giaume (1991) adrenergic regulation of inter cellular comunications in astrocytes

8/3/2019 GIAUME (1991) Adrenergic Regulation of Inter Cellular Comunications in Astrocytes

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 8 , p p . 5 5 7 7 - 5 5 8 1 , J u l y 1 9 9 1N e u r o b i o l o g y

A d r e n e r g i c r e g u l a t i o n o f i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n s b e t w e e nc u l t u r e d s t r i a t a l a s t r o c y t e s f r o m t h e mouse( g a p j u n c t i o n s / g l i a l c e l i s / n o r e p i n e p h r i n e / L u c i f e r y e l l o w )

C H R I S T I A N G I A U M E , P H I L I P P E M A R I N , J O C E L Y N E C O R D I E R , J A C Q U E S G L O W I N S K I , A ND J O E L PREMONTI n s t i t u t N a t i o n a l d e l a S a n t d e t d e l a R e c h e r c h e M d d i c a l e U 1 1 4 , C o l l e g e d e F r a n c e , 1 1 , P l a c e M a r c e l i n - B e r t h e l o t , 7 5 2 3 1 P a r i s C e d e x 0 5 , F r a n c eC o m m u n i c a t e d b y L o u i s S o k o l o f f , M a r c h 2 6 , 1 9 9 1ABSTRACT T h e p e r m e a b i l i t y o f g a p j u n c t i o n s i n c u l t u r e ds t r i a t a l a s t r o c y t e s w a s i n v e s t i g a t e d b y t h e s c r a p e - l o a d i n g / d y e -t r a n s f e r t e c h n i q u e . P r o l o n g e d a p p l i c a t i o n o f n o r e p i n e p h r i n e( N E ) ( 1 0 j ) M ) r e d u c e d b y h a l f t h e e x t e n t o f d y e ( L u c i f e r y e l l o w )s p r e a d . T h i s e f f e c t w a s l i n k e d t o t h e a c t i v a t i o n o f a , - a d r e n e r g i cr e c e p t o r s s i n c e i t w a s m i m i c k e d b y m e t h o x a m i n e a n d a n t a g o -n i z e d b y p r a z o s i n . T h e a d e n o s i n e a g o n i s t 2 - c h l o r o a d e n o s i n e ( 1 0, u M ) , w h i c h p o t e n t i a t e s t h e N E - e v o k e d a c t i v a t i o n o f p h o s p h o -l i p a s e C ( P L C ) i n s t r i a t a l a s t r o c y t e s , a l s o p o t e n t i a t e d t h eN E - e v o k e d c l o s u r e o f g a p j u n c t i o n s , t h e e f f e c t b e i n g a s i m p o r -t a n t a s t h a t o b s e r v e d w i t h t h e u n c o u p l i n g a g e n t o c t a n o l .M e a s u r e m e n t s o f i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d t u r n o v e r p e r f o r m e d i ni d e n t i c a l e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s r e v e a l e d a c l o s e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e e x t e n t o f PLC a c t i v a t i o n a n d t h e m a g n i t u d e o f t h eu n c o u p l i n g p r o c e s s . T h e e f f e c t o f NE w a s m i m i c k e d b y b o t hp h o r b o l e s t e r a n d a r a c h i d o n i c a c i d , s u g g e s t i n g t h a t b i o c h e m -i c a l e v e n t s l i n k e d t o PLC s t i m u l a t i o n s u c h a s p r o t e i n k i n a s e Ca c t i v a t i o n a n d / o r e i c o s a n o i d p r o d u c t i o n a r e l i k e l y i n v o l v e d i nt h e N E - i n d u c e d u n c o u p l i n g . I n a d d i t i o n , i n t h e p r e s e n c e o f acAMP p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r , t h e s t i m u l a t i o n o f f l - a d -r e n e r g i c r e c e p t o r s b y i s o p r o t e r e n o l ( 1 0 jM) l e d t o a l a r g ei n c r e a s e i n cAMP a c c u m u l a t i o n c o r r e l a t e d w i t h a n e x t e n s i o n o fd y e d i f f u s i o n . T h i s o b se r v a t i o n s u g g e s t s t h a t j u n c t i o n a l p e r -m e a b i l i t y c o u l d a l s o b e c o n t r o l l e d b y a c A M P - d e p e n d e n tm e c h a n i s m . A l t o g e t h e r t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t i n t e r c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o n b e t w e e n c u l t u r e d a s t r o c y t e s c a n b e r e g u l a t e db y d i f f e r e n t s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s a s a r e s u l t o f t h e a c t i o no f n e u r o t r a n s m i t t e r s o n t h e i r r e c e p t o r s .

A s t r o c y t e s , w h i c h r e p r e s e n t a l a r g e f r a c t i o n o f t h e c e l lp o p u l a t i o n i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m , a r e a c t i v e l y i n -v o l v e d i n s e v e r a l f u n c t i o n s i n c l u d i n g n e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o na n d m i g r a t i o n , p o t a s s i u m h o m e o s t a s i s , o r s i g n a l i n g p r o -c e s s e s ( 1 ) . I n d e e d , n o t o n l y n e u r o n s b u t a l s o a s t r o c y t e s a r ep o t e n t i a l t a r g e t s f o r c h e m i c a l s i g n a l s s u c h a s g r o w t h f a c t o r s( 2 ) , h o r m o n e s , a n d n e u r o t r a n s m i t t e r s ( 3 ) . As s h o w n r e c e n t l y ,t h e s e c e l l s p o s s e s s r e c e p t o r s f o r a m i n o a c i d s , a m i n e s , a n dp e p t i d e s , a n d r e s p o n s e s i n d u c e d b y t h e s e n e u r o t r a n s m i t t e r si n v o l v e c h a n g e s i n s e c o n d m e s s e n g e r p r o d u c t i o n , m e m b r a n ec o n d u c t a n c e s , u p t a k e p r o c e s s e s f o r a m i n o a c i d s , e n e r g e t i c s ,o r p r o t e i n m e t a b o l i s m ( 3 ) . I n a d d i t i o n , i n a l l b r a i n s t r u c t u r e sa n d a t a l l d e v e l o p m e n t s t a g e s , a s t r o c y t e s a r e c o u p l e d b y g a pj u n c t i o n c h a n n e l s ( 4 , 5 ) . T h i s h a s b e e n s h o w n n o t o n l y i np r i m a r y c u l t u r e s ( 6 - 9 ) b u t a l s o i n v i v o u s i n g e i t h e r e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( 1 0 ) , i n t r a c e l l u l a r d y e i n j e c t i o n s ( 1 1 ) , o r a n t i b o d -i e s a g a i n s t g a p j u n c t i o n p r o t e i n s ( 5 , 1 2 , 1 3 ) . T h r o u g h t h e s ej u n c t i o n a l c h a n n e l s , w h i c h a l l o w i o n i c a n d m e t a b o l i c e x -c h a n g e s b e t w e e n n e i g h b o r i n g c e l l s , p o p u l a t i o n s o f a s t r o c y t e smay o p e r a t e a s a s y n c y t i u m ( 4 ) i n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f l o c a li o n i c a n d a m i n o a c i d c o n c e n t r a t i o n s a r o u n d n e u r o n s .

