g.p. microbiologia 4

8/20/2019 g.p. Microbiologia 4

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTAFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA

PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

IV CICLO

GUIA DE PRÁCTICA

DE

MICROBIOLOGIA MÉDICA


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UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

INDICE Página

Recomendaciones generales 3 Microscopia: estudio y manejo del microscopio 4 Métodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales 7 Coloración diferencial de Gram 9 Coloración diferencial de Ziehl-Neelsen 11 Coloración especial: coloración de Leishman y Vago 12 Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales 14 Siembra bacteriana. Medios de aislamiento 17

Metabolismo bacteriano 19 Pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiograma) 27 Reacción antígeno – anticuerpo: Aglutinación 29 Fagocitosis 31 Reacción de Precipitación 32 Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA 33 Preparación de Antígenos bacterianos 35 Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus 38 Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Género Streptococcus 40 Aislamiento e Identificación de cocos Gram negativos: Genero Neisseria 42 Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus 44

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: genero Listeria 46 Estudio microbiológico de la flora normal de la Secreción Bucofaríngea 48 Aislamiento e Identificación de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50Aislamiento e identificación de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium 52Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona 54Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56SerologíaAislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo 59Estudio e Identificación de Vibrio cholerae 62Estudio e Identificación del Genero Leptospira 64Estudio e Identificación de Bartonella 66Estudio e Identificación de Treponema – Prueba de VDRL ó RPR 67Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo 68Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. 71Estudio e Identificación de Hongos Ambientales 74Estudio e Identificación de Hongos Dermatofitos 78Estudio de Hongos Levaduriformes: Observación de cortes histopatológicos 81Estudio de Hongos Dimórficos: Observación de cortes histopatológicos 83ANEXOS: SEMINARIOS:Genética Microbiana e Ingeniería Genética 86Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunación 87

Antibióticos y quimioterápicos 88Enfermedades de transmisión sexual. SIDA 89Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 90


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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas llevando consigo la Guía de Prácticas,mandil, plumón indeleble para escribir sobre vidrio y lápices de colores.

2. No se podrá ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prácticas, para evitarcontaminaciones

3. Durante las prácticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posiblescontaminaciones.

4. Sobre la mesa de trabajo sólo deberán colocar su guía de práctica y su libreta de apuntes.5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodón, etc. al tacho de basura6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de práctica para evitar que

se tiñan la mesa de trabajo, ropa o manos.7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco.8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan

debidamente cerrados y en posición vertical para evitar que se derramen.9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en frascos de boca ancha con

desinfectante.10. Todos los cultivos que se preparen deberán incubarse, teniendo en cuenta las siguientes

anotaciones: Nombre o iniciales de los estudiantes Nombre del germen, número de mesa, turno y fecha de la siembra

Las placas deberán ser invertidas, a menos que el profesor de instruccionescontrarias Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillasLos alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37ºC

11. Al finalizar el trabajo:Limpiar con algodón los objetivos del microscopio

Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no

queden láminas sobre la platinaLimpiar la mesa de trabajoComprobar que la llave de gas este cerradaLavarse prolijamente las manos con jabón.

12. El Protocolo de cada práctica será controlado por el profesor al final de la práctica.

El Profesor Responsable del Curso


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ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA SIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

PRÁCTICA N° 1

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I. OBJETIVO

1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio

compuesto.2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.

II. MATERIALES

Microscopios Pipeta PasteurLáminas portaobjetos Plumón indeleble Laminillas cubreobjetos Papel lente Láminas coloreadas Tela de felpa(25 cm) Suero fisiológico Fibra de pelo y lana

III. PARTES DEL MICROSCOPIO Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:

PARTE MECANICA

Tubo portalentes y cremallera CondensadorTornillos macro y micrométrico Brazo y Pie Revolver CharnelaPlatina

PARTE OPTICA

Ocular Lentes de condensadorObjetivos DiafragmaEspejo

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.

3.

Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y losobjetivos de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.


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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 2

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES Y ESPECIALES.

INTRODUCCION

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados

colorantes ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de

metileno.C)

Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina(ácido).

En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul demetileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de loscolorantes derivados de la anilina.

Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul

de lactofenolB) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -

Neelsen.C)

Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celularescomo la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.

A. COLORACIONES SIMPLES

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de losmicroorganismos.

MATERIAL

Muestra con mezcla bacterianaLáminas portaobjetosLaminillas cubreobjetoAsa bacteriológica de Kolle en aro

Colorante Azul de metilenoColorante Tinta China

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Colorante Azul de lactofenolMechero de BunsenVarillas para coloraciónAceite de cedroXylol

Papel lenteMicroscopio de luz con objetivo de inmersión

COLORACIÓN AZUL DE METILENO:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos3. Lavar con agua y dejar secar4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto4. Observar con lente de menor y mayor aumento.

RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo

oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus

COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto4 Observar con lente de menor y mayor aumento

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul – celeste

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados

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B. COLORACIONES DIFERENCIALES

Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorantees llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la deZiehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente

COLORACION DE GRAM

Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gramnegativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el

peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas lamayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff

MATERIAL

Muestra con mezcla de bacterias

Solución fisiológica al 0.85%

Láminas portaobjetos

Asa bacteriológica de Kolle en aro

Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:

Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)Bicarbonato de sodioLugol (mordiente)

Alcohol- acetona (decolorante)Fucsina básica (colorante de contraste) Mechero de Bunsen

Varillas para coloración

Microscopio de luz con objetivo de inmersión

Aceite de cedro

Xylol

Papel lente

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PROCEDIMIENTO

1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación delfrotis.

2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el

centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, paraobtener una preparación en capa fina.3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la

llama débil del mechero de Bunsen.4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solución

de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta

que no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.

9.

Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS

Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas.

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PRACTICA N° 3

COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

INTRODUCCION Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenidode lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol-resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básicafenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a

penetrar en la célula y en esta forma resistir a la decoloración.

MATERIAL Láminas con frotices de bacilo tuberculoso

Set de coloración Ziehl-Neelsen:

Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)Alcohol ácido (alcohol etílico con 3% de HCl)Azul de metileno (colorante de contraste)

Mechero de alcohol

PROCEDIMIENTO 1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con elmechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento

por tres veces, evitando que hierva el colorante.2. Lavar con agua corriente.3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.4. Lavar con agua corriente5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.6. Lavar con agua corriente7. Secar y observar con lente de inmersión.

RESULTADO Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol resistentes setiñen de color azul.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

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PRACTICA N° 4

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

INTRODUCCION

Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad conlos colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de

microorganismos presentes en la sangre.

COLORACION DE LEISHMAN

Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología demicroorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.

MATERIALES

Frotis de sangre con Bartonella

Solución de colorante Leishman

Agua destilada tamponada

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos3.

Lavar con agua de caño y dejar secar4. Observar con objetivo de inmersión5. Anotar los resultados en el protocolo.

COLORACIÓN DE VAGO

Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por elmétodo de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.

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MATERIALES Lámina portaobjetos

Palito mondadientes


Set de coloración de Vago:Mercuro cromo al 2%Violeta de genciana

Asa de siembra en aro

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO 1. En una lamina colocar una gota de suero fisiológico al o.85%2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa

fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.

3.

Fijar el frotis al calor suave4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos5. Lavar con agua corriente6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos7. Lavar con agua corriente8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

RESULTADOS Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuroColoración de Vago: Observar Tr eponema phagadeni , espiroqueta que se encuentra formando

parte de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

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PRACTICA N° 5

MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES,

INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en mediosespeciales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestosnitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Según su utilización pueden ser:

simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales.

MATERIALES Goteros de vidrio

Probetas de 100 ml.

Trípodes con malla de Asbesto

Balones de 250 ml. Tubos de 16x150 mm

Tiras de Papel indicador de Ph Tubos de 13x100 mm Frasco con solución NaOH (N/10) Placas Petri Frasco con solución HCl (N/10) Frascos estériles Pinzas rectas Agua destilada Bagetas de vidrio Tubo con sangre citratada

Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Agua destilada 100 Ml Agua destilada 100 ml pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g

pH 7.0 - 7.4

Caldo peptonado Peptona 2.0 g Cloruro de sodio 1.0 g

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

6.0 gr. de Agar SS deshidratado.

6.5 gr. de Agar TSI.

2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons

2.1 gr. de Agar Urea.

1.7 gr. de Caldo MR VP

3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

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PREPARACION

I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter

al calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio esácido agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gotasolución de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121ºC por15 Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37ºC por 24 horas. Luego dejar enrefrigeración hasta su utilización.

2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia,luego agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOHó HCl. Luego envasar y esterilizar a 121ºC por 15 Minutos y controlar la esterilidad porincubación a 37ºC por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.

II.

MEDIOS ENRIQUECIDOS

1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejarenfriar hasta una temperatura de 45ºC y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir enPlacas Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo enrefrigeración hasta su utilización. El color normal del medio debe ser rojo cereza.

2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de80ºC hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y realizarcontrol de esterilidad y dejarlo después en refrigeración.

III. MEDIOS SELECTIVOS

3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hastasu completa disolución. Autoclavar a 121º C por 15 Minutos y repartir en placas estériles.

4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter alcalor hasta su completa disolución. Repartir luego en placas estériles. No necesita autoclavar.

IV. MEDIOS DIFERENCIALES

1. Para el Agar TSI (Hierro tres azúcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada,hervir hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar enautoclave a 121º C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado.El medio al final tendrá un color rojo naranja.

2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá un colorverde.

3.

Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucióny autoclavar. Después adicionar 5 ml de Solución de Urea al 40% esterilizada por filtración;

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mezclar homogéneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El mediotendrá un color amarillo.

4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de13x100mm y autoclavar a 121º C por 15 Min.

5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completadisolución y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121º C por 15 min., y dejarenfriar los tubos en plano inclinado.

PROTOCOLO

Realizar un cuadro indicando:

A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.

C. Materiales que usaron para la preparación.

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PRACTICA N° 6

SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

INTRODUCCION

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre unincremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a

las 24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo.Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominancultivos y el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por elcual se pone en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existenvarias técnicas de siembra, siendo las más usadas : La siembra por estría, por dispersión-agotamiento, por inoculación y por puntura.

Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:

FORMA : Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.ELEVACIÓN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.

BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.TAMAÑO : Diámetro en milímetros.CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.CROMOGENESIS : Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.

MATERIALES

Tubos con suero fisiológico estéril

Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo

Tubos de 16x150 con Agar nutritivo

Placas con Agar nutritivo

Placas con Agar Mac Conkey

Placas con Agar hipertónico de Chapman

PROCEDIMIENTO

A) TIPOS DE SIEMBRA

Tubos con Agar Sabouraud Tubos de 16x150 con medio hipertónico de

Chapman

Torundas estériles

Asas de siembra en aro y punta

Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana

sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.

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Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de lasuperficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45º ycontinuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.

Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con

ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.

Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana eintroducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo.

B) LECTURA:

Con la ayuda del profesor:1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de

cultivos sembrados.2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.

PROTOCOLO

METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA MEDIO DE CULTIVO SIEMBRA USADO

ESTRIA

DISPERSIONAGOTAMIENTO

PUNTURA

INOCULACIÓN

CARACTERISTICA OBSERVACION DE MEDIO DE CULTIVO DE LA COLONIA COLONIAS USADO

FORMA

ELEVACIÓN

BORDES

SUPERFICIE

TAMAÑO

CONSISTENCIA

CROMOGENESIS

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PRACTICA N° 7

METABOLISMO BACTERIANO

INTRODUCCION

La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de lascaracterísticas de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sinembargo, la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo anivel de género y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos

para cada especie y sirvan como marcadores de identificación.

En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de lacolonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicose indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductosespecíficos.

I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en unmedio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptorfinal de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización dehidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.

Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades deácidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible porel cambio de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas(CO2 e H

+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.

A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en lacapacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrógeno (H2S).El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH quees el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentesen este medio pueden ser fundamentalmente tres:1. Fermentación de glucosa únicamente.

2.

Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.3. No fermentación de carbohidratos.

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Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que sedetecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo haciaarriba del tubo.

El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales dehierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).

MATERIAL

Tubo con medio TSI en plano inclinado.

Cepas control: E. coli , S. aureus, Ps. Aeruginosa

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y

estríe la superficie del pico de flauta.2. Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo. 2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que

se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y lacantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinosgenerados por la utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados.

Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.

3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentación de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por loque el tubo permanece amarillo.

4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.

5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.

B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM ) 2.

La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característicavaliosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético,fórmico) a partir de glucosa.Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como paramantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo),

superando el sistema amortiguador del pH del medio.

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3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de laglucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil- metil-carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol.

La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la accióndel KOH y Oxígeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo laacción catalítica del Alfa naftol y Creatinina.

MATERIALES

Cepa bacteriana MR positivo y negativo

Cepa bacteriana VP positivo y negativo

Reactivo Rojo de metilo

Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)

Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella

PROCEDIMIENTO

1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo ynegativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C.

2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

1.

Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismonombre, cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.

2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15minutos. Es importante añadir los reactivos en el orden específico.Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo esobservada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora loscultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.

II.

ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

PRODUCCION DEL INDOL

Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre elaminoácido triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico yamoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando laaparición de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de

agregar una solución que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.

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MATERIALES

Cepa indol positivo y negativo.

Medio líquido peptonado y/o Medio SIM

Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido).

Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.

PROCEDIMIENTO

La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia deindol y constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en elmedio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambioalguno, siendo esta una prueba negativa.

III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familiaEnterobacteriaceae , las cuales pueden obtener energía por vía distinta de lafermentación de los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente decarbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee

para determinar esta característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituyeuno de los metabolitos del ciclo de Krebs.

PRINCIPIO

La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio concitrato con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato deSimmons)incluye citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato deamonio como única fuente de nitrógeno.Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal deamonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 enhidróxido de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul debromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).

MATERIALES Cepa control citrato positivo y negativo.

Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado

PROCEDIMIENTO 1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnivca de estría en cada tubo

la cepa citarto positiva y negativa.2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

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INTERPRETACION

Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado.

Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.

IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzimaureasa que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:

O║

NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH ═ (NH4)2 CO3 Ureasa

El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose unaalcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.

MATERIALES

Cepa patrón ureasa positiva y negativa ( E. col i , Proteus )

Medio Agar urea según Christensen

PROCEDIMIENTO

1.

Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocularen el fondo.

2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C

INTERPRETACION

Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo elmedio. Prueba negativa: El medio permanece del color original

V. PRUEBA DE LA CATALASA

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativasanaerobias.El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismooxidativo de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo.La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguientereacción:

2 H2O2 --------> 2 H2O + O2

La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa

negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).

