Anna Sułek

Pracownia Molekularnych Podstaw Chorób Neurodegeneracyjnych

Zakład Genetyki, IPiN

Sformułował podstawowe prawa dziedziczenia,

przeprowadzając badania nad krzyżowaniem roślin,

głównie grochu zwyczajnego (Pisum sativum), których wyniki

ogłosił w 1865 roku na posiedzeniu lokalnego towarzystwa

naukowego w Brnie. W 1866 roku opublikował je drukiem w

artykule Badania nad mieszańcami roślin.

Jego odkrycia początkowo nie uzyskały rozgłosu i dopiero w

roku 1900 trzej uczeni Hugo de Vries, Carl Correns i Erich

Tschermak, niezależnie potwierdzili wyniki jego prac

1868 (1871) – Friedrich Miescher – nukleina (białko + inna nieznana

substancja)

1889 – Richard Altmann – oddzielenie białka i kw. nukleinowego

do 1929 – Phoebus Levene – ustalenie składu chemicznego kw.

nukleinowych

lata 1927-1943 – Fred Griffin, Oswald Avery – prace fizjologiczne na

bakteriach: DNA jako czynnik transformujący

1953 – J. Watson, F. Crick – podwójna helisa model struktury

wynikający z modelu sposób replikacji cząsteczek DNA

Podstawowe właściwości związku chemicznego - nośnika informacji

genetycznej:

- zdolność do wytwarzania w procesie replikacji kopii cząsteczek

- zdolność do kierowania syntezą i wyznaczania pierwszorzędowej

struktury białek

Nukleotyd – jednostka monomeryczna

Cukier – 2’deoksyryboza

Zasady azotowe:

– dwupierścieniowe puryny: adenina i guanina

- jednopierścieniowe pirymidyny: cytozyna i tymina

Grupy fosforanowe

Helisa DNA jest prawoskrętna

Puryna łączy się wyłącznie z

pirymidyną

Wiązania wodorowe stabilizują

dwuniciową helisę

RNA jest jednoniciowy

Cukier – ryboza

Zasada – uracyl

- Transportujący RNA

- Rybosomowy RNA

- Informacyjny RNA

Copyright © motifolio.com 6111192

Proces semikonserwatywny

Replikacja DNA zachodzi przed podziałem komórkowym

DNA ulega powieleniu w kierunku od 5’ końca do 3’ końca

Proces katalizują enzymy zwane polimerazami DNA

Mechanizmy korekcyjne – 1 nukleotyd na 5 miliardów jest wbudowywany

nieprawidłowo

Etapy replikacji

• Rozplecenie dwuniciowej helisy – helikaza, białka SSB tworzą bąble replikacyjne

• Inicjacja replikacji – starterowy odcinek RNA (prymaza)

• Synteza nici wiodącej i opóźnionej (fragmenty Okazaki)

W typowej komórce ssaków znajduje się 40-100 000 replikonów a każdy replikuje

40-200 kpz DNA. Jako pierwsze replikują się regiony aktywne transkrypcyjnie

Replication bubble

Local opening of DNA helix

RNA primer synthesis

New DNA chain starts

leading-strand synthesis

RNA primers start additional

New DNA chains

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Copyrigt ©

motifolio.com

Przepływ informacji genetycznej – ujęcie klasyczne

Jądro

komórkowe cytoplazma

Regulatorowe RNA

mRNA

białka DNA

Przepływ informacji genetycznej – ujęcie współczesne

Transkrypcja zachodzi od 5’ do 3’ końca z nici matrycowej (antysensownej)

INICJACJA – miejscem startu transkrypcji musi być początek genu –

sekwencja zasad promotora, przyłączenie polimeraz RNA

Polimeraza II transkrybuje geny kodujące białka, do przyłączenia

wymaga określonych sekwencji promotora np. kasety TATA oraz

czynników transkrypcyjnych np. TFIIA, TFIIB

Inne sekwencje zawarte w promotorze: CCAAAT, sekwencje

wzmacniające (enhancer), sekwencje wyciszające (silencer)

