hada c. macher manzano fea del servicio de...

Hada C. Macher ManzanoFEA del Servicio de Bioquímica Clínica delHospital Universitario Virgen del Rocío de

Sevilla

XXIII Reunión Científica SANAC Almería

� El ADN circulante es el que encontramos en plasma o suero, no unido a células, circulando por el torrente sanguíneo (cantidades muy bajas en individuos sanos)

� Se describe la existencia de ADN circulante por primera vez en 1948 (Mandel y Metais).

� Tanto el ADN como el ARN circulan libres de células en el torrente sanguíneo y son resistentes a las ADNasas y ARNasas endógenas.

� ADN estable en suero y plasma a 4ºC durante 24 h; más de un año si el plasma o suero es separado y congelado

� ARN estable en plasma a 4ºC durante 6 h (más estables los microRNAs circulantes).


• Presente en diversos compartimentos extracelulares (sangre, saliva, orina, sudor, liquido amniotico y fluido cerebroespinal)

• Secuencias circulantes espejo del genoma del individuo

libre de partículas

• ADNasociado a partículas

• Posibles fuentes del ADN extracelular Necrosis célular y de tejidosLiberación mediante apoptosis Liberación celular de exosomasRotura de células sanguíneasBacterias y virusTransposones y retro-transposones Liberación espontánea de virtosomas


� Liberación espontanea de un complejo de ADN/RNA lipoproteína sintetizado de novo

� La fracción protéica incluye ADN y ARN polimerasas dependientes de ADN

� Entra fácilmente en otras células, donde es capaz de modificar biológicamente a las células receptoras (alteraciones inmunológicas y transformación de células normales a células cancerosas).

� Tanto ADN como ARN están presentes en este complejo

� La liberación no causa perjuicio alguno para la célula

� La fracción lipoprotéica es recién sintetizada por la célula y no deriva de lipoproteínas de membrana


MATERNO POR DENNIS LODESCUBRIMIENTO DEL ADN FETAL CIRCULANTE EN EL PLASMA

MATERNO POR DENNIS LO

EN 1997 SE PRODUCE UN HITO EN EL USO DEL ADN CIRCULANTE, ES EL COMIENZO DE LA UTILIZACIÓN DEL ADN FETAL EN EL DIAGNOSTICO PRENATAL NO INVASIVO (Dennis Lo y cols, The Lancet, Vol 350, issue

9076; 16 August 1997,pp:485-487)


CARACTERÍSTICAS DEL ADN FETAL CIRCULANTE EN PLASMA MATERNO

•El ADN fetal que circula en el suero materno mide entre 100 y 300 pb. (En la gestante normalmente hay cadenas mayores de 500 pb y que llegan hasta 24 Kb de longitud).

•El ADN fetal constituye entre el 2,5-14% del ADN circulante materno según la edad gestacional.

•El ADN fetal se elimina de la sangre materna en su mayoría 1h tras el parto y como máximo a las 48h.

•Es detectable con técnicas de amplificación del ADN desde la sexta semana de gestación.

•El ARN fetal también ha demostrado su estabilidad en el plasma materno.


UTILIDAD DEL ADN CIRCULANTE EN EL DIAGNÓSTICO PRENATAL

Representación de las posibilidades de herencia fetal de ungen heterocigoto en el padre. Las cadenas rojasrepresentan el ADN de herencia paterna, las cadenasverdes el de herencia materna y la estrella es la diana deestudio genético (Lo y cols 2007)


APLICACIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS CIRCULANTES EN NIPD ANTES DEL 2010

Determinación Secuencia detectada Método de detección

Sexo fetal (determinación y

aplicación a desordenes

gestacionales)

SRY, DYS14, DYS1, DYZ1, DYZ3, DAZ,

ZFY.

PCR (convencional, anidada, a

tiempo real)

Grupos sanguíneos RHD, RHC, RHc, RHE, Kell. PCR (convencional, anidada, a

tiempo real)

Desordenes de un sólo gen HD, FGFR3, DMPK, CFTR, globina,

CYP21, MEN2A.

PCR (convencional, anidada, a

tiempo rea, HRM, Cold HRM),

Espectrometría de masas tras PCR .

Aneuploidias (trisomías 13,

18, 21)

SNPs, maspin, PLAC4 RNA, Cromosoma 21

locus.

PCR (a tiempo real, sensible a

metilaciones y/o espectrometría de

masas, PCR Digital)

Marcadores fetales

universales

Fetal RNA (PLAC4, GCM1, ZDHHC1,

PAPPA, PSG9, PLAC1, TFP12, KISS1)

RASSF1A, maspin. STRs, polimorfismos

inserción/delección bialélica , SNPs.

RT–PCR; microarray. Conversión

con bisulfito o PCR sensible a

metilaciones con espectrometría de

masas, PCR convencional, anidada)

Marcadores Universales de

ADN (Materno junto con

fetal)

GAPDH, CCR5, b-globina, b-actina, b-

gonadotrofina coriónica, albumina, ATL1.

