasyon ile 36

mol ATP üretilirken anaerobik glikoliz ile sadece 2 mol ATP üretilir. Enerji ihtiyacının

14

karĢılanması için anaerobik glikoliz hızının 18 kat artması gerekir. Ancak glikolizisin

maksimum stimülasyonu ile kapasite en çok 4–5 kat artabilir. Bunun nedeni bu sırada

biriken NADH‟tan kaynaklanan H+ iyon birikiminin glikolizin kilit enzimlerinden biri

olan fosfofruktokinaz (PFK) aktivitesini inhibe etmesidir. Böylece glikoliz, parsiyel

oksijen yokluğunda oksidatif fosforilasyonu stimüle edebilmesine karĢın, hiçbir zaman

mitokondriyal oksidasyonun yerini dolduramaz.1,23

Hipoksi-iskemi sırasında primer enerji yetmezliğinin ardından geliĢen ve

enerjinin kısmen geri kazanıldığı bir reperfüzyon devresi vardır. YaklaĢık 24 saatlik bir

latent süre sonunda yeterli serebral perfüzyon ve oksijenizasyonun olmasına rağmen

ikinci bir enerji yetmezliğinin olduğu dönem geliĢir. Latent faz döneminde gecikmiĢ

hücre hasarı oluĢur. Bu dönem çalıĢmaların yoğun olarak yapıldığı ilgi çeken bir

dönemdir.10

2.1.5.3.2. Ġntrasellüler asidoz

Beyinde hasar oluĢturacak kadar yeterli H-Ġ, hemen daima doku asidozu ile

birliktedir. Bunun nedeni laktik asit birikimidir.1 Ġntrasellüler laktik asidoz, glikozun

oksidatif metabolizmasının kısmi veya total anaerobik glikolizise dönüĢümü sonucu

meydana gelir. Bu olay esnasında doku O2‟i çok düĢük seviyelere iner. Bazı araĢtırıcılar

beyindeki laktik asidozun hipoksik-iskemik hasarın major nedeni olduğunu öne

sürmüĢlerse de yapılan bazı araĢtırmalarda immatür hayvanlarda serebral laktik asidozun

beyin hasarı oluĢmasında kritik rolünün bulunmadığı yönünde bulgular da elde

edilmiĢtir.24

Hipoksi-iskemide laktik aside ek olarak hidrojen iyonlarının da hücresel

asidoza neden olduğu düĢünülmüĢtür. ĠndirgenmiĢ ekivalanların major kaynağı, ATP‟nin

asit hidrolizi ile oluĢan ve sellüler enerji kaybı ile biriken NADH+, H

+‟dir.

25

Hipoksi-iskemi esnasındaki sellüler asidoza bağlı nöronal nekrozdan değiĢik

mekanizmalar da sorumlu olabilir. Bunlar arasında mitokondriyal fonksiyonun

inhibisyonu, iyon dengesinin bozulması, Ca+2

birikimi ve ödem oluĢumunun artıĢı

gösterilebilir.5

2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması

H-Ġ serebral hasarın en önemli nedenlerinden birisi sinapslarda eksitatör

nörotransmitterlerin birikmesidir. Eksitatör aminoasitlerin en önemli özelliği fizyolojik

15

düzeyleriyle toksik düzeyleri arasındaki farkın çok az olmasıdır. Ġnsanda en çok

bulunan eksitatör nörotrasmitter aminoasit L- glutamattır. Daha az miktarda bulunan L-

aspartat da önemli bir eksitatör aminoasittir.1,26

L-glutamat sinaptik aralıktan ATP‟ye

bağımlı aktif transport ile geri emilir. Astrositler içine alınan glutamat, ATP‟ye bağımlı

bir enzim olan glutamin sentetaz aracılığıyla NH3 ile birleĢerek glutamin Ģeklinde

ortamdan uzaklaĢtırılmıĢ olur. Hipoksik iskemi durumunda ATP‟nin üretiminde azalma

olması nedeniyle sinaptik aralıktan uzaklaĢtırılamayan L-glutamat, nörotoksik etkisini

bağlandığı reseptörler aracılığıyla gösterir (ġekil-2). Bu reseptörler baĢlıca; N-metil D-

aspartat (NMDA), alfa amino 3-OH 5-metil 4 isoksazol propionik asit (AMPA), kainat

(KA) ve 1-amino-siklopentan-15,3R-dikarboksilik asittir (ACPD veya kuiskalat-B).

NMDA, AMPA ve KA reseptörleri postsinaptik membrandan Na+ ve Ca

+2 iyon geçiĢini

sağladıkları için bunlara iyonotropik reseptörler denir. ACPD reseptörüne ise fosfoinositol

hidrolizi, protein kinaz-C aktivasyonu ve endoplazmik retikulumdan Ca+2

mobilizasyonunu sağladığı için metabolizmayı uyaran anlamında metabotropik reseptör

denir. Ġyonotropik reseptörlerin hepsinde Na+, K

+ geçiĢi sağlanır. NMDA reseptöründeki

iyon kanalından Na+ ve K

+‟a ek olarak Ca

+2‟ da geçer. AMPA reseptörü yalnız immatür

nöronlarda Ca+2

‟a geçirgen özellik taĢır.1,27

ġekil-2. Akson terminalinden salınan glutamatın postsinaptik dentrit ve astrosit içerisindeki

döngüsü, reseptörleri ve iyon kanalları (VBKK: voltaj bağımlı kalsiyum kanalı, Glu: glutamat, Gln:

glutamin).

16

Nöronal hücre kültürlerinde yapılan çalıĢmalarda iyona bağımlı nöronal hasar

mekanizması iki Ģekilde açıklanmıĢtır:

A- Erken nörotoksisite: Depolarizasyon esnasında nöronların içine fazla

miktarda Na+ ve Cl

- geçiĢinin olması nedeniyle hücre içi ozmolaritesi artar. Hücre içine

su giriĢi artar. Sitotoksik ödem meydana gelir ve hücre ölümü gerçekleĢir.

B- GecikmiĢ nörotoksisite: NMDA reseptörlerine bağlı kanallar yoluyla hücre

içine giren fazla miktardaki Ca+2

iyonları, biyokimyasal bazı olayları harekete

geçirirerek nöron ölümüne yol açar.

Eksitatör aminoasitlerin, serebral hipoksi iskemide, nöronal zedelenmenin

nedeni olduğunu gösteren bulgular Ģunlardır:

1. Beynin hipoksiye daha duyarlı olan bölgeleri glutamik asit içeren

sonlanmanın en fazla olduğu yerlerdir.

2. HIE'li yenidoğanlarda BOS glutamat ve aspartat düzeylerinin arttığı

gösterilmiĢtir.

3. Beyine glutamat enjekte edildiğinde HĠE benzeri değiĢiklikler olmaktadır.

Glutamat salım inhibitörü (BMW 1003C87 triklorofenil- diaminopirimidin) verilmesi

H-Ġ beyin hasarını büyük ölçüde önlerken glutamat alım inhibitörü (L- trans 2, 4-

Pyrolidin dikarboksilat) verilmesi nörotoksik etki yapmaktadır.28,29

4. Glutamat reseptör antagonistleri H-Ġ hasarı büyük ölçüde önler. NMDA

reseptör antagonisti olan MK801 'in ve AMPA reseptör antagonisti olan NBQX'un

hasarı azalttığı; bunda NMDA reseptör antagonistlerinin daha etkili olduğu

gösterilmiĢtir.30

NMDA reseptör kanal kompleksinde antagonistik etki yapan ilaçların (ketamin,

dekstrometorfan, fensiklidin) ve magnezyumun hasarı önlemede yararlı olduğu

gösterilmiĢtir. Magnezyum antikonvülzan etkisini NMDA reseptörünü bloke ederek

yapmaktadır. Nitekim annelerine Ģiddetli preeklamsi nedeniyle magnezyum sülfat

tedavisi uygulanan bebeklerin uzun dönem izlemlerinde nörolojik prognozlarının daha

iyi olduğu özellikle serebral felç oranının daha az olduğu saptanmıĢtır. Ancak bu

konuda yapılan baĢka bir çalıĢmada benzer sonuçların alınmadığı bildirilmiĢtir.31,32

17

2.1.5.3.4. Ġntrasellüler kalsiyum birikimi

Bir hücrenin yaĢam fonksiyonlarını sürdürebilmesi için hücre içi homeostazı

sağlayan enzimlerin iĢlevlerini etkileyen intrasellüler ikinci bir messenger olarak görev

yapan Ca+2

iyon konsantrasyonunun çok dar bir aralıkta tutulması gerekmektedir. Hücre

içinde fazla miktarda Ca+2

birikimi nöron ölümü ve membran bütünlüğünün bozulmasına

neden olur. Normalde serbest Ca+2

hücre içinde çok düĢük düzeylerde olup, tamamına

yakını mitokondri ve endoplazmik retikulumda, az miktarı ise nöronun plazma

membranı ve nükleus gibi hücre içi organellere bağlı halde bulunur. Bağlanma iĢlevi

enerjiye (ATP) bağımlı ve intrasellüler pH‟dan etkilenen bağımsız olaylar ile meydana

gelir. Ayrıca Ca+2

bağlayan çok özel proteinler de sitozol içinde bulunur ve bunlar serbest

Ca+2

konsantrasyonlarının hücre içerisinde dar sınırlarda korunmasını sağlarlar.

Kalsiyumun fizyolojik ekstrasellüler seviyeleri plazma membranı boyunca serbest

kalsiyumun hücreye giriĢ çıkıĢına imkân verir.1

Hipoksi-iskemi‟de glutamat reseptörlerinin aĢırı uyarılması sonucu hücre içinde

serbest sitozolik Ca+2

konsantrasyonu artar.1 Bu yükselmenin iki kaynağının olduğu

tahmin edilmektedir:

1. Kalsiyumun intrasellüler depolardan serbest hale geçmesi

2. Plazma membranı boyunca geçiĢinin artması

Açığa çıkan serbest sitozolik Ca+2

, potansiyel olarak toksik seviyelere eriĢir.

Sitozolde kalsiyum birikimi Ģu Ģekilde gerçekleĢir; AMPA reseptörlerinin uyarılması

hücre membranının sağladığı Na+-K

+ dengesini bozarak depolarizasyona neden olur. Bu

depolarizasyon NMDA reseptörlerindeki magnezyumun uzaklaĢmasına yol açarak

hücre içine daha fazla Ca+2

girmesine neden olur. Hücre, önce Na+ giriĢinin artmasıyla

ĢiĢerse de, esas zedelenme hücre içindeki Ca+2

düzeyinin artmasıyla olur.1 ACPD

(kuiskalat) reseptörlerinde ise intrensek iyon kanalı yoktur. Etkilerini G proteinlerini

aktive ederek gösterirler. G proteini fosfolipaz C'yi aktive eder. Bu enzim hücre zarının

iç kısmındaki fosfatidil inositol'ü inositol trifosfat ve diaçilgliserole parçalar.

Diaçilgliserol bazı hücre içi proteinleri aktif hale getirirken, inositol trifosfat hücre içi

depolardan sitoplazmaya serbest Ca+2

salınmasına neden olur (ġekil -3). Kalsiyum

dengesinde meydana gelen bu değiĢiklikler hücre içerisinde birçok enzimin

aktivasyonuna yol açarak nöronun canlılığının devamını etkiler.1

18

ġekil-3. Hücre içi kalsiyum homeostazı (DAG: diaçil gliserol, PL-C: fosfolipaz- C, PIP2:fosfatidil

inositol -4,5 -difosfat, IP3:inozitol trifosfat).

Hücre içi serbest Ca+2

'un artması

1. Endonükleazların aktive olmasıyla DNA, proteazların aktive olmasıyla

sitoskeletal proteinler ve bazı membran proteinleri parçalanır.

2. Fosfolipaz A2 aktive olur ve membran fosfolipidlerinin yıkılmasına yol açar.

Hücrede araĢidonik asit birikir. Siklooksijenaz enziminin aktivasyonu ile

prostoglandinler ve tromboksan A2 meydana gelir. Siklooksijenaz yolağı ve hipoksik-

iskemik serebral hasardaki rolü aĢağıdaki bölümlerde daha detaylı anlatılacaktır.

Lipooksigenaz enzimi de aktive olarak lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikalleri

açığa çıkar (ġekil-4).

3. ATP düzeyi azalır; ADP, AMP, adenozin, ve hipoksantin oluĢur. Ksantin

dehidrogenaz enzimi ksantin oksidaza çevrilir bu enzimle hipoksantin parçalanır ve bol

miktarda serbest oksijen radikali ortaya çıkar.1

4. Ca+2

-kalmodülin kompleksi NOS‟u aktive etmesiyle NO oluĢur. NO

‟in

HĠE patogenezindeki rolüne daha sonraki bölümlerde ayrıntılı bir Ģekilde değinilecektir.

Nörotransmitterlerin salınımı ile artan hücre içi kalsiyum, Ca+2

-kalmodulin

bağımlı protein kinaz II enzimini aktive eder. Bu enzim, içi nörotransmitterlerle dolu

vezikülleri skeletal proteinlere bağlı tutan „„sinapsin‟‟ adlı proteini fosforile ederek bu

veziküllerin serbestleĢmesine neden olur. Serbest kalan veziküller yine Ca+2

yardımıyla

19

presinaptik bölgedeki „‟sinaptofizin‟‟ adlı proteinle birleĢir ve içeriklerini sinaptik

aralığa boĢaltırlar. Eksitatör aminoasitlerin ekstrasellüler aralığa salınmasıyla olay daha

da Ģiddetlenir. ÇeĢitli lipaz, proteaz ve endonükleazların da aktivasyonu sonucu diğer

nöronlar da etkilenir. Kalsiyum ayrıca ksantin ve prostoglandin formasyonu ile serbest O2

radikallerinin oluĢumuna da yol açar. Nihayet intrasellüler serbest Ca+2

‟un yüksek

konsantrasyonları mitokondriyumda oksidatif fosforilasyonun kesintiye uğramasına neden

olur.1,33

2.1.5.3.5. Serbest radikaller

Özellikle reperfüzyon-reoksijenizasyon döneminde prostaglandinlerin yapımı,

hipoksantinin parçalanması ve NO artıĢı ile serbest radikaller açığa çıkmaktadır (Ģekil-

4). Bunlar doğrudan hücre için toksik olabildikleri gibi, retikülo endotelial hücrelerin

aktive olmalarına yol açarak doku zedelenmesini de arttırırlar.34

Burada toplanan

lökositlerin ürettikleri O2 radikalleri, sitokinler ve proteazlarla hücre zedelenmesi

yaparlar.35

Hipoksi-iskemi (Eksitatör aminoasit etkisi)

ATP Fosfolipitler Arjinin

Hipoksantin AraĢidonik asit Nitrik oksit

Ksantin Lökotrienler Peroksinitrit

Serbest oksijen radikalleri Zedelenme

Reperfüzyon- Oksijenasyon

ġekil- 4. Reperfüzyon reoksijenizasyon döneminde serbest oksijen radikallerinin oluĢumu.