ELONGACJA – rozplatanie nici DNA na odcinku kilkunastu par zasad

Synteza RNA

TERMINACJA – lepiej poznana u Procaryota. Być może dysocjacja

jakiegoś czynnika transkrypcyjnego destabilizuje kompleks

transkrypcyjny

Splicing – usuwanie intronów z pre-mRNA, katalizowane przez snRNP

Blokowanie końca 5’ – capping,

Poliadenylacja – polimeraza poliA dołącza ciąg reszt adenylowych

Informacyjny RNA jest bezpośrednia matrycą do syntezy białka

Pierwsze dwa nukleotydy po stronie 5’ intronu to GT a ostanie po stronie 3’ to AG

• mRNA

• 31-40 rodzajów tRNA

• Mała podjednostka rybosomu

• Duża podjednostka rybosomu

• Czynniki elongacyjne

Inicjacja – wiązanie małej podjednostki rybosomowej w obrębie 5’ czapeczki,

pierwszy czytany kodon to AUG – kodon start, przyłączenie transferowego

tRNAfMet

Elongacja – przyłączenie dużej podjednostki rybosomowej

Miejsce P- miejsce peptydylowe, miejsce A – miejsce aminoacylowe

Terminacja – kodon STOP, czynnik eRF

Potranslacyjne modyfikacje:

• Przyłączanie grup chemicznych: metylacja, fosforylacja, acetylacja,

hydroksylacja, lipidy, oligosacharydy (glikozylacja)

• Rozcinanie łańcuchów polipeptydowych: usuwanie pojedynczych

aminokwasów, wewnętrznych fragmentów peptydowych, sekwencji

sygnałowej białek sekrecyjnych, rozcinanie na mniejsze peptydy

• Ok. 15% genów ulega ekspresji w pojedynczej komórce

• Regulacja ekspresji na poziomie transkrypcji odbywa się poprzez wiązanie

białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi

• Domena wiążąca DNA(np. palce cynkowe)

• Domena odpowiedzialna z a dimeryzację (np. zamek leucynowy)

• Domena transaktywująca (bogata np. w kwaśne aminokwasy)

• Regulacja ekspresji przez:

• Hormony

• Cytokiny

• Interferencja RNA – na poziomie potranskrypcyjnym

Cell cycle

Cell

Cycle

Chromosome

replication and

cell growth

Chromosome

separation

Cell

division

Copyright © motifolio.com 5111181

M

S

Comparison of Mitosis and Meiosis

Mitosis Meiosis Parent cell (before chromosome replication)

Chromosome

replication Chromosome

replication

2n = 4

Prophase

Duplicated

Chromosome

(2 sister chromatids)

Metaphase

Anaphase

Telophase

2n 2n

Daughter cells of mitosis

Chromosomes align

at the metaphase plate

Sister chromatids

separate during

anaphase

Prophase I

Metaphase I

Anaphase I

Telophase I

Meiosis I

Meiosis II

Tetrads align

at the metaphase plate

Daughter cells of meiosis II

n n n n

Sister

chromatids

Remain together

Homologous

chromosomes

separate

Sister

chromatids

separate

during

anaphase II

Tetrads formed by

synapsis of homologous

chromosomes

5111189

Struktura genomu człowieka

Geny – 1,5%

ok. 25 000

Sekwencje powtórzone

45%

Krótkie

SINES

mikrosatelity

Sekwencje

rozproszone

Sekwencje

tandemowe

Długie

LINES

minisatelity

Inne - 44%

GENOM JĄDROWY – 3 miliardy nukleotydów

GENOM MITOCHONDRIALNY – 15 tysięcy nukleotydów

Genom człowieka – 3 miliardy par zasad

20-23 tysięcy genów

23 chromosomy – 55-250 mln par zasad

Polimorfizmy – ok 10 mln – 1/300 par zasad

Rodziny genów:

wszystkie geny zlokalizowane w tym samym locus chromosomowym

(rodzina hormonów wzrostu – 5 genów, chromosom 17)

geny należące do rodziny w różnych loci – 5 genów rodziny aldolaz na

różnych chromosomach

Serie zespołów genów na różnych chromosomów – np. geny homeotyczne

Największą rodzinę u człowieka stanowi 737 genów kodujących

receptory rodopsynopodobne sprzężone z białkiem G – białka

identyfikujące specyficzne cząsteczki na zewnątrz komórki

Pseudogeny:

Zmutowane wersje genu wyjściowego

Pozagenowy DNA

Stanowi większość DNA genomowego

rozproszone sekwencje powtórzone (SINE, LINE)

zespoły sekwencji powtórzonych – satelitarne DNA

Chromatyna – DNA+białka

Heterochtomatyna – nieaktywna

Euchromatyna – aktywna

Poliploidia

Aneuploidia

Mozaikowatość

Aberracje chromosomowe

• aberracje liczbowe

• aberracje strukturalne

• Inne aberracje

Mutacje

• Mutacje punktowe

• Mutacje dynamiczne

Typ chromosomu Nr

chromosomu

Przybliżona częstość

występowania

AUTOSOMY

Zespół Patau

Zespół Edwardsa

Zespół Downa

13

18

21

1:15 000

1:5 000

1:600

CHROMOSOMY PŁCI

Zespół Turnera

Zespół Klinefeltera

Zespół potrójnego chromosomu X

X0

XXY

XXX

1:3 000 dziewczynek

1:700 chłopców

1:2 000

33% ogółu stwierdzanych aberracji

Najczęściej występujące objawy aberracji chromosomowych to:

• Opóźnienie rozwoju somatycznego

• Dysmorfia w budowie ciała

• Mnogie wady rozwojowe

• Niepełnosprawność intelektualna

Duplikacja jest zazwyczaj mniej groźna niż delecja - trisomie vs monosomie

Duplikacja w autosomach cięższa niż w chromosomach płci

Monosomie autosomów są letalne

Monosomia X jest zazwyczaj letalna

Aberracje zrównoważone – nie mają zazwyczaj wpływu na fenotyp (u

potomstwa inaczej)

Mutacja punktowa to zmiana jednego nukleotydu na inny (też delecje i insercje)

Tranzycja: pirymidyna na pirymidynę (C – T), puryny na purynę A – G

Transwersja:

• pirymidyna na purynę (T-A, T-G, C-A, C-G)

• Puryna na pirymidę (A-T, A-C, G-T, G-C)

Zmiana nukleotydu powodująca zmianę aminokwasu – missense

Zmiana nukleotydu powodująca utworzenie kodonu STOP – nonsense

Delecja/insercja powodująca zmianę ramki odczytu - frameshift

Zmienność mutacyjna jest

podstawą procesów ewolucyjnych

Gen to jednostka informacji, odpowiada określonemu segmentowi DNA,

kodującemu określoną sekwencję aminokwasów lub cząsteczki RNA

Wielkość genów jest różna i waha się od kilkudziesięciu do kilku milionów

par zasad

Białko kodowane przez gen Liczba

eksonów

Wielkość

genu bp

Wielkość

białka

Histon H1 1 585 195

Insulina 3 1430 51

Hydroksylaza fenyloalaninowa

13 90 000 451

CFTR (mukowiscydoza) 27 250 000 1480

Czynnik koagulacyjny VIII 26 189 000 26

Dystrofina 79 24 000 000 3685

Tityna (koneksyna) 363 280 000 38138

POJĘCIA:

fenotyp,

linia czysta,

dominacja

Krzyżówka jednocechowa

Stosunek 3:1

Częściowa lub niepełna dominacja

Allele letalne

Allele wielokrotne

Krzyżówka dwucechowa

Dwie niezależne cechy kodowane

przez dwa geny mające różny

charakter

Epistaza – geny kodujące szlak

biosyntetyczny

Jeśli dwa geny są sprzężone to ich

allele nie segregują niezależnie

Rekombinacja – proces, który prowadzi

do powstania nowych kombinacji

genetycznych w trakcie mejozy

Mutacje – dziedziczne zmiany w sekwencji DNA

Wierność replikacji jest wysoka – 1 błąd na 1010 par zasad

sprawdzanie i korekta przez egzonukleazę 3’-5’

funkcjonowanie aparatu naprawy

Mutageny fizyczne – promieniowanie jonizujące

Mutageny chemiczne – czynniki alkilujące, arylujące, kwas azotawy

Uszkodzenia DNA – chemiczna reaktywność z egzogennymi związkami może powodować zmiany w strukturze (oksydacja, alkilacja, związki addycyjne)