PCR (convencional, anidada)


APLICACIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS CIRCULANTES EN NIPD: EVOLUCION HACIA LA SECUENCIACION MASIVA Y LA PCR

DIGITAL INSTAURANDOSE SU USO DESDE 2011XXIII Reunión Científica SANAC Almería

APLICACIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS CIRCULANTES EN NIPD: EVOLUCION HACIA LA SECUENCIACION MASIVA Y LA PCR

DIGITAL INSTAURANDOSE SU USO DESDE 2011

En secuenciación masiva se amplifican masivamente fragmentos de ADN de forma dirigida, o no, y posteriormente el análisis informático agrupa los amplicones en base a un “Blast” con el ADN conocido y detecta SNPs diferenciales entre la madre y el feto.


El diagnostico de aneuploidías se considera una prueba de cribado por laexistencia de falsos positivos descritos al existir una fracción de ADN fetalmenor del 4% en la circulación materna

* Cuando la gestante padece obesidad.(Ultrasound Obstet Gynecol 2013; 41: 26–32.G. ASHOOR et al)

* Cuando la fertilización ha sido in vitro.

La existencia de mosaicismos en la placenta también puede llevar a confusión

Las gestaciones gemelares o múltiples tienen menor sensibilidad de detecciónde aneuploidías

Se han descrito falsos positivos en los que la madre era la portadora de unaanomalía cromosómica que desconocía


•El NIPT ofrece una alta sensibilidad para el estudio de las aneuploidias 21,18 y 13, existiendo noobstante, falsos positivos por lo que recomiendan se oferte amniocentesis en estos casos. Norecomiendan aún otras alteraciones ofertadas en NIPT por distintas compañías de NGS.

•La gestante debe ser informada de las posibilidades y limitaciones del test, así como tener derecho ano saber más de lo que concierne a las aneuploidías 21, 18 y 13 aunque el test dilucide otrasposibilidades.

•Hay que diferenciar el tipo de información que se debe dar a la gestante que se hace el cribadoconvencional y a la que se le oferta el NIPT, los profesionales deben estar formados para el consejogenético.

•Reconocen la utilidad de estas técnicas en la práctica clínica pero no creen deba sustituir al cribadoclásico, de momento lo enfocan como contingencia de los casos de riesgo intermedio en el clásico.


Hasta el año 2015 se criticaba que los datos de eficiencia de las diferentes plataformas deNGS estaban sesgados porque solo se analizaba población en riesgo, actualmente esto se hasolventado con estudios en población normal


Ya proponen el NIPT comoprimera línea de cribado deaneuploidias cromosómicassustituyendo al clásicoSe identificarían un 15% más deaneuploidiasReduciría un 88% de técnicasinvasivasValorando los gastos debidos a laimprecisión del cribado clásico yla mayor precisión del NIPT elresultado es que se ahorrasuprimiendo el cribado clásico.


• Diagnostico del RHD fetal en plasmamaterno desde la semana 10 de gestaciónpara todas las gestantes RhD negativas

• Diagnóstico del sexo fetal desde la semana6 de gestación para toda gestante consíndrome Adreno-genital y posiblesherencias ligadas al cromosoma X.

• Diagnostico de la mutaciones puntualesheredadas del padre en casos concretos(MEN2A, HPA1A)


RESULTADOS DETERMINACIÓN RHD FETAL

En el Protocolo de Consenso entre Hematólogos y Ginecólogos para el diagnóstico y prevención de la enfermedad hemolítica del feto , esta prueba figura en primer lugar para valorar la compatibilidad en la gestante RhD negativa.Siendo una técnica rutinaria de diagnóstico en numerosos países desde el año 2000 hasta el presente, en el HUVR está en cartera de servicios desde el 2010 para todas las gestantes RhD negativas

PCRPCRPCRPCR MultiplexMultiplexMultiplexMultiplex deldeldeldel gengengengen SRYSRYSRYSRY yyyy dededede exonesexonesexonesexones 5555 yyyy 7777 deldeldeldel gengengengen RHDRHDRHDRHD conconconcon

ADNADNADNADN deldeldeldel plasmaplasmaplasmaplasma oooo suerosuerosuerosuero maternomaternomaternomaterno desdedesdedesdedesde semanasemanasemanasemana 10101010 dededede gestacióngestacióngestacióngestación

Negativo para el RHD y Negativo para el RHD y Negativo para el RHD y Negativo para el RHD y

positivo para el SRYpositivo para el SRYpositivo para el SRYpositivo para el SRY

Feto varón RHDFeto varón RHDFeto varón RHDFeto varón RHD----

Todos los genes positivosTodos los genes positivosTodos los genes positivosTodos los genes positivos

Feto varon RHD+Feto varon RHD+Feto varon RHD+Feto varon RHD+

Todos los genes Todos los genes Todos los genes Todos los genes

negativosnegativosnegativosnegativos

Posible hembra RHDPosible hembra RHDPosible hembra RHDPosible hembra RHD----

Positivo para RHD y negativo Positivo para RHD y negativo Positivo para RHD y negativo Positivo para RHD y negativo

para el SRYpara el SRYpara el SRYpara el SRY

Hembra RHD+Hembra RHD+Hembra RHD+Hembra RHD+

Los duplicados no concuerdan :Los duplicados no concuerdan :Los duplicados no concuerdan :Los duplicados no concuerdan :

no cocluyenteno cocluyenteno cocluyenteno cocluyente

Repetición de estudio del Repetición de estudio del Repetición de estudio del Repetición de estudio del