20

2.1.5.3.6. Sitokinler

Proinflamatuvar sitokinler birkaç değiĢik mekanizma ile beyin hasarına neden

olurlar. Ġnflamatuvar sitokinler direk serebral sitotoksik etki göstererek oligodendrosit

öncüllerinin farklılaĢmasını önlerler,36

oligodendrosit apoptosisini stimüle ederler.37,38

ve vakuoler myelin dejenerasyonuna neden olurlar.39

Sitokinlerin potent vazomotor ve

vazooklusif etkileri olabilir.40,41

Son bilgiler sitokin toksisitesinin glutamat

transportundaki bozukluklar nedeni ile olabileceğini göstermiĢtir.42

Ekstrasellüler

glutamat regülâsyonunda önemli rolü olan astrositler, glutamatı 1000 kat konsantre

etme yeteneğine sahiptir. Glial kültürlerde proinflamatuvar sitokinlerden Ġnterlökin

(ĠL)-1β ve Tümör nekrozis faktör (TNF)- α‟nın glutamat transportörünün fonksiyonunu

bozdukları ve glutamat aracılıklı oksidatif stresi arttırdıkları gösterilmiĢtir.42

Buna

karĢın anti-inflamatuvar olan ĠL-4 ve ĠL-10 bu etkiyi pro-inflamatuvar sitokinlerin

üretimini engelleyerek indirek yoldan inhibe eder. Astrositlerdeki glutamatı temizleme

kapasitesindeki bozulma antioksidanlar, vitamin-E ve glutatyon ile düzeltilebilir. Bu

durum, astrositik glutamat transportörlerinin serbest radikaller ile kısmen de olsa

hasarlandığını göstermektedir. Oligodendrositlerdeki glutamat transportörlerindeki

geriye dönüĢüm de hipoksik-iskemik hasarın mekanizması ile iliĢkilendirilmiĢtir.43

Son

olarak glutamat reseptörlerinin fetal geliĢim sırasında aksonlarda geçici olarak

bulunduğu tanımlanmıĢtır, bu nedenle aksonal zedelenme immatür beyaz cevherdeki

glutamat birikiminin diğer bir nedeni olabilir.44

DolaĢımda yer alan sitokinler, iskemi veya maternal, fetal ve neonatal kaynaklı

enfeksiyon zemininde oluĢabilirler. Tek baĢına iskemi dolaĢımdaki sitokinlerin

artmasına neden olabilir. Buna karĢın ĠL-1β ve TNF-α gibi inflamatuvar sitokinlerin in-

situ üretimi endotoksinler aracılığı ile mikroglialar üzerinde toll-like reseptörlerin

aktivasyonu ile sağlanır ve oligodendrosit ölümüne neden olur.45

2.1.5.3.8. Apopitoz

Hipoksi iskemiden sonra nöronlar dejenere olur. Nöronların nasıl öldüğünü

anlamak tedavinin yönlendirilmesi için oldukça önemlidir. Nöronlar farklı yollarla

ölebilir. Hücre ölümü apopitoz ve nekroz diye iki farklı tip olarak sınıflandırılmıĢtır. Bu

hücre dejenerasyonun yapısal ve biyokimyasal açıdan farklı oldğuna inanılmaktadır.1

21

Apopitoz özel moleküler yolaklarla ilerleyen kendine özgü meknizmaların

karıĢtığı aktif organize programlanmıĢ hücre ölümüdür. Apopitoz genelde geliĢen

beyinin fizyolojik hücre ölümü olarak görülür. Memelilerde birkaç gen ailesi apopitozu

düzenler (Tablo 6). Bcl-2 ailesi; sistein içeren kaspaz ailesi, aspartat spesifik proteazlar;

apopitoz inhibitör protein (AĠP); ailesi, tümör nekrozis faktör (TNF) reseptör ailesi ve

p53 gen ailesi46

Bcl-2 protoonkogen ailesi birtakım etkileĢimler yoluyla proteinleri

kodlayan apopitozis düzenleyici bir gen grubudur. Bu Bcl-2 ailesi içerisindeki

etkileĢimler hücresel yaĢam ve ölüme etki eder. Kaspazlar (sisteinil aspartat- spesifik

proteazlar) proenzimler tarafından aktive edilirler. Nükleer proteinler, hücre iskeleti

proteinleri, sitozolik proteinler kaspazlar tarafından parçalanan hedef proteinlerdir.

Normal hücrelerde istenmeyen apopitozu önlemek için proapopitotik proteinlerin

aktiviteleri apopitoz inhibitör proteinler tarafından etkisizleĢtirilir. Apopitoza bağlı

hücre ölümü hücre membranında bulunan ölüm reseptörleri olarak adlandrılan yüzey

reseptörlerince baĢlatılabilir. Tümor nekrozis faktör reseptör ailesi ölüm reseptörleri

olarak görev yapar. Fas (CD95/Apo–1) ve p75 (düĢük afiniteli sinir büyüme faktör

reseptörü) bu ailenin üyeleridir. Bu mekanizmayla apopitoz Fas‟ın hücre yüzeyinde

birikimi ile baĢlatılır. Çok değerli Fas ligandların TNF ailesinden bir üye tarafından

bağlanması ile Fas aktivasyonuna neden olur. P53 ve onun iki homologu olan p63 ve

p73 apopitozu harekete geçirir.46

Nekroz, hücreye dıĢarıdan gelen saldırılardan (osmotik, termal, toksik veya

travmatik) dolayı hemostazı sürdürememesi ile sonuçlanan hücre ölümüdür. Hücresel

nekroz süreci hücre membranın yapısal ve fonksiyonel içerğinin hasarı, hızlı iyon ve su

giriĢi sonuç olarak hücrenin çözülmesini içerir. Böylece hücresel nekroz hücre içindeki

bir program değil fakat ani veya yavaĢ homostatik karıĢıklıklar ve fizyolojik

durumlardan gelen değiĢiklikler tarafından baĢlatılır. Hipoksi iskemiden sonra

nörodejeneratif hastalıklardan farklı bir hücre ölümü meydana gelir. Havyan modelleri

HĠE için tedaviler geliĢtirilmesine yardım edebilir. Bu tedaviler anahtar enzim

aktivasyonunun inhibisyonu, hücre membranındaki iyon kanallarının (NMDA, Ca+2

kanalları), diğer proteinlerin veya nöronal hasar sürecinde ortaya çıkan toksik kimyasal

ürünlerin (serbest oksijen radikaller) bloke edilmesi veya aktivasyonunun önlenmesini

sağlayan ilaçlar olabilir.47

22

Ġmmatür beyinde nörodejerasyon fenotipik olarak heterojenöz veya bölgeye

özeldir. Hayvan modelinde korpus striatum nöronal hasar daha baskın bulunmuĢtur.48-50

Yenidoğan rat beyninde apopitoz daha çok saptanmıĢtır.51-53

EriĢkinlerde hipoksi

iskemiden sonra selektif nöronların apopitoza yatkın olması kavramı halen

tartıĢmalıdır.54,55

Yenidoğan beyninde, bu düĢünce daha çok sorgulanmalıdır. Hipoksi

iskemiden sonra apopitozun ve nekrozun nöronal ölüme katkısının doğru olarak

tanımlanması son derece önemlidir. Çünkü hem klinik çalıĢamalarda hemde hayvan

modellerinde hipoksi-iskemiden sonra antiapopitotik tedaviler önerilmiĢtir.56

Hipoksi iskemiden sonra striatal nöronlarda 24 saatten sonra nekroz geliĢir.

Golgi aygıtında ve endoplamik retikulumda 3–12 saatte hasar oluĢurken, mitokondri 12

saate kadar sağlamdır. Mitokondride önce aktivitede bir baskılanma daha sonra

zararlnma ve sonunda mitokondriyal yetersizlik geliĢir. Lizozomlarda hasar 3-6 saatte

görülür. Na,K-ATPaz inaktivasyonu 3 saatte gözlenir. Hipoksinin 6 saatinde DNA ve

RNA hidroksil readikallerinden zarar görür.49,50,54

Nöronal apopitoz hipoksi iskemiden

sonraki ilk 24 saatte nöron ölümünün en büyük nedeni değildir. Nöron ve mikrogliadaki

apopitoza en büyük katkı gecikmiĢ veya ikincil hücre ölümünde görülür.49,50,57

Hipoksik iskemik yenidoğan ratlarda nörodejenerasyon hem nekroz hem de apopitoz

Ģeklinde görülmektedir. Ayrıca bu iki nöronal hücre ölümü karıĢık olarak ta görüldüğü

bildirilmiĢtir. Bu çalıĢamalarda nöronal nekroz serebral kortekste daha belirgin iken,

apopitoz talamus ve beyin sapında, hem nekroz hemde apopitoz ise hipokampus ve

striatumda görülmektedir.52,58

Yenidoğan rat beyninde hipoksi-iskemiden sonraki talamik nöron apopitozu

yapısal olarak kortikal zedelenmeden sonraki talamik nöron apopitozu ile benzerdir.51,58

Yenidoğan rat beyninde hipoksi-iskemiden sonraki talamik nöronlardaki apopitoza Fas

ölüm resptölerinin ve kaspaz–8 düzeylerinde hızlı bir artıĢın eĢlik ettiği saptanmıĢtır.

Aynı zamanda mitokindriden zengin hücre fraksiyonlarında Bax ve çüzülebilir protein

kısmında sitokrom c düzeyinin arttığı gösterilmiĢtir. Talamusta artan Fas ölüm

reseptörü ve Bax, sitokrom c birikimi ve kaspaz–8 kaspaz-3‟ün belirgin artıĢına ve

apopitoz oluĢumuna neden olur.52

Bir haftalık ratlarda hipoksi-iskemiden sonra talamustaki yapısal nöron

dejenerasyonunun apopitoz olduğu bildrilmiĢtir.59

Bununla birlikte elektron

mikroskopik çalıĢmalar yalnız apopitozun olmadığını nekrozun da devam ettiğini ve

23

devam eden apopitoz-nekroz olayının olduğunu göstermiĢitir.54,57,60

DNA

fragmantasyon analizleri bu yorumu destekler niteliktedir.61,62

2.1.5.3.8.1. Nekroz ve Apopitozda Hücresel DeğiĢiklikler

Hipoksi- iskemi süresince dokulara zarar veren metabolik değiĢiklikler

meydana gelir. Hücrede aerobik metabolizmadan anaerobik metabolizmaya kayıĢ olur. 63

Tablo 5. Nekroz ve apopitoz arasında anatomik ve iĢlevsel farklılıklar 63

Nekroz Apopitoz

Hücresel hemostaz bozulur Hücresel hemostaz sağlamdır

Hücre zarında iyon akıĢı artar (Na+, Ca

+2) Hücre zarında iyon akıĢı korunur

Organeller ĢiĢer Sitozol yoğunlaĢır

Enerji tükenir Enerji depoları korunur

Makromoleküler sentaz azalır Makromoleküler sentez uyarılır

Kromatin aggregasyonunda kayıp olur Kromatin aggregasyonu yoğunlaĢır

Pasif atrofi Aktif bozulma

Bunun sonucunda NADH, FADH ve laktik asit birikimi H+‟unu arttırır. Anaerobik

metabolizma hücrenin enerji ihtiyacını karĢılayamaz ve yüksek enerjili fosfat depoları

boĢalır. Transselüler iyon pompasının yetersizliği hücre içi Na+, Cl

- ve su birikimine

neden olur (sitotoksik ödem). Hipoksi iskemi aynı zamanda akson sonlanmalarından

eksitator aminoasitlerin (glutamat) salınımını uyarır. Sinaptik aralığa glutamat salınımı

dendritlerdeki AMPA-QA ve NMDA yüzey reseptörlerini uyararak Na+ ve Ca

+2 akıĢına

neden olur. Sitozoldeki Ca iyonu birikimi hücre zarına akıĢı arttırır, dıĢarı akıĢı azaltır.

Bu etki nöron ölümüne neden olan biyokimyasal olaylar kaskadını baĢlatır.63

Nöronlar hem nekroz hem de apopitoza uğradıklarında reperfüzyon sırasında

nöronların iĢlevsel ve antomik bütünlüğünde belirgin farklılıklar oluĢur. Nöron nekroza

gittiğinde yeni oksijen ve substrat gereksiniminden dolayı en az bazı biyokimyasal

oluĢumlarda tersine dönmeyi içeren yavaĢ ilerleyen metabolik bozukluklar görülür.

Hücresel asidoz ve laktat glikolizisi inhibe eder. Sonuç olarak glukoz tüketimi azalır ve

hücre içi glukoz birikimine neden olur. Oksidatif metabolizma yeniden gerçekleĢtiğinde

NADH ve FADH mitokondride tüketilir, hem mitokondri hem de sitozol okside olur.

24

Oksijenizasyonla birlikte değiĢik metabolik süreçler yoluyla serbest radikal üretilir.

Mitokondriyal Ca+2 ve serbest radikal birikimi oksidatif fosforilasyonu bozarak ikincil

enerji yetersizliğine neden olur. Hücre memebranı parçalanmaya baĢlar ve özellikle

mitokondride daha belirgin olmak üzere organellerde ĢiĢme meydana gelir. Çekirdek

kromatini yoğunlaĢır ve piknozis oluĢur, sonuçta nöron çözülür ve ölür.64

Apopitozdaki iĢlevsel ve anatomik değiĢiklikler nekrozdan farklıdır. En belirgin

bozukluk mitokondride meydana gelir, ikinci olarak çekirdekte etkiler görülür.

Histolojik olarak çekirdek DNA‟sındaki değiĢiklikler özel bir boyama yöntemi olan

“terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling (TUNEL)” ile gösterilebilir.63–

67

Tablo 6. Apopitozun moleküler düzenlenmesi 66

Bcl-2 ailesi

Antiapitotik

proteinler

Proapopitotik

proteinler

Kaspaz ailesi

Apopitoz inhibitör

proteinler (AIP)

Tümör

süresör

ailesi

Bcl-2 Bax Apopitoz “baĢlatıcılar” :

kaspaz -2, -8, -9, -10

NAIP

SMN

p53

p63

p73

Bcl-x1 Bak Apopitoz “cellâtlar” :

kaspaz–3, -6, -7

Sitokin iĢlemciler: kaspaz -

1, -4, -5, -11, -12, -14

AIP1

Boo Bcl-xs

Bad

Bid

Bik

AIP2

XAIP

2.1.5.3.8.2. Ekstrinsik Apopitotik Yolak

Ölüm reseptörlerinin bulunduğu bölgede adaptör proteinlerin trimerizasyonu ile

apopitoz baĢlatıcıları olan prokaspaz–8, -10 ve -2‟nin etkisi, prokaspaz–3,-6 ve -7‟nin

aktivasyonuna yol açar. Bu membran reseptörleri tumör nekrozis faktor ile iliĢkili

apopitoz reseptör–1 ve -2, CD95/Fas/APO–1, tumör nekrozis faktör reseptör 1 ve 2,

25

TWEK resptörlerini içerir. FAS/APO–1 (CD95) sitokin reseptör gibi hücre yüzeyi

reseptörleri hem apopitoz hem de enflamatuvar mekanizmalara karıĢır.68

2.1.5.3.8.3. Ġntrinsik Apopitotik Yolak

Bu yolak mitokondri bağımlıdır, mitokondri iç membranından salınan Bax ve

Bcl–2 ailesi üyeleri bu yolakta rol alır. Apopitotik uyarılar mitokondriyal fonksiyonları

bozar ve aĢırı miktarda serbest radikal üretimine ve serbest radikallerin yok edilmesini

sağlayan glutatyon gibi serbest radikal temizleyici sistemlerin azalmasına neden olur.

