Retrovirus: HTLV

Infecciones Virales Transmisibles por Vía Transfusional: Hitos, Paradigmas, Aprendizajes. Fundación Hemocentro Buenos Aires

7 de Noviembre de 2013

• HTLV-1 (Gallo et al, 1979)

• Paciente con leucemia T del adulto

(ATL)

PRIMEROS RETROVIRUS HUMANOS

• HTLV-2 (Kalyanaraman et al, 1982)

• Paciente con leucemia de células vellosas

(Hairy cell leukemia)

Homología 65%

Familia: RetroviridaeSubfamilia: Oncovirinae

Virus: BLV (Bovine Leukemia Virus)HTLV (Human T cell Leukemia Virus)STLV (Simian T cell Leukemia Virus)

HTLV

• Sexual (60% hombre a mujer vs. 1% mujer a hombre)

• Perinatal

• 18-30% principalmente por lactancia (> 6m)

TRANSMISION

ALTAMENTE ASOCIADA A CÉLULAS

• 3% sin lactancia

• Transfusión de componentes sanguíneos celulares

(40-60%)

• Por compartir agujas contaminadas con sangre

infectada

• En órganos y tejidos para transplante

• Células Hematopoyéticas de sangre de cordón

TRANSMISION: Nuevas Pesquisas

umbilical para donación de BSCU

Nuevos Desafíos

�Detección en mujeres embarazadas

�Bancos de Leche y Lactarios

HTLV-1: Patología de la infección

• Leucemia/linfoma de células T del Adulto (ATL)

• ~ 5% de los individuos infectados, 20 y 40 años post-infección

• Linfocitosis T, linfopatía, hepatoesplenomegalia, hipercalcemia, lesiones cutáneas por infiltración leucémicalesiones cutáneas por infiltración leucémica

• Infección perinatal es un factor de riesgo importante

• Las células “flower” se asocian con un estado de alto riesgo

• Hombre: mujer: 1,4:1

Tulane Med Center

HTLV-1: Otras patologías asociadas

�Uveítis

�Dermatitis�Dermatitis

�Artropatías

HTLV-1: Patología de la infección

• Mielopatía asociada a HTLV-1 / Paraparesia

Espástica Tropical (HAM/TSP)

• Enfermedad neurodegenerativa

• 0.25-2 % de los infectados, 40 años• Lesiones neurológicas, inflamación crónica de la médula • Lesiones neurológicas, inflamación crónica de la médula espinal

• Progresiva debilidad de los miembros inferiores, espasticidad, distorsiones sensoriales, incontinencia

urinaria

• Desarrollo rápido asociado con transfusión sanguínea

• La infección en la edad adulta sería un factor de riesgo

• Hombre: mujer:1:3

HTLV-2

�Muy pocos casos asociados con leucemia a células vellosas�Se ha asociado a síndromes neurológicos similares a HAM/TSP�No se ha establecido su rol etiológico�No se ha establecido su rol etiológico

NUEVOS RETROVIRUS HUMANOS

• HTLV-3: varios aislamientos en pigmeos en África Central

• HTLV-4: 1 sólo aislamiento en África• HTLV-4: 1 sólo aislamiento en África

• Evidencias de transmisión simio-humano (cazadores)

• No hay datos de prevalencia en poblaciones o bancos de sangre ni sobre riesgo de transmisión o enfermedad

Características Epidemiológicas

���� Aumento de la seroprevalencia con la edad

Infancia 20-30a 60a

���� Mayor prevalencia en MUJERES (> 40 años)

Hombre/Mujer 4 > Mujer/Hombre

HTLV-1

• Sudoeste de Japón

• Caribe

• Parte de Oceanía (Nueva Guinea)

PREVALENCIA

• Parte de Oceanía (Nueva Guinea)

• África Central y Occidental

• Regiones de América del Sur (Brasil, Colombia, Argentina, Perú, Bolivia, Uruguay, Guyanas Francesas y Chile)

