hajdú angéla

1

Mágneses folyadékok előállítása és

stabilizálása fiziológiás körülmények között

orvos-biológiai felhasználás céljából

Hajdú Angéla

Nanokémia Laboratórium

Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

SOTE-ÁOK

2

• Folyadékban szétoszlatott mágneses részecskék, külső mágneses térrel manipulálhatók.

• Mágneses részecskék, gyakran vas-oxidok, mérete kicsi, néhány tíz nanométertől (10-9 m) néhány mikrométerig (10-6 m) terjed.

Mágneses folyadékok

Mágneses folyadék„God created space and the devil created

surface.”/Wolgang Pauli/

Magnetit (Fe3O4) (mágnesvaskő)

3

Feltételei:- Biokompatibilis, nem

mérgező- Kémiailag stabilak- Egységes méretűek- Vizes közegben ne

aggregálódjonStabilitás, egyedi részecskék

– adszorpciós réteg

trombózis veszély – rögképződés az érpályában

aggregáció

Orvosbiológiai felhasználás

A részecskék összetapadását meg kell akadályozni!

Intravénás bejuttatás vagy közvetlen a tumorba injektálni...

C. Alexiou et al.,JMMM, (2001)

4

Teranosztika

DiagnosztikaTerápia

Hipertermia

Borítás

Mágneses mag

Funkciós csoport

pl: ligand antitest, effektor molekula

Hatóanyag

Kontrasztanyag, festék +

Sun et al., Advanced Drug

Delivery Reviews, 2008

Célzott hatóanyag bejuttatás

MRI

5

Magnetit előállítása

FeCl2, FeCl3

lúgos hidrolízis

Fe3O4

Fe3-xO4

TEM

XRD

DLS

ATR-FTIR

6

Adszorpció magnetit felületén

n

Citrát(CA)

Na-oleát(NaOA)

Poliakrilát(PAA)

7

Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Tanszék, Szeged; Zupkó István

Mágneses folyadékok kölcsönhatása HeLa sejtekkel

MTT assay

NINCS citotoxikus hatás

5, 20, 100 g/ml

5, 20, 100 g/ml

A különféle hidrofil réteggel burkolt szuperparamágneses magnetit nanorészecskék proton relaxivitást csökkentő hatásának tesztelése MRI diagnosztikai céllal

MRI - H-NMR

Bruker MiniSpec Mq 20 (0,47 T) Bruker DRX 400 (9,47 T)

GE Excite HD (1,5 T)

Euromedic Diagnostic Kft, Szeged, Babos MagorKolloid- és Környezetkémiai Tanszék, Debrecen, Bányai István

9

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

0.0025

0.003

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Vas koncentráció, mg/L

R1,

ms

-1

Magnetit

r1 relaxivitás1,5 Tesla - MRI

20 oC

PAA-magnetit

NaOA-magnetit

CA- magnetit

Resovist

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0.5 mg Fe/L1 mg Fe/L 2.5 mg Fe/L 5 mg Fe/L7.5 mg Fe/L 10mg Fe/L

Jelinte

zità

s

TI, ms

0.6 mmol CA/g magnetit pH~7

Nö

vekv

ő

kon

cen

trác

ió

MRI-T1 (spin-rács) relaxációKülönböző

stabilizátorok

R1=1/T1


I = Io ( 1 – f e –TI / T1)

10

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0.6 mmol CA/g magnetit pH~7

0.5 mg Fe/L 1 mg Fe/L 2.5 mg Fe/L 5 mg Fe/L 7.5 mg Fe/L 10 mg Fe/L

Norm

aliza

lt J

elinte

nzi

tas

TE, ms

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Vas koncentráció, mg/L

R2,

ms

-1

Magnetit

r2 relaxivitiás1,5 Tesla - MRI

20 oCPAA-magnetit

CA-magnetit

NaOA-magnetit

Resovist

Nö

vekv

ő

kon

cen

trác

ió

MRI-T2 (spin-spin) relaxációKülönböző

stabilizátorok

R2=1/T2


I = Io e –TE / T2

11

r1, r2 relaxivitás térerősség függése

0.47 T, 25oC 1.5 T, 20oC 9.4 T, 25oC

r2 (mM-1s-1) r2 (mM-1s-1) r2 (mM-1s-1)Magnetit 297.9 429.5 301.8

NaOA-magnetit 176.4 240.2 138.9PAA-magnetit 186.5 232.4 154CA-magnetit 143.9 155.7 95.8