M o r e o v e r , s e v e r a l d a t a o b t a i n e d o n o t h e r c e l l t y p e s i n d i -c a t e t h a t t h e j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y f o r i o n s o r s m a l l m o l e -c u l e s i s u n d e r t h e c o n t r o l o f s e c o n d m e s s e n g e r s ( 1 4 , 1 5 ) . F o ri n s t a n c e , i n c r e a s e s i n cAMP ( 1 6 - 1 8 ) , a c t i v a t i o n o f p r o t e i nk i n a s e C ( P K C ) b y s y n t h e t i c d i a c y l g l y c e r o l s o r p h o r b o l e s t e r s( 1 9 ) , a n d a p p l i c a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d ( 2 0 ) u p - o r d o w n -r e g u l a t e g a p j u n c t i o n p e r m e a b i l i t y . I n s o m e c a s e s , t h e s ee f f e c t s c o u l d b e r e p r o d u c e d b y d i r e c t s t i m u l a t i o n o f m e m-b r a n e r e c e p t o r s c o u p l e d t o c o r r e s p o n d i n g i n t r a c e l l u l a r s i g -n a l i n g p a t h w a y s ( 1 4 ) .I n t h e p r e s e n t s t u d y , u s i n g t h e s c r a p e - l o a d i n g / d y e - t r a n s f e rt e c h n i q u e ( 2 1 ) a t t e m p t s w e r e made t o d e t e r m i n e w h e t h e rc o m m u n i c a t i o n t h r o u g h g a p j u n c t i o n c h a n n e l s i n c u l t u r e da s t r o c y t e s f r o m m o u s e s t r i a t u m i s r e g u l a t e d b y n o r e p i n e p h -r i n e ( N E ) . NE w a s s e l e c t e d s i n c e a l l c l a s s e s o f a d r e n e r g i cr e c e p t o r s a r e w i d e l y e x p r e s s e d i n a s t r o c y t e s a n d t h e i r c o u -p l i n g t o s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s i s w e l l d o c u m e n t e d ( 2 2 ) .I n a d d i t i o n , NE h a s a w i d e s p r e a d a c t i o n i n t h e c e n t r a ln e r v o u s s y s t e m a n d c o u l d a c t n o t o n l y a s a n e u r o t r a n s m i t t e rb u t a l s o a s a p a r a c r i n e a g e n t ( 2 3 ) .

METHODSC e l l C u l t u r e s . P r i m a r y c u l t u r e s o f g l i a l c e l l s w e r e p r e p a r e da s d e s c r i b e d ( 2 4 ) . S t r i a t a w e r e r e m o v e d f r o m 1 6 - d a y - o l dS w i s s mouse e m b r y o s . C e l l s w e r e d i s s o c i a t e d a n d p l a t e d o np o l y o r n i t h i n e - c o a t e d ( 1 . 5 , u g / m l ; S i g m a ) c u l t u r e d i s h e s( N u n c ) . S e e d i n g d e n s i t y w a s - 8 x 1 0 5 c e l l s p e r d i s h ( 3 5 - m md i a m e t e r ) . T h e c u l t u r e medium i n c l u d e d 90% o f a m i x t u r e( 1 : 1 ) o f m i n i m a l e s s e n t i a l medium a n d F - 1 2 n u t r i e n t( G I B C O ) , s u p p l e m e n t e d w i t h g l u c o s e ( 3 3 m M ) , g l u t a m i n e ( 2m M ) , NaHCO3 ( 3 m M ) , a n d H e p e s ( 5 m M ) , a n d 10% N u -S e r u m ( C o l l a b o r a t i v e R e s e a r c h ) . T h i s m e d i u m w a s c h a n g e de v e r y 3 d a y s . A f t e r 1 2 d a y s o f c u l t u r e , t o p r e v e n t f i b r o b l a s ta n d m i c r o g l i a p r o l i f e r a t i o n , c y t o s i n e a r a b i n o n u c l e o s i d e ( S i g -m a ) ( 1 1 L M ) w a s a d d e d f o r 4 8 h r . A l l e x p e r i m e n t s w e r ep e r f o r m e d o n 1 8 - t o 2 0 - d a y - o l d c u l t u r e s . A t t h i s t i m e , c e l l sw e r e i d e n t i f i e d a s c o n f l u e n t a s t r o c y t e s b y i n d i r e c t i m m u n o -

f l u o r e s c e n t s t a i n i n g w i t h a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t g l i a lf i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n . T h e p r o p o r t i o n o f g l i a l f i b r i l l a r ya c i d i c p r o t e i n - p o s i t i v e c e l l s r a n g e d f r o m 90% t o 95% o f t h et o t a l c e l l p o p u l a t i o n .J u n c t i o n a l C o m m u n i c a t i o n . Gap j u n c t i o n p e r m e a b i l i t y w a sd e t e r m i n e d b y t h e s c r a p e - l o a d i n g t e c h n i q u e d e s c r i b e d b yE l - F o u l y e t a l . ( 2 1 ) . C e l l s w e r e f i r s t i n c u b a t e d f o r t h e i n d i -c a t e d t i m e s i n a n i o n i c s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 3 0 mM N a C l , 2 . 8mM K C I , 1 mM C a C 1 2 , 2 mM M g C l 2 , a n d 1 0 mM H e p e s ( p H7 . 2 ) a n d t h e n w a s h e d f o r 1 m i n w i t h t h e s a m e s o l u t i o n i nw h i c h c a l c i u m w a s o m i t t e d . S c r a p e l o a d i n g w a s a c h i e v e dw i t h a b r o k e n r a z o r b l a d e i n t h e c a l c i u m - f r e e medium c o n -A b b r e v i a t i o n s : NE, n o r e p i n e p h r i n e ; L Y , L u c i f e r y e l l o w ; PKC,p r o t e i n k i n a s e C ; 2 C A , 2 - c h l o r o a d e n o s i n e ; P L C , p h o s p h o l i p a s e C ;I s o , i s o p r o t e r e n o l ; I P , i n o s i t o l p h o s p h a t e ; PMA, p h o r b o l 1 2 -m y r i s t a t e 1 3 - a c e t a t e ; P L A 2 , p h o s p h o l i p a s e A 2 ; IBMX, 3 - i s o b u t y l -m e t h y l x a n t h i n e .

5 5 7 7

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

5 5 7 8 N e u r o b i o l o g y : G i a u m e e t a l .t a i n i n g L u c i f e r y e l l o w ( L Y ) ( 0 . 5 m g / m l ) ( S i g m a ) , a s m a l lm o l e c u l e ( 4 5 7 D a ) t h a t m o v e s f r e e l y t h r o u g h g a p j u n c t i o n sf r o m l o a d e d c e l l s t o n e i g h b o r i n g o n e s . T h e d y e s o l u t i o n w a sr e m o v e d 2 m i n l a t e r a n d c e l l s w e r e w a s h e d s e v e r a l t i m e s w i t ht h e c a l c i u m - c o n t a i n i n g i o n i c s o l u t i o n . When a m i x t u r e o f LYa n d r h o d a m i n e d e x t r a n ( 1 0 k D a ; S i g m a ) w a s u s e d , t h el o c a l i z a t i o n o f t h e s e c o n d d y e , t o w h i c h g a p j u n c t i o n s a r ei m p e r m e a n t , w a s r e s t r i c t e d t o i n i t i a l l y l o a d e d c e l l s . I n a l le x p e r i m e n t s , j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y w a s e s t i m a t e d 8 m i na f t e r s c r a p i n g b y t a k i n g p h o t o m i c r o g r a p h s ( K o d a k TMAX;4 0 0 ASA) w i t h a N i k o n i n v e r t e d m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t ha p p r o p r i a t e f i l t e r s . I n e a c h t r i a l , f i v e s i d e - b y - s i d e p h o t o m i -c r o g r a p h s w e r e t a k e n i n t h e c e n t e r o f t h e c u l t u r e d i s h ,a l l o w i n g t h e v i s u a l i z a t i o n o f = 4 0 0 c e l l s o f t h e f i r s t r o ws t a r t i n g f r o m t h e s c r a p e l i n e . N e g a t i v e s w e r e t h e n e x a m i -n a t e d w i t h a n i m a g e a n a l y z e r s y s t e m ( I m s t a r s o f t w a r e ) a n dd a t a w e r e q u a n t i f i e d a c c o r d i n g t o t w o p r o c e d u r e s : ( i ) d i g i -t i z e d i m a g e s w e r e s c a n n e d a l o n g l i n e s p e r p e n d i c u l a r t o t h es c r a p e ( F i g . 1 A , v e r t i c a l l i n e s ) a n d p r o f i l e s w e r e p l o t t e d b ym e a s u r i n g t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y f o r e a c h p i x e l ( F i g . 1 B ) ;( i i ) f l u o r e s c e n t a r e a s w e r e m e a s u r e d f r o m d i g i t i z e d i m a g e s b yc o m p u t a t i o n o f t h e s u r f a c e o c c u p i e d b y t h e d y e . T h r e s h o l d