• Medio Oriente

PREVALENCIA

HTLV-2

• Poblaciones originarias de América (Panamá, Nuevo México, Florida y Brasil)

• Tribus pigmeas de África Central• Tribus pigmeas de África Central

• Usuarios de drogas inyectables (UDIs)

Distribución Mundial(15-20 x 106 de personas infectadas)

HTLV-1 endémico HTLV-2 endémico• HTLV-1 aislados • HTLV-2 aislados

HTLV y Bancos de Sangre

• Japón: 1986

• Estados Unidos y Caribe: 1989

Tamizaje de anticuerpos:

• Estados Unidos y Caribe: 1989

• Francia: 1991

• Países del Norte de Europa: 1993 y 1994

• Argentina 2002 (Ley Nacional 2005)

1989HTLV-I/II en UDIs en Ciudad de Bs As.(Libonatti et al)

HTLV-I/II en otros grupos de riesgo

(HSH, trabajadoras sexuales, hemofílicos)

Circulación de HTLV en Argentina

1992 HTLV-I/II en Bancos de Sangre Ciudad de Bs As (Bouzas et al)

1993-1999

HTLV-II en grupos de Tobas y Wichis (Chaco)

Alta prevalencia de HTLV-I en nativos de Jujuy con focos de HAM/TSP

Casos intrafamiliares y esporádicos de ATL y HAM/TSP en Bs As

Prevalencia en Argentina

HTLV-1: Región de alta prevalencia en el Noroeste (Jujuy, Salta, Formosa) ∼ 0.8%.

Región del centro ∼ 0.04 - 0.15%

HTLV-2: Poblaciones originarias del Norte (Salta, Formosa y Chaco (Tobas, Matacos, Wichis, Chorotes)

HTLV-1 y HTLV-2:

Grupos de riesgo: UDIs, HSH, trabajadoras sexualesCo-infección con HIV

Prevalencia de HTLV-1/-2 en donantes de sangre

• Caribe 0.2%

• Estados Unidos 0.016- 0.025%

• Grecia 0.02%

• Argentina: Bs. As 0.02-0.04%, Jujuy: 0.81%

• Reino Unido 0.005%• Reino Unido 0.005%

• Francia: 0.004%

• Holanda 0.002%

• España 0.002%

• Suecia 0.002%

• Alemania 0.001-0.004%

HTLV-1/-2 en Banco Público de Referencia Nacional de

Sangre de Cordón Umbilical (BSCU)

Prevalencia de HTLV-1 5/3786 (0.13%)

BSCU: Dras Gamba, Remesar, del Pozo, 2013

Diagnóstico de la Infección

Pruebas serológicas

�Aglutinación de partículas de gelatina

�Enzimoinmunoanálisis�Enzimoinmunoanálisis

�Inmunofluorescencia indirecta�Inmunoblotting (Western Blot)�Inmunoensayo en línea (LIA)

Pruebas serológicas confirmatorias

• WB preparados con lisados virales de HTLV-1 con el agregado deantígenos de envoltura recombinantes

• Agregado de glicoproteínas externas recombinantes propias deHTLV-1 y HTLV-2, que permite la diferenciaciónHTLV-1 y HTLV-2, que permite la diferenciación

• Desarrollo de la proteína env recombinante: GD21

Alto porcentaje de pruebas indeterminadas

p28

rgp46 I

rgp46 II

p36p32

Western blot

p28

GD21

p19

p24p26

InnoLia(Inmunoensayo en Línea,

InnoGenetics)

Western Blot

WB

NegativoPositivo Indeterminado Negativo

Informe:

Negativo

Positivo

Informe: HTLV-I

HTLV-II

HTLV-I/II

Indeterminado

Pruebas moleculares: PCR

• Son virus ARNss

• Tropismo por células T CD4+

• Infección persistente: � Integración no específica en el genoma (Provirus)

HTLV 1 y 2

� Integración no específica en el genoma (Provirus)

� Baja producción de virus libre

• Replicación viral ocurre con la división celular�baja tasa de replicación�alta fidelidad de transcripción

Alta Estabilidad Genética

• Complejo de 3 receptores ?

MODELO DE ENTRADA DE HTLV 1

Proteoglicanos de heparan sulfato (HSPGs)Neurofilina (NRP1)

Transportador de Glucosa (GLUT1)

Ghez et al, Retrovirology 2010

a) Cosmopolita Transcontinental (A)

Japonés (B)

Africano Occidental (C)

Africano del Norte (D)

Peruano de Origen Africano (E)

GENOTIPOS DEL HTLV-1

LTR

b) África Central

c) Melanesiad) Contiene aislamientos de Gabón y de Camerún

e) Aislado en un pigmeo Efe Mbuti del Congo

f) Aislado en un individuo en Gabón

g) Recientemente descripto en África Central

a) Cosmopolita

Transcontinental (HTLV-1aA): Caribe, Japón, África del Sur, Irán, Rusia…

Japonés (HTLV-1aB)

Africano Occidental (HTLV-1aC): África occidental y cuenca del Caribe

Africano del Norte (HTLV-1aD): Marruecos, Argelia y Mauritania

GENOTIPOS DEL HTLV-1

Peruano de Origen Africano (HTLV-1aE): Perú

En Argentina: HTLV-1aA (Jujuy y Ciudad de Buenos Aires)

Posibles hipótesis del origen del HTLV-1 en América del Sur

1) Origen Africano (siglo XVI al XIX):

*Alta prevalencia de acs anti HTLV-1 en población negra de África yde América del Sur. Similitud de secuencia de aa en el gen env

pero no en LTR.

*Aislamientos del Caribe tienen semejanza con los del Oeste deÁfrica

2) Origen Asiático: población de Mongoles introdujo el virus tanto aJapón hace 10000 años como al Nuevo Mundo por el estrecho deBering.

3) Origen Japonés: por migraciones recientes vía Océano Pacífico.

� HTLV-2A: América del Norte y UDIs Europeos y sus parejas sexuales

� HTLV-2B: Nativos americanos

GENOTIPOS DEL HTLV-2

� HTLV-2D:Tribu Africana: Mbuti Efe Pigmy

DESAFIOS

� Limitada información sobre la epidemiología y la historia natural de la infección por HTLV

� Limitado acceso a pruebas serodiagnósticas (confirmatorios) en varias areas(confirmatorios) en varias areas

� Desempeño de las pruebas diagnósticas� Alta proporción de resultados indeterminados

por tamizaje

Diagnóstico molecular y tipificación viral

MUESTRA: Sangre periférica anticoagulada con EDTA 10% (ADN extraído de PBMC)

METODOLOGIA:PCR –RFLP

PCR anidadaPCR en tiempo real

Tipificación del HTLV-1 y –2PCR-RFLP: tax

128pb

Sau 3A Taq 1α

TAX/REX

128pb

HTLV-2

104pb

24pb

HTLV -1

122pb69pb53pb

6pb 6pb

HTLV-2 HTLV-1

Tipificación del HTLV-1 y –2PCR anidada: pol

1ra RONDA

12P1/SK111

398bp HTLV-1/2

2da RONDA

2P3/1P1/12P5

318bp HTLV-1 (1P1/12P5)

161bp HTLV-2(2P3/12P5)

Human T Lymphotropic Virus Types I and II Proviral Sequences in Argentinian Blood Donors With Indeterminate

Western Blot Patterns.Mangano A, Remesar M, del Pozo A, Sen L. Journal of Medical Virology 2004

Población de estudio =106.791 DSPeríodo = 1993-2004

WB RR Prevalencia %

PCR

Total I + II+ Indet. Neg% Total I + II+ Indet. Neg

Indet. 112 0.102 52 1 1 3 (6%) 47 (90%)

I + * 32 0.030 18 18 0 0 0

II + ** 14 0.013 9 0 9 0 0

Neg 24 0.022 8 0 0 0 8

Total 182 0.170 87 19 10 3 55

* Indeterminado vs. HTLV-I, p=0.01; **Indeterminado vs. HTLV-II, p<0.001.