Ġskemiden sonra reperfüzyon ile birlikte serbest radikaller hücre içinde intrinsik

apopitotik yolağı etkin hale getirirler. Ayrıca mitokondriyal fonksiyonların bozulması

birlikte elektron transport zincirinin ve ADP fosforilasyonunun bozulmasına, Ca+2

‟nin

hücre içinde artmasına neden olur. Ca+2

birikimi enerji üretilmesine engel olarak

mitokondriyal transitiyon permeabilite poru‟nun (mPTP) açılmasına yol açar. Bu durum

proapopitotik protein olan Bax‟ın mitokondri içinden dıĢına çıkmasını sağlar.69

Fizyolojik koĢularda Bcl-2 bir antiapopitotik proteindir ve Bcl-2 ailesi üyesidir,

mitokondri dıĢ memranında yerĢik olup membran bütünlüğünü ve sitokrom salınıını

düzenler. Burada Bcl-2, kaspazdan bağımsız olarak apopitoz baĢlatır. Sitokrom c

salınımı prokaspaz-9 yoluyla apopitozu baĢlatır.68

2.1.5.3.8.4. Kaspaz Bağımsız Apopitoz Aktivasyonu

Kaspaz bağımsız apopitoz mitokondri iç membranından salınan daha sonra

hücre çekirdeğine yerleĢen AIF tarafından oluĢturulan ölüm sinyaline bir yanıttır.68

2.1.5.3.8.5. Kaspaz Bağımlı Apopitoz aktivasyonu

Proteolitik enzimler olan kaspaz -3, -6 ve -7 aktive olduklarında çeĢitli

proteinleri parçalarlar. Bu proteinler kinazlardan sitoskletal proteinlere, transkripsiyonel

regulatorlere kadar değiĢebilir. CAD (Caspase activated deoxyribonuclease) ve PARP

(poly ADP-ribose polymerase) apopitozu gösteren DNA parçalanmasına katkıda

bulunan iki aktive kazpaz parçasıdır. CAD sitozolden çekirdeğe geçerek orada DNA‟yı

parçalar.68

26

2.1.6. Hipoksik iskemik beyin hasarının önlenmesine yönelik giriĢimler

Son çalıĢmalarda H-Ġ‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen sürenin çok kritik

olduğu görülmüĢ ve bu dönem „terapodik pencere‟ olarak adlandırılmıĢtır. Bu dönemde

oluĢan hücre ölümüne neden olan moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte

çok yararlıdır. Bu dönem fetal koyunda 6 saat kadardır.70

Fetüste ve yenidoğan bebekte

olayın baĢlangıç zamanını ve ciddiyetini bilmek zordur. Term yenidoğanda H-Ġ‟e neden

olan intrauterin asfiksinin ne zaman beyin hasarına yol açtığını belirleyen bir metot

henüz yoktur. Benzer Ģekilde beyin hasarlarının daha çok postnatal dönemde olduğu

prematürelerdeki beyin hasarı genellikle bulgu vermez veya sessizdir. Bu nedenle hem

prematürelerde hem de term bebeklerde beyin hasarının geç tespit edilmesi „terapodik

pencere‟ döneminin kaçırılmasına neden olur. Tablo 5‟te hipoksik-iskemik beyin

hasarının önlenmesinde değerli olan mevcut giriĢimler gösterilmiĢtir.10

2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması

Enerji kaybı çok ciddi olmasa dahi iskemiden sonra nöron ölümüne yol açan

kaskadı baĢlatan olaydır. Glikoz düzeyleri normal değerlerin çok üstüne çıktığında

serebral laktat düzeyleri yükselmektedir. Bu nedenle glikozun fizyolojik düzeylerde

tutulması önemlidir.1

Yüksek doz barbitüratın serebral metabolik hızı azalttığı ve böylece enerjinin

korunmasını arttırdığı bilinmektedir. Ġnsanlarda yüksek doz barbitürat kullanımı ile

ilgili çalıĢmalar yapılmıĢtır. Hafif hiperkapninin de hayvan modellerinde protektif etkisi

olduğu gösterilmiĢtir. Enerji tüketiminin azaltılmasında en umut verici giriĢim hafif

hipotermi gibi görünmektedir. Biyokimyasal etkiler bu giriĢimin nöroprotektif yararları

ile korelasyon göstermektedir. Dahası, hafif hipotermi reperfüzyondan saatler sonra

geliĢen ikincil enerji yetersizliğini de azaltır. Hafif hipoterminin perinatal hayvan

modellerinde, H-Ġ‟deki etkisi birçok çalıĢmada incelenmiĢ ve etkisi gösterilmiĢtir.

Hemen hemen tüm çalıĢmalarda hipotermi H-Ġ sırasında veya reperfüzyondan hemen

sonra veya her iki dönemde birden uygulanmıĢtır. Ancak iskemik kuzularda yapılan bir

çalıĢmada olaydan 5,5 saat sonra kranyumun hafif soğutulmasının da hasarı azalttığı

elektrofizyolojik ve nöropatolojik olarak gösterilmiĢtir. Tüm bu anlatılan giriĢimlerden

hafif hipoterminin önemli bir nöroprotektif etkisi olduğu görülmektedir.10

27

2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu

Ekstrasellüler glutamat birikimi hem nöronal hem de oligodendroglial hücre

ölümüne yol açar. Presinaptik sinir uçlarından glutamat salınımının kalsiyum aracılıklı

olduğu ve magnezyumun bu olayı bloke ettiği için, kalsiyum kanal blokörleri veya

magnezyumun bu basamakta yararlı olabileceği bildirilmiĢtir. Ancak kalsiyum kanal

blokörlerinin kardiyovasküler yan etkilerinin olması, magnezyumun da bir çok H-Ġ

modelinde tam olarak yararlı olduğunun gösterilememiĢ olması nedeniyle rutin tedavide

kullanımı önerilmemiĢtir.10

Adenozin reseptörlerinin inhibisyonu glutamat salınımını inhibe ettiği için

adenozin, adenozin antagonistleri ve adenozin agonistlerinin nöroprotektif etkisi üzerine

çalıĢmalar yapılmıĢtır. Bazı perinatal modellerde adenozin agonistlerinin etkili olduğu

görülmüĢ olsa da mevcut bilgiler her zaman tutarlı sonuçlar göstermemektedir. 20

Kültüre edilmiĢ nöronlarda ve yenidoğan domuzlarda yapılmıĢ çalıĢmalarda

hafif hipoterminin nöroprotektif etkisinin bir kısmından sinaptik sinir uçlarından

glutamat salınımını inhibe etmesinin sorumlu olduğu gösterilmiĢtir. Ancak çalıĢmaların

bazılarında bu gösterilememiĢtir. 10

Serbest radikal tutucularının nöroprotektif etkisi, kısmen glutamat salınım

düzeyinde etki göstermesine bağlı olabilir çünkü serbest radikallerin bazı modellerde

nöronal glutamat salınımını arttırdığı görülmüĢtür. Ayrıca fenitoin ve lamotrijinin de H-

Ġ‟de yararlı etkisinin görülmesi bu antikonvülzanların glutamat salınımını inhibe

etmesinden kaynaklanmaktadır. 10

2.1.6.3. Glutamat geri alımındaki bozukluğun iyileĢtirilmesi

Hipoksi-iskemi‟de ekstrasellüler glutamat artıĢının nedeni sadece artmıĢ salınım

değil aynı zamanda astrosit ve presinaptik sinir uçlarından geri alımın bozulmasıdır

(Ģekil-2). Hipotermi, iskemi nedeni ile geliĢen astrositlerde enerji bağımlı glutamat

alımındaki bozukluğu azaltarak bir miktar nöroprotektif etki sağlayabilir. Bu kanıya

kültüre astrositlerdeki çalıĢmalar sonucunda varılmıĢtır. 10

28

Tablo 7. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki mevcut değerli giriĢimler1

1. Enerji kaybının azaltılması

Glikoz

Hipotermi

Barbitürat

Hiperkapni (hafif)

2. Glutamat salınımının inhibisyonu

Kalsiyum kanal blokörleri

Magnezyum

Adenozin/adenozin agonistleri

Hipotermi

Serbest radikal tutucuları

Lamotrijin

Fenitoin

3. Glutamat alım yetersizliğinin düzeltilmesi

Hipotermi

4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi

NMDA reseptör antagonistlerinin (MK–801, magnezyum, ketamin, dekstrofan) verilmesi

Non-NMDA reseptör antagonistlerinin (NBQX, CNQX) verilmesi

5. Lökosit/ mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu

Nötropeni

Platelet aktivasyon faktör (PAF) antagonistleri

IL-1 reseptör antagonistleri

Anti-ICAM-1 antikoru

Antisitokin antikorları/ilaçları

6. Ġntrasellüler olayların akıĢının bloke edilmesi

Hipotermi

Serbest radikal sentez inhibitörleri (allopurinol, indometazin, demir Ģelatörleri,

magnezyum)

Serbest radikal tutucuları (vitamin E, 21-aminosteroidler)

NOS inhibitörleri/tutucuları (nitroarjinin deriveleri)

Growth faktörleri (ĠGF–1, BDNF, GH, NGF) içeren anti-apopitotik ajanlar

Monosialogangliosidler (GM–1)

29

2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi

NMDA reseptör antagonistlerinden özellikle MK–801, magnezyum; ketamin ve

destrofan‟ın iskemik nöron hasarının değiĢik modellerinde hem kültür hem de in-vivo

Ģartlarda nöroprotektif etkisinin olduğu gösterilmiĢtir. Benzer Ģekilde bazı modellerde

non-NMDA (AMPA/kainate) antagonistlerinin (örn.NBQX, CNQX) kullanımı ile ek

yararlı etki gösterilmiĢtir.

Bu ajanlar daha sıklıkla hasardan birkaç saat sonra veya hasarın sonlanmasından

hemen sonra uygulandığında nöroprotektif etkisi belirgindir. 10

Non-NMDA reseptörlerin inhibisyonu sadece nöronal zedelenmeyi değil aynı

zamanda oligodendroglial zedelenmeyi de inhibe eder. Son çalıĢmalar AMPA/kainate

reseptörlerinin aktivasyonunun kültüre oligodendrositlerin ve in-vivo çalıĢmalarda

oligodendrogliaların ölümüne neden olduklarını göstermiĢtir.10

Bu bulguların hepsi

birden değerlendirildiğinde glutamatın hem reseptör hem de non-reseptör aracılıklı

mekanizmalar ile immatür oligodendroglialara toksik etki gösterdiği görülmektedir.

Mekanizmaların her ikisi de non-reseptör aracılıklı olanlar serbest radikal tutucuları ile

ve reseptör aracılıklı olanlar da spesifik reseptör antagonistleri ile önlenebilir. Non-

NMDA antagonistlerinin farklılaĢan oligodendrositleri hipoksik-iskemik olaydan

korumadaki yararlı etkisinden dolayı bu ajanlar hem nöronal hem de beyaz cevher

hasarına karĢı koruyucu olabilir. Oligodendrositler NMDA reseptörü eksprese etmezler

ve nöronlardan farklı olarak NMDA antagonistleri oligodendroglial korumada önemli

görünmemektedir. 10

2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu

Hipoksi-iskemiye maruz kalan immatür oligodendrositler sitokinlerden en fazla

zarar gören hücrelerdir.3 Lökosit adherasyonu, mikroglial aktivasyon ve sitokin etkisi

hipoksik-iskemik beyin hasarında önemli görünmesine rağmen perinatal modellerde bu

düzeyde nöroproteksiyon ile ilgili çalıĢmalar azdır. Ġn-vivo perinatal hipoksik iskemik

hasarda H-Ġ öncesi yaratılan nötropeninin yararlı etkisi olduğu gösterilmiĢtir. 10

Ġskemi/reperfüzyon ile artan PAF lökosit adezyonunda ve daha sonra geliĢen

inflamatuvar kaskatta önemlidir. Ġmmatür ratta PAF antagonistinin hem tedavi öncesi

hem de tedavi sonrası reperfüzyondan sonra uygulanmasının infarkt sahasını azalttığı

gösterilmiĢtir.10,71

EriĢkin hayvanlarda yapılan çalıĢmalarda lökosit adezyon molekülleri

30

veya değiĢik sitokinlerin üzerine etki eden antikor veya ilaçların önemli nöroprotektif

etkisi olduğu görülmüĢtür. Mikroglia/makrofajların önemli bir ürünü IL-1β‟dır. IL-1β

TNF-α‟yı da içeren diğer proinflamatuvar sitokinlerin salınımını sağlar. Yenidoğan ratta

H-Ġ‟de IL-1β reseptör antagonistinin olaydan önce ve reperfüzyon sırasında

kullanılmasının yararlı etkileri olduğu gösterilmiĢtir.10

Benzer Ģekilde bir fosfodiesteraz

inhibitörü olan, H-Ġ‟den sonra beyinde arttığı bilinen ve TNF-α üretimini inhibe eden

pentoksifilin‟in H-Ġ‟den hemen önce uygulandığında hipoksik-iskemik hasarını azalttığı

görülmüĢtür (Tablo 8). 10

Tablo 8. Deneysel modellerde perinatal hipoksik iskemik beyin hasarında inflamasyon ve

sitokinler10

Hipoksi- iskemiden sonra hızlı ve aktif bir Ģekilde mikroglia aktivasyonu olur

Nötropeni koruyucudur

Sitokinler (özellikle de IL-1β ve TNF-α) H-Ġ‟den sonra hızlı bir Ģekilde artar

TNF-α antagonisti olan pentoksifilin H-Ġ‟den hemen önce uygulandığında hipoksik iskemik

beyin hasarını azaltır

IL-1 β reseptör antagonistleri H-Ġ‟den önce veya H-Ġ sonlandıktan hemen sonra uygulandığında

hipoksik- iskemik beyin hasarını azaltmaktadır

2.1.6.6. Ġntrasellüler olayların akıĢının bloke edilmesi

Hücre ölümüne neden olan intrasellüler biyokimyasal olayların akıĢının blokajı

kalsiyumla aktive olan iĢlemler, serbest oksijen radikallerinin oluĢumu, nitrik oksit

sentezi ve apopitotik ve nekrotik hücre ölümüdür. Hipotermi bu kaskadta bir çok

düzeyde etki eder ancak bu etkiler arasında en belirgin olanları serbest radikal oluĢumu

ve nitrik oksit sentezindeki azalmadır. DeğiĢik H-Ġ modellerinde nöroprotektif olduğu

gösterilen serbest radikal inhibitörleri; ksantin oksidazı inhibe eden allopurinol,

siklooksijenazı inhibe eden indometazin, Fenton reaksiyonu ile hidroksil radikallerin

üretimini azaltan demir Ģelatörleri ve lipid peroksidasyonunu inhibe eden

magnezyum‟dur. Serbest radikal tutucularının (vitamin E, 21-aminosteroidler,

idebenon) nöroprotektif etkilerinin olduğu gösterilmiĢtir.10

Deneysel modeller hem

nöronal hem de oligodendroglial hasarı içermektedir.

