Comparison of YopE and YopT activities in counteracting host signalling responses to Yersinia pseudotuberculosis infection

Gloria I. Viboud, Edison Mejía and James B. BliskaDepartment of Molecular Genetics and Microbiology,Center for Infectious Diseases, School of Medicine, StateUniversity of New York at Stony Brook, Stony Brook, NY11794-5222, USA.

BGN famille des entérobactériesBGN famille des entérobactéries

3 espèces pathogènes chez l’homme3 espèces pathogènes chez l’homme Y. pestisY. pestis : agent de la peste : agent de la peste

Forme buboniqueForme bubonique Forme pulmonaireForme pulmonaire

Y. pseudotuberculosis et enterocoliticaY. pseudotuberculosis et enterocolitica O:3, O:9, O:8, O:5 O:3, O:9, O:8, O:5 Gastro-entérite avec adénolymphiteGastro-entérite avec adénolymphite Formes septicémiquesFormes septicémiques Manifestations auto-immunes (erythème noueux, arthrites réactionnelles, Manifestations auto-immunes (erythème noueux, arthrites réactionnelles,

etc…)etc…)

Système de sécrétion de type III en communSystème de sécrétion de type III en commun Protéines de structures : seringue moléculaireProtéines de structures : seringue moléculaire Protéines de translocationsProtéines de translocations Toxines et effecteursToxines et effecteurs

Plasmide de 70-75 kb en communPlasmide de 70-75 kb en commun Adhésines / Invasines (YadA)Adhésines / Invasines (YadA) Protéines antiphagocytaires (Yop)Protéines antiphagocytaires (Yop) Protéines de régulation (Lcr)Protéines de régulation (Lcr)

Les YersinesLes Yersines

6 effecteurs ciblant des molécules de signal6 effecteurs ciblant des molécules de signal YopE, YopH, YopO et YopT : antiphagocytaire + AIYopE, YopH, YopO et YopT : antiphagocytaire + AI YopJ : AI en inactivant voies MAPK et NFYopJ : AI en inactivant voies MAPK et NFκκBB YopMYopM

YopB et YopDYopB et YopD Propriétés de formation de pores dans les membranesPropriétés de formation de pores dans les membranes Canal de translocationCanal de translocation

Infection de cellules en culturesInfection de cellules en cultures Multi-Yops mutants : poreMulti-Yops mutants : pore WT : pas de formation de poreWT : pas de formation de pore

Occupation des canauxOccupation des canaux Action sur voies de signal requisesAction sur voies de signal requises

Pré-requis et ContextePré-requis et Contexte

Nombreux effecteurs SST3 agissent sur une famille de GTPasesNombreux effecteurs SST3 agissent sur une famille de GTPases

Cibles des effecteursCibles des effecteurs

GTPase-GDP

OFF

GTPase-GTP

ONREG

Guanine nucleotide exchange factors (GEFs)

GTPase-accelerating proteins (GAPs)

Guanine nucleotide dissociation inhibitors

(GDIs)

(Prénylation post traduc)

Famille de GTPases Rho Activation voies MAPK et NFκB

Production IL-8

YopEYopTCystéine protéase

YopE et YopT inactivent RhoA,Rac1 et Cdc42YopE et YopT inactivent RhoA,Rac1 et Cdc42 Spécificité de substrat influencée par cellule hôteSpécificité de substrat influencée par cellule hôte

Infection HeLa par mutant multi-YopInfection HeLa par mutant multi-Yop Formation de poresFormation de pores Production massive d’IL-8Production massive d’IL-8 Expression de YopE ou YopT annulent ces effetsExpression de YopE ou YopT annulent ces effets

YopT pas exprimé dans certaines souches virulentes de YopT pas exprimé dans certaines souches virulentes de Y. Y. pseudotuberculosispseudotuberculosis

Formation de pores et IL-8 par activation GTPasesYopE et YopT inactivent ces GTPases

Rôles respectifs de YopE et YopT ?

Redondance ?