DESAFIOS

Algoritmos alternativos para confirmación diagnóstica ���� métodos de biología molecular

� no están disponibles para uso de rutinafalta de estandarización y control de calidad� falta de estandarización y control de calidad

� limitaciones operacionales: protocolos de PCR-anidadas. Actualmente disponibilidad de PCR en tiempo real

MARCADORES PRONÓSTICOS

� CARGA PROVIRAL (Taylor et al, 99)

� Expansión monoclonal de células infectadas � Expansión monoclonal de células infectadas T CD4+ (Takemoto et al, 94)

� Susceptibilidad Genética (Jeffery et al, 99)

Monitoreo de la infección:Cuantificación de la carga proviral de

HTLV-1 por PCR en tiempo real

� Transcripción reversa del ARN viral� Integración del ADN proviral en el LT

� Propagación de la infecciónexpansión clonal de los linfocitos infectados con

Características de la infección

expansión clonal de los linfocitos infectados con

expansión del ADN proviral

transferencia del genoma viral por contacto

directo entre célula infectada y no infectada

�Escasa producción viral Medición de carga proviral(CPV) en CMT

∼10 a más 100.000 copias /106 CMT

� Alta CPV factor de riesgo de progresión de enfermedad

� CPV de HTLV-1 es mayor en pacientes sintomáticos que

asintomáticos

�Altas CPV se asocia con mayor riesgo de HAM/TSP y ATL

Carga Proviral de HTLV

�Altas CPV se asocia con mayor riesgo de HAM/TSP y ATL

�Infecciones parasitarias o el tratamiento de infecciones

concurrentes como HIV que estimulan la proliferación

linfocitaria, producen un aumento de la expansión clonal y

mayores CPV

Identificación y cuantificación de HTLV por PCR en tiempo real

SYBR GREEN

Diluciones seriadas 1/10

Curva de Melting

Identificación y cuantificación de HTLV por PCR en tiempo real

Sondas Taqman

NUESTRA EXPERIENCIA EN EL

Monitoreo de la infección:Cuantificación de la carga proviral de

HTLV-1

NUESTRA EXPERIENCIA EN EL HOSPITAL GARRAHAN

SERVICIO DE HEMOTERAPIA

LABORATORIO DE RETROVIRUS

Desarrollo de un ensayo para la cuantificación de carga proviral de HTLV-1

# PCR en tiempo real, SYBR Green

# Cuantificación en CMT

# Amplificación en paralelo de un fragmento del gen pol

(318bp) y albúmina (81bp)

# Curva de calibración: línea celular MT-2 (2 copias de pol

por célula)

Carga proviral de HTLV-1: cuantificación por PCR en tiempo real

Albúmina

Pol

Límite de detección = 400 copias/106 CMT

Carga proviral Asintomáticos vs Sintomáticos

Los pacientes sintomáticos (n=10) presentaron cargas virales significativamente mayores (mediana=5.02 log10 copias/10

6 PBMCs,

IQR=4.70-5.30) que los asintomáticos (n=52; mediana=4.11 log10copies/106 PBMCs, IQR=3.55-4.66).

Carga proviral según síntomatología

Síntomaticos:5 HAM/TSP2 ATLL2 uveitis

Los pacientes con HAM/TSP presentaron cargas virales significativamente mayores (mediana=5.25 log10 copias/10

6 PBMCs)

que otros sintomáticos (mediana=4.04 log10 copies/106 PBMCs).