31

2.2. Eikozanoidler (AraĢidonik asid metabolitleri) ve Otakoidler

Eikozanoidler yirmi karbon atomlu yağ asidlerinden türeyen ve güçlü biyolojik

etkinlik gösteren endojen maddelerdir. Eikozanoid adı Yunanca yirmi anlamına gelen

“eicosa”dan gelir. Yirmi karbonlu yağ asidi iskeleti üzerinde varolan yapı

değiĢikliklerine göre, doğrudan biyolojik etkinliği olan primer eikozanoidler değiĢik alt-

gruplarda toplanırlar. Bu alt-gruplardaki maddeler dokularda araĢidonik asid ve diğer

prekürsör yağ asidleri üzerine belirli enzimlerin etkimesi sonucu oluĢurlar. Bu enzimler

siklooksijenazlar, lipooksijenazlar ve sitokrom P450 monooksijenaz enzimleridir.72

Eikozanoidler, prekürsör yağ asidlerinden oluĢmalarında rol oynayan enzim

türüne göre siklooksijenaz ürünleri, lipooksijenaz ürünleri ve 450 mono oksijenaz

ürünleri Ģeklinde üç gruba ayrılır. Bu grupların fizyolojik ve patolojik olaylara katkıları

ve çeĢitli sistem ve organlara etkileri bakımından aralarında belirgin farklar vardır.72

2.2.1.Eikozanoid Biyosentezi

Eikozanoidlerin biyosentezi, araĢidonik asidin hücre membranındaki

fosfolipidler veya diğer kompleks lipidlerden fosfolipaz A2 (PLA2) gibi eikozanoid

sentez enzimleri aracılığı ile mobilize edilmesine veya salınımına bağımlıdır.

AraĢidonik asid kısmen de fosfatidilinozitidlerden fosfolipaz C ve digliserid lipaz

kombinasyonu aracılığı ile sentezlenmektedir.73,74

Eikozanoid biyosentezindeki artıĢ, genel olarak fiziksel, kimyasal ve hormonal uyarılara

cevap olarak oluĢmakta veya düzenlenmektedir. Daha sonraki basamakta araĢidonik

asid, dört ayrı sentez yolağına girer: siklooksijenaz (prostaglandin endoperoksidaz

sentaz), lipooksijenaz, P450 epoksijenaz (sitokrom P450) ve izoprostan (ġekil 1).74

2.2.1.1. Siklooksijenaz Ürünleri (Prostaglandinler, Prostasiklinler ve

Tromboksanlar)

Siklooksijenaz enziminin 2 izoformu vardır: siklooksijenaz-1 (COX- 1) ve

siklooksijenaz-2 (COX-2). COX-l bir çok hücrenin içeriğinde gösterilmiĢtir ve daima

vardır. Aksine COX-2 normal olarak bulunmaz fakat belli serum faktörleri, tümör

promotorları, sitokinler ve growth faktörler ile indüklenebilir ve bu etki deksametazon

32

gibi glukokortikoidler ile inhibe edilebilir. Lipopolisakkarid (endotoksin) kısmen bu

indükleme yönünden potent bir ajandır. Bu sentez basamakları üzerinde nonsteroidal

anti-infiamatuvar ilaçların kendi terapötik etkilerini göstermesi açısından büyük önem

taĢır. Ġndometazin ve sulindak baĢlıca COX-l üzerinden etkisini gösterir. Meklofenamat

ve ibuprofen COX- 1 ve COX-2 üzerinde eĢit derecede potent etki gösterirken.

selokoksib ve rofekoksib tercihen COX-2‟yi inhibe etmektedir. Selektif COX-2

inhibitörleri, COX-l inhibitörlerine göre daha az gastrik strese neden olmakta ve kronik

inflamasyonun tedavisinde daha tercih edilmektedir. Aspirin her iki enzimi de farklı

uzantılarda asetiller ve inhibe eder. Siklooksijenazların iki farklı aktivitesi mevcuttur:

(1) endoperoksidaz aktivitesi esterleĢmemiĢ prekürsör yağ asidlerini siklik endoperoksid

prostaglandin G (PGG)‟ye oksijenalize ve siklize eder, (2) peroksidaz aktivitesi ile

PGG‟yi prostaglandin H (PGH)‟ye dönüĢtürür. Stabil olmayan PGG ve PGH ileri

basamaklarda prostasiklin (PGI2), tromboksan (TXA), prostaglandin E (PGE),

prostaglandin F (PGF) veya prostaglandin D (PGD) gibi ürünlere dönüĢür. PGE2 ve

PGD2 sentezi için farklı izomerazlar tespit edilmiĢtir. PGH2‟nin PGF2‟ye dönüĢümünü

katalizleyen bir redüktaz enzimi de karakterize edilmiĢtir. PGH2 ayrıca iki ayrı stabil

olmayan ve oldukça aktif maddelere dönüĢür: (1) tromboksan A2 (TXA2) tromboksan

sentaz ile oluĢturulmaktadır. Bu ürün 30 saniye içinde stabil fakat inaktif TXB2‟ye

dönüĢmektedir. PGI2 prostasiklin sentaz ile oluĢturulmakta ve nonenzimatik olarak

inaktif 6-keto PGFct‟ye dönüĢmektedir. Çoğu dokuların serbest araĢidonik asidden

PGG ve PGH sentezi yapabilme yeteneği varken, her bir dokuda enzimlerin varlığına ve

miktarına bağlı olarak yazgıları değiĢmektedir. Örneğin, akciğer ve dalak bu ürünlerin

tümünü sentezleyebilir. Buna karĢılık trombositler PGH‟yi metabolize eden baĢlıca

enzim olarak tromboksan sentaz enzimini içermekte iken, endotel hücreleri baĢlıca

prostasiklin sentaz enzimini içermektedir.72

2.2.1.2. Lipooksijenaz Ürünleri

AraĢidonik asidin 5-, 12- ve 15-lipoksijenaz ile metabolize olması sonucu

hidroksiperoksieikozatet raenoik asid (HPETEs) oluĢur, daha sonra bu ara ürün hızlı bir

Ģekilde hidroksi türevlerine (HETEs) ve lökotrienlere dönüĢür. Aktif olarak araĢtırılan

lökotrienlerin çoğu inflamatuvar hücrelerde (PMNs, bazofil, mast hücreleri, eozinofil,

33

makrofaj) 5- lipooksijenaz tarafından oluĢturulmaktadır. Bu yolak astım ve anafilaktik

Ģok ile iliĢkili olduğundan önem taĢır. Bu hücrelerin uyarılması intraselüler kalsiyum

seviyesini yükseltir ve araĢidonik asid salımmına, daha sonra da 5-lipooksijenaz ile

unstabil epoksid lökotrien A1 (LTA1) oluĢumuna neden olur. Bu ara ürün dihidroksi

lökotrien B4 (LTB4) ya da lökotrien C4 (LTC4)‟e dönüĢür. LTC4 peptidazlarla LTD4

ve LTE4‟e dönüĢebilir. LTC4 ve LTD4 kuvvetli bronkokonstriktördür ve “slow-

reacting substance of anaphylaxis (SRS-A)”ın baĢlıca yapıları olarak fark edilmiĢlerdir.

Anti-lökotrien ilaç geliĢimine yönelik dört yaklaĢım vardır: 5-lipooksijenaz enzim

inhibitörleri, lökotrien reseptör antagonistleri, membrana bağlı 5- lipooksijenaz aktive

edici protein (FLAP) inhibitörleri ve fosfolipaz A2 inhibitörleri. Diğer bir grup

lipoksinlerin LXA ve LXB‟in biyolojik rolleri henüz aydınlanamamıĢtır.10

2.2.1.3. Eikozanoid Metabolizması

Prostaglandinler sentez edildikleri dokularda bulunan enzimler tarafından veya

akciğer ve böbrek korteksinde bulunan enzimler tarafindan inaktive edilirler. Özellikle

akciğer damar yatağı bu maddeleri inaktive etmekte oldukça etkindir ve bu organda

%95‟e varan bir oranda inaktivasyon gerçekleĢir. Tüm prostaglandinlerin biyolojik

aktivitesi için önemli olan C15-hidroksil grubu ilk olarak prostaglandin 15-

hidroksidehidrojenaz enzimi ile okside edilir. Ardı sıra gelen bir dizi olaydan sonra PGE

ve PGF‟ler inaktif tetranor (16 karbonlu) metabolitlerine, PGD2 ise PGJ2‟ye dönüĢür.

Prostasiklin akciğerde parçalanmaz fakat karaciğer ve böbrekte inaktive edilir. Ana

metaboliti olan 6-keto-prostagiandin F1‟ya yıkılır. TXA2 inaktivasyonu ise karmaĢıktır.

Enzimatik olmayan bir hidrolizle TXB2‟ye dönüĢür. LTC4‟ün inaktivasyonu akciğerler,

böbrek ve karaciğerde geliĢir. BaĢlangıç basamağında LTE4‟e dönüĢür ve biyolojik

aktivitesini kaybeder. LTB4‟ün metabolizması ise baĢlıca oksidasyonla oluĢur.75

2.2.1.4. Eikozanoidlerin Etki Mekanizması

Eikozanoidler otokrin ve parakrin özellik gösterirler ve hücre yüzeyinde

reseptörlere bağlamrlar. Prostanoidlerin farmakolojik spesifikliği farklı hücrelerde

reseptör tipi ve yoğunluğu ile belirlenir. Bütün reseptörler ve alt tipleri G-proteinine

kenetli olarak etkilerini gösterirler. Ġkincil ulaklar olarak adenilil siklaz stimülasyonu

34

(cAMP artıĢı) veya inbibisyonu (cAMP azalıĢı) ya da fosfolipaz C stimülasyonu

(diaçilgliserol ve inozitol 1,4,5- trifosfat artıĢı sonucunda hücre içi kalsiyum artar)

meydana gelir. Eikozanoidlerin düz kas üzerindeki kontraktil etkileri kalsiyum salınımı

aracılığı ile olurken, onların gevĢetici etkileri cAMP üretimi ile olmaktadır.

Eikozanoidlerin immün sistem dâhil birçok hedef hücrede etkileri benzer Ģekilde

açıklanabilir. Eikozanoidlerin çoğunun kontraktil etkileri ekstraselüler kalsiyumun

azaltılması veya kalsiyum kanal blokörü ilaç kullanımı ile inhibe edilebilir.

Lökotrien Reseptörleri: DeğiĢik hücre ve dokularda LTB4, LTC4 ve LTD4 için

reseptörler tanımlanmıĢtır (cysLT1 ve cysLT2). Lökotrien reseptörleri de G proteine

kenetlidir ve onların aktivasyonu intraslüler kalsiyum konsantrasyonunu artırır.75

2.2.2. Fosfolipaz A2 ve Hipoksik Ġskemik Serebral Hasar

Beyin fosfolipaz A2, sn-2 pozisyonundaki membran fosfolipidlerindeki açil

esterlerini parçalayan bir esterazdır, serbest yağ asidi ve lizofosfolipid üretimine neden

olur. AraĢidonik asit ve lizofosfolipid fosfolipaz A2‟nin katalizlediği en önemli

reaksiyonlardır. Normal koĢullar altında bir kısım araĢidonik asit inflamatuvar

mediyatörlere, prostaglandinlere, lökotrienlere ve tromboksanlara çevrilirken araĢidonik

asitin büyük bir kısmı tekrar beyin fosfolipidlerinin içerisine katılır.76

Fosfolipaz A2

ailesi sekretuvar fosfolipaz A2, sitozolik fosfolipaz A2 ve kalsiyum bağımsız fosfolipaz

A2‟den oluĢur. AraĢidonik asit salınımı genellikle sitozolik fosfolipaz A2 yoluyla

meydana gelir. Sekretuvar fosfolipaz A2, intraselüler olarak sentez edilir daha sonra

ektraselüler olarak seekrete edilir. Sekretuvar fosfolipaz A2 esas olarak sinaptazomlarda

ve sinaptik vesiküllerde depo edilir.77,78

Fosfolipaz A2 iki tip hücre yüzeyi reseptörüne

bağlanır. N tipi reseptör nöronlarda, M tipi reseptör ise kaslarda bulunur.79

Beyin

sekretuvaar fosfolipaz A2, bir sekresyon molekülü ve enzim aktivasyonu için gerekli

milimolar konsantrasyonda Ca+2

içeririr. Bu enzim fosfolipid yağ açil zincirleri için

seçici özellik göstermez. Sektretuvar fosfolipaz A2 memeli beyinin tüm bölgelerinde

bulunur. Fakat hipokampus, medulla oblongata ve ponsta daha yüksek aktivite

gösterir.80

35

Rat beyin sinaptozomlarında ve nöron hücre kültürlerinde sekretuvar fosfolipaz

A2, asetil kolin, glutamat reseptörleri, veya voltaj bağımlı kalsiyum kanalları yoluyla

depolarizasyona neden olduğu gösterilmiĢtir. Bu bulgulara göre sekretuvar fosfolipaz

A2 nöronal metabolizmada önemli rol oynayabilir.78,81

Glutamat ve analogları sekretuvar fosfolipaz A2‟yi doza ve zamana bağlı olarak

uyarır.82

Kortikal hücre kültürlerinde glutamat nörotoksisitesinin artmıĢ sekretuvar

fosfolipaz A2 ile birlikteliği vardır. Bu gözlem glutamatın sinaptik aktivitesinin

sekretuvar fosfolipaz A2 tarafından düzenlendiğini gösterebilir.83

Sitozolik fosfolipaz A2 tüm beyin dokularında bulunmasına karĢın tam olarak

pürifye edilelmemiĢtir. Rat beyninde sitozolik fosfolipaz A2‟nin Hve L diye iki formu

bulunmuĢtur. Fosfolipaz A2-H kalsiyum ile inhibe olurken, fosfolipaz A2 –L‟nin aktivite

göstermesi için mikromolar konsantrasyonda kalsiyuma gereksinim vardır.84

Sitozolik

fosfolipaz A2 izoenzimleri araĢidonik asit salınımı ve eikozonoid formasyonundan

sorumlu olduğu düĢünülür.85

Hücresel seviyede, kalsiyum mobilizasyonu, sitoplazmik

fosfolipaz A2 ve ektraselüler sitoplazmik fosfolipaz A2 arasındaki etkileĢim eikozanoid

artıĢından sorumlu olabilir. Patolojik koĢullar altında kalsiyum, fosfolipaz A2 ve

ektraselüler sitoplazmik fosfolipaz A2 arasındaki etkileĢim oksidatif stres ve

inflamasyonun eĢlik ettiği nörolojik hastalıkların patofizyolojisinde önemli rol

oyanayabilir. Kalsiyumdan bağımsız fosfolipaz A2 nöronal hücre proliferasyonu,

apopitozis ve diferensiyasyonunda görev alır.77

2.3. Ġnflamatuvar Merdiyatörler ve Neonatal Beyin Hasarı

Hipoksik-iskemik beyin hasarı, hipoksi-iskemi anında baĢlayıp resusitasyon

ardından iyileĢme döneminde devam eden bir süreçtir. Akut dönemde selektif nöronal

nekroz veya infarkt Ģeklinde gözlenen doku hasarı, nöron, glia ve endotel hücre

yapısının bozulması ile devam eder. Ġnfarkt alanına en yakın bölgede yer alan

nöronlarda nekroz ya da programlanmıĢ hücre ölümü yani apopitozis geliĢir.11

Özellikle

prematüre bebeklerde son yıllarda yapılan epidemiyolojik ve deneysel çalıĢmalarda

inflamasyon, periventriküler lökomalazi ve serebral palsi arasında yakın iliĢki olduğu

görülmüĢtür.3 Nekroz geliĢmiĢ hücrelerde hasarın önüne geçilmesi söz konusu değildir.

Ancak infarkt etrafında devam eden hasar sürecinin önüne geçilmesi bu dönemde

meydana gelen biyokimyasal olayların iyi bilinmesi ile mümkün olabilir.