Recherche de YopT sécrété par immunoblottingRecherche de YopT sécrété par immunoblotting

Recherche de l’expression de YopTRecherche de l’expression de YopT

YPIII : souche n’exprimant pas YopTYPIII : souche n’exprimant pas YopTDélétion de 1791 pbDélétion de 1791 pb

Retrouvée par PCRdans IP2666 et YP126Retrouvée par PCRdans IP2666 et YP126

Comparaison des plasmides de virulence pYVComparaison des plasmides de virulence pYV

yopT sycT yopM

YPIII U18804 gtggaaacag----------//----------ggatttgaaaIP32953 NC_006153 gtggaaacagcactgtcaca//aacgcttcagggatttgaaa

29513 34884

3142429634

M1T1 T3

44 45yopT sycT yopM

YPIII U18804 gtggaaacag----------//----------ggatttgaaaIP32953 NC_006153 gtggaaacagcactgtcaca//aacgcttcagggatttgaaa

29513 34884

3142429634

M1T1 T3

44 45

IP2666 YopT- : virulente chez la sourisIP2666 YopT- : virulente chez la sourisRôle respectif par construction de souches isogéniques Rôle respectif par construction de souches isogéniques dérivées de IP2666dérivées de IP2666

YopEYopE- - TT--

YopEYopE- - TT++

YopEYopE++ T T--

YopEYopE++ T T++

Insertion d’un plasmide contenant Insertion d’un plasmide contenant yopT-sycTyopT-sycT ou ou yopE yopE dans le dans le mutant IP6 YopEmutant IP6 YopE--TT--

Test de virulenceTest de virulence

Inoculation Inoculation à la sourisà la souris

P=0,95

P=0,0047

P=0,75

P=0,05

Construction des souches dérivées de YP27 YopEConstruction des souches dérivées de YP27 YopE--HH--JJ--TT--

YP27/vecteurYP27/vecteur YP27/pPEYopEYP27/pPEYopE YP27/pPTYopTYP27/pPTYopT

Culture sur tapis de cellules HeLaCulture sur tapis de cellules HeLa

Effet antiphagocytaireEffet antiphagocytaire

Test de protection à la gentamycine

Test par double IF après perméation

Construction des souches dérivées de YP27 YopEConstruction des souches dérivées de YP27 YopE--HH--JJ--TT--

YP27/vecteurYP27/vecteur YP27/pPEYopEYP27/pPEYopE YP27/pPTYopTYP27/pPTYopT

Mesure de l’IL-8 par ELISA sur le surnageant de culture de HeLaMesure de l’IL-8 par ELISA sur le surnageant de culture de HeLa

Production d’IL-8Production d’IL-8

Production d’IL-8 stimulée par deux voiesProduction d’IL-8 stimulée par deux voies Voie des MAPKsVoie des MAPKs Voie du NFVoie du NFκκBB

Rac1 connu pour activerRac1 connu pour activer Les MAPKs JNK et p38Les MAPKs JNK et p38 La voe du NFLa voe du NFκκBB

Voie ERK sous dépendance de RasVoie ERK sous dépendance de Ras

Voies de transduction du signal mises en jeuVoies de transduction du signal mises en jeu

Mesure de l’activité respective de YopT et YopE

Mesure de l’inactivation des MAPKs JNK, ERK et p38

Activité de la voie NFκB par mesure de IκBα

Formation de pores sur HeLa par mutants multi-Yops Formation de pores sur HeLa par mutants multi-Yops inhibée par surexpression de YopT et YopEinhibée par surexpression de YopT et YopE

Comparaison de l’activité : Comparaison de l’activité : utilisation de mutant Yop utilisation de mutant Yop contrôlé par promoteur naturelcontrôlé par promoteur naturel

Inhibition de la formation de poresInhibition de la formation de pores

Test d’incorporation d’EtBr / Acridine OrangeTest d’incorporation d’EtBr / Acridine Orange

Etude des profils de sécrétion des différents sérogroupesEtude des profils de sécrétion des différents sérogroupes 2 souches O:3 YopT- (YP126 et IP2666)2 souches O:3 YopT- (YP126 et IP2666) PCR : même délétion dans pYVPCR : même délétion dans pYV Analyse de séquences supplémentaires nécessaireAnalyse de séquences supplémentaires nécessaire

Etude de la virulence des mutants YopTEtude de la virulence des mutants YopT Mutant YopE-T- : virulence très atténuée chez la sourisMutant YopE-T- : virulence très atténuée chez la souris Mutant YopE-T-/pPTYopT : virulence partiellement restauréeMutant YopE-T-/pPTYopT : virulence partiellement restaurée

Première démonstration de virulence de YopTPremière démonstration de virulence de YopT

Mutant YopE+T-/pPTYopT : virulence inchangéeMutant YopE+T-/pPTYopT : virulence inchangée

YopT pas indispensable à virulence de Y.pYopT pas indispensable à virulence de Y.pFonction de YopT redondante à celle de YopEFonction de YopT redondante à celle de YopE

DiscussionDiscussion

Rôle de YopT dans la colonisation d’autres tissus ?