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MATERIALES Cepas Control: S. aureus , Streptococcus ó Enterococcus Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%

Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que loseritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados

falsos positivos.

PRUEBA EN LÁMINA

a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de unacolonia bien aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio.

b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.d) Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.

PRECAUCIONES

1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, yaque puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultadode la prueba.

2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.

3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, encaso que ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar laacción. NO DEBE USARSE AGUA.

INTERPRETACION

Prueba cualitativa: La aparición rápida y prolongada de burbujas, de gas oefervescencia son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimasdiferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutasdurante 20- 30’, éstas no son catalasa positivas.

VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA

Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabónde la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formaciónde agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobiosfacultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o sonanaerobios estrictos.En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetilo tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados comúnmente oxidasa).

MATERIAL Cepa control: sembrada en Agar nutritivo

Reactivo de oxidasa

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PROCEDIMIENTO

1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los

discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa

INTERPRETACIÓN Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente unintenso color azul oscuro.

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)

Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no degases (CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).

Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la reacción producida en la superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pHdel medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidadal color purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada elfondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina

Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta

la glucosa: superficie purpura/fondo amarillo.b) Descarboxilación de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo

(superficie violeta/fondo amarillo).c) Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo. d) Producción de gas: ruptura del medio. e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA

Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustanciastóxicas que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agarsangre, produciendo la lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen puedenclasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.

MATERIALES Cepa bacterianaPlacas con Agar sangre de carnero

PROCEDIMIENTO

1.

Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre2. Incubar por 18 – 24 horas a 37° C

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INTERPRETACIÓN Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento delmedio debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado acompuestos del tipo de la biliverdina

Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zonaclara alrededor de la colonia

VIII. PROTOCOLO

PRUEBAS MEDIO DE REACTIVO Y /O LECTURA BIOQUÍMICAS CULTIVO INDICADOR

TSI (Fermentación-

H2S)

VP VOGES-

PROSKAUER

MR ROJO DE METILO

INDOL 0

CITRATO

CATALASA

UREASA

CITOCROMO OXIDASA

LIA (Agar Lisina

Hierro)

HEMOLISINA

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PRACTICA N° 8

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCION

Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de losantibióticos y quimioterapeúticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:

Método de dilución

Método de Difusión en Agar

OBJETIVOS 1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los

antibióticos.2. Interpretar los resultados del método utilizado.3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada.

DILUCION EN TUBO

Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo laconcentración inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe elcrecimiento “in vitro” bacteriano. Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o enmedio agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24horas, se puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimientomacroscópico bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.

DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)

Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o

quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste ensembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luegodiscos de papel filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24horas, se observan las zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad deantibiótico presente en el disco difiere para los distintos fármacos.

MATERIALES

Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya

Tubos con caldo nutritivo

Tubos con Agar semisólido

Tubos con cultivo bacteriano

Asas de siembra

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Torundas estériles

Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck).

Pinzas

Mecheros

PROCEDIMIENTO

1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembraruniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.

2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes

antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.4. Incubar a 37°C durante 24 horas.

LECTURA

a)

Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacterianoalrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco. b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si el

microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentesantimicrobianos utilizados.Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero

puede responder a dosis altas del antibiótico.La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su capacidadde difusión en el Agar.

c) Anotar e interpretar los resultados.

Antimicrobiano Código Resistente Sensible Antimicrobiano Código Resistente Sensible Gram negativo Gram positivo

Amikacina AK-MK ≤ 14 ≥17 Ac.nalidixico NA ≤ 21 ≥ 16 Amoxicilina + clavulanico AM ≤ 13 ≥ 18 Cefepima FEP ≤ 14 ≥ 18 Ampicilina AMP ≤ 13 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Cefalotina CFM ≤ 14 ≥18 Clindamicina CM-DA ≤ 14 ≥17 Cefotaxima CTX ≤ 14 ≥ 23 Cloranfeicol C ≤ 12 ≥18 Ceftazidima CAZ ≤ 14 ≥ 20 Eritromicina E ≤ 13 ≥18 Ceftriaxona CRO ≤ 13 ≥17 Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15 Cefuroxina RBA ≤ 14 ≥18 Nitrofurantoina FD ≤ 14 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Norfloxacin NOR ≤ 12 ≥17 Cloranfenicol C ≤ 12 ≥18 Oxacilina AO ≤ 10 ≥13

Gentamicina GM-GE ≤ 12

≥15

Penicilina P ≤ 19

≥20

Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Rifampicina RIF ≤ 16 ≥ 20 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19 Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Tobramicina NN ≤ 12 ≥15 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19

Vancomicina V ≤ 9 ≥12

PROTOCOLO Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prácticadesarrollada.

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PRACTICA N° 9

REACCION ANTIGENO – ANTICUERPO: AGLUTINACIÓN

La aglutinación es un fenómeno inmunológico producto de una reacción antígeno-anticuerpo enel que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamaño grande. Estas partículas

pueden ser bacterias, eritrocitos, partículas de látex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertasen forma natural o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino ymezclarse con antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac

observables a simple vista o con lentes de poco aumento.