d e t e c t i o n f o r LY w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r e m e n t s o f b a c k -g r o u n d i n t e n s i t y i n d i s h a r e a s i n w h i c h n o d y e w a s p r e s e n t .O n l y h e m i f i e l d s o f t h e s c r a p e d r e g i o n w e r e c o n s i d e r e d i no r d e r t o a v o i d t h e a r t i f a c t d u e t o t h e f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n o ft h e p l a s t i c d i s h a f t e r t h e r a z o r s c r a p e . F o r e a c h e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n , t h e s i z e o f t h e f l u o r e s c e n t a r e a w a s a v e r a g e d f r o md a t a o b t a i n e d i n t h e f i v e a d j a c e n t i m a g e s , a n d t h i s v a l u e i se x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t h e c o n t r o l o b t a i n e d f r o m c e l l so r i g i n a t i n g f r o m t h e s a m e c u l t u r e . I n c o n t r o l c o n d i t i o n s , f o ra g i v e n c u l t u r e , v a r i a t i o n b e t w e e n m e a s u r e m e n t s m a d e o nt w o d i f f e r e n t d i s h e s w a s a l w a y s < 1 0 % . T h i s s e c o n d m e t h o do f q u a n t i f i c a t i o n o f f e r e d t h e a d v a n t a g e o f r e d u c i n g t h e h e t -e r o g e n e i t y o f d y e s p r e a d o b s e r v e d e v e n i n c o n t r o l c o n d i t i o n s( F i g . 1 A ) . I n d e e d , a v e r a g e d f l u o r e s c e n c e p r o f i l e s ( o n e d i -m e n s i o n ) w e r e c a l c u l a t e d f r o m n o m o r e t h a n f i v e i n i t i a l l yl o a d e d c e l l s , w h i l e f l u o r e s c e n c e a r e a s ( t w o d i m e n s i o n s ) w e r ec o m p u t e d f r o m a l a r g e c e l l p o p u l a t i o n .When a d r u g w a s t e s t e d , i t w a s a p p l i e d f r o m t h e b e g i n n i n go f t h e i n c u b a t i o n a n d i n c l u d i n g t h e w a s h i n g s t e p . A l l d r u g sw e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a , e x c e p t f o r 2 - c h l o r o a d e n o s i n e( 2 C A ) ( R e se a r c h B i o c h e mi c a l s , N a t i c k , M A ) . E x c e p t f o rp r e i n c u b a t i o n w i t h p h o r b o l e s t e r s , w h i c h w a s c a r r i e d o u t a t3 7 T C , a l l s c r a p e - l o a d i n g e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t r o o mt e m p e r a t u r e ( 2 0 0 C - 2 2 0 C ) .I n o s i t o l P h o s p h o l i p i d T u r n o v e r A s s a y . C e l l s , g r o w n i n 2 4 -w e l l d i s h e s , w e r e i n c u b a t e d f o r 2 4 h r i n t h e p r e s e n c e o f 1 1 X C io f m y o - [ 3 H ] i n o s i t o l p e r w e l l ( 1 7 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ;

Ba0

a0x I0

I z

Da0e 2 0 0g o02I. 1000

o

C o m m i s s a r i a t a l ' E n e r g i e A t o m i q u e ) i n t h e c u l t u r e m e d i u m .A f t e r r e m o v a l o f t h e m e d i u m , c e l l s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e sa n d t h e n p r e i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n i n K r e b s p h o s p h a t e b u f f e r( 1 2 0 mM N a C l / 1 5 . 6 mM N a H 2 P O 4 / 4 . 8 mM K C l / 1 . 2 mMM g S O 4 / 1 . 2 mM C a C 1 2 / 3 3 . 3 mM g l u c o s e , p H 7 . 4 ) s u p p l e -m e n t e d w i t h L i C l ( 1 0 m M ) . D r u g s w e r e t h e n a d d e d f o r 2 0 m i ni n t h e p r e s e n c e o f a d e n o s i n e d e a m i n a s e ( 1 u n i t / m l ; B o e h -r i n g e r M a n n h e i m ) i n o r d e r t o p r e v e n t t h e e f f e c t o f e n d o g e -n o u s a d e n o s i n e o n p h o s p h o l i p a s e C a c t i v i t y ( P L C ) ( 2 4 ) . T h ei n c u b a t i o n w a s s t o p p e d b y a d d i n g s u c c e s s i v e l y 2 0 0 A l o f0 . 1 % T r i t o n X - 1 0 0 i n 0 . 1 M NaOH, 2 0 0 , l o f 0 . 1 % T r i t o nX - 1 0 0 i n 0 . 1 M H C l , a n d 5 0 0 p l o f w a t e r . C e l l s w e r e t h e ns c r a p e d a n d [ 3 H ] i n o s i t o l p h o s p h a t e s ( I P s ) w e r e e x t r a c t e d a n dm e a s u r e d a s d e s c r i b e d ( 2 4 ) .I n t r a c e l l u l a r cAMP A c c u m u l a t i o n A s s a y . C e l l s , g r o w n i n2 4 - w e l l d i s h e s , w e r e i n c u b a t e d f o r 2 h r w i t h [ 2 - 3 H ] a d e n i n e ( 2p C i p e r w e l l ) ( N E N / D u P o n t ) i n c o m p l e t e m e d i u m . T h em e d i u m w a s t h e n r e m o v e d a n d r e p l a c e d b y K r e b s p h o s p h a t eb u f f e r , c o n t a i n i n g t h e d r u g s d e s c r i b e d a b o v e . T h e 5 - m i ni n c u b a t i o n w a s s t o p p e d b y r e p l a c i n g t h e m e d i u m w i t h 0 . 5 m lo f i c e - c o l d t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( 6 % ; v o l / v o l ) . C e l l s w e r e t h e ns c r a p e d a n d r a d i o a c t i v e ATP a n d cAMP w e r e e x t r a c t e d a n d

s e p a r a t e d a c c o r d i n g t o r e f . 2 5 .RESULTS

I n r e s t i n g c o n d i t i o n s , s t r i a t a l a s t r o c y t e s a r e w i d e l y c o u p l e da s i n d i c a t e d b y t h e l a r g e p r o p o r t i o n o f s t a i n e d c e l l s o b s e r v e da f t e r s c r a p e l o a d i n g w i t h L Y . T e n m i n u t e s a f t e r t h e d y ei n t r o d u c t i o n , a s t r o c y t e s w e r e h i g h l y f l u o r e s c e n t a t t h e b o r d e ro f t h e s c r a p e l i n e a n d f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f t h e c e l l sd e c r e a s e d g r a d u a l l y u p t o a d i s t a n c e c o r r e s p o n d i n g t o =1 0c e l l d i a m e t e r s ( F i g . 1 A a n d B ) . When a s t r o c y t e s w e r ee x p o s e d t o t h e u n c o u p l i n g a g e n t o c t a n o l ( 0 . 6 m M ) , o n l y c e l l sf o r m i n g t h e f i r s t r o w w e r e f l u o r e s c e n t ( F i g . 1 C ) . As e x -p e c t e d , p l o t t i n g o f t h e f l u o r e s c e n c e p r o f i l e s a c c o r d i n g t o t h ef i r s t p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n M e t h o d s i n d i c a t e d t h a t t h ed i f f u s i o n o f LY t h r o u g h g a p j u n c t i o n s i s b l o c k e d i n t h ep r e s e n c e o f o c t a n o l ( F i g . 1 D ) , t h e r e s u l t s b e i n g s i m i l a r t ot h o s e o b t a i n e d w i t h r h o d a m i n e d e x t r a n ( d a t a n o t s h o w n ) .C l o s u r e o f A s t r o c y t e G a p J u n c t i o n s U n d e r A c t i v a t i o n o fa 1 - A d r e n e r g i c R e c e p t o r s b y N E . I n c u b a t i o n o f s t r i a t a l a s t r o -c y t e s f o r 2 0 m i n i n t h e p r e s e n c e o f NE ( 1 0 , u M ) d e c r e a s e d b yh a l f t h e d i f f u s i o n o f LY b e t w e e n c e l l s ( F i g . 2 B ) . T h i s e f f e c ts e e m s t o b e m e d i a t e d b y a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s s i n c e t h ea - a d r e n e r g i c a g o n i s t m e t h o x a m i n e ( 1 0 0 , u M ) d e c r e a s e d j u n c -t i o n a l p e r m e a b i l i t y a s w e l l ( F i g . 2 C ) a n d t h e a c t i o n o f NE wasp r e v e n t e d b y t h e a 1 - a d r e n e r g i c s p e c i f i c a n t a g o n i s t , p r a z o s i n