2 uveitis1 PG

2.5

5.0

7.5NorteCentro

Otros Países

CP

V H

TL

V-1

lo

g10

cop

ias/

106

CM

T

Carga proviral HTLV-1 según procedencia

North Center Other Country0.0

Asintomáticos

CP

V H

TL

V-1

lo

g

cop

ias/

10

En los individuos nacidos en el Norte la CPV fue significativamente

mayor (4.69 log10/106 CMT, IQR:4.43-5.00) comparados con los del

Centro (3.83 log10/106 CMT, IQR:2.63-3.84).

2.5

5.0

7.5C

PV

HT

LV

-1 l

og

10

cop

ias/

106

CM

T

Carga proviral y Sexo

Female Male0.0

2.5

CP

V H

TL

V-1

lo

g

cop

ias/

10

Femenino Masculino

# No encontramos diferencias significativas entre la CPV y el sexo o

edad de los individuos.

�La carga proviral de HTLV-1 se asoció con elfenotipo de la infección, siendo baja en lospacientes asintomáticos y alta en los sintomáticos,indicando que sería un marcador relevante del

Conclusiones

indicando que sería un marcador relevante deldesarrollo de la enfermedad.

� Se encontró una correlación entre la cargaproviral y el Norte de Argentina como lugar denacimiento.

REPORTE DE UN CASO

Hospital Garrahan

Hospital Roffo

Mangano et al , Retrovirology 2011

�Noviembre 2008. Pac. Masculino, 52 años con lesionesdérmicas nodulares.

� Refiere diagnóstico de infección por HTLV-1 luego de unadonación de sangre en 2005. Nació y vive en Buenos Aires.

� Biopsia de piel: Foliculitis y desarrollo de Trychophyton rubrum.

� Rto leucocitos= 48.000 céls/ml

� Artralgias. TAC cuello, tórax y abdomen= normal

� Derivado al Servicio de Infectología y Hematología� Derivado al Servicio de Infectología y Hematología

� Hto=42%, plaquetas 170.000/ml, calcio sérico= 9.6 mg/dl,álbumina= 4.2 g/dl, urea nitrogenada 31 mg/dl, creatinina= 1.29mg/dl y LDH= 769 IU/l. Otros tests dentro de los límitesnormales.

� Citometría de flujo de S.P.: 65% población linfocitaria con 52%clon anormal T positivo para CD3, CD25, CD4, CD5 y negativopara CD7, CD8, CD19, and CD56.

� Biopsia de M.O. 20% infiltración por linfocitos maduroscompatibles con ATL.

� Plan para iniciar INF alfa + AZT.

� Aumento de leucocitos a 111.000 céls./ml

� Inicia quimioterapia en Noviembre 2008 por 6 ciclos convincristina 2mg, doxorubicina 100mg, ciclofosfamida 1500 mg yprednisona 80mg día por 21 días, más GCSF.

� El pac. desarrolla diabetes y requiere insulina diariamente.

� Remisión completa de la leucemia y comienza en Mayo 2009con INF alfa 5 millones de unidades tres veces por semana +AZT 600 mg/día y profilaxis con TMS.AZT 600 mg/día y profilaxis con TMS.

� Luego de un año de terapia presenta alta CpV

� Cambio a INF PEG alfa 2B 120 µg por semana, tenofovir 300mg/día and lamivudina 300 mg/día.

� Junio 2011, continúa en remisión con elevada CpV

• Septiembre 2009 CpV= 5.5 log10 copies/106 PBMC.

• Diciembre 2009 (1 año en ARV) CpV= 5.3 log10 copies/106 PBMC.

• Agosto 2010 (4 meses con nuevo ARV), CpV= 5.45 Log10 copies/106 PBMC.

• Febrero 2011 CpV= 5.35 log10 copies/106 PBMC.

Conclusión:

Paciente con ATL en remisión luego de 3 años, con carga proviral de HTLV-1 persistentemente alta luego de 2 años en persistentemente alta luego de 2 años en

tratamiento ARV

Muchas gracias ...