36

Hasar sürecinin devam ettiği reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük

damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve

ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir. Açığa çıkan serbest radikaller

lökosit, platelet ve endotel hücrelerindeki adezyon moleküllerini aktive ederek

lökositlerin adezyonu ve ekstravazasyonunu sağlar. Kan beyin bariyerinin bozulmasıyla

serbest radikaller parankim içine boĢalarak hasarın yayılmasına neden olur.86

Neonatal

beyin hasarının erken döneminde gözlenen nötrofil akümülasyonu ile hasarın derecesi

arasında yakın iliĢki olduğuna inanılmaktadır. Ayrıca serebral iskemide santral sinir

sisteminde inflamatuvar mediyatörlerin açığa çıktığı bilinmektedir. EriĢkin ve immatür

kemirgen hayvanlarda hipoksi iskemi sonrasında beyinde IL-1 ve TNF- gibi

sitokinlerin açığa çıktığı gösterilmiĢtir.87

2.3.1. Prostaglandin ve Hipoksik-iskemik Beyin Hasarı

Ġskemik zedelenme beyin dokusunda fosfolipaz A2 uyarısı doğurur. Bu

enzimlerin uyarılması beyinde büyük miktarda serbest yağ asidi salınımı ile

sonuçlanır.77

Serbest yağ asidi oluĢumu, ATP‟nin tükenmesi ve iyon hemostazındaki

değiĢiklilkler membren fonksiyon bozukluğu ve hücresel hasara neden olur.77

Ayrıca

iskemik zedelenmeden sonra sitoplazmik fosfolipaz A2 mRNA gen ekpresyonunda artıĢ

meydana gelir.88

Sitoplazmik fosfolipaz A2‟nin nöronal hasar ile iliĢikisi güçlü bir

biçimde ortaya konmuĢtur.89

Orta serebral arterin bağlanmasından sonra sitoplazmik

fosfolipaz A2 genetik olarak olmayan farelerde daha az nöronal hasar, daha az infarkt ve

beyin ödemi oluĢtuğu gösterilmiĢtir. Yine bu grup farelerde prostaglandin ve lökotrien

üretiminin önemli ölçüde azalmıĢtır.90

Hipoksi iskemiden sonra sitozolik Ca++

konsantrasyonu artar. Artan sitozolik

fosfolipaz A2‟yi aktive eder ve serbest yağ asitleri ve araĢidonik asit üretimine neden

olur. AraĢidonik asit metabolizasyonu sonrası serbest oksijen radikallerinin üretimi ile

sonuçlanır. HĠE geliĢen yenidoğan bebeklerde HĠE‟nin ağırlığı ile BOS‟ta ölçülen

prostanoidlerin konsantrasyonu arasında iliĢki olduğu bildirilmiĢtir.6,91

Ġndometazin uygulaması PGD2‟nin yükselmesini ve hasarlı bölgenin alanını

azaltmıĢtır. PGD2 sentezinin inhibisyonu bu etkileri reseptör aracılı mekanizmalar ile

37

iliĢkili olabileceği gibi sikjlooksijenazın katalize ettiği ve serbest radikallerin üretimine

neden olan yolak gecikmiĢ nöronal ölüme neden olabilir. Yine prostanoide bağlı beyin

hasarı glutamat toksistesi ile iliĢkili olabilir.6

Ġskemiyi takiben doku hasarı ve apopitozis meydana gelir. Hipoksi-iskemiden

sonra siklooksijenaz–2‟nin upregülasyonu ve PGE2 düzeyinin arttığı bildirilmiĢtir.93

Bir çalıĢmada PGE2‟nin uyardığı apopitozis kaspaz-3 bağımlı olduğu ve kaspaz

inhibitörleri PGE2‟nin uyardığı apopitozisi önlediği gösterilmiĢtir. Bu olayda kapsaz-8

ve kaspaz-7‟de olaya karıĢmıĢ olabileceği ileri ileri sürülmüĢtür. 94

Iedocala ve arkadaĢları95

genetik olarak COX-2 negatif ratlarda iskemiye olan

yatkınlığın azaldığını göstermiĢtir. Bu veriler PGE2 „nin gecikmiĢ nöronal ölümde rol

aldığını göstermektedir.

COX-2 aktivasyonu ile bazı prostanoidler üretilir ve bu durum doğrudan nöronal

ölüm ile iliĢkili olabilir.96

Ayrıca PGE2 sitokin üretimini arttırarak nörotoksisiteye

katkıda bulunabilir veya glutamat toksisitesini arttırabilir.97

NS-398 uygulaması

glutamat toksisitesine bağlı nöronal hasardan korur. Belki de hücre içi Ca++

hemostazını

sağlayarak bunu gerçekleĢtirir.98

COX inhibitörlerinin verilmesinin deney hayvanlarında geçici ön beyin

iskemisinden sonra gecikmiĢ hipokampal CA1 nöronal ölümü azalttığını göstermiĢitir.99

Ayrıca nonselektif COX inihibisyonunun iskemik infarkt alanını küçülttüğünü

göstermiĢtir.100

.

Öte yandan kortikal hücre kültürlerinde NMDA reseptör aracılı

nörotoksistenin patogenezinde COX-2‟nin katkısının olduğu ve nöronal hücre hasarında

COX-2 mRNA eksprsyonu ve aktivitesini takiben nörotoksik NMDA konsantrasyonu

arttığı ileri sürülmüĢtür. Nonselektif COX enzim blokajı prostaglandinlerin uyardığı

NMDA„yı azaltır. Bu etki sadece COX-2 inhibisyonu ile meydana gelir COX-1

inhibisyonun böyle bir etkisi yoktur. Yine COX-2 inhibisyonu ile yalnızca NMDA

aracılı nöroprotektif etki meydana gelir.98

38

3. GEREÇ ve YÖNTEM

Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarının patogenezinin anlaĢılması ve yeni

tedavi yaklaĢımlarının belirlenmesi amacıyla yıllardan beri immatür rat modelleri

kullanılmaktadır.101-103

Yedi günlük ratların tercih edilmesinin nedeni bunların

beyinlerinin geliĢim düzeyinin histolojik olarak 32-34 haftalık insan fetusları ile olan

benzerliğidir. Yedi günlük ratlarda serebral kortikal nöron tabakası geliĢimini

tamamlamıĢ, germinal matriks involüsyona uğramıĢ ve beyaz cevher henüz miyelinize

olmaya baĢlamıĢtır. Postnatal 12-13 günlük ratların beyinleri ise fulterm

yenidoğanlarınkine benzemektedir. Ġmmatür ratlarda hipoksi-iskemi oluĢturmak

amacıyla tek taraflı karotis arter ligasyonu ardından % 8 oksijen, % 92 nitrojen

karıĢımının inhalasyonu Ģeklinde uygulanan Levin‟in rat modeli kullanılmaktadır.80

Bu çalıĢma, hipoksi-iskemi modeli oluĢturulan 7 günlük Winstar-albino ratlar

üzerinde yapıldı. ÇalıĢmaya alınan ratlar Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi

Deneyler AraĢtırma ve Uygulama Merkezinde üretime alınan 10 ayrı rat çiftinin

bulunduğu kafeslerden seçildi. Aynı merkezde oluĢturulan etik kurul tarafından

çalıĢmanın etik onayı alındı. Ratların bulunduğu ortamda 12 saat gündüz, 12 saat gece

ortamı sağlandı. 0da sıcaklığı sürekli olarak 21-23 0C ve nemi % 40-60 arasında tutuldu.

Üretime alınan eriĢkin ratlar Adana TavaĢ yem fabrikasından temin edilen standart rat

yemi ile beslendi.

ÇalıĢmaya ağırlıkları ve cinsiyetleri arasında fark olmayan üç tedavi, bir hipoksi

iskemi grubu ve bir kontrol olmak üzere toplam beĢ grup rat alındı. Ġlk doğdukları

günden itibaren annelerinin yanında bulunan ve anne sütü ile beslenen rat yavruları 7

günlük olduklarında çalıĢmaya alındı. Her bir ratın hangi gruba alınacağı randomize

seçimle belirlendi. Grup 1, hipoksi ve iskemi iĢlemi uygulanmayan ancak sadece cilt

kesisi yapılan ve tek doz 2 ml /kg % 0,9 NaCl (serum fizyolojik=SF) verilen shame

grubu (n=15). Grup 2, hipoksi iskemi grubu hipoksi iskemi iĢlemi yapılan ve 2 ml/kg %

0,9 NaCl (serum fizyolojik: SF) (n: 15), Grup 3, hipoksi iskemi iĢleminden 30 dakika

öncesinde tek doz 2 mg/kg/doz indometazin verilen grup (n: 15). Grup 4, hipoksi iskemi

iĢlemi sonrası 2 mg/kg/doz indometazin tedavisi verilen grup (n: 15, Grup 5, hipoksi

iskemi iĢlemi sonrası 4 mg/kg/doz indometazin tedavisi verilen grup (n: 15) olarak

belirlendi. ÇalıĢmaya alınan rat yavrularının iĢlem öncesi ağırlıkları ve cinsiyetleri

kaydedildi. Eter anestezisi altında boyun ortasından, trakeanın hemen solundan

39

uygulanan 0,5 cm‟lik kesi ile sol arteria karotis kommunis bulundu. 4/0 ipek sutur

materyali ile arter iki tarafından bağlanılarak ortası kesildi. Cilt aynı sutur materyali ile

kapatıldıktan sonra 1-2 saat süreyle anestezi etkisi geçene kadar annelerinin yanına

verilen ratlar beĢerli gruplar halinde % 8 oksijen, % 92 nitrojen içeren transparan

fiberglastan yapılmıĢ, çevre ısısı ıĢık kaynağı yardımıyla 33 oC‟ye ayarlanan bir kafeste

2,5 saat bekletildi. Ortamdaki oksijen konsantrasyonu oksijen monitörü (ohmeda 5120

seri numarası: FABQ0104 USA) ile sürekli ölçülerek %8 oksijen içeren hipoksik ortam

2,5 saat süreyle korundu. Bu iĢlemin ardından yarım saat oda havasında iyileĢmeye

bırakılan ratlar deney sonuna kadar kalmak üzere annelerinin yanına verildi.

Ġlaçlar ve SF; intraperitoneal yoldan 50lt içerisinde, insülin enjektörleri ile

uygulandı. Grup 1‟de (Shame grubu) tek doz 2 ml/kg % 0,9 NaCl uygulandı. Grup 2‟de

(Hipoksik iskemik grup) 2 ml /kg % 0,9 NaCl hipoksi-iskemi iĢlemi bittikten yarım saat

sonra baĢlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Ġndometazin (ConfortidR flakon

50 mg Alpharma-ISIS Germany) verilen grup 3‟de indometazin 2 mg/kg dozda hipoksi-

iskemi iĢleminden yarım saat önce tek doz verildi. Grup 4‟te indometazin 2 mg/kg

dozda hipoksi-iskemi iĢlemi bittikten yarım saat sonra baĢlanıp 12 saat aralıklarla

toplam 3 doz verildi. Grup 5‟de indometazin 4 mg/kg dozda hipoksi-iskemi iĢlemi

bittikten yarım saat sonra baĢlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Üç günün

sonunda 10 günlükken deney ve kotrol grubunda yer alan ratlar derin anestezi altında

intrakardiyak formaldehit perfüzyonu ardından dekapite edildi.

Organ perfüzyonu öncesi her bir deney hayvanına 50 mg/kg intraperitoneal

yoldan pentotal verildi. Derin anestezi sağlandıktan sonra toraks açıldı, sol ventrikülden

girilip sağ atriumdan drene olacak Ģekilde 1 dk süreyle SF perfüzyonunun ardından %

10 formaldehit içeren solüsyon ile 5 dk süreyle organ perfüzyonu sağlandı. Bu iĢlemin

ardından kraniyum açılarak beyin dokusu çıkarıldı ve % 10 formaldehit içinde patolojik

inceleme yapılacağı güne kadar bekletildi.

Beyinlerden, 10 günlük rat atlası kaynak alınarak hipokampal bölgeyi tam olarak

temsil eden koronal kesitler örneklendi (82). Her bir kesitte iskemik hasar oluĢması

beklenen sol hemisferin lokalizasyonunu belirlemek için çentik ile iĢaret konuldu. % 10

Formaldehitle tespit edilen kesit örneklerinden parafin bloklar hazırlandı. Hazırlanan

parafin bloklardan 5 kalınlığında kesitler alınıp, Histokimyasal inceleme için S7100

40

ApopTag® Peroxidase ile iĢleme tabi tutuldu. IĢık mikroskobunda değerlendirilip, her

bir grupta apopitotik hücreler sayılarak kaydedildi.

3.1.Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag® Peroxidase Uygulanması

3.1.1.Dokuların Hazırlanması

Parafin bloklardan, lam üzerine 5 kalınlığında kesitler alındı.

a. Her kesit 5 dakika süre ile 3 kez XYLENE içinde yıkandı.

b. Her kesit 5 dakika süre ile 2 kez ABSOLUTE ETHANOL içinde yıkandı.

c. Her kesit önce %95 ETHANOL i.çinde tekrar yıkanır yıkanmaz % 70‟lik

ETHANOL içinde 3 dakika süre ile yıkandı.

d. Her kesit deparafinize edilip alkolden geçirildikten sonra fosfat tamponlu

salinde (PBS, pH 7,4) 5 dakika süre ile yıkandı. Her kesitin çevresi kurutulduktan sonra,

kesitler nemli ortama konuldu. Bu evreden baĢlayarak her basamakta kurutma iĢlemi

tekrarlandı.

3.1.2 Endojen peroksidazların giderilmesi

a. Her kesitin üzerini tamamen kaplayacak Ģekilde 2-3 damla “Peroksidase

Blocking Reagent” (% 3‟lük H2O2) damlatılarak 5 dakika oda sıcaklığında bekletildi.

b. Ġlk durulama için kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi.

Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS‟nin kesit üzerine akması sağlandı.

c. Kesitler 2 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı.

3.1.3 Dokuların hazırlanması

a. Kesitler proteinaz K ile 15 dakiaka süre ile oda ısısnda iĢleme tabi tutuldu (60-

150 μL/5 cm2).

b. . Ġlk durulama için kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi.

Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS‟nin akması sağlandı

c. Kesitler 2 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı.

3.1.4 Denge Tamponun uygulanması (EQUILIBRATION BUFFER)

a. Nazikçe fazla sıvı preparat üzerinden alındı.

b. Hemen EQUILIBRATION BUFFER (60 μL/5 cm2, #S7100) doğrudan kesit

üzerine uygulandı. 10 saniye süreile oda ısısında inkübe edildi.

41

c. Kesitler 10–16 saat süre ile 16–22 °C‟de nemli bir ortam içerisinde inkübe

edildi.

3.1.5 Working Strength Ligase Enziminin uyglanması

a. Nazikçe fazla sıvı preparat üzerinden alındı.

b. Bir pipet yarımıyla kesitler üzerine hemen Working Strength Ligase Enzimi

(60 μL/5 cm) uygulandı.

3.1.6 Yıkama

a. Kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile

PBS‟nin kesit üzerine akması sağlandı.

b. Kesitler 10 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı.

3.1.7 Streptavidin-Peroxidase Conjugate uygulaması

a. Hemen bir pipetle kesit üzerine STREPTAVIDIN-PEROXIDASE (50–60

μL/5 cm2 of S7200–5) uygulandı.

b. Nemli bir ortam içerisinde 30 dakika süre ile inkübe edildi.