I F I G . 1 . U s e o f t h e s c r a p e - l o a d i n g t e c h n i q u e f o rt h e s t u d y o f i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n s i n c u l -t u r e d s t r i a t a l a s t r o c y t e s . ( A ) F l u o r e s c e n c e p h o t o -m i c r o g r a p h t a k e n i n c o n t r o l c o n d i t i o n s . T e n m i n -u t e s a f t e r s c r a p i n g , LY h a s d i f f u s e d w i d e l y t h r o u g h -- o u t t h e c o n f l u e n t m o n o l a y e r o f a s t r o c y t e s . ( B )I S c a n n i n g o f t h e p h o t o m i c r o g r a p h m a d e w i t h a ni m a g e - a n a l y z e r s y s t e m a l o n g l i n e s p e r p e n d i c u l a r t ot h e s c r a p e ( v e r t i c a l w h i t e l i n e s ) . F l u o r e s c e n c e i n -t e n s i t y ( o r d i n a t e ) s c a l e d f r o m 0 t o 2 5 0 w a s p l o t t e dv e r s u s t h e d i s t a n c e ( a b s c i s s a ) e x p r e s s e d i n p i x e l s( p x ) ( 1 p x = 1 . 5 j L m ) . ( C ) B l o c k a g e o f j u n c t i o n a lp e r m e a b i l i t y b y t h e u n c o u p l i n g a g e n t o c t a n o l ( 6 xi O - 4 M ) . N o t e t h a t a f t e r a 5 - m i n a p p l i c a t i o n , t h el o c a l i z a t i o n o f t h e d y e w a s m a i n l y r e s t r i c t e d t o t h ef i r s t r o w o f c e l l s , i n d i c a t i n g t h a t t h e u n c o u p l i n g w a sa l m o s t c o m p l e t e a s c o n f i r m e d b y p l o t t i n g t h e f l u o -r e s c e n c e p r o f i l e ( D ) . I n B a n d D , t h e c e n t r a l p e a k i sa n a r t e f a c t d u e t o t h e f l u o r e s c e n c e o f t h e p l a s t i cd i s h s u b s e q u e n t t o t h e r a z o r s c r a p e . E x p e r i m e n t s i nP x A a n d C a r e f r o m t h e s a m e c u l t u r e . ( B a r = 2 5 0 , u m . )

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 )


3/5

P r o c . N a t L . A c a d . S c i . U S A 8 8 ( 1 9 9 1 ) 5 5 7 9C o n t r o l

- -' l w " - - . - w l " ' wMtI~ A-J-1)J C o n t r o l

I D T, v o j l X I ~ P 7

)f lC)IO

-

NE

1 ! ] ; . NE

O - + n 3 0 ? 0 ) p xE

1) 2

1 0 0 3 o n p x

NE+2CA

1 5 0

F I G . 2 . U n c o u p l i n g o f a s t r o c y t e sb y NE. F l u o r e s c e n c e m i c r o g r a p h sC c o r r e s p o n d i n g t o h e m i f i e l d s o f a s t r o -M e L ~ c t h c y t e d i s h c u l t u r e o b t a i n e d i n s c r a p e -Xl;th l o a d i n g e x p e r i m e n t s . C o n t r o l ( L e f t ) ,i n t h e p r e s e n c e o f NE ( 1 0 A r M ) ( C e n -t e r ) , a n d i n t h e c o m b i n e d p r e s e n c e o f-. NE a n d 2CA ( 1 0 A t M ) ( R i g h t ) . ( B a r =2 5 0 A . m . ) ( A - F ) A v e r a g e d f l u o r e s -cence p r o f i l e s . I n e a c h c a s e , t h e s o l i dP l i n e r e p r e s e n t s t h e a v e r a g e o f f i v eF f l u o r e s c e n c e p r o f i l e s a s d e t e r m i n e d i nbA M e t h o d s , a n d t h e d a s h e d l i n e s i n d i -c a t e + S D . C o n c e n t r a t i o n s u s e d f o r2 0 - m i n p r e i n c u b a t i o n w e r e a s f o l l o w s :N E , 1 0 , u M ; m e t h o x a m i n e ( M e t h ) ,1 0 0 A M ; p r a z o s i n ( P Z ) , 1 , u M ; 2 C A ,

____________ 1 0 A L M . A l l e x p e r i m e n t s a r e f r o m t h e1 0 1 1 S o f a p x s a m e c u l t u r e .( 1 A t M ) ( F i g . 2 D ) , w h i c h w a s i n e f f e c t i v e w h e n u s e d a l o n e( d a t a n o t s h o w n ) .R e l a t i o n s h i p B e t w e e n t h e U n c o u p l i n g E f f e c t o f NE a n d PLCA c t i v a t i o n . I t i s w e l l k n o w n t h a t a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s a r ec o u p l e d t o PLC ( 2 6 ) . C h a n g e s i n g a p j u n c t i o n p e r m e a b i l i t yi n d u c e d b y NE w i t h o r w i t h o u t o t h e r p h a r m a c o l o g i c a l a g e n t sw e r e t h e r e f o r e c o m p a r e d t o c h a n g e s i n p h o s p h a t i d y l i n o s i t o lt u r n o v e r . F o r t h i s p u r p o s e , i n o r d e r t o o b t a i n m e a n d a t a f r o mi n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s , j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y w a s e s t i -m a t e d b y m e a s u r i n g t h e t o t a l a r e a o c c u p i e d b y t h e d y e ( s e eM e t h o d s ) . W i t h t h i s a p p r o a c h , d i f f u s i o n o f LY i n a l a r g ep o p u l a t i o n o f c e l l s w a s e s t i m a t e d i n e a c h d i s h ( - 2 0 0 i n i t i a l l yl o a d e d c e l l s f r o m f i v e s i d e - b y - s i d e h e m i f i e l d s ) . H o w e v e r ,c h a n g e s i n j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y a r e p r o b a b l y u n d e r e s t i -m a t e d s i n c e t h e c a l c u l a t e d f l u o r e s c e n c e a r e a i s n e v e r e q u a l t oz e r o e v e n w h e n j u n c t i o n s a r e b l o c k e d w i t h o c t a n o l ( s e e F i g .1 C ) . T h e r e f o r e , a c o r r e c t i o n w a s m a d e b y s u b t r a c t i n g t h er e s i d u a l f l u o r e s c e n c e a r e a m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f o c -t a n o l ( F i g . 3 L e f t , s h a d e d b a r s ) . A s e x p e c t e d , c h a n g e s i nj u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y a p p e a r t o b e m o r e p r o n o u n c e d w i t ht h i s p r o c e d u r e ( o p e n b a r s ) . E s t i m a t i o n s o f [ 3 H J I P f o r m a t i o nw e r e c a r r i e d o u t o n c e l l s o r i g i n a t i n g f r o m t h e s a m e c u l t u r e su s i n g t h e s a m e i n c u b a t i o n t i m e ( 2 0 m i n ) a n d t h e s a m ec o n c e n t r a t i o n s o f p h a r m a c o l o g i c a l a g e n t s .I n s t r i a t a l a s t r o c y t e s , a s r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 2 4 ) , t h ea c t i v a t i o n o f PLC b y a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s i s p o t e n t i a t e db y t h e c o s t i m u l a t i o n o f a d e n o s i n e r e c e p t o r s ( F i g . 3 R i g h t ) . A si n t h e PLC a s s a y , w h e n NE w a s a p p l i e d 2 0 m i n i n t h ep r e s e n c e o f 2CA ( 1 0 A M ) , t h e u n c o u p l i n g e f f e c t o f NE w a sa l s o e n h a n c e d ( F i g s . 2E a n d 3 L e f t ) . M o r e o v e r , 2CA a l o n e ,w h i c h h a s n o e f f e c t o n PLC a c t i v a t i o n , d i d n o t m o d i f y g a pj u n c t i o n p e r m e a b i l i t y ( F i g s . 2F a n d 3 ) . A c l o s e c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e m a g n i t u d e o f g a p j u n c t i o n u n c o u p l i n g a n d o f I Pa c c u m u l a t i o n w a s a l s o s e e n w h e n a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r sw e r e s t i m u l a t e d w i t h m e t h o x a m i n e , e i t h e r i n t h e a b s e n c e o rp r e s e n c e o f 2CA ( F i g . 3 ) . A l l t h e e f f e c t s i n d u c e d b y e i t h e r NEo r m e t h o x a m i n e w e r e s u p p r e s s e d b y t h e s e l e c t i v e a n t a g o n i s to f a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s , p r a z o s i n .C l o s u r e o f A s t r o c y t e G a p J u n c t i o n s b y P h o r b o l E s t e r a n dA r a c h i d o n i c A c i d . A c t i v a t i o n o f PLC i n c r e a s e s i n t r a c e l l u l a rl e v e l s o f s e v e r a l s e c o n d m e s s e n g e r s s u c h a s c a l c i u m i o n s ,