AGLUTINACION BACTERIANA

Existen muchos métodos comúnmente empleados para demostrar la aglutinación bacteriana, unode los más simples es la aglutinación en lámina o prueba de Widal, que consiste en la mezcladel antígeno con el suero del paciente en una lámina. Esta técnica ofrece un método de muestreorápido para análisis de rutina.

MATERIALES Lámina para aglutinación ( láminas excavadas)

Antígeno bacteriano

Suero de paciente

Pipetas serológicas de 0.2 ml

Palitos mondadientes

PROCEDIMIENTO

1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una láminade vidrio excavada.

2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada gota de suero de un mismo paciente.

3.

Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.4. Hacer rotar suavemente la lámina por espacio de 2 a 3 minutos.

RESULTADO

La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable que tienden aagruparse en la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.

PROTOCOLO:

Realizar una aglutinación cualitativa y una cuantitativa

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Aglutinación cuantitativa

TUBOS

REACTIVOS 1 2 3 4 5

ANTISUERO 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005

ANTIGENO AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

TITULO 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320

RESULTADO:

Título del suero: ………………………………………………………….

Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en práctica

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PRACTICA N° 10

FAGOCITOSIS

La línea celular de defensa está íntimamente asociada con la línea humoral. La fagocitosis o elenglobamiento de partículas extrañas por ciertas células es un fenómeno no específico, pero seincrementa cuando intervienen anticuerpos específicos o complementos. Entre las célulasfagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos (monocitos libres). A estassustancias que demuestran habilidad para hacer a los antígenos más susceptibles a la fagocitosisse les llama OPSONINAS.

FAGOCITOSIS “IN VITRO” Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difíciles de realizar, en comparación con otras

pruebas serológicas, pero en ciertos sistemas es la única a ser utilizada. El antígeno y la sangretotal (conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego,muestras de estas mezclan se colorean.El índice fagocítico es el número promedio de partículas ingeridas por cada 100 Neutrófilos de lasangre.

MATERIAL Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o

Klebsiella Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sódica al

1%

Una jeringa de 5 ml con aguja N° 20

Pipetas Pasteur con perilla de jebe


PROCEDIMIENTO

Colorante Wright

Agua tamponada

Baño María a 37°C

Centrífuga

Gradilla

Microscopio con objetivo de inmersión

Aceite de cedro

1. Con la jeringa hipodérmica recolectar 5 ml de sangre venosa.2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.

3.

Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.4. Llevar los tubos a Baño María por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glóbulos blancos de

cada tubo.7. Realizar los frotices y colorear con Wright:

Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.

Añadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.

Después de 15 minutos, lavar con agua de caño.

Secar y observar con objetivo de inmersión.

RESULTADO Se observará la presencia de gérmenes intracelulares que han sido fagocitados.

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PRACTICA N° 11

REACCION DE PRECIPITACION

INTRODUCCION Es una reacción antígeno- anticuerpo, en el que el antígeno es de naturaleza soluble. Cuando semezcla un antígeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zonade equivalencia y visibles por lo general macroscópicamente. Las reacciones de precipitación

pueden realizarse en un gel como el Agar.

INMUNODIFUSION SIMPLE Llamada técnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentración de Inmunoglobulinas enel suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y sedeja gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antígeno,

procediéndose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observándose la formaciónde un halo circular de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración antigénica.

INMUNODIFUSION DOBLE Llamada también método de Ouchterloni, es útil para comparar antígenos, detectar anticuerpos

precipitantes, anticuerpos antinucleares y antígenos en enfermedades. En esta prueba se empleaAgar semi-sólido en portaobjetos, en el cual se efectúan perforaciones, los cuales se llenan conlos elementos reaccionantes (antígeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubación atemperatura ambiente, observamos la aparición de bandas de precipitación.

MATERIALES

Suero positive Placas Petri Antígeno Pipetas capilares

Láminas de vidrio con Agar noble al 1% Láminas preparadas y coloreadas

PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.2. Depositar en los orificios periféricos los antígenos a estudiar.3. Colocar las láminas en una cámara húmeda.

RESULTADO

Observar las bandas de precipitación que se forman:Identidad total : Las bandas de precipitación se unen. Identidad parcial : Se observa un espolón.

No identidad : Las bandas se cruzan.

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INMUNOELECTROFORESIS Es útil para la separación de las proteínas en un campo eléctrico, permitiendo medir e identificarcomponentes séricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.Resulta de la combinación de la electroforesis con la inmunodifusión. En una primera fase losantígenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su

movilidad en un campo eléctrico, luego de una corrida electroforética, se coloca el antisuero en unaespecie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las proteínas que han migrado. Luego deincubar, se forman bandas de precipitación frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.

PRACTICA N° 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA

INTRODUCCION

En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos para la detección de antígenosvirales como de anticuerpos específicos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).

Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacióno la prueba de Fijación de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).

Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinadautilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromogénicos, las que producen unareacción de color. Estas pruebas se conocen como “Análisis de Inmunoabsorbencia Ligada a Enzimas” (enzime- linked immunosorbent assay) ó ELISA.

La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no esnecesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran número de muestrassimultáneamente en forma rápida y automatizada.

PROCEDIMIENTO

Determinación de Anticuerpo en fase sólida

Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo ó perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el

anticuerpo específico antiviral o anticuerpo de captura.

Luego se añade la muestra clínica, si esta contiene antígeno viral se unirá al anticuerpo de captura Esta unión se detectará mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas más usadas son la

peroxidasa, fosfatasa alcalina ó biotina- aviclina.

Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antígeno.

Añadir el sustrato de la enzima.

Observar la presencia de color.

LECTURA

El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colorímetro o un

espectrofotómetro. A mayor cantidad de antígeno presente en la muestra, más intenso será el color observado.

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ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA

(Ensayo Inmunoenzimático para la detección de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficienciahumana HIV-1 grupo O y HIV-2)

PLACAS CON SUEROS

GLICO-PROTEINA + OBTENIDOS +

DEL VHI DE PACIENTE

CONTROL + INCUBAR 30 min a

37° CONTROL +

Absorber

CONTROL - LAVAR twin

salino CONTROL - 1/10

(5 veces)

CONTROL -

PACIENTE

PACIENTE

SECAR PACIENTE la placa

CONJUGADO

(Peroxidasa con Ig

G Antihumana) 5ulC/ pozo

+

INCUBAR

30 min

a 37°

LAVAR

twinsalino 1/10

SECAR

la placa

SUSTRATO A 20 ul.

Cromogénico (Ag-Ac color

celeste) SOLUCION

SUSTRATO B + DE

Buffer Peróxido PARADA Hidrogeno 100

ul

(tomado de Wiener lab.)

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MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 13

PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS

INTRODUCCION

Antígeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales,induce la formación de anticuerpos o la aparición de fenómenos de hipersensibilidad. "In vitro"y en presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo específico, dando

lugar a fenómenos perceptibles.

Los Antígenos más comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,hematíes, suero, etc.Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antígeno en dosis adecuadas ygeneralmente progresivas con las siguientes finalidades.1. Inducir en el hombre o en los animales, la formación de anticuerpos que los protejan contra

determinados procesos infecciosos. Este método conocido como vacunación confiereinmunidad adquirida activa.

2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales serán empleados en:a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, tétanos,

etc., en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente unainmunidad adquirida pasiva.

B) La tipificación de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas declasificación, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para lasShigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli .

I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS YFLAGELARES A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.

A. MATERIAL

Cultivo bacteriano en medio sólido y en desarrollo confluente

Cultivo bacteriano en medio líquido (caldo nutritivo)

Pipetas graduadas estériles de 5 cc.

Suero fisiológico estéril, repartido en frascos de 100 cc.

Embudos y gasa, estériles para filtrar

Acido fénico concentrado en tubos de 13x100 ml.

Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.

Pipetas de Pasteur, estériles

Escala de MacFarland (tubo Nº 3)

Pipetas graduadas de 1 ml. Tubos vacíos estériles de 16x150 ml.

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Algodón y Alcohol yodado

Agar nutritivo en placas y tubos

B. PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiológico estéril a los cultivos bacterianos presentados en medio sólido

2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar3. Filtrar a través de gasa estéril4. Separar la suspensión en cantidades iguales en dos tubos de 13x1005.

Para preparar el Antígeno somático "O", medir la cantidad de suspensión bacterianade uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar unaconcentración de 0.5%.Se puede así mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antígeno a laebullición durante dos horas, o tratándolo con alcohol absoluto.

6.

Para preparar el Antígeno flagelar "H", inactivar las fracciones somáticas en el otrotubo de suspensión bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar unaconcentración del 0.5%

7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108

gérmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. desuero fisiológico, gotas de cada uno de los antígenos concentrados hasta alcanzar unaturbidez similar al tubo Nº3 de la Escala de MacFarland.

Este es un Método turbidimétrico de cálculo bacteriano, que consiste en diluir el antígenoy apreciar la turbidez obtenida comparándola con la de los tubos patrones de un nefelómetro o determinándola con exactitud mediante un Espectrofotómetro.

El Nefelómetro más conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera: Preparar una solución de Cloruro de Bario al 1%Otra de Ácido sulfúrico al 1%.Colocar una serie de 10 tubos vacíos y estérilesAgregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:

TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cl2Ba 1%0.1 cc. 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 1% 9.9 cc. 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

Bacterias 3.0 x 6.0 x 9.0 x 1.2 x 1.5 x 1.8 x2.1 x 2.4 x

2.7 3.010 10 10 10 10 9 10 9 x x por cc. 10 10

109 10

9

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La unión de ambos reactivos químicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que alhomogenizarse da una turbidez que es más intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de

bario empleado. A cada tubo corresponde una concentración de gérmenes determinada, deacuerdo a lo señalado en el cuadro.