3.1.8 PBS içerisinde yıkama

a. Kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile

PBS‟nin kesit üzerine akması sağlandı.

b. Oda ısısında 5 dakika süreyle 3 kez PBS değiĢtirilerek yıkandı.

3.1.9 Peroxidase Substratında renk geliĢimi

a. Kesitin üzerindeki fazla sıvı nazikçe alındı.

b. Yeterli miktardaki PEROXIDASE SUBSTRATE (75 μL/5 cm2) kestin

üzerini örterecek Ģekilde uygulandı.

c. Oda ısısında 3-6 dakika koyulaĢaması için beklendi.

d. Optimal koyulaĢmayı bulmak için ıĢık mikroskobu altında bakıldı.

3.1.10 Kesitlerin yıkanması

a. Kesitler distile su ile 3 kez 1 dakika süre ie yıkandı.

b. kesitle oda ısısnda 5 dakika süreyle distile su içinde inkübe edildi.

42

3.1.11 Ġkinci kez örneklerim koyulaĢtırılması

a. Oda ısısında 10 süre ile %0.5 methyl green uygulandı.

b. Kesitler 3 kez distle su ile yıkandı.

c. Kesitler % 100N-BUTANOL içine 3 kez 30 saniye süre ile daldırıldı.

3.1.12. Örnekleri mikroskop altında incelemeye hazırlama

a. Örnekleri dehidrate etmek için 3 XYLENE‟li kavanozda ikiĢer dakika süreyle

örnekler bekletildi.

b. Örnekler üzerindeki sıvı nazikçe alındı.

c. Lam üzerine lamel kapatıldı.

3.1.13. Mikroskop altında inceleme

a.Örnekler ıĢık mikroskopualtında incelenmeye alındı.

3.2. Histopatolojik değerlendirme

Rat beyinleri %10‟luk formaldehitde tespit edildikden sonra, hipokampus

seviyesinden geçen bir dilim ile örneklendi. Bu dilimden parafin bloklar hazırlanarak

seri kesitler yapıldı. Hazırlanan toplam 60 histolojik kesit Histokimyasal Olarak S7100

ApopTag® Peroxidase ile iĢleme tabi tutularak ıĢık mikroskobunda değerlendirildi.

Apopitotik hücre sayımı bilateral hipokampus CA1 bölgesi ve parietal kortekste yapıldı.

10 X 40 güçteki ıĢık mikroskobunda patolog tarafından hücre sayımı 5 alanda sayılarak

kaydedildi ve Nicon® E500 fotograf makinesi ile görüntülendi (Resim–1,2,3,4).

3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme

Tedavi ve kontrol grubunda yer alan ratların özellikleri ve sonuçlar hazır istatistik

programı SPSS version 11.0 ile değerlendirildi. Sonuçların değerlendirilmesinde Mann

Whitney U testi ve ki-kare analiz yöntemleri kullanıldı. Kontrol ile tedavi grupları

arasında yapılan ikili karĢılaĢtırmalarda; genel hata oranı = 0,05‟te tutulabilmesi için

her bir karĢılaĢtırmada önemlilik seviyesi /k olarak alındı (k=karĢılaĢtırma sayısı). P

değeri 0.05‟den küçük bulunduğunda anlamlı farklılık olduğu kabul edildi.

43

4. BULGULAR

Serum fizyolojik verilen shame grubuna (Grup 1) ağırlıkları 9,8–13 gr arasında değiĢen,

ortalama 10,31,21 gr ağırlığında sekiz‟i erkek 15 rat alındı. Hipoksi iskemi iĢlemi

uygulanan ve serum fizyolojik verilen hipoksik iskemik grubuna (Grup 2) ağırlıkları

9,1–13,5 gr arasında değiĢen, ortalama 10,81,1 gr ağırlığında yedi‟si erkek 15 rat

alındı. Hipoksi –iskemi iĢlemi öncesi indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 3)

ağırlıkları 10,0–13,1 gr arasında değiĢen, ortalama 10,30,7 gr ağırlığında dokuz‟u

erkek 18 rat alındı. Hipoksi-iskemi iĢlemi sonrası 2 mg/kg indometazin verilen tedavi

grubuna (Grup 4) ağırlıkları 9,3–15,3 gr arasında değiĢen, ortalama 10,61,9 gr

ağırlığında sekiz‟i erkek 15 rat alındı. Son grup hipoksi- iskemi sonrası 4 mg/kg

indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 5) ağırlıkları 8,9–13,9 gr arasında değiĢen,

ortalama 10,51,3 gr ağırlığında yedi‟si erkek 15 rat alındı. Tablo-9‟da gruplara göre

cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı gösterildi. Gruplar arasında ağırlık ve cinsiyet

bakımından istatistiksel farklılık yoktu (p>0,005).

Tablo 9. Gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı

Grup Cinsiyet Ağırlık (gr)

OrtalamaSS

(alt sınır-üst sınır)

1 (Sham) n=15

7 diĢi, 8 erkek

10,31,21

(9,8–13,0)

2 (Hipoksik-iskemik) n:15

8 diĢi, 7 erkek

10,81,1

(9,1–13,5)

3 (Hipoksi–iskemi öncesi 2 mg/kg

indometazin)

n:15

8 diĢi, 7 erkek

10,30,7

(10,0–13,1)

4 (Hipoksi–iskemi sonrası 2 mg/kg

indometazin)

n:15

7 diĢi, 8 erkek

10,61,9

(9,3–15,3)

5 (Hipoksi–iskemi sonrası 4 mg/kg

indometazin)

n:15

8 diĢi, 7 erkek

10,51,3

(8,9–13,9)

44

Gruplar arasında cinsiyet ve ağırlık ortalamaları arasında istatistiksel olarak fark

saptanmadı. Hipoksik-iskemiden sonraki 72. saatte TUNEL positif hücre sayısı grup

2‟de 22.00±5.28 iken, sham grubunda 3,86±1,09 idi (p<0.001). Hem H-I öncesi hem de

H-I sonrası 2mg indometazin tedavisi ile apopitotik hücre sayısı yaklaĢık yarı yarıya

azaldı (sırasıyla 9,83±1,23, 9,50±0,73, p<0,001 ve p<0,001). H-I sonrası 4 mg/kg

indometazin tedavisi ile TUNEL pozitif hücre sayısını (6,30±1,12) neredeyse sham

grubundaki apopitotik hücre sayısına yakın bir düzeye azalttı ve sham grubu apoptotik

hücre sayısı ile karĢılaĢtırıldığında aralarında anlamlı istatistiksel farklılık yoktu

(p>0,05). Tedavi grupları içerisinde en iyi nöroprotektif etkiyi H-I sonrası 4mg/kg

indometazin gösterdi. Yine H-I sonrası 2 mg/kg indometazin tedavisi gibi H-I öncesi

tek 2 mg/kg indometazin tedavisi de oldukça baĢarılı biçimde nöroprotektif etki

gösterdi.

Tablo 10. Gruplara göre apopitotik hücre dağılımı

Gruplar TUNEL pozitiv boyanan apopitotik hücre sayıları

Ortalama ± SS

(alt-üst sınır)

Sağ hemisfer Sol hemisfer p

1 (Sham)

(n: 15)

3,90±1,10

(2–5) 3,53 1,06

(2–5)

>0,05

2 (Hipoksik-iskemik)

(n: 15)

12,40±1,58a

(11–14) 31,46 0,97

a

(13–47)

<0,01

3 (Hipoksi-iskemi öncesi 2 mg/kg

indometazin)

(n: 15)

8,26±1,03 a

(6–10) 11,331,58

a

(10 – 14)

<0,05

4 (Hipoksi-iskemi sonrası 2mg/kg

indometazin)

(n: 15)

7,93±0,79 a

(6–10) 11,000,65

a

(10–12)

<0,05

5 (Hipoksi-iskemi sonrası 4mg/kg

indometazin)

(n:15)

5,86±0,91

(5–7) 6,60 1,40

(5–8)

>0,05

a Grup 2, 3, 4‟te sağ ve sol hemisferler arasında TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücre sayıları arasında

istatisitiksel farklılık saptandı.

Gruplarda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler Ģekil 5-9‟da

görülmektedir

45

ġekil 5. Sham grubunda az sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40).

ġekil 6. Hipoksik-iskemik hasar oluĢturulan grupta artan sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik

hücreler (10x40).

46

ġekil 7. Hipoksik-iskemik hasar öncesi 2mg/kg indometazin uygulanan grupta TUNEL pozitif

boyanan apopitotik hücreler (10x40).

ġekil 8. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 2mg/kg indometazin verilen grupta daha az sayıda TUNEL

pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40).

47

ġekil 9. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 4mg/kg indometazin uygulanan grupta belirgin olarak azalan

TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40).

Indometazinin beyin hemisferlerinde hipoksi ve hipoksik-iskemi üzerine etkileri

değerlendirildiğinde; sham ve H-I sonrası 4mg/kg indometazin tedavi grubu hariç tüm

gruplarda sol hemisferlerdeki apopitotik hücre sayısı sağ hemisferdeki hücrelerden

istatistiksel olarak anlamlı ölçüde daha yüksekti (p<0,05), (Tablo 10).

Sol hemisferlerde; H-I öncesi ve sonrası 2 mg/kg indometazin tedavileri

apopitotik hücre sayısını 3 kat azaltırken (p<0,01), H-I sonrası 4 mg/kg indometazin

tedavisi ise apopitotik hücre sayısı H-I grup ile karĢılaĢtırıldığında yaklaĢık 5 kat azalttı

(p<0,001).

48

5. TARTIġMA

Neonatoloji ve perinatoloji alanındaki ilerlemelere rağmen kalıcı nörolojik

sekellerin en sık nedeni olarak gösterilen hipoksik-iskemik beyin hasarı, obstetrisyen ve

neonatologları uğraĢtıran yenidoğanın önemli sorunlarından biridir.10

Hipoksik-iskemik

beyin hasarı, hipoksi-iskemi anında baĢlayıp resusitasyon ardından iyileĢme döneminde

devam eden bir süreçtir. Akut dönemde selektif nöronal nekroz veya infarkt Ģeklinde

gözlenen doku hasarı, nöron, glia ve endotel hücre yapısının bozulması ile devam eder.

Ġnfarkt alanına en yakın bölgede yer alan nöronlarda nekroz ya da programlanmıĢ hücre

ölümü yani apoptozis geliĢir.21

Nekroz geliĢmiĢ hücrelerde hasarın önüne geçilmesi söz

konusu değildir. Ancak infarkt etrafında devam eden hasar sürecinin önüne geçilmesi

bu dönemde meydana gelen biyokimyasal olayların iyi bilinmesi ile mümkün olabilir.

Son çalıĢmalarda H-Ġ‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen latent dönemin çok

kritik olduğu görülmüĢ ve bu dönem “terapodik pencere” olarak adlandırılmıĢtır.

Hipoksi-iskemiye maruz kalan bir yenidoğan bebekte bu süre 6 ile 12 saat arasında

değiĢmektedir.10

Terapodik pencere döneminde oluĢan hücre ölümüne neden olan

moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte çok yararlıdır.58

Hipoksik-iskemik serebral hasar, hücresel düzeyde oksidatif metabolizmanın

anaerobik metabolizmaya kayması ile baĢlar. Glikozun anaerobik yoldan yıkımı

sonucunda hücrede NADH, FADH gibi redükte ajanlar ile laktik asit ve H iyonları

birikmeye baĢlar. Anaerobik glikoliz, hücrenin enerji gereksinimini karĢılayamadığı için

ATP gibi yüksek enerjili fosfat rezervleri tüketilmeye baĢlar. Bunun sonucunda hücreler

arasında iyon geçiĢini sağlayan ATP‟e bağımlı pompa fonksiyonları bozulur. Hücre

içerisinde Na, Ca

2, Cl

- ve su birikerek sitotoksik ödem meydana gelir. Hipoksi-

iskemi aynı zamanda glutamat gibi eksitotoksik aminoasitlerin akson terminallerinden

salınımını stimüle eder. Glutamat salınımı glutamat hücre reseptörlerini aktive ederek

Na ve Ca

2 iyonlarının hücre içerisine girmesine neden olur. Membran fosfolipitlerinin

turnoverinin artması sonucu sitozol içerisinde serbest yağ asitleri birikir daha sonra

mitokondri içerisinde devam eden indirgenme reaksiyonlarının sonucunda oluĢan

serbest oksijen radikalleri, membran fosfolipitlerinin peroksidasyonuna yol açar.

Reaksiyonun ürünü olarak açığa çıkan prostaglandin, ksantin, ürik asit ve Ca2

sitosol

içerisinde birikmeye baĢlar. Kalsiyumun intrasellüler depolardan (mitokondri ve

49

endoplazmik retikulum) serbest hale geçmesi ve plazma membranı boyunca geçiĢinin

artması sonucunda hücre sitoplâzmasında yüksek seviyelere ulaĢır. Özetle sellüler enerji

yetmezliği, asidoz, glutamat ve serbest radikal oluĢumu, hücre içinde Ca2

birikimi ve

lipit peroksidasyonu hücrenin yapısal komponentlerinin bozulmasına ve nihayetinde

hücre ölümüne yol açan biyokimyasal kaskadlar dizisidir.21

Hipoksi-iskemi ardından intrasellüler kalsiyum konsantrasyonunun artmasıyla

fosfolipaz A2‟nin aktive olduğu, membran fosfolipidlerinin yıkılmasıyla hücrede

araĢidonik asid biriktiği, siklooksijenaz ve lipooksigenaz enzimlerinin aktivasyonuyla

prostoglandinler, tromboksan A2 ve lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikallerinin

açığa çıktığı bilinmektedir.43,75

Özellikle prematüre bebeklerde son yıllarda yapılan

epidemiyolojik ve deneysel çalıĢmalarda inflamasyon, periventriküler lökomalazi ve

serebral palsi arasında yakın iliĢki olduğu görülmüĢtür.3 EriĢkin ve immatür kemirgen

hayvanlarda hipoksi iskemi sonrasında beyinde ĠL-1 ve TNF- gibi sitokinlerin açığa

çıktığı gösterilmiĢtir.74

Bu sitokinlerin NOS-2 (iNOS) enzimini uyardıkları gibi

siklooksijenaz-2 (COX-2) enziminin de uyarılmasını sağlayarak NO ve prostaglandin

üretimine neden oldukları bilinmektedir. iNOS ile COX–2 enzimleri iĢlevleri

bakımından birbirine çok benzemektedir. Hipoksi-iskeminin neden olduğu inflamatuvar

sitokinlerin açığa çıkması ile iNOS ile aynı dönemde COX–2 yolağı aktive olur.65

Reperfüzyon-reoksijenasyondan önce bir siklooksijenaz inhibitörü olan

indometazin verilmesinin, postiskemik hipoperfüzyonu önlediği gösterilmiĢtir.8 Ayrıca

NMDA aracılıklı geliĢen pial arteiolar dilatasyonu önlediği, süperoksit serbest

radikallerin üretimini baskıladığı, serebral enerji metabolizmasını ve elektiriksel

kortikal aktiviteyi koruduğu, dolaĢımdaki nötrofil sayısını ve sitokin üretimini azalttığı

bildirilmiĢtir.10,21,91

Hasar sürecinin devam ettiği reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük

damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve

ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir.86

Sikloooksijeneaz yolağının

upregulasyonu, artmıĢ prostaglandin ürünleri (özellikle PGE2) ve ROS plasma

membranındaki ölüm reseptörlerini ve kaspaz-8‟i aktive ederek hücreyi apopitozise

götüren kaspaz-3 aktivasyonuna yol açarak nöronal apopitozise yol açtığı ileri

sürülmüĢtür.104

Bir kaç çalıĢmada COX inhibitörlerinin kaspaz aktivasyonununu

önlediği, PGE2 üretimini baskıladığı, geç nöronal ölümü azalttığı ve iskeminin neden