d i a c y l g l y c e r o l , a n d a r a c h i d o n i c a c i d . T h e r e f o r e , t h e e v e n t u a li n v o l v e m e n t o f t h e s e s e c o n d m e s s e n g e r s i n t h e r e g u l a t i o n o fa s t r o c y t e g a p j u n c t i o n p e r m e a b i l i t y w a s i n v e s t i g a t e d . When

s c r a p e l o a d i n g w a s a c h i e v e d i n t h e p r e s e n c e o f e x t e r n a lc a l c i u m i o n s ( 1 m M ) , d i f f u s i o n o f LY w a s b l o c k e d ( n = 3 )( d a t a n o t s h o w n ) i n d i c a t i n g t h a t C a 2 + i o n s , a t a m i l l i m o l a rc o n c e n t r a t i o n , c l o s e g a p j u n c t i o n s . PKC a c t i v a t i o n b y p r o d -u c t s o f i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d b r e a k d o w n , s u c h a s d i a c y l g l y c -e r o l , c o u l d a l s o b e i n v o l v e d s i n c e t h e s t i m u l a t i o n o f PK C w i t hp h o r b o l 1 2 - m y r i s t a t e 1 3 - a c e t a t e ( P M A ) ( 0 . 1 6 , u M ) e x e r t e d am a r k e d u n c o u p l i n g e f f e c t ( F i g . 4 B ) , a s a l s o i n d i c a t e d b y t h ed e c r e a s e d s i z e o f t h e f l u o r e s c e n t a r e a ( 5 1 % 7 % ; n = 4 ) . Ont h e c o n t r a r y , t h e a p p l i c a t i o n o f 4 - O - m e t h y l - P M A , 1 . 6 x 1 0 - 7M , a n i n a c t i v e f o r m o f p h o r b o l e s t e r , h a d n o e f f e c tF l u o r e s c e n c e a r e a , I P a c c u m u l a t i o n ,% o f c o n t r o l % o f c o n t r o l

C o n t r o lO c t a n o l - *

NE * , - *NE+2CA-n

2CA n-M e t h -

Meth+2CA - *nNE+PZ-3P Z

F I G . 3 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s i z e o f t h e f l u o r e s c e n t a r e a a n dt h e a c c u mu l a t i o n o f I P s i n s t r i a t a l a s t r o c y t e s . ( L e f t ) A v e r a g e d v a l u e s( m e a n S E M ) o f t h e s u r f a c e s t a i n e d w i t h LY i n f i v e s c r a p e - l o a d e dh e m i f i e l d s . T h e n v a l u e s r e f e r t o t h e n u m b e r o f i n d e p e n d e n t e x p e r -i m e n t s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e o f t h e i r i n t e r n a l c o n -t r o l s . S h a d e d p a r t o f e a c h b a r r e p r e s e n t s t h e m i n i m a l f l u o r e s c e n c ea r e a e s t i m a t e d u n d e r m a x i m a l b l o c k a g e o f c o m m u n i c a t i o n s w i t ho c t a n o l . I n c u b a t i o n t i m e s a n d c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t s a n d a n t a g -o n i s t s a r e t h e s a m e a s t h o s e r e p o r t e d i n F i g s . 1 a n d 2 . ( R i g h t ) R e s u l t su n d e r t h e i n d i c a t e d c o n d i t i o n s a r e e x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e ( m e a n S E M ) o f t h e b a s a l I P p r o d u c t i o n ( i . e . , i n t h e a b se n c e o f a g o n i s t ) .S h a d e d p a r t o f t h e b a r s r e f e r s t o t h e c o n t r o l v a l u e ( 1 0 0 % ) a n d n v a l u e sr e p r e s e n t t h e n u m b e r o f i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . * , S i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e ; P < 0 . 0 1 ; S t u d e n t ' s t t e s t . P Z , p r a z o s i n ;M e t h , m e t h o x a m i n e .

N e u r o b i o l o g y : G i a u m e e t a l .


4/5

5 5 8 0 N e u r o b i o l o g y : G i a u m e e t a l .

C o n t r o l

2 0 0 4 0 0 p x

BPM A 1 . 6 x 1 0 - 7 m" A

2 0 0 .

100"w . -0 2 0 0 4 0 0 p x

F I G . 4 . E f f e c t s o f p h o r b o l e s t e r s a n d a r a c h i d o n i c a c i d o n j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y o f s t r i a t a l a s t r o c y t e s . ( A ) A v e r a g e d f l u o r e s c e n c e p r o f i l ei n c o n t r o l c o n d i t i o n s . ( B a n d C ) I n h i b i t i o n o f d y e s p r e a d occurring a f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 T C f o r 1 h r w i t h 1 . 6 x 1 0 - 7 M PMA o r f o r 1 0 m i n w i t h5 x 1 0 - 5 M a r a c h i d o n i c a c i d ( A A ) , r e s p e c t i v e l y . A l l a v e r a g e d curves ( m e a n S D ) w e r e o b t a i n e d f r o m d e t e r mi n a t i o n s o f f i v e f l u o r e s c e n c ep r o f i l e s o f s c r a p e - l o a d e d c o n f l u e n t a s t r o c y t e s f r o m t h e same c u l t u r e .o n t h e d i f f u s i o n o f LY ( n = 2 ) ( d a t a n o t s h o w n ) . A r a c h i d o n i ca c i d may b e p r o d u c e d a f t e r a c t i v a t i o n o f e i t h e r d i a c y l g l y c e r o ll i p a s e o r p h o s p h o l i p a s e A 2 ( P L A 2 ) . I t h a s a l r e a d y b e e nr e p o r t e d t h a t a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ca n b e c o u p l e d d i r e c t l yo r n o t t o PLA2 i n d i f f e r e n t c e l l t y p e s , i n c l u d i n g a s t r o c y t e s( 2 7 , 2 8 ) . As s h o w n i n F i g . 4 C , when a s t r o c y t e s w e r e e x p o s e dt o a r a c h i d o n i c a c i d ( 5 0 , A M ) , j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y wasr e d u c e d , as a l s o i n d i c a t e d b y t h e d e c r e a s e d s i z e o f t h em e a s u r e d f l u o r e s c e n t a r e a ( 4 5 % + 6 % ; n = 3 ) .L a r g e I n c r e a s e i n cAMP P r o d u c t i o n I s C o r r e l a t e d w i t hE n h a n c e m e n t o f J u n c t i o n a l P e r m e a b i l i t y . f - A d r e n e r g i c recep-t o r s p o s i t i v e l y c o u p l e d t o a d e n y l a t e c y c l a s e are w i d e l y ex-p r e s s e d i n a s t r o c y t e s ( 3 , 2 2 ) . T h e r e f o r e , t h e e f f e c t o n j u n c -t i o n a l p e r m e a b i l i t y o f t h e s e l e c t i v e 8 - a d r e n e r g i c a g o n i s ti s o p r o t e r e n o l ( I s o ) was a l s o t e s t e d . I s o ( 1 0lM) o n l y s l i g h t l ye n h a n c e d t h e s i z e o f t h e f l u o r e s c e n t area ( 1 6 % 5 % ; n = 6 ) .H o w e v e r , t h i s e f f e c t was s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d ( 2 9 % 3 % ;n = 6 ; P < 0 . 0 5 , S t u d e n t ' s t t e s t ) u n d e r t h e c o m b i n e dpresence o f t h e n o n s e l e c t i v e cAMP p h o s p h o d i e s t e r a s e i n -h i b i t o r , 3 - i s o b u t y l m e t h y l x a n t h i n e ( I B M X ) ( 1 m M ) , w h i c ha l o n e h a d a s l i g h t i n c r e a s i n g e f f e c t ( 9 % 6 % ; n = 2 ) . I n o u re x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , IB M X e n h a n c e d m a r k e d l y t h e i s o -p r o t e r e n o l - i n d u c e d a c c u m u l a t i o n o f [ 3 H ] c A M P ( 2 5 3 a n d6 3 0 3 0 f mo l p e r w e l l ; n = 5 ; i n t h e a b s e n c e o r presence o fIBMX, r e s p e c t i v e l y ) , w h e r e a s t h e b a s a l a c c u m u l a t i o n wass l i g h t l y a l t e r e d ( 1 0 1 a n d 4 4 4 f m o l p er w e l l ; n = 5 ) .A l t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t yf o r LY i n a s t r o c y t e s i s s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d o n l y when l a r g eamounts o f cAMP are a c c u m u l a t e d w i t h i n t h e c e l l s .

DISCUSSIONI n t h e p r e s e n t s t u d y , we h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t NE r e d u c e sj u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y f o r LY i n mouse s t r i a t a l a s t r o c y t e sg r o w n i n p r i m a r y c u l t u r e . T h e N E - e v o k e d u n c o u p l i n g o f c e l l soccurs t h r o u g h t h e a c t i v a t i o n o f a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ass h o w n w i t h s e l e c t i v e a g o n i s t ( m e t h o x a m i n e ) a n d a n t a g o n i s t( p r a z o s i n ) o f t h e s e r e c e p t o r s . I n a d d i t i o n , e x t e n d i n g p r e v i o u so b s e r v a t i o n s , i n d i c a t i n g t h a t a d e n o s i n e p o t e n t i a t e s t h e i n -crease i n i n o s i t o l p h o s p h o l i p i d b r e a k d o w n e v o k e d b y NE i ns t r i a t a l a s t r o c y t e s ( 2 4 ) , o u r s t u d y a l s o i n d i c a t e s t h a t t h ec o m b i n e d s t i m u l a t i o n o f a d e n o s i n e r e c e p t o r s b y 2CA a l s op o t e n t i a t e s t h e NE-evoked c l o s u r e o f g ap j u n c t i o n s ( F i g . 2 ) .C o m p a r i s o n o f d a t a o b t a i n e d i n p a r a l l e l b i o c h e m i c a l a n ds c r a p e - l o a d i n g e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h e e x i s t e n c e o f a c l o s er e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e e x t e n t o f PLC a c t i v a t i o n a n d t h em a g n i t u d e o f r e d u c t i o n o f g a p j u n c t i o n p e r m e a b i l i t y ( F i g . 3 ) .I n d e e d , t h e p o t e n t i a t i o n b y 2C A o f t h e NE - o r m e t h o x a m i n e -e v o k e d a c c u m u l a t i o n o f I P s was a s s o c i a t e d w i t h a h i g h e rr e d u c t i o n i n LY d i f f u s i o n t o s u r r o u n d i n g a s t r o c y t e s . PLCa c t i v a t i o n l e a d s t o s e v e r a l i n t r a c e l l u l a r e v e n t s , s u c h as a n

i n c r e a s e i n c y t o s o l i c c a l c i u m , t h e a c t i v a t i o n o f P K C b yd i a c y l g l y c e r o l , a n d t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . I na d d i t i o n , d u e t o t h e c o n c o m i t a n t a c t i v a t i o n o f P L A 2 , a r a c h i -d o n i c a c i d i s f o r m e d i n a much h i g h e r c o n c e n t r a t i o n i n s t r i a t a la s t r o c y t e s u n d e r t h e c o m b i n e d a p p l i c a t i o n o f 2C A a n d NE( o r m e t h o x a m i n e ) ( M . T e n c e a n d J . P . , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) .I n f l u e n c e s o f C a 2 + , a r a c h i d o n i c a c i d , a n d P K C a c t i v a t i o nw e r e t h u s i n v e s t i g a t e d s e p a r a t e l y . A d i r e c t c o n t r i b u t i o n o fC a 2 + i o n s i n t h e N E - e v o k e d c l o s u r e o f g a p j u n c t i o n s s e e m su n l i k e l y s i n c e i n a s t r o c y t e s , as shown w i t h c a l c i u m - s e n s i t i v ef l u o r e s c e n t p r o b e s , c h a n g e s i n i n t e r n a l C a 2 + c o n c e n t r a t i o n sd u e t o NE ( 1 0 A M ) are o n l y t r a n s i e n t ( 1 - 3 m i n ) a n d t h e i rmaximum p e a k n e v e r e x c e e d s 1 AM ( 2 9 ) . M o r e o v e r , i nc o n f l u e n t a s t r o c y t e s , when a s i m i l a r i n c r e a s e i n c y t o s o l i cc a l c i u m l e v e l s i s i n d u c e d b y g l u t a m a t e , c a l c i u m i o n s d i d n o tc l o s e t h e j u n c t i o n s b u t , i n c o n t r a s t , s p r e a d o u t i n t o a d j a c e n tc e l l s i n a " w a v e - l i k e " manner ( 3 0 ) . A d i r e c t r o l e o f f r e ec a l c i u m i n t h e u n c o u p l i n g e f f e c t o f NE ca n t h e r e f o r e b er e a s o n a b l y r u l e d o u t . On t h e o t h e r h a n d , p h o r b o l e s t e r s ,w h i c h d i r e c t l y a c t i v a t e P K C as w e l l as t h e u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d a r a c h i d o n i c a c i d , w e r e f o u n d t o h a v e t h e a b i l i t y t or e d u c e t h e p e r m e a b i l i t y o f a s t r o c y t e g a p j u n c t i o n s ( F i g . 4 ) .A l t h o u g h t h e p a r t i c i p a t i o n o f o t h e r i n t r a c e l l u l a r e v e n t s can-n o t b e e x c l u d e d , t h e s e o b s e r v a t i o n s s t r o n g l y s u g g e s t t h a tPK C a c t i v a t i o n a n d / o r e i c o s a n o i d f o r m a t i o n are l i k e l y i n -v o l v e d i n t h e c l o s i n g e f f e c t o f NE o n g a p j u n c t i o n p e r m e -a b i l i t y .R e s u l t s o b t a i n e d w i t h I s o s u g g e s t t h a t i n o u r e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h e s t i m u l a t i o n o f f - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s a l o n eh a s n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y . T h i ss t a t e m e n t c o u l d , h o w e v e r , b e c h a l l e n g e d s i n c e w i t h t h es c r a p e - l o a d i n g t e c h n i q u e i t i s e a s i e r t o d e t e c t a r e d u c t i o n t h a na n i n c r e a s e i n d y e d i f f u s i o n when j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y i sa l r e a d y h i g h i n c o n t r o l s . M o r e o v e r , t h e i n c r e a se i n cAMPc o n c e n t r a t i o n i n d u c e d b y t h e f - a d r e n e r g i c a g o n i s t i s o n l yt r a n s i e n t , w h i c h i s n o t t h e case f o r t h e I P a c c u m u l a t i o ni n d u c e d b y NE o r m e t h o x a m i n e ( P . M . a n d J . P . , u n p u b l i s h e dr e s u l t s ) . T h i s s h o r t l i f e t i m e c o u l d e x p l a i n w hy a s i g n i f i c a n ti n c r e a s e i n t h e p e r m e a b i l i t y o f g a p j u n c t i o n s was o n l y s e e nu n d e r t h e p r o l o n g e d a n d l a r g e i n c r e a s e i n cAMP r e s u l t i n gf r o m t h e c o m b i n e d a c t i o n o f I s o a n d IBMX.I n s u m m a r y , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t i n t e r c e l l u l a r commu-n i c a t i o n b e t w e e n a s t r o c y t e s o c c u r r i ng t h r o u g h g a p j u n c t i o n sca n b e up- a n d d o w n - r e g u l a t e d b y d i s t i n c t s i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y s , as o b s e r v e d f o r g a p j u n c t i o n s o f s e v e r a l o t h e rc e l l u l a r t y p e s ( 1 4 , 1 5 , 3 1 ) .A l t h o u g h e x t r a p o l a t i o n f r o m r e s u l t s o b t a i n e d w i t h c u l t u r e dc e l l s t o t h e i n v i v o s i t u a t i o n s h o u l d b e ma de w i t h c a u t i o n , t h er e c e p t o r - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y i na s t r o c y t e s d e m o n s t r a t e d i n o u r s t u d y c o u l d h a v e i m p o r t a n tf u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e . Gap j u n c t i o n s c o u p l e n e i g h b o r i n g