Zmiany letalne – zaburzenie replikacji i transkrypcji

Mutacje

GENOTYP – FENOTYP

Rodzaj i lokalizacja mutacji w danym genie (DMD/BMD)

Funkcja genu w zależności od tkanki (ch. Hirschsprunga/rdzeniasty rak tarczycy)

Kilka genów (stwardnienie guzowate, wielotorbielowatość nerek)

Cecha jednogenowa

Cecha oligo-, poligenowa

Środowisko Zmiany polimorficzne

Imprinting – piętnowanie genomowe

Monoalleliczna ekspresja genu – np. w przypadku chromosomów XY

Imprinting jest mechanizmem równoważącym dawkę genu

Mechanizm wyciszania alleli polega zazwyczaj na metylacji fragmentu DNA

Wzór metylacji jest specyficzny jest specyficzny dla komórek rozrodczych

(inny dla plemnika, inny dla komórki jajowej), po zapłodnieniu jest

wymazywany i nadawany na nowo.

Wzór metylacji jest tkankowo specyficzny a jego regulacja odgrywa rolę w

rozwoju osobniczym.

Charakter losowy: inaktywacja jednego chromosomu X

Charakter rodzicielski: uzależniony od matczynego bądź ojcowskiego pochodzenia

Brak ekspresji informacji genetycznej

pochodzenia ojcowskiego:

- Zespół Pradera-Willego

- Kociego krzyku

- Millera-Dickera

- Beckwitha-Wiedemanna

Brak ekspresji informacji genetycznej

pochodzenia matczynego:

- Zespół Angelmana

- Di George’a

- Zespół włosowo-nosowo-paliczkowy

CHOROBY GENETYCZNIE UWARUNKOWANE

• ZABURZENIA CHROMOSOMOWE

zmiany liczby

zmiany strukturalne

• CHOROBY JEDNOGENOWE (monogenowe)

zmiany w pojedynczych genach, różne sposoby dziedziczenia

• CHOROBY WIELOCZYNNIKOWE

wiele współdziałających genów, brak typowego mendlowskiego wzoru

dziedziczenia

Choroby dziedziczone w sposób autosomalny dominujący – przykłady

• Neurofibromatoza I

• Choroba Huntingtona

• Rodzinna hipercholesterolemia

*Cechy charakterystyczne dziedziczenia AD

*Objawy choroby ujawniają się bez względu na płeć

*Choroba ujawnia się u heterozygot

*Stan homozygotyczności zazwyczaj prowadzi do bardzo

ciężkiej postaci choroby

*Ryzyko ponownego urodzenia chorego dziecka wynosi 50%

*Zmienna ekspresja

*Niepełna penetracja

*Mozaikowość germinalna

Choroby dziedziczone w sposób autosomalny recesywny – przykłady

• Mukowiscydoza

• Talasemia

• Fenyloketonuria

*Cechy charakterystyczne dziedziczenia AR

*Objawy choroby ujawniają się bez względu na płeć

*Rodzice chorego dziecka są bezobjawowymi

nosicielami mutacji

*Ryzyko ponownego urodzenia chorego dziecka

wynosi 25%

*Duże prawdopodobieństwo pokrewieństwa

pomiędzy rodzicami

*Wszystkie dzieci osoby chorej są obligatoryjnymi

nosicielami mutacji

Choroby recesywnie sprzężone z płcią:

- Dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera

- Hemofilia A i B

- Daltonizm

- Zespół Kennedy’ego rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni

*Cechy charakterystyczne dla dziedziczenia AR

sprzężonego z płcią

*Chorują wyłącznie mężczyźni

*Kobiety nosicielki mutacji na X nie wykazują cech choroby

*Brak dziedziczenia z ojca na syna – wszyscy synowie chorego

ojca są zdrowi

*Wszystkie córki chorego ojca są nosicielkami mutacji

*Cechy charakterystyczne dla dziedziczenia AD

sprzężonego z płcią

*Chorują kobiety i mężczyźni

*U kobiet objawy choroby mogą być słabiej wyrażone

*Brak dziedziczenia z ojca na syna – wszyscy synowie chorego

ojca są zdrowi

*Wszystkie córki chorego ojca będą chore

*Chora kobieta ma 50% ryzyko, że jej potomstwo będzie chore

*Często choroby letalne dla płci męskiej

*Cechy charakterystyczne dziedziczenia mitochondrialnego

*Objawy choroby ujawniają się bez względu na płeć

*Choroby mitochondrialne przekazywane są wyłącznie w linii żeńskiej - chory ojciec nie przekazuje choroby