Activité antiphagocytaire de YopE > YopTActivité antiphagocytaire de YopE > YopT

Montrée par 2 tests, qqsoit niveau d’expression de YopTMontrée par 2 tests, qqsoit niveau d’expression de YopT Différence de niveau d’activité entre les 2 testsDifférence de niveau d’activité entre les 2 tests Différence dans les temps d’incubation (30 min contre 2h)Différence dans les temps d’incubation (30 min contre 2h) Internalisation de Y.p nécessite activation de Rac1Internalisation de Y.p nécessite activation de Rac1

YopE est l’inhibiteur de Rac1 le plus efficaceYopE est l’inhibiteur de Rac1 le plus efficace

Pas d’activité antiphagocytaire de Y.e observée sur Pas d’activité antiphagocytaire de Y.e observée sur macrophages ou PNNmacrophages ou PNN

Mécanisme de phagocytose différentMécanisme de phagocytose différentDifférences génétiques entre Y.p et Y.eDifférences génétiques entre Y.p et Y.e

DiscussionDiscussion

Différence d’inhibition IL-8 expliquée par différence Différence d’inhibition IL-8 expliquée par différence d’inhibition des voies MAPKs et NFd’inhibition des voies MAPKs et NFκκBB

YopE inhibe activation de ERK, JNK et NFYopE inhibe activation de ERK, JNK et NFκκBB YopT provoque inhibition modéréeYopT provoque inhibition modérée Même effet inhibiteur sur p38Même effet inhibiteur sur p38

Inhibition préférentielle de YopE sur Rac1Inhibition préférentielle de YopE sur Rac1YopT agit sur RhoA : activateur mineur des YopT agit sur RhoA : activateur mineur des

voies voies MAPK et NFMAPK et NFκκBB

YopT down-régule partiellement Rac1YopT down-régule partiellement Rac1Détache Rac1 des membranes cellulairesDétache Rac1 des membranes cellulairesEntraîne translocation GTPase dans le noyau (rôle ?)Entraîne translocation GTPase dans le noyau (rôle ?)

YopE > YopT inhibent Ras dépendant – ERK !?YopE > YopT inhibent Ras dépendant – ERK !?Rac1 active PAKRac1 active PAKPAK + Raf activent cascade ERKPAK + Raf activent cascade ERK

DiscussionDiscussion

Inhibition de la formation de poresInhibition de la formation de pores

Activée similaire de YopE et YopTActivée similaire de YopE et YopT

Précédemment : Précédemment : Surexpression de RhoA et Rac1 activés restaure formation de Surexpression de RhoA et Rac1 activés restaure formation de pores par mutant multi-Yop YopE+T+pores par mutant multi-Yop YopE+T+Formation des pores annulée par inhibiteurs de polymérisation Formation des pores annulée par inhibiteurs de polymérisation de l’actinede l’actine

Yop provoquent formations des pores par Yop provoquent formations des pores par activation GTPases et polymérisation de activation GTPases et polymérisation de

l’actinel’actine

Détermination des GTPases impliquées dans Détermination des GTPases impliquées dans le le mécanisme de formation des poresmécanisme de formation des pores

DiscussionDiscussion

Gènes codant pour Yop très conservés dans les 3 Gènes codant pour Yop très conservés dans les 3 espèces : espèces : pression de sélectionpression de sélection

Force motrice pour délétion de YopT ?Force motrice pour délétion de YopT ?

Etudes récentesEtudes récentes Y.e YopT- plus efficace pour la colonisation des certains Y.e YopT- plus efficace pour la colonisation des certains

tissus chez la souristissus chez la souris Infection compétitive WT / YopT- : seul YopT- persiste dans Infection compétitive WT / YopT- : seul YopT- persiste dans

le foie après 2j d’infection chez la sourisle foie après 2j d’infection chez la souris

DiscussionDiscussion

Rôle exact de YopT avantage infectivité ?