C. CONTROL DE ESTERILIDAD

Sembrar cada uno de los antígenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, conla finalidad de controlar su esterilidadRealizar la observación a las 18 ó 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.

Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la práctica.

D.

INOCULACION

1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc.,1.0cc., 1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antígeno, con intervalo de 4 a 5 días.

2. Realizar la sangría después de 4 días de la última inyección.

E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIÓN (DEMOSTRACION)

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ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA


PRACTICA Nº 14

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAMPOSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS

INTRODUCCION

Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y Grampositivos en loscultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como

patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forúnculos, abscesos,intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus , S. epidermidis y S. saprophyti cus , sólo dos tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S. aur eus produce una enzima llamada coagulasa.

MATERIALES

Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado

Placas Petri con Agar sangre (AS)

Tubos con Caldo plasma


Set de colorantes para Gram

Asa de platino en aro

Reactivo Catalasa

PROCEDIMIENTO:

1.

Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agarsangre, por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las

características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman(tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)

4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de unacolonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba dela coagulasa)

5. Realizar la prueba de la Catalasa.6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y

como indicador de pH el rojo de fenol7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina

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RESULTADOS:

1. Características macroscópicas de la muestra:2. Resultado de la coloración realizada

3.

Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus coagula el plasma.4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparición

de burbujas en las tres especies.5.

Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) deS. aureus y S. saprofi ticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.

6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofi ticus . S. epidermidis es

sensible y S. saprofi ticus resistente.

PROTOCOLO:

Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamaño de lacolonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras características que crea conveniente.

Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.

CEPAS MH AS COAGULASA CATALASA GRAM Característica BACTERIANAS o (Agar morfológica TRABAJADAS Manitol sangre)

salado

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PRACTICA Nº 15

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STREPTOCOCCUS

INTRODUCCION

El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de

Lancefield en los grupos A (S. pyogenes ); B (S. agalactiae ); C (Ej. S. equi ); D (Ej.Enterococos); G (S. canis ); H (S. sangui s ); K (S. salivarius ) y Streptococcus pneumoniae (no

pertenece a ningún grupo). Con la coloración de Gram se comportan como positivos adoptandoformas de cadenas. Algunos son patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte dela flora normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.

Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permitediferenciar algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta,los glóbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no lisados como sucedeen la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de underivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. Elgrupo de estreptococos alfa hemolíticos se denominan S. vir idans . La mayoría de Streptococcus

pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permitenla diferenciación de las especies de Streptococcus.

MATERIAL

Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI

Placas con Agar sangre de carnero

Torunda estéril y bajalengua

Tubos con Thioglicolato

Tubos con caldo Inulina

Discos de Bacitracina

Discos de Optochin

Solución de Desoxicolato al 2%

Tubo con ClNa al 6.5%


Set de colorantes de Gram- Kopeloff

Asas de Kolle, pinzas

Microscopio, aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produceturbidez o sedimento.

2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de dispersión y

agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lámina portaobjetosy colorear por Gram.

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3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el

disco de Optochin,4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%

7.

Realizar la prueba de la catalasa8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias de lisarse en presencia de sales biliares

LECTURA

1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S. pneumoniae son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.

2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a laBacitracina y S pneumoniae es sensible a la Optochina

3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de

Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se observa quelas colonias son lisadas (desaparecen)

4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el

efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% yácido tioglicolato que actúa como agente reductor disminuyendo aun más el potencial deoxido-reducción del medio.

6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D)7. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa

PROTOCOLO Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada

IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS

Metabo Desarro Lisis por Bilis SENSIBILIDAD CAMP Hidrólisis lismo llo en

ORGANISMO De de la NaCl Bacitra Opto Hipu Escu Inulina 6.5% Desoxi

cina chin rato lina colato Sodio - hemolíticos GRUPO A S R N N N N N N

S. pyogenes

GRUPO B R* R P P N N P* N S. agalactiae

GRUPO C, F, G R R N N N N N N

- hemolíticos GRUPO Viridans R* R N N N* N N N

S. pneumoniae R S N N N P N P*

S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reacción variable

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PRACTICA Nº 16

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA

INTRODUCCION

Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares, con loslados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies, entre éstasN. gonorrhoeae , y N. meningitidis , causan frecuentemente enfermedad significativa en elhombre. En muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con elcolorante azul de metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.

Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate,que le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y unatensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37°C y un pH de7.2 a 7.6.

Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otrosmicroorganismos morfológicamente similares.La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono:Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.

El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y ellaboratorio. Se debe considerar los siguientes aspectos:a) Recolección correcta de la muestra.

b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio.c) Selección del medio de cultivo apropiadod)

Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.

MATERIALES

Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria

Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria

Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram

Reactivo de Citocromo- oxidasa

Reactivo de catalasa



Set de coloración de Gram

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Colorante de Azul de metileno

Microscopio

Asas de siembra en aro y punta

Solución de alcohol yodado

Algodón y Xilol.