RHD junto a la betaRHD junto a la betaRHD junto a la betaRHD junto a la beta----globinaglobinaglobinaglobina


RESULTADOS DETERMINACIÓN RHD FETAL

En esta población las gestantes RhD negativas queportan niño negativo para el antígeno D suponen el38.7%. Dado que en esta ocasión determinamos docefalsos positivos, han sido un 38,4% de las gestantes lasque se han ahorrado la inmunoprofilaxis


RESULTADOS DETERMINACIÓN SEXO FETAL

La técnica no alcanza el 100% de sensibilidad y enel consejo genético se le ofrece a las pacientes laposibilidad de la amniocentesis antes de tomardecisiones a razón del sexo fetal


• Hoy en día el RHD y sexo fetales se pueden realizar en cualquier laboratorio que disponga de PCR a tiempo real, existiendo la posibilidad de automatización del proceso

• Las técnicas para la detección de mutaciones puntuales son altamente fiables si se dispone de PCR digital, aunque se pueden abordar con COLD PCR HRM

• La secuenciación masiva actualmente es una tecnología fiable para la detección de trisomías 21 y 18, así como bastante sensible para la detección de aneuploidías del cromosoma 13 y los cromosomas sexuales

• No obstante existen falsos positivos en el NIPT, por lo que se recomienda ofertar amniocentesis confirmatoria en casos de resultados positivos de aneuploidias por NIPT

•El NIPT demuestra ser costo-efectivo y sería importante plantearlo desde la sanidad pública

•Se recomienda ofertar el NIPT en el contexto del consejo genético


METODOS UTILIZADOS PARA EL NIPD DE MUTACIÓN PUNTUALCON HERENCIA AUTOSOMICA DOMINANTE DEL PADRE (MEN2A)

PARA LA REALIZACIÓN DE LA HRM SE USAN AGENTES INTERCALANTES DE ADN DETERCERA GENERACIÓN QUE PERMITEN DIFERENCIAR UNA SOLA BASE NITROGENADACAMBIADA RESPECTO AL CONTROL SANO CON DIFERENTE TEMPERATURA MELTING

Se determina la mutación C634Y por ser la mayoritaria en nuestra población con un amplicón de 135 pb.La HRM es tan fiable como la secuenciación para esta mutación en heterocigosis (100% de sensibilidad y especificidad para amplicones con menos de 400 pb)


DIAGNÓSTICO DE MEN2A MEDIANTE ESTUDIO DEL ADN CIRCULANTE EN SUERO CON HRM

A

B

Analisis de la HRM por el software del LC 480 para 23 pacientes con Sdr.MEN2A frente a 10 controles sanos (rojos) tras ser normalizadas las curvas defusión de la melting (A) y realizarse la derivada diferencial de la fluorescenciamediante la substracción del perfil control (difference plot) (B). El análisis porHRM muestra la una clara diferencia en la pendiente de la curva meltig de loscontroles sanos frente a todos los pacientes con la mutación C634Y.


METODOS

LA FAST COLD PCR SEGUIDA DE HRM SE REALIZA AÑADIENDO 20 CICLOS TRAS LOS 45DE LA PCR PARA LA HRM UTILIZADA EN DIAGNOSTICO SEROLÓGICO, PERO LOS 20 CICLOSADICIONALES TIENEN COMO TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIÓN 91ºC, QUE ES LA TMPARA NUESTRO AMPLICON FAVORECIENDO LA AMPLIFICACIÓN DEL PRODUCTO MUTADO

METODOS UTILIZADOS PARA EL NIPD DE MUTACIÓN PUNTUALCON HERENCIA AUTOSOMICA DOMINANTE DEL PADRE (MEN2A)


Diagnostico prenatal no invasivo por High Resolution Melting (HRM) COLD PCR de fetos con MEN2A es eficiente

Este resultado ofrece la posibilidad de abordar el diagnóstico prenatal noinvasivo, para una gestante sana que queda embarazada de un varón portadorde la mutación, dado que esta enfermedad es de herencia autosómicadominante, el 50% de los hijos son susceptibles de heredar la enfermedad.

Conventional HRM

COLD-PCR

50%

25%

10%

5%2,5%

50%, 25%, 20%, 10%

5%

2,5%

Pregnant

Pregnant


Diagnostico prenatal no invasivo por High Resolution Melting (HRM) COLD PCR de fetos con MEN2A secuenciacion de resultados

Secuenciación de los productos de la COLD PCR de un control positivo conMEN2A para la mutación C634Y (A), un control negativo sano (B), y de lagestante que posee el feto con la mutación C634Y heredada del padre (C).

Cys(TGC)

Tyr (TAC)


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