A0uw 2 0 0U0

o 1 0 0I z

L0

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2 0 0 -

1 0 0

0 2 0 0 4 0 0 p x

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 )


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 ) 5 5 8 1a s t r o c y t e s t o f o r m a f u n c t i o n a l s y n c y t i u m , w h i c h a l l o w s i o n i cm o v e m e n t s a l o n g t h e i r e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t s . C o n s e -q u e n t l y , c h a n g e s i n j u n c t i o n a l p e r m e a b i l i t y s h o u l d m o d i f yt h e a b i l i t y o f i o n s t o move f r o m c e l l t o c e l l . I n a d d i t i o n t o i t sw e l l k n o w n r e g u l a t o r y e f f e c t o n m e m b r a n e c o n d u c t a n c e s( 3 2 ) , b y i t s a c t i o n o n g a p j u n c t i o n p e r m e a b i l i t y , NE c o u l d b ec r i t i c a l f o r t h e r e g u l a t i o n o f e x t e r n a l p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o nb y a s t r o c y t e s ( 3 3 ) a n d f o r t h e d i f f u s i o n t h r o u g h t h e a s t r o c y t en e t w o r k o f s i g n a l i n g c a l c i u m w a v e s f o l l o w i n g l o c a l a g o n i s ts t i m u l a t i o n ( 3 0 ) .A n o t h e r l i k e l y c o n s e q u e n c e o f t h e r e g u l a t i o n o f i n t e r c e l -l u l a r c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n a s t r o c y t e s i s r e l a t e d t o t h e i rh e t e r o g e n e i t y . I n d e e d , r e c e n t d a t a s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t , i na d d i t i o n t o r e g i o n a l h e t e r o g e n e i t y ( 3 4 ) , a s t r o c y t e s f r o m ad e f i n e d b r a i n s t r u c t u r e c a n a l s o d i f f e r i n t h e n a t u r e a n d t h ed e n s i t y o f t h e i r r e c e p t o r s . F o r i n s t a n c e , a u t o r a d i o g r a p h i co b s e r v a t i o n s made a f t e r b i n d i n g o f a p p r o p r i a t e l i g a n d s ( 3 5 )a n d m e a s u r e m e n t s i n s i n g l e a s t r o c y t e s o f c h a n g e s i n i n t r a -c e l l u l a r c a l c i u m l e v e l s i n d u c e d b y a d r e n e r g i c a g o n i s t s ( 2 9 )s u g g e s t t h a t a s u b p o p u l a t i o n o f c o r t i c a l a s t r o c y t e s o n l yp o s s e s s f u n c t i o n a l a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s . S i n c e s e c o n dm e s se n g e r s s u c h a s C a 2 " , i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e , o r cAMPg e n e r a t e d a f t e r a c t i v a t i o n o f t h e s e r e c e p t o r s c a n p e r m e a t eg a p j u n c t i o n s ( 3 6 - 3 8 ) , t h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s p h a r m a c o l o g -i c a l h e t e r o g e n e i t y c o u l d b e q u e s t i o n e d . A c c o r d i n g t o o u ro b s e r v a t i o n s , u n d e r a c t i v a t i o n o f a 1 - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ,t h i s f u n c t i o n a l h e t e r o g e n e i t y c o u l d b e u n m a s k e d t h r o u g h t h ec l o s u r e o f g a p j u n c t i o n s , a p h e n o m e n o n t h a t s h o u l d l e a d t ot h e i n d i v i d u a l i z a t i o n o f c e l l s b e a r i n g t h e s e r e c e p t o r s .We w i s h t o t h a n k G . L ' h o t e , who s e t u p t h e p r o g r a m t o a v e r a g ef l u o r e s c e n t p r o f i l e s , a n d J . P . M a r t i n f o r p h o t o g r a p h i c a s s i s t a n c e .W e a r e a l s o g r a t e f u l t o D r s . H . C h n e i w e i s s a n d J . A . G i r a u l t f o r t h e i rc o m m e n t s o n t h e m a n u s c r i p t . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h eI n s t i t u t N a t i o n a l d e l a S a n t e e t d e l a R e c h e r c h e M d d i c a l e a n dD i r e c t i o n d e s R e c h e r c h e s E t u d e s e t T e c h n i q u e s ( G r a n t 8 7 - 2 0 1 ) .

1 . K i m e l b e r g , H . K . & N o r e n b e r g , M . D . ( 1 9 8 9 ) S c i . Am. 2 6 0 ( 4 ) ,4 4 - 5 2 .2 . Y o n g , V . W . , K i m , S . U . , K i m , M . W. & S h i n , D . H . ( 1 9 8 8 )G l i a 1 , 1 1 3 - 1 2 3 .3 . M u r p h y , S . & P e a r c e , B . ( 1 9 8 7 ) N e u r o s c i e n c e 2 2 , 3 8 1 - 3 9 4 .4 . M u g n a i n i , E . ( 1 9 8 6 ) i n A s t r o c y t e s , e d s . F e d o r o f f , S . & V e r -n a d a k i s , A . ( A c a d e m i c , L o n d o n ) , V o l . 1 , p p . 3 2 9 - 3 7 1 .5 . D e r m i e t z e l , R . , T r a u b , O . , H w a n g , T . K . , B e y e r , E . , B e n n e t t ,M . V . L . , S p r a y , D . C . & W i l l e c k e , K . ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 8 6 , 1 0 1 4 8 - 1 0 1 5 2 .6 . K e t t e n m a n n , H . , O r k a n d , P . R . & S c h a c h n e r , M . ( 1 9 8 3 ) J .N e u r o s c i . 3 , 5 0 6 - 5 1 6 .7 . F i s h e r , G . & K e t t e n m a n n , H . ( 1 9 8 5 ) E x p . C e l l R e s . 1 5 9 ,2 7 3 - 2 7 9 .8 . D u d e k , F . E . , G r i b k o f f , V . K . , O l s o n , J . E . & H e r t z b e r g ,E . L . ( 1 9 8 8 ) B r a i n R e s . 4 3 9 , 2 7 5 - 2 8 0 .9 . K e t t e n m a n n , H . & R a n s o m , B . R . ( 1 9 8 8 ) G l i a 1 , 6 4 - 7 3 .1 0 . M a s s a , P . T . & M u g n a i n i , E . ( 1 9 8 5 ) N e u r o s c i e n c e 1 4 , 6 9 5 - 7 0 9 .1 1 . C o n n o r s , B . W . , B e r n a r d o , L . S . & P r i n c e , D . A . ( 1 9 8 4 ) J .N e u r o s c i . 4 , 1 3 2 4 - 1 3 3 0 .