50

olduğu infarkt alanını küçülttüğü gösterilmiĢtir.105,106

Ġndometazinin kaspaz aktivasyonu

hangi mekanizmalarla önlediği kesin olarak bilinmemektedir. Ancak daha önce yapılan

çalıĢmalarda COX-2 aktivitesinin prostaglandin reseptölörlerini aktive ederek

intranöronal kalsiyum birikimine neden olduğu, bu sırada ROS üretiminin olduğu,

NMDA aracılı nörotoksisteye neden olduğu, öte yandan özellikle PGE2‟nin

intranörönal kalsiyum birikimine neden olduğu kalsiyum birikiminin ise hücre içi bazı

olaylardan sonra proapopitotik transkripsiyon ve kaspaz-8‟in expresyonunun artĢına

neden olduğu ve sonuç olarak kaspaz aracılı nöronal ölüm gerçekleĢtiği ileri

sürülmektedir.8,98,104

Daha önce yapılan çalıĢmalarda indometazinin dozu ve uygulama

zamanı ile ilgili fikir birliği yoktur. Buccelatti ve arkadaĢları8 fokal iskemik rat

beyninde iskemiden 1 saat önce 20 mg/kg/doz indometazin tedavisinin kontrol grubuna

göre infarkt alanını küçülttüğünü göstermiĢti. Tutak ve arkadaĢları7 ise deneysel

hipoksik iskemik rat beyninde hipoksik-iskemiden 30 dakika sonrası 0,2 mg/kg (12 saat

arayla 3 doz) indometazin tedavisinin kontrol grubuna göre rat beyninde infarkt alanının

küçüldüğünü bildirdiler. Öte yandan Kondo ve arkadaĢları107

geçici ön beyin iskemisi

oluĢturulan grebillerde iskemiden 5 dakika önce uyguladıkları 5 mg/kg/doz indometazin

tedavisinin kontrol grubuna göre TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücre sayısının

anlamlı ölçüde düĢtüğü ve dolayısıyla gecikmiĢ nöronal hasarı önlediğini ortaya koydu.

Bizim çalıĢmamızda ise H-I rat modelinde H-I‟den 30 dakika önce tek doz 2 mg/kg

indometazin tedavisiyle apopitotik hücre sayısını kontrol grubuna göre düĢük bulduk.

Yine bu çalıĢmada aynı zamanda H-I sonrası 3 kez 12 saat arayla uygulanan 2 mg/kg

indometazin tedavisi de apopitotik hücre sayısını azalttı ve H-I öncesi 2 mg/kg

indometazin tedavisine eĢ nöroprotektif etki gösterdi. ÇalıĢmamızda H-I sonrası tek doz

indometazin uygulaması yapılmadığından, H-I sonrası tek doz indometazinin rat beyni

üzerine etkilerinin sonuçlarını bilemiyoruz.

Ek olarak bu çalıĢmada H-I‟den 30 dakika sonra 4 mg/kg/doz indometazin

tedavisinin H-I öncesi ve sonrası 2 m/kg/doz indometazin tedavisinden daha baĢarılı bir

Ģekilde apopitozisi önlediğini ortaya koydu. H-I sonrası yüksek doz indometazin

tedavisi iskeminin neden olduğu gecikmiĢ nöronal hasar derecesini, hipoksinin neden

olduğu nöronal hasar düzeylerine indirmesi oldukça ilginç bir bulgu olarak

değerlendirildi. Daha önce yapılan çalıĢmalarda PGE2 miktarı ile gecikmiĢ nöronal

hasar arasında iliĢki olduğunu ve PGE2‟nin doza bağımlı olarak nöronal apopitoza

51

neden olduğu ileri sürülmüĢtü.108

Bizim çalıĢmamızda yüksek indometazin tedavisinin

doza bağımlı nöroproektif etki göstermesi belki de doz bağımlı artmıĢ siklooksijenaz

inhibisyonu ve dolayısıyla azalmıĢ prostaglandin ürünleri ve serbest radikal miktarı ile

iliĢkili olabilir. Bu konuda kapsamlı çalıĢmalara ihtiyaç vardır.

Sonuç olarak yaptığımız bu çalıĢma; indometazinin hipoksik iskemik hasar

öncesi ve sonrası gecikmiĢ nöronal hasarı önlediğini gösterdi. Özellikle 4 mg/kg gibi

yüksek doz indometazin tedavisinin düĢük doz indometazin tedavilerinden daha çok

nörorotektif etkisinin olduğunu ortaya koydu. Ancak indometazinin hiposik iskemik

ensefalopati tedavisinde geç nöronal hasarı önleme ve optimal tedavi dozu ile ilgili daha

kapsamlı çalıĢmalara ihtiyaç vardır.

52

SONUÇLAR

1- Hipoksik –iskemik hasardan sonra apopitotik hücre sayısı sham grubundan

oldukça fazlaydı (p<0.001)

2- Hipoksi iskemi öncesi tek doz 2 mg/kg indometazin verilmesi, hipoksik

iskemik gruba göre apopitotik hücre sayısını azalttı (p<0,05).

3- Hipoksik-iskemik hasardan sonra 2 mg/kg indometazin verilmesi hipoksik

iskemik gruba göre apopitotik hücre sayısını azalttı (p<0,05).

4- Hipoksik-iskemik hasardan sonra 4 mg/kg indometazin verilmesi hipoksik

iskemik gruba göre apopitotik hücre sayısını azalttı (p<0,05).

5- H-I‟den 30 dakika sonra 4 mg/kg/doz indometazin tedavisinin H-I öncesi ve

sonrası 2m/kg/doz indometazin tedavisinden yaklaĢık 2 kat daha baĢarılı bir Ģekilde

apopitozu önledi. (p<0,05).

53

7. KAYNAKLAR

1) Volpe JJ. Hypoxic-Ischemic Encephalopathy: Neuropathology and pathogenesis. In:

Volpe J, ed. Neurology of the Newborn. 4rd ed. Philadelphia, PA: WB Saunders; 2000;

217–394.

2) Perlman JM. Intrapartum hypoxic-ischemic cerebral injury and subsequent cerebral

palsy. Pediatrics 1997; 99:851–8.

3) du Plessis AJ, Volpe J. Perinatal brain injury in the preterm and term newborn.

Current Opinion in Neurology 2002; 15:151–7.

4) Szabo C. Physiological and pathophysiological roles of nitric oxide in the central

nervous system. Brain Res Bull 1996; 41:13–41.

5) Vannucci RC, Palmer C. Hypoxic-ischemic encephalopathy: pathogenesis and

neuropathology. In: Fanaroff AA, Martin RJ, eds. Neonatal-Perinatal Medicine.

Philadelphia, PA: Mosby-Yearbook, Inc 1997: 856–77.

.

6) Vilanova JM, Figueras JA, Rosello J, Gomez G, Gelpi E, Jimenez R. Arachidonic

acid metabolites in CSF in hypoxic-ischaemic encephalopathy of newborn infants. Acta

Paediatrica 1998; 87:588-92.

7) Tutak E, Satar M, Zorludemir S, Erdoğan S, Yapicioğlu H, Narli N.

Neuroprotective effects of indomethacin and aminoguanidine in the newborn rats with

hypoxic-ischemic cerebral injury. Neurochem Res 2005; 30:937–42.

8) Buccellati C, Folco GC, Sala A, Scelsi R, Masoero E, Poggi P, et al. Inhibition of

prostanoid synthesis protects against neuronal damage induced by focal ischemia in rat

brain. Neurosci Lett 1998; 257:123-6.

9) Greene KR, Rosen KG, Levene MI. Perinatal asphyxia, in fetal and neonatal

neurology and neurosurgery, 2nd ed. (Eds, Levene MI, Lilford RJ, Bennett MJ, Punt J),

Churchill Livingstone, Edinburgh 1995; 387–442.

10) Volpe JJ. Perinatal Brain Injury: From pathogenesis to neuroprotection. Mental

Retardation and Develepmental Reviews 2001; 7:56–64.

11) Vannucci RC, Perlman JM. Interventions for Perinatal Hypoxic-Ischemic

Encephalopathy. Pediatrics 1997; 100:1004–114.

12) Hill A, Volpe JJ. Neurological and Neuromuscular Disorders. In: Avery GB, Fletcher

MA, MacDonald MG.(eds). Neonatology Pathophysiology & Management of the

Newborn. 5th ed. Philadelpha; Lippincott Williams&Wilkins 1999: 1231-52.

13) Pasternak JF: Hypoxic-ischemic brain damage in the term infant: Lessons form

laboratory. Ped Clin N A 1993; 40:061–72.

54

14) Satar M, Narlı N, Kırımi E, Atıcı A, Türkmen M, Yapıcıoğlu H. Hipoksik iskemik

ensefalopatili 205 olgunun değerlendirilmesi. T Klin Pediatri 2001; 10:36-41.

15) Martin-Ancel A, Garcia-Alix A, Gaya F, Cabanas F, Burgueros M, Quero J: Multiple organ involvement in perinatal asphyxia. J Pediatr 1995; 127:786–793.

16) Evans DJ, Levene MI: Hypoxic-ischaemic injury. In: Textbook of Neonatology, 3rd

ed. (Eds, Rennie JM, Roberton NRC). Churchill Livingstone, Edinburgh 1999: 1235–

1251.

17) Hill A, Volpe JJ. Hypoxic-ischemic Cerebral Injury in the Newborn. In: Swaimann

KF, Ashwal S (eds.). Pediatric Neurology. 3nd ed. St. Louis; Mosby Inc 1999: 191-

205.

18) Fitzhardinge PM, Flodmark O, Fitz CR, Ashby S: The prognostic value of

computed tonography as an adjunct assesment of the term infant with postasphyxial

encephalopathy. J Pediatr 1981; 99:777-781.

19) Vannucci RC, Yager JY, Vannucci SJ: Cerebral glucose and energy utilization

during the evolution of hypoxic-ischemic brain damage in the immature rat. J Cereb

Blood Flow Metab 1994; 143:279-288.

20) Harkness RA: Is post-hypoxic-ischemic cell damage associated with excessive ATP

consumption rather than a failure of ATP production? Acta Paediatr 1997; 86:1-5.

21) Vannucci RC. Hypoxia-Ischemia: Clinical Aspects. In: Fanaroff AA, Martin RJ eds.

Neonatal-Perinatal Medicine, Disease of the Fetus and Infant.6th

ed. St Louis: Mosby

1997: 812-951.

22) Plum F: What causes infarction in ischemic brain?. The Robert Wartenberg Lecture,

Neurology 1983; 33:222-233.

23) Yager JY, Brucklacher RM, Vannucci RC. Cerebral energy metabolism during

hypoxia-ischemia and early recovery in the immature rats. Am J Physiol 1992; 262:

672-7.

24) Rehncroná S, Rosen I, Siesjo BK. Brain lactic acidosis and ischemic cell damage: I.

Biochemistry and neurophysiology. J Cereb Blood Flow Metabol 1981;1:297-311.

25) Paschen W, Djuricic B, Mies G, Schmidt-Kastner R, Linn F. Lactate and pH in the

brain: association and dissociation in diferent pathophysiological states. J Neurochem

1987; 48:154-159.

26) Feet BA, Gilland E, Groenedaal F, Brun NC, Hagberg H, Saugstad OD: Cerebral

excitatory aminoacids and Na, K-ATP ase activity during resuscitation of severely

hypoxic newborn piglets. Acta Pediatr 1998; 87:889-95.

55

27) McDonald JW, Johnston MV. Phsiological and pathophysiological roles of excitatory

amino acids during central nervous system development. Brain Res Rev 1990; 15:41-

70.

28) Gilland E, Puka-Sundvall M, Andine P, Bona E, HagbergH. Hypoxic-ischemic

injury in the neonatal rat brain: effect of pre-and post-treatment with the glutamate

release inhibitor BW1003C87. Brain Res Brain Res Rev 1994; 83:79-84.

29) Barks JD, Silverstein FS, The glutamate uptake inhibitor L-trans–2, 4-pyrrolidine

dicarboxylate is neurotoxic in neonatal rat brain. Mol Chem Neuropathol 1994; 23:201-

215.

30) Jensen FE, Blume H, Alvarado S, Firkunsy I, Geary C. NBQX blocks acute and

late epileptogenic effects of perinatal hypoxia. Epilepsia 1995; 36:966-972.

31) Nelson KB, Grether JK. Can magnesium sulfate reduce the risk of cerebral palsi in

very low birth weight infants? Pediatrics 1995; 95:263-9.

32) Paneth N, Jetton J, Pinto-Martin J, Susser M, The Neonatal Brain Hemorrhage

Study Analysis Group. Magnesium sulfate in labor and risk of neonatal brain lesions

and cerebral palsy in low birth weight infants. Pediatrics 1988; 82:533-542.

33) D’Souza SW, Slater P: Excitator amino acids in neonatal brain: contributions to

pathology and their therapeutic strategies. Arch Dis Child 1994; 70:147-50.

34) Schleien CL, Kuluz JW. The role of leukocytes in global and focal brain ischemia. In:

TibboelD, van der Voort E (eds). İntensive care in Childhood: A Challenge to the

Future. Berlin: Springer- Verlag; 1996: 175-86.

35) Bulkley GB. Reactive oxygen metabolites and reperfusion injury: abberrant triggering

of reticuloendothelial function. Lancet 1994; 344:934-6.

36) Cammer W, Zhang H. Maturation of oligodendrocytes is more sensitive to TNF alpha

than is survival of precursors and immature oligodendrocytes. J Neuroimmunol 1999;

97:37-42.

37) Selmaj K, Walczak A, Mycko M. Supression of experimental autoimmune

encephalomyelitis with a TNF binding protein (TNF bp) correlates with down-

regulation of VCAM–1/VLA–4. Eur J Immunol 1998; 28:2035–2044.

38) Louis JC, Magal E, Takayama S, Varon S. CNTF protection of oligodendrocytes

against natural and tumor necrosis factor-induced death. Science 1993; 259:689-92.

39) Taupin V, Renno T, Bourbonniere L. Increasedseverity of experimental autoimmune

ancephalomyelitis, chronic macrophage/microglial reactivity, and demyelination in

transgenic mice producing tumor necrosis factor-alpha in the central nervous system.

Eur J Immunol 1997; 27:905-13.

56

40) Brian J, Faraci F. Tumor necrosis factor-a-induced dilatation of cerebral arterioles.

Stroke 1998; 29:509-15

41) Brian J, Heistad D, Faraci F. Mechanism of endotoxin-induced dilatation of cerebral

arterioles. Am J Physiol Heart Circ Phys 1995; 38:783-8.

42) Liao SL, Chen CJ. Differantial effects of cytokines and redox potential on glutamate

uptake in rat cortical glial cultures. Neurosci Lett 2001; 299:113-6.

43) Fern R, Moller T. Rapid ischemic cell death in immature oligodendrocytes: a fatal

glutamate release feedback loop. J Neurosci 2000; 20:34-42 ,

44) Northington FJ, Traytsman RJ, Koehler RC, Martin LJ. GLT1, glial glutamate

transporter, is transiently expressed in neurons and develops astrocyte spesificity only

after midgestation in the ovine fetal brain. J Neurobiol 1999; 39:515-26,

45) Kopp EB, Medzhitov R. The Toll-receptor family and control of innate immunity.