Gd-DTPA - 5.3 -Resovist 291.8 305.8 374.6

Minták

0.47 T, 25oC 1.5 T, 20oC 9.4 T, 25oC

r1 (mM-1s-1) r1 (mM-1s-1) r1 (mM-1s-1)Magnetit 27.8 8.9 0.5

NaOA-magnetit 4.5 1.1 0.2PAA-magnetit 17.7 3.9 0.5CA-magnetit 15.7 3.5 0.8

Gd-DTPA - 4.7 -Resovist 40 14.4 1.7

Minták

Minták r1 (mM-1s-1) r2 (mM-1s-1)Magnevist (1.0 T) 3.4 3.8

Resovist (0.94 T, 62 nm) 12 188MION (0.47 T) 3.7 6.5

PEG-ilált magneto-liposzóma (1.5 T, 40 nm)

3 240

Fehérjével borított magnetoferritin

(1.5 T, 25 oC, 12 nm)8 218

Lumirem (300 nm, 0.47T) 3.2 72

Bonnemain,1996, Yan et al.,2007, Weissleder et al.,1990

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Magnetit NaOA-magnetit

PAA-magnetit

CA -magnetit

Resovist

r1, m

M-1

s-1

0.47 T

1.5 T

9.4 T

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Magnetit NaOA-magnetit

PAA-magnetit

CA-magnetit

Resovist

r2, m

M-1

s-1

0.47 T1.5 T9.4 T

Gd-komplex: r1 = 4,7 mM-1s-1; r2 = 5,3 mM-1s-1

12

A mágneses folyadékok hipertermiás hatása

1MHz, 5,4 AC

H=3,3 kA/m

800 kHz, 5,4 AC

H=2,1 kA/m

Vízhűtés

OszcilloszkópGenerátor

ErősítőTekercsHőmérő

Mornet et al., 2004

42oC, 30 perc

a) Neél relaxációb) Brown relaxáció

Fizika Intézet, Veszprém, Szalai István

13

Nanorészecske-fehérje kölcsönhatás

M. A. Dobrovolskaia,S. E. McNeil, Nature, Nanotechnology, 2007 Walczyk et al., JACS, 2010

Soft coronaHard corona

14


Sun et al.,Advanced Drug Delivery Reviews, 2008Lynch et al., ACIS, 2007

Sejtmembránon átjutás:

1, fagocitózissal2, makropinocitózissal3, clathrin irányított endocitózissal4, caveolin irányított endocitózissal5, clathrin/caveolin független endocitózissal

M. A. Dobrovolskaia,S. E. McNeil, Nature, Nanotechnology, 2007

Mit lát a sejt?

Nanorészecskét

Fehérjét

15


Fehérje koncentráció

Só koncentráció

pH

10 % ; 55 % humán plazma10 % marha szérum albumin (sejt táptalaj)

10mM foszfát puffer + 100mM NaClsejt médium (só mellett növekedési faktorok…stb)pH= 7,5

Full corona Hard corona

A nanorészecskék szétoszlatása a biológai

médiumba, majd időprofil felvétele(0-24 h)

Nanorészecske + médium:1 h inkubáció 25oC

Felesleg eltávolítása:3 x centrifugálás, újra diszpergálás foszfát

pufferben

Időprofil felvétele (0-24 h)

Magnetit nanorészecskékStabilizátorok: citrát, poliakrilát, oleát

16


Részecskeméret meghatározás:

Hidrodinamikai átmérő

Aggregáció fokaFelületi töltés

RészecskeméretEloszlás

RészecskeméretFehérje réteg vastagsága

17


60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

0 5 10 15 20 25Time, h

<d

H>

, nm

CA coated magnetite0.1 mg/ml

0.6 mmol CA/ g magnetite

cMEM PDI: 0.26-0.23

PBS PDI: 0.15-0.16 in water PDI: 0.13-0.15

10 % hp full corona PDI: 0.28-0.3

55% hp hard corona PDI: 0.13

18

20

23

26

29

32

35

38

41

44

47

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time, h

<d

AP>

, nm

CA coated magnetite0.8 mg/ ml

pH~7.5

CPS8-24%sucrose

0.6 mmol CA/ g magnetite

cMEM

55% hp hard corona

10 % hp full corona

PBS

55% hp full corona


55% hp full corona:~5 nm55% hp hard corona: ~3.5-4 nm10% hp full corona: 1.5-3 nm