*Chora matka zawsze przekazuje mutację

*Specyficzność tkankowa

*Nasilanie się objawów z wiekiem

Zanik nerwów wzrokowych Lebera

Neuropatie, miopatie, encefalopatie

Genom mitochondrialny – 16 569 pz

W komórce jajowej znajduje się ok. 100 000 cząsteczek mtDNA

Ze względu na losową segregację mitochondrialnego DNA – duża

heterogenność objawów

Objawy kliniczne mogą dotyczyć wszystkich układów i narządów

Uważa się, że jeśli mutacje dotyczą genów kodujących tRNA (mutacje

punktowe) musi ich być 95% a w przypadku delecji – 60%

Wiele zaburzeń pojawia się dopiero w wieku dorosłym

Mutacja genu 12S rRNA + antybiotyki aminoglikozydowe - głuchota u dzieci

śr. wiek zach. 5 lat

Specyficzność tkankowa – na niedobory tlenu wrażliwe są najbardziej

komórki nerwowe, komórki mięśni szkieletowych i gruczołów

wydzielniczych.

Zjawisko heteroplazmii – nie we wszystkich chorobach, Zespół Lebera i

głuchota – 100% mutacji

Choroby, które wykazują rodzinne występowanie, ale ich rozkład

genetyczny nie wykazuje mendlowskiej segregacji cech

Choroby wieloczynnikowe = wiele genów + środowisko

Etiologia chorób kompleksowych może być oligenowa, poligenowa i

wieloczynnikowa

Cechy (choroby)wieloczynnikowe:

cechy jakościowe – cecha/brak cechy

cechy ilościowe – reprezentowane przez parametry mierzalne

(stężenie glukozy, wzrost)

Common disorders – wysoka częstość populacyjna

Choroby nowotworowe

Choroby psychiczne

Choroby układu krążenia

• Interakcja genotypu i środowiska

• Interakcje genów

• Wzory segregacji odbiegające od mendlowskich modeli

• Obecność alleli wielokrotnych

Brak homogenności badanych grup!

CYKRZYCA INSULINOZALEŻNA – IDDM1, IDMM2, locus DQ, inne

CHOROBA HIRSCHSPRUNGA – protoonkogen RET, endotelina i

receptor endoteliny receptor alfa dla glejopochodnego czynnika

neurotropowego, SOX 10, inne

ASTMA – geny kodujące

receptory o dużym i

małym powinowactwie

do IgE, interferonu

gamma, limfocytów T

(TCR); geny układu HLA;

zespołu interleukin,

czynników wzrostowych i

inne

Poradnictwo genetyczne

Diagnoza: fenotypowa, genotypowa, określenie

wielkości ryzyka

Ryzyko: uwzględnienie czynników

modyfikujących

penetracja

Mozaicyzm germinalny

imprinting

Populacyjne ryzyko: empiryczna częstość

występowania wady

Przykład zastosowania sekwencji mikrosatelitarnych w praktyce

• Jakość i wiarygodność

• Profesjonalna porada

• Dobrowolność

• Poufność

• Zakaz dyskryminacji

Prawo a testy genetyczne

Kraje obszaru niemieckojęzycznego: Austria, Szwajcaria, Niemcy –

Gendiagnostikgesetz 2009;

Portugalia, Francja, Szwecja, Norwegia, Hiszpania, Dania, Łotwa,

Estonia

POLSKA: ustawa o diagnostyce laboratoryjnej, o zawodzie lekarza i

dentysty, ustawa transplantacyjna, prawo farmaceutyczne, ustawa

o prawach pacjenta

2012 r. projekt ustawy – celem regulacji jest zwiększenie

wiarygodności i bezpieczeństwa badań genetycznych

Ustawa utknęła w Ministerstwie Zdrowia