1 2 . S h i o s a k a , S . , Y a m a m o t o , T . , H e r t z b e r g , E . L . & N a g y , J . I .( 1 9 8 9 ) J . C o m p . N e u r o l . 2 8 1 , 2 8 2 - 2 9 7 .1 3 . E l A o u m a r i , A . , F r o m a g e t , C . , D u p o n t , E . , R e g g i o , H . , D u r -b e c , P . , B r i a n d , J . P . , K r e i t m a n , B . & G r o s , D . ( 1 9 9 0 ) J .M e m b r . B i o l . 1 1 5 , 2 2 9 - 2 4 0 .1 4 . N e y t o n , J . & T r a u t m a n n , A . ( 1 9 8 6 ) J . E x p . B i o l . 1 2 4 , 9 3 - 1 1 4 .1 5 . S p r a y , D . C . , S a e z , J . C . , B u r t , J . M . , W a t a n a b e , T . , R e i d ,L . M . , H e r t z b e r g , E . L . & B e n n e t t , M . V . L . ( 1 9 8 8 ) i n M o d e r nC e l l B i o l o g y : G a p J u n c t i o n s , e d s . H e r t z b e r g , E . L . & J o h n s o n ,R . G . ( L i s s , Ne w Y o r k ) , V o l . 7 , p p . 2 2 7 - 2 4 4 .1 6 . P i c c o l i n o , M . , N e y t o n, J . & G e r s c h e n f e l d , H . M . ( 1 9 8 4 ) J .N e u r o s c i . 4 , 2 4 7 7 - 2 4 8 8 .1 7 . S a e z , J . C . , S p r a y , D . C . , N a i r n , A . C . , H e r t z b e r g , E . L . ,G r e e n g a r d , P . & B e n n e t t , M . V . L . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . USA 8 3 , 2 4 7 3 - 2 4 7 7 .1 8 . De M e l l o , W . C . ( 1 9 8 8 ) i n M o d e r n C e l l B i o l o g y : G a p J u n c t i o n s ,e d s . H e r t z b e r g , E . L . & J o h n s o n , R . G . ( L i s s , Ne w Y o r k ) , V o l .7 , p p . 2 4 5 - 2 5 4 .1 9 . M u r r a y , A . W. & G a i n e r , H . S . C . ( 1 9 8 9 ) i n C e l l I n t e r a c t i o n sa n d G a p J u n c t i o n s , e d s . S p e r e l a k i s , N . & C o l e , W. C . ( C R C ,B o c a R a t o n , F L ) , V o l . 1 , p p . 9 7 - 1 0 6 .2 0 . G i a u m e , C . , R a n d r i a m a m p i t a , C . & T r a u t m a n n , A . ( 1 9 8 9 )P f l u g e r s A r c h . 4 1 3 , 2 7 3 - 2 7 9 .2 1 . E l - F o u l y , M . H . , T r o s k o , J . E . & C h a n g , C . ( 1 9 8 7 ) E x p . C e l lR e s . 1 6 8 , 4 2 2 - 4 3 0 .2 2 . S t o n e , E . A . & A r i a n o , M . A . ( 1 9 8 9 ) B r a i n R e s . R e v . 1 4 ,2 9 7 - 3 0 9 .2 3 . M o b l e y , P . & G r e e n g a r d , P . ( 1 9 8 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA8 2 , 9 4 5 - 9 4 7 .2 4 . E l E t r , M . , C o r d i e r , J . , G l o w i n s k i , J . & P r e m o n t , J . ( 1 9 8 9 ) J .N e u r o s c i . 9 , 1 4 7 3 - 1 4 8 0 .2 5 . S a l o m o n , Y . , L o n d o s , C . & R o d b e l l , M . ( 1 9 7 4 ) A n a l . B i o c h e m .5 8 , 5 4 1 - 5 4 8 .2 6 . P e a r c e , B . R . , C a m b r a y - D e a k i n , M . A . , M o r r o w , C . , G r i m b l e ,J . & M u r p h y , S . ( 1 9 8 5 ) J . N e u r o c h e m . 4 5 , 1 5 3 4 - 1 5 4 0 .2 7 . B u r c h , R . M . , L u i n i , A . & A x e l r o d , J . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . USA 8 3 , 7 2 0 1 - 7 2 0 5 .2 8 . D e G e o r g e , J . J . , M o r e l l , P . , M c C a r t h y , K . D . & L a p e t i n a ,E . G . ( 1 9 8 6 ) N e u r o c h e m . R e s . 1 1 , 1 0 6 1 - 1 0 7 1 .2 9 . S a l m , A . K . , L e r e a , L . , C a s t r o s , H . & M c C a r t h y , K . D . ( 1 9 9 0 )i n N e u r o l o g y a n d N e u r o b i o l o g y : D i f f e r e n t i a t i o n a n d F u n c t i o n so f G l i a l C e l l s , e d . L e v i , G . ( L i s s , Ne w Y o r k ) , V o l . 5 5 , p p .2 7 5 - 2 8 8 .3 0 . C o r n e l l - B e l l , A . H . , F i n k b e i n e r , S . M . , C o o p e r , M . S . &S m i t h , S . J . ( 1 9 9 0 ) S c i e n c e 2 4 7 , 4 7 0 - 4 7 3 .3 1 . L o e w e n s t e i n , W . R . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m . S o c . S y m p . 5 0 , 4 3 - 5 8 .3 2 . A k e r m a n , K . E . O . , E n k v i s t , M . 0 . K . & H o l o p a i n e n , I .( 1 9 8 8 ) N e u r o s c i . L e t t . 9 2 , 2 6 5 - 2 6 9 .3 3 . H e r t z , L . ( 1 9 9 0 ) i n N e u r o l o g y a n d N e u r o b i o l o g y : D i f f e r e n t i a -t i o n a n d F u n c t i o n s o f G l i a l C e l l s , e d . L e v i , G . ( L i s s , Ne wY o r k ) , V o l . 5 5 , p p . 2 2 5 - 2 3 4 .3 4 . W i l k i n , G . P . , M a r r i o t t , D . R . & C h o l e w i n s k i , A . J . ( 1 9 9 0 )T r e n d s N e u r o s c i . 1 3 , 4 3 - 4 6 .3 5 . L e r e a , L . S . & M c C a r t h y , K . D . ( 1 9 8 9 ) G l i a 2 , 1 3 5 - 1 4 7 .3 6 . D u n l a p , K . , T a k e d a , K . & B r e h m , P . ( 1 9 8 7 ) N a t u r e ( L o n d o n )3 2 5 , 6 0 - 6 2 .3 7 . L a u r e n c e , T . S . , B e e r s , W. H . & G i l u l a , N . B . ( 1 9 7 8 ) N a t u r e

( L o n d o n ) 2 7 2 , 5 0 1 - 5 0 6 .3 8 . S a e z , J . C . , C o n n o r , J . A . , S p r a y , D . C . & B e n n e t t , M . V . L .( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 , 2 7 0 8 - 2 7 1 2 .

N e u r o b i o l o g y : G i a u m e e t a l .

giaume (1991) adrenergic regulation of inter cellular comunications in astrocytes

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