METODOLOGIA

1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas, circularesde bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas sicorresponden a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de borde entero,circulares, translúcidas o ligeramente opacas.

2.

Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos elcambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.

3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la

lámina control.4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul de

metileno.

PROTOCOLO

MEDIO DE CULTIVOCOLONIASTAMAÑOGRAM AZUL DE MUESTRA METILENO

AGAR THAYER MARTIN

AGAR CHOCOLATE

SECRECION ENDOCERVICAL

OXIDASA CATALASA

PRUEBAS BIOQUIMICAS

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PRACTICA Nº 17

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAMPOSITIVOS: GENERO BACILLUS

INTRODUCCION

El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas yque pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies causan enfermedadesen el hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como

"carbunco", otros como el B. cereus , B. subtil is , B. megaterium y B. mycoide s son saprofitas yse encuentran en el suelo, agua y aire.La especie patógena B. anthracis , causante del carbunco en los procesos patológicos se presentacomo un bacilo rectilíneo, Gram positivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los cultivos, lascolonias son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), seagrupan en largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.

MATERIALES

Placas Petri con Agar nutritivo

Placas Petri con Agar sangre

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con Agar semisólido

Tubos con gelatina

Láminas para frotices

Set de coloración de Gram

Set de coloración de Hiss para cápsula

Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas

Asa de Kolle

PROCEDIMIENTO

1.

Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.

COLORACION HISS (PARA CAPSULA)

1) Preparar un frotis2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%. 4) Lavar con agua corriente y secar5) Observar al microscopio con lente de inmersión

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COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)

1) Preparar un frotis2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos

(adicionar colorante cada vez que falte)

3)

Lavar con agua corriente4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto5) Lavar y secar6) Observar al microscopio con lente de inmersión

LECTURA:

EN LOS CULTIVOS En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies

patógenas y ß- hemolíticas en las especies saprofitas.En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados

En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pinoinvertido En Gelatina: sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.

EN LAS LAMINAS COLOREADAS

Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el centro del bacilo.

Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o incoloro. Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.

RESULTADOS

A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

GENERO BACILLUS

ESPECIE PATÓGENA ESPECIE SAPROFITA

Caldo nutritivo

Agar nutritivo

Agar sangre

Agar semisólido

Hemolisis

Hidrólisis de la gelatina

Prueba de la Catalasa

Fermentación salicina

Movilidad

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ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA


PRACTICA Nº 18

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO LISTERIA

INTRODUCCION

El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V óde Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposición, en el suelo,en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre. El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces,desarrolla bien en medios de cultivo comunes.

MATERIAL

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con medios semisólidos (Motilidad)

Placas Petri con Agar sangre

Placas Petri con Agar nutritivo

Tubos de 13x100 con:

Agar urea de Christensen

Citrato de Simmons

Caldo rojo de fenol con glucosa

Caldo rojo de fenol con sacarosa

Caldo rojo de fenol con lactosa

Caldo rojo de fenol con manita

Caldo rojo de fenol con salicina

Caldo esculina

Caldo:

MR-

VP

PROCEDIMIENTO

1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.

2.

Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lámina ylaminilla.

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3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los

diferentes medios diferenciales4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.

LECTURA

FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.

LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos.

EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.

EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.

EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar

MOVILIDAD + GLUCOSA + MR +

HEMOLISINA + SACAROSA - VP +

CATALASA + LACTOSA -

OXIDASA - MANITA -

UREA - SALICINA +

CITRATO - ESCULINA +

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PRACTICA Nº 19

"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION BUCOFARINGEA”

INTRODUCCION

La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de

forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momentodependen de la edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinarla flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados;ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en sutracto gastrointestinal, en los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos

presentan un gran desarrollo de levaduras.La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacteriasanaerobias.La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gramnegativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patógenas como Streptococcus pneumoniae , Neisseria meningitidis , S. pyogenes , Klebsiella pneumoniae y Haemophilusinfluenzae .

MATERIALES

Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)Agar nutritivo en placas

Agar sangre en placasAgar chocolate en placasMedio hipertónico de Chapman en placasAgar Mac Conkey en placasAgar Sabouraud en tubosTorundas estériles (2 x tubo)Baja lenguaAsa de Kolle en aroLaminas portaobjetosSet de colorante Gram

Varillas para coloración

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PROCEDIMIENTO

A. PRIMER DIA

1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37ºC

B. SEGUNDO DIA

LECTURA

Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado enlos medios de cultivos.

IDENTIFICACION

Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioquímico correspondiente y pruebas de patogenicidad si se requiere.

Caldo plasma en tubo- Disco de Bacitracina- Disco de Optochin- Reactivo de Citocromo- oxidasa-

Reactivo de catalasa

PROTOCOLO

El alumno realizará un cuadro estadístico con los resultados obtenidos.

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PRACTICA Nº 20

AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL- RESISTENTES

GENERO MYCOBACTERIUM.

INTRODUCCION

Este género esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología bacilar, poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan lentamenteen los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.

Existen especies patógenas para el hombre y los

g.p. microbiologia 4

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