sűrűség

19


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300Particle size, nm

Pe

rce

nta

ge

of

pa

rtic

les

0.6 mmol CA / g magnetite

pH~6; 1g /mlNanosight

82 93

86

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Particle size, nm

Pe

rce

nta

ge

of

pa

rtic

les

0.6 mmol CA / g magnetite55% human plasma-hard corona in PBS

2 h1g/mlpH~7.5

98 100

20

SDS-PAGE

CA-MF OAOA-MFPAA-MF

55% 10%55% 10%55% 10%

25

50

40

30

8060

20

15

230150100

kDa

55-10% human plasma

21

SDS-PAGE

CA-MF OAOA-MFPAA-MF

10% cMEM 10% cMEM 10% cMEM

25

50

40

30

8060

20

15

230150100

kDa

CA-MF OAOA-MFPAA-MF

5 min 1 h 4 h 5 min 1 h 4 h 5 min 1 h 4 h

25

5040

30

80

20

15

230150100

kDa

60

Time dependent protein adsorption

Human plasma –Cell medium

MS analízise a fontosabb

feherjéknek

22

Magnetic Resonance Imaging

8.2

3.52.9

5.1

10.8

5.6

3.2

6.4

2.31.6

5.3

0

2

4

6

8

10

12

CA-MF-w

ater

CA-MF-P

BS

CA-MF-h

ard c

orona

CA-MF-fu

ll co

rona

PAA-MF-w

ater

PAA-MF-P

BS

PAA-MF-h

ard c

orona

PAA-MF-fu

ll co

rona

OAOA-MF-w

ater

OAOA-MF-h

ard c

orona

OAOA-MF-fu

ll co

rona

r1, m

M-1

s-1

r1, r2 relaxivities

289

133.8173

281.1

490

236.3202

377.4

170

95

195.2

0

100

200

300

400

500

CA-MF-w

ater

CA-MF-P

BS

CA-MF-h

ard c

orona

CA-MF-fu

ll co

rona

PAA-MF-w

ater

PAA-MF-P

BS

PAA-MF-h

ard c

orona

PAA-MF-fu

ll co

rona

OAOA-MF-w

ater

OAOA-MF-h

ard c

orona

OAOA-MF-fu

ll co

rona

r2, m

M-1

s-1

r1, mM-1s-1 r2, mM-1s-1r2 / r1

CA-MF-water 8.2 289 35.2CA-MF-PBS 3.5 133.8 38.2

CA-MF-hard corona 2.9 173 59.7CA-MF-full corona 5.1 281.1 55.1

PAA-MF-water 10.8 490 45.4PAA-MF-PBS 5.6 236.3 42.2

PAA-MF-hard corona 3.2 202 63.1PAA-MF-full corona 6.4 377.4 59.0

OAOA-MF-water 2.3 170 73.9OAOA-MF-hard corona 1.6 95 59.4OAOA-MF-full corona 5.3 195.2 36.8

Pluronic F127/OA-MNPs (71 nm) 0.311 (37oC) 71.3 (37oC) 229.3 (37oC)

Resovist (65 nm) 10.9 (37oC) 190 (37oC) 17.4 (37oC)

Protein coated-magnetoferritin(12 nm) 8 (37oC) 218 (37oC) 27.25 (37oC)

PVP grafted MNPs (~220 nm) 2.6 (25oC) 72.1 (25oC) 28.1 (25oC)

Yan et al., Radiography, 2007; Arsalani et al., Polymer Letter, 2010; Qin et al., Adv. Mater, 2007

23

Kiürülésük a szervezetből

• Fél-életidejük a vérben nagyon rövid – méretükkel szintén befolyásolható a

keringési idő

• A májban és a lépben halmozódnak fel:

RES sejtekKupffer sejtek

•Feltehetőleg a vörösvértestek szintézisébe kapcsolódik a mágneses folyadék vastartalma

• Letális dózis fél-érték meghatározása, nincs klinikai intolerancia vagy működési zavar

W. Möller et al.,JMMM (2005)

L.M.Lacava et al.,JMMM (2004)

24

SANS

hajdú angéla

Documents