Curr Opin Immunol 1999; 11:13-8,

46) Martin LJ. Neuronal cell death in nervous system devolepment, disease, and injury.

Int J Mol Med 2001; 7:455-78.

47) Brambrink AM, Price AC, Kaiser A, Agnew DM, Ichord RN, Traystman RJ.

Neuronal death in newborn striatum after hypoxia-ischemia is necrosis and evolves

with oxidative stress. Neurobiol Dis. 2000; 7:169-91.

48) Martin LJ, Brambrink AM, Lehmann C, Portera-Cailliau C, Koehler R,

Rothstein J, Traystman RJ. Hypoxia-ischemia causes abnormalities in glutamate

transporters and death of astroglia and neurons in newborn striatum. Ann Neurol 1997;

42:335-48.

49) Martin LJ, Brambrink AM, Price AC, Kaiser A, Agnew DM, Ichord RN,

Traystman RJ. Neuronal death in newborn striatum after hypoxia-ischemia is necrosis

and evolves with oxidative stress. Neurobiol Dis 2000; 7:169-91.

50) Golden WC, Brambrink AM, Traystman RJ, Martin LJ. Failure to sustain

recovery of Na,K-ATPase function is a possible mechanism for striatal

neurodegeneration in hypoxic-ischemic newborn piglets. Brain Res Mol Brain Res

2001; 88:94-102.

51) Northington FJ, Ferriero DM, Graham EM, Traystman RJ, Martin LJ. Early

Neurodegeneration after Hypoxia-Ischemia in Neonatal Rat Is Necrosis while Delayed

Neuronal Death Is Apoptosis. Neurobiol Dis 2001; 8:207-19.

52) Nakajima W, Ishida A, Lange MS, Gabrielson KL, Wilson MA, Martin LJ, Blue

ME, Johnston MV. Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after

hypoxic ischemia in the newborn rat. J Neurosci 2000; 20:7994-8004.

57

53) Northington FJ, Ferriero DM, Flock DL, Martin LJ. Delayed neurodegeneration in

neonatal rat thalamus after hypoxia-ischemia is apoptosis. J Neurosci 2001; 21:1931-8.

54) Martin LJ, Al-Abdulla NA, Brambrink AM, Kirsch JR, Sieber FE, Portera-

Cailliau C. Neurodegeneration in excitotoxicity, global cerebral ischemia, and target

deprivation: A perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. Brain Res

Bull 1998; 46:281-309.

55) Yamashima T. Implication of cysteine proteases calpain, cathepsin and caspase in

ischemic neuronal death of primates. Prog Neurobiol 2000; 62:273-95.

56) Schulz JB, Weller M, Moskowitz MA. Caspases as treatment targets in stroke and

neurodegenerative diseases. Ann Neurol 1999; 45:421-9.

57) Martin LJ, Sieber FE, Traystman RJ. Apoptosis and necrosis occur in separate

neuronal populations in hippocampus and cerebellum after ischemia and are associated

with differential alterations in metabotropic glutamate receptor signaling pathways. J

Cereb Blood Flow Metab 2000; 20:153-67.

58) Northington FJ, Ferriero DM, Flock DL, Martin LJ. Delayed neurodegeneration in

neonatal rat thalamus after hypoxia-ischemia is apoptosis. J Neurosci 2001; 21:1931-8.

59) Cheng Y, Deshmukh M, D'Costa A, Demaro JA, Gidday JM, Shah A, Sun Y,

Jacquin MF, Johnson EM, Holtzman DM. Caspase inhibitor affords neuroprotection

with delayed administration in a rat model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury.

J Clin Invest 1998; 101:1992-9.

60) Ishimaru MJ, Ikonomidou C, Tenkova TI, Der TC, Dikranian K, Sesma MA,

Olney JW. Distinguishing excitotoxic from apoptotic neurodegeneration in the

developing rat brain. J Comp Neur 1999; 408:461-76.

61) Portera-Cailliau C, Price DL, Martin LJ. Excitotoxic neuronal death in the

immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J Comp Neurol

1997; 378:70-87.

62) Portera-Cailliau C, Price DL, Martin LJ. Non-NMDA and NMDA receptor-

mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct:

further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J Comp Neurol 1997; 378:88-

104.

63) Sastry PS, Rao KS. Apoptosis and the nervous system. J Neurochem 2000; 74:1-20.

64) Fiskum G, Murphy AN, Beal MF. Mitochondria in neurodegeneration: acute

ischemia and chronic neurodegenerative diseases. J Cereb Blood Flow Metab 1999;

19:351-69.

65) Murphy AN, Fiskum G, Beal MF. Mitochondria in neurodegeneration: bioenergetic

58

function in cell life and death. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19:231-45.

66) Nicotera P, Lipton SA. Excitotoxins in neuronal apoptosis and necrosis. J Cereb

Blood Flow Metab 1999; 19:583-91.

67) Iijima T. Mitochondrial membrane potential and ischemic neuronal death. Neurosci

Res 2006; 55:234-43.

68) Lopez-Neblina F, Toledo AH, Toledo-Pereyra LH. Molecular Biology of Apoptosis

in Ischemia and Reperfusion. J Invest Surg 2005; 18:335–50.

69) De Giorgi F. Lartigue L, Bauer MK, Schubert A, Grimm S, Hanson GT,

Remington SJ, Youle RJ, Ichas F. The permeability transition pore signals apopsotis

by directingh Bax transolocation and multimerization. FASEB J 2002; 16:607–9.

70) Gunn AJ, Gunn TR, Gunning MI et al. Neuroprotection with prolonged heat cooling

started before postischemic seizures in fetal sheep. Pediatrics 1999; 102:1098-106.

71) Akisü M, Kültürsay N, Coker I, Hüseyinov A. Platelet-Activating Factor Is an

Important Mediator in Hypoxic Ischemic Brain Injury in the Newborn Rat. Biol

Neonate 1998; 74:439-44.

72) Kayaalp SO. Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. Onuncu Basım, cilt 2,

Hacettepe TAŞ, Ankara 2006; 89:1502-25.

73) Goodman & Gilman’s. The Pharmacological Basis of Therapeutics. Joel G Hardman,

Lee E. Limbird. Tenth Edition 2001; 26: 669-85.

74) Bertram G. Katzung. Basic and Clinical Pharmacology. Eighth Edition. A lange

Medical Book 2001; 18: 311-25.

75) Richard A. Harwey, Pamela C. Champe. Pharmacology. Lippincott’s Illustrated

Reviews 1992; 39:379-80.

76) Leslie CC. Regulation of the specific release of arachidonic acid by cytosolic

phospholipase A2. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2004; 70:373-6.

77) Farooqui AA, Ong WY, Horrocks LA. Biochemical aspects of neurodegeneration in

human brain: involvement of neural membrane phospholipids and phospholipases A2.

Neuroche. Res 2004; 29:1961–77.

78) Ross BM, Kim DK, Bonventre JV, Kish SJ. Characterization of a novel

phospholipase A2 activity in human brain. J Neurochem 1995; 64:2213-21.

79) Hanasaki K, Arita H. Phospholipase A2 receptor: a regulator of biological functions

of secretory phospholipase A2. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002; 68-69:71-82.

80) Thwin MM, Ong WY, Fong CW, Sato K, Kodama K, Farooqui AA,

59

Gopalakrishnakone P. Secretory phospholipase A2 activity in the normal and kainate

injected rat brain, and inhibition by a peptide derived from python serum. Exp Brain

Res 2003; 150:427-33.

81) Matsuzawa A, Murakami M, Atsumi G, Imai K, Prados P, Inoue K, Kudo I.

Release of secretory phospholipase A2 from rat neuronal cells and its possible function

in the regulation of catecholamine secretion. Biochem J. 1996; 318:701–9.

82) Xu NJ, Bao L, Fan HP, Bao GB, Pu L, Lu YJ, Wu CF, Zhang X, Pei G. Morphine

withdrawal increases glutamate uptake and surface expression of glutamate transporter

GLT1 at hippocampal synapses. J Neurosci 2003; 23:4775–84.

83) DeCoster MA, Lambeau G, Lazdunski M, Bazan NG. Secreted phospholipase A2

potentiates glutamate-induced calcium increase and cell death in primary neuronal

cultures. J Neurosci Res 2002; 67:634-45.

84) Yoshihara Y, Yamaji M, Kawasaki M, Watanabe Y. Ontogeny of cytosolic

phospholipase A2 activity in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 1992; 185:350-

5.

85) Hernández M, Nieto ML, Sánchez Crespo M. Cytosolic phospholipase A2 and the

distinct transcriptional programs of astrocytoma cells. Trends Neurosci 2000; 23:259-

64.

86) du Plessis A, Johnston MV. Hypoxic-ischemic brain injury in the newborn: Cellular

mechanisms and potential strategies for neuroprotection. Clinics in Perinatology 1997;

24:627-54.

87) Saliba E, Henrot A.Inflamatory mediators and neonatal brain damage Biology of the

Neonate 2001; 79:224-7.

88) Lin TN, Wang Q, Simonyi A, Chen JJ, Cheung WM, He YY, Xu J, Sun AY, Hsu

CY, Sun GY. Induction of secretory phospholipase A2 in reactive astrocytes in

response to transient focal cerebral ischemia in the rat brain. J Neurochem 2004;

90:637-45.

89) Tabuchi S, Uozumi N, Ishii S, Shimizu Y, Watanabe T, Shimizu T. Mice deficient

in cytosolic phospholipase A2 are less susceptible to cerebral ischemia/reperfusion

injury. Acta Neurochir Suppl. 2003; 86:169-72.

90) Uozumi N, Shimizu T. Roles for cytosolic phospholipase A2alpha as revealed by

gene-targeted mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002; 68-69:59-69.

91) Westcott JY, Murphy RC, Stenmark K. Eicosanoids in human ventricular

cerebrospinal fluid following severe brain injury. Prostaglandins 1987; 34:877-87.

60

92) Mirro R, Armstead W, Busija D, Green R, Leffler C. Increasing ventilation pressure

increases cortical subarachnoid cerebrospinal fluid prostanoids in newborn pigs.

Pediatr Res 1987; 22:647–50.

93) Miettinen S, Fusco FR, Yrjanheikki J, Keinanen R, Hirvonen T, Roivainen R,

Narhi M, Hokfelt T, Koistinaho J. Spreading depression and focal brain ischemia

induce cyclooxygenase–2 in cortical neurons through Nmethyl- d-aspartic acid-

receptors and phospholipase A2. Proc Natl Acad Sci 1997; 94;6500–5.

94) Miwa M, Saura R, Hirata S, Hayashi Y, Mizuno K, Itoh H. Induction of apoptosis

in bovine articular chondrocyte by prostaglandin E(2) through cAMP-dependent

pathway. Osteoarthritis Cartilage 2000; 8:17–24.

95) Iadecola C, Niwa K, Nogawa S, Zhao X, Nagayama M, Araki E, Morham S, Ross

ME. Reduced susceptibility to ischemic brain injury and N-methyl-d-

aspartatemediated neurotoxicity in cyclooxygenase–2-deficient mice. Proc Natl Acad

Sci 2001; 98:1294–9.

96) Takadera T, Yumoto H, Tozuka Y, Ohyashiki T. Prostaglandin E (2) induces

caspase-dependent apoptosis in rat cortical cells. Neurosci Lett 2002; 317:61–4.

97) Fiebich BL, Schleicher S, Spleiss O, Czygan M, Hull M. Mechanisms of

prostaglandin E2-induced interleukin–6 release in astrocytes: possible involvement of

EP4-like receptors, p38 mitogen- activated protein kinase and protein kinase C. J

Neurochem 2001; 79:950–8.

98) Hewett SJ, Uliasz TF, Vidwans AS, Hewett JA. Cyclooxygenase–2 contributes to N-

methyl-D-aspartate-mediated neuronal cell death in primary cortical cell culture. J

Pharmacol Exp Ther 2000; 293:417–25.

98) Johnson AJ, Hsu AL, Lin HP, Song X, Chen CS. The cyclo-oxygenase–2 inhibitor

celecoxib perturbs intracellular calcium by inhibiting endoplasmic reticulum Ca2 -

ATPases: a plausible link with its anti-tumour effect and cardiovascular risks. Biochem

J 2002; 366:831–7.

99) Sasaki T, Nakagomi T, Kirino T, Tamura A, Noguchi M, Saito I, Takakura K.

Indomethacin ameliorates ischemic neuronal damage in the gerbil hippocampal CA1

sector. Stroke 1988; 19:1399-403.

100) Cole DJ, Patel PM, Reynolds L, Drummond JC, Marcantonio S. Temporary focal

cerebral ischemia in spontaneously hypertensive rats: The effect of ibuprofen on infarct

volume. J Pharmacol Exp Ther 1993; 266:1713-7.

101) Vannucci RC, Connor JR, Mauger DT, Palmer C, Smith MB, Towfighi J,

Vannucci SJ. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Journal of

Neuroscience Research 1999; 55:158-163.

61

102) Levine S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol 1960; 36:1-17.

103) Rice JED, Vanucci RRC, Brierly JB. The influence of immaturity on hypoxic-

ischemic brain damage in the rat. Ann. Neurol 1981; 9:131-41.

104 Miwa M, Saura R, Hirata S, Hayashi Y, Mizuno K, Itoh H. Induction of apoptosis

in bovine articular chondrocyte by prostaglandin E(2) through cAMP-dependent

pathway. Osteoarthritis Cartilage 2000; 8:17–24.

105) Li RC, Row BW, Gozal E, Kheirandish L, Fan Q, Brittian KR, Guo SZ,

Sachleben LR Jr, Gozal D. Cyclooxygenase 2 and intermittent hypoxia-induced

spatial deficits in the rat. Am J Respir Crit Care Med 2003; 168:469-75.

106) Lipper EG, Voorhies TM, Ross G, Vanucci RC, Auld PA. Early predictors of one-

year outcome for infants asphyxiated at birth, Dev Med Child Neurol 1986; 28:303-9.

107) Kondo F, Kondo Y, Gómez-Vargas M, Ogawa N. Indomethacin inhibits delayed

DNA fragmentation of hippocampal CA1 pyramidal neurons after transient forebrain

ischemia in gerbil. Brain Res 1998; 791: 352-6.

108) Takadera T, Ohyashiki T. Prostaglandin E2 deteriorates N-methyl-D-aspartate

receptor-mediated cytotoxicity possibly by activating EP2 receptors in cultured cortical

neurons. Life Sci 2006; 78:1878-83.

62

8. ÖZGEÇMĠġ

Adı Soyadı : Erdal TAġKIN

Doğum Tarihi ve Yeri : 02.04.1970/Elazığ

Medeni durumu : Evli

Adres : Sürsürü M. MithatpaĢa Bulvarı No:133/8

Elazığ

Telefon : 0 242 2411533

Fax : -

E-mail : drerdaltaskin@yahoo.com

Mezun Olduğu Tıp Fakültesi : Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi

Varsa Mezuniyet Derecesi : -

Görev Yerleri : Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve

Hastalıkları Anabilim Dalı Elazığ

Dernek Üyelikleri : Milli Pediatri Derneği

Alınan Burslar : -

Yabancı Dil(ler) : Ġngilizce

Diğer Hususlar : -