gtpáz aktivitás mérése gyakorlat
DESCRIPTION
GTPáz aktivitás mérése gyakorlat. Lévay Magdolna 2006.04.10. Rac. P. P. Rac - GDP. P. Rac - GDP. GAP. GDP. Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata. mosás. mosás. Módszer: GAP assay. GAP nélkül: lassú GTP-hidrolízis. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/1.jpg)
GTPáz aktivitás mérése gyakorlat
Lévay Magdolna
2006.04.10.
![Page 2: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/2.jpg)
Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata
Rac
GDPP
Rac- GDPP
Rac- GDP
P
GAP
![Page 3: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/3.jpg)
Módszer: GAP assay
mosás mosás
Beütésszám pl. 82800
GAP nélkül: lassú GTP-hidrolízis
GAP jelenlétében: gyors GTP-hidrolízis
Beütésszám pl. 8468
![Page 4: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/5.jpg)
Idő (min)
Feh
érj
éh
ez
kötö
tt
32P-G
TP (
%)
A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata I.:
Időbeli kinetika -mérés egy GAP koncentráció mellett különböző időpontokban (pl. 0,5, 10, 15 perc)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Rac
5ul GAP
![Page 6: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/6.jpg)
A GAP relatív mennyisége
kötö
tt
32P-G
TP (
%)
0
20
40
60
80
100
120
1 10 100
PS nélkül
PS
A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata II.:
Koncentrációfüggés -mérés egy adott időpontban (pl. 5. perc)
![Page 7: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/7.jpg)
Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata
PRac- GDP
GAP
2. Rac+ GAP Inkubálás→ 100 μl oldat az indításhoz
→ 5 min inkubálás
Rac- GDP
P
3. A reakció leállítása
→ 150μl 4oC Wash Buffer
→ nitrocelluóz korongra
→ mosás 5 ml Wash Bufferrel
1.b: GAP bemérése→ Wash Buffer + GAP
GAP
Rac
GDP
P
1.a: Rac + [32P]GTP→ inkubálás alacsony [Mg] mellett (10 min)
→ + 1μl 1 M MgCl2 (10 min, 4oC)
→ Assay buffer
![Page 8: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/8.jpg)
Az oldatok összeállítása• Rac töltése: 86μl nucleotide depletion buffer* 10μl 10 mg/ml BSA (bovine serum albumin) 1μl 10 mM ATP 1μl 10 mM DTT 1μl Rac (1-2 μg) 1μl [32P]GTP izotóp (25 μl= 10 MBq)
+1μl 1M MgCl2
• Assay buffer: 100μl 10 mg/ml BSA 10μl 10 mM ATP 10μl 10 mM DTT 2-8 ml→ 100 μl az indításhoz 10μl 10 mM GTP ad 1 ml Wash Buffer**
10 min inkubálás
szobahőm.
10 min inkubálás 4oC
![Page 9: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/9.jpg)
Oldatok *nucleotide depletion buffer:
50 mM HEPES, pH 7.4 50 mM NaCl 0.1 mM DTT 0.1 mM EGTA 5mM EDTA
**Wash Buffer:
25 mM HEPES, pH 7.5 50 mM NaCl 1 mM MgCl2
10 ml
1 l
![Page 10: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/10.jpg)
Beckman LS-5000TD Liquid SCINTILLATION COUNTER
![Page 11: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/11.jpg)
A mérés alapja:Cerenkov effektus
![Page 12: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/12.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás
![Page 13: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/14.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!
![Page 15: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/15.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk
![Page 16: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/16.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása
![Page 17: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/17.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás
![Page 18: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/18.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás• Ne zavarjuk meg az izotóp laborban
dolgozó munkatársunkat
![Page 19: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/19.jpg)
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás• Ne zavarjuk meg az izotóp laborban
dolgozó munkatársunkat• Sugárvédelem!
![Page 20: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/20.jpg)
Sugárvédelem
Az izotópot mindig plexiüveg mögött nyissuk ki!
Figyeljünk az izotópos hulladék elhelyezésére!
Dokumentáció
![Page 21: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/21.jpg)
Sugárvédelem
Lehetőleg plexiüveg mögött és kesztyűben dolgozzunk.
![Page 22: GTPáz aktivitás mérése gyakorlat](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081418/568136a7550346895d9e49f7/html5/thumbnails/22.jpg)
IrodalomSettleman J, Albright CF, Foster LC, Weinberg Association between GTPase activators for Rho and Ras families.
Nature. 1992 Sep 10;359(6391):153-4.
Molnar G, Dagher MC, Geiszt M, Settleman J, Ligeti E. Role of prenylation in the interaction of Rho-family small GTPases
with GTPase activating proteins.Biochemistry. 2001 Sep 4;40(35):10542-9.
Ligeti E, Dagher MC, Hernandez SE, Koleske AJ, Settleman J. Phospholipids can switch the GTPase substrate preference of a
GTPase-activating protein.J Biol Chem. 2004 Feb 13;279(7):5055-8. Epub 2003 Dec 29.
Moskwa P, Paclet MH, Dagher MC, Ligeti Autoinhibition of p50 Rho GTPase-activating protein (GAP) is
released by prenylated small GTPases.J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6716-20. Epub 2004 Dec 13.