genome annotation 2010

23 September 2010 Fernán Agüero

Análisis y anotación de genomas

Fernán Agüero


Historia

• Primer proyecto de secuenciación de un genoma: Escherichia coli (US + Japón). Comenzó en 1992 y terminó en 1997. 4.6 MB

• Primer genoma (eubacteria): Haemophilus influenzae (1995). 1.83 MB

• Primer genoma (archaea): Metanococcus jannaschii (1996). 1.6 MB

• Primer genoma (eukarya): Caenorhabditis elegans (1998). 97 MB

– http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_elegans/Science98

– Hoy

– ~ 140 Eukaryotic genomes

– ~ 1100 Bacterial genomes

– ~ 100 Archaeal genomes


Qué es un genoma?

• Una colección de– genes

• que codifican productos proteicos

• que codifican RNAs

– pseudogenes

– regiones no codificantes

• regulatorias (expresión)

• estructurales

– attachment a matriz nuclear

– mitosis / meiosis

– elementos repetitivos


Qué es anotar?

• Agregar información, de la manera más

confiable y actualizada que se pueda para

describir una secuencia

• Información asociada a coordenadas

genómicas (comienzo..fin), a distintos

niveles

• Interpretar la información cruda de

secuencia en un marco biológico


Anotación genómica

• Dos niveles de anotación

– Estructural: encontrar genes y otros sitios con

relevancia biológica. Armar un modelo del genoma:

cada gen/sitio es un objecto asociado a una posición

en el genoma

– Funcional: los objetos son utilizados en búsquedas

(y experimentos). El objetivo es atribuir información

biológica relevante a los objetos.


Más niveles de anotación

• Organismo: fenotipo: morfología, fisiología,

comportamiento, respuestas ambientales

• Celula: vías metabólicas, cascadas de

señalización, localización subcelular.

• Molecula: sitios de binding, actividad

catalítica, estructura tridimensional

• Dominio

• Motif

• Residuo


De donde proviene la anotación?

• Fuentes utilizadas en la anotación:

– publicaciones que reportan nuevas secuencias

– reviews que actualizan periódicamente la anotación

de familias o grupos de proteínas

– expertos externos

– análisis de secuencia


Anotación genómica

transcription

RNA processing

translation

AAAAAAA

Genomic DNA

Unprocessed RNA

Mature mRNA

Nascent polypeptide

folding

Reactant A Product BFunction

Active enzyme

ab initio gene prediction

Functional identification

Gm3

Comparative gene prediction


Annotation & functional genomics

Gene

Knockout

Expression Microarray

RNAi phenotypes

proteome based functional genomics

La anotación del genoma es esencial en el desarrollo de

estrategias funcionales (functional genomics)


Anotación: busqueda de genes

• Buscar genes en el genoma– RNA

• ribosomal RNAs BLASTN

• tRNAs tRNAscan

– protein coding

• ab initio gene prediction ORFs, codon usage, frecuencia de hexámeros, modelos, etc.)

• similarity BLASTX, otros

• Buscar regiones no codificantes– regulatorias

• ab initio Gibbs sampling

• similarity patterns, profiles

– repetitivas

• similarity

• ab initio

• En todos los casos literatura!


Integrar resultados

Secuenciagenoma

BLASTX

BLASTN

RepeatMasker

tRNASCan

gene prediction

DB

flatfiles

Visualización


Genome annotation: C. elegans

• C. elegans, 1997• Se utilizaban métodos basados en un único algoritmo

• Tendencia actual:• Integrar predicciones de distintos algoritmos

Genome annotation: hoy



Genome annotation

Taverna: a tool for building and running workflows of services.

Nucleic Acids Research 2006 34:W729

http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkl320

• Automated genome annotation

• Pipelines

• Usan scripts (small programs)

• They run in Unix

• Store results in databases

• Or in flat files

• Graphical workflows

• Taverna, http://taverna.sf.net

• Escrito en Java

• Corre en PCs/Macs

• No es necesario instalar bases de datos o software adicional

• Utiliza estos recursos en forma remota

http://taverna.sf.net/

http://taverna.sf.net/


Workflows / Taverna


Resumir resultados de análisis

• Guardar el reporte crudo de un BLAST (lista de hits,

alineamientos) es demasiado

• Prácticamente cualquiera de los análisis que se realizan

sobre DNA o proteínas para anotar un genoma pueden

resumirse en:– secuencia start end

– cromosoma1 1723 3456

• Este formato básico es la base del formato GFF (Sanger)

Secuencia metodo programa start end frame score extra

Contig1 similarity blastx 100 1000 +1 132 gi|12345|AF34093 casein kinase ...

Contig1 cds glimmer 85 1201 +1 1321 ORF0001; overlap with ORF0002

Contig1 similarity blastn 80 1300 . 136 gi|54321|AF09990 complete genome


Anotación: herramientas

• Artemis– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis

– Permite visualizar

• secuencia, con sus traducciones virtuales (6)

• tracks de anotación (entries)

• plots (built-ins y creados por el usuario)

– Lee secuencias en formato FASTA, EMBL, GenBank

– Lee features en formato EMBL, GenBank, GFF, MSPcrunch, BLAST


Artemis: main window

Feature list

Sequence view

Sequence view


Artemis: plots

%GC plot

AA properties

plot para un

CDS


Artemis: display de análisis

Frameplot

BLASTX

BLASTN


Artemis:


Artemis: zoom


Artemis: spliced genes


Artemis: comparar análisis


Otras estrategias

• Artemis se usa para anotar genomas bacterianos o

para pequeños proyectos (cósmidos, BACs, etc.)

• En genomas más grandes, la tendencia es a

distribuir la anotación

• Los tracks de anotación son generados en distintos

centros

• Ejemplo: UCSC Genome Browser (genoma

humano, ratón).


Anotación automática: TrEMBL

• La anotación de TrEMBL (translated

EMBL) se hace por métodos automáticos.

– Requerimientos para anotar automáticamente

• Una base de datos de referencia bien anotada (ej.

Swissprot)

• Una base de datos que sea altamente confiable (en el

sentido diagnóstico) en la asignación de proteínas a

grupos o familias (ej CDD, InterPro)

• Una serie de reglas de anotación


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Anotación automática

• El problema– SwissProt vs TrEMBL (2003)

• Human, chromosome by chromosome

• http://www.ebi.ac.uk/proteome/HUMAN/

Total num

ber of e

ntries (S

P+Tr)

1: 1'6402: 1'0443: 8794: 6305: 7456: 9697: 7528: 5499: 61710: 59411: 97612: 85213: 27514: 50815: 46916: 70617: 53818: 22919: 1'12120: 55421: 17922: 405X: 645Y: 61

Chromosome

% in

Sw

iss-Pro

t

49%


Anotación automática

• Exceso de información– ~ 136,000 secuencias en SwissProt

– Pero mas de 1 millón esperando en TrEMBL para ser incorporadas, luego de pasar por curación manual

– El número de secuencias en TrEMBL crece exponencialmente

• Soluciones– Aumento en la calidad de las anotaciones

automáticas

• HAMAP

– Mejor integración de datos funcionales

– Explorar automatica de la literatura


Transferencia directa de anotación

• Realizar una búsqueda en la base de datos de referencia y transferir la anotación

• Ejemplo: FASTA contra una base de datos de secuencias y transferencia de la línea DE del mejor hit

Target

XDB


Anotación a partir de múltiples fuentes

• Generalmente se usa más de una base de datos externa

• Hay que combinar los resultados

Target

XDB


Conflictos

• Contradicción

• Inconsistencia

• Sinónimos

• Redundancia


Traducción de anotaciones

• Es necesario utilizar un traductor para mapear el lenguaje utilizado en la base de datos externa (XDB) al lenguaje utilizado en la base de datos target que queremos anotar

Target

XDB


Traducciones: algunos ejemplos

ENZYME TrEMBL

CA L-ALANINE=D-ALANINE

CC -!- CATALYTIC ACTIVITY: L-ALANINE=

CC D-ALANINE.

PROSITE TrEMBL/SITE=3,heme_iron

FT METAL IRON

Pfam TrEMBL

FT DOMAIN zf_C3HC4

FT ZN_FING C3HC4-TYPE


Requerimientos de un sistema de anotación automática

• Corrección

• Escalable

• Actualizable

• Poco redundante

• Completo

• Vocabulario controlado


Cómo funciona?

• Una proteína en TrEMBL es reconocida

como un miembro de cierto grupo o

familia de proteínas

• Este grupo de proteínas en Swissprot

comparten entre sí partes de la anotación

• La anotación común es transferida

automáticamente a la proteína en TrEMBL

y marcada como „annotated by similarity‟


Anotación: evidencias

• Las anotaciones suelen estar acompañadas de TAGS que indican la evidencia en la que se basa la anotación

• Ejemplos de algunos TAGS utilizados en TrEMBL:

– EMBL: la información fue copiada del original (EMBL/GenBank/DDBJ)

– TrEMBL: anotación modificada para corregir errores o para adecuarse a la sintaxis propia de Swissprot

– Curator: juicio del curador

– Similarity: por similitud con otra secuencia, a juicio del curador

– Experimental: evidencia experimental de acuerdo a una referencia, que usualmente es un paper.

– Opinion: opinión emitida por el autor de una referencia, usualmente con poca o ninguna evidencia experimental

– Rulebase: información derivada del uso de una regla de anotación automática

– SignalP: programa de predicción


Anotación: manual vs automática

• La anotación de un genoma ocurre en etapas– anotación automática

• correr todos los análisis sobre el genoma

• generar un primer borrador con todos los datos organizados. Por ejemplo en páginas web o integrando todos los datos en un display unificado (Artemis)

– anotación manual: cura de los datos

• una persona (curador) revisa la anotación, gen por gen, verificando la anotación automática, agregando anotaciones manuales, corriendo eventualmente algún programa particular


Qué herramientas se usan?

• Oakridge Genome Annotation Channel– http://compbio.ornl.gov/channel

• ENSEMBL– http://ensembl.ebi.ac.uk

• Artemis– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis

• GeneQuiz– http://www.sander.ebi.ac.uk/genequiz

• Genome browsers: varios– cada consorcio/proyecto desarrolló el suyo: Apollo

(FlyBase, Drosophila), AceDB (C. elegans),


Anotación: fuentes de error

• Transferencia transitiva de anotaciones– gen1 mal anotado como „casein kinase‟ presente en

los bancos de datos

– gen2 con alta similitud con gen1, resulta anotado como casein kinase

• Solución:– usar bases de datos curadas: por ejemplo Swissprot

– revisar la anotación de más de un hit

– verificar que las anotaciones de todos los hits concuerden


Anotación confiable: proyecto HAMAP

• High-quality Automated Microbial Annotation of

Proteomes– Swissprot (Swiss Bioinformatics Institute-European

Bioinformatics Institute)

– CNRS Lyon

– INRIA Grenoble

– INRA Toulouse

– CNRS Marseille

– Pasteur Institute


HAMAP

• Hay muchos genomas bacterianos terminados, pero va a haber

muchos más en los próximos años

• El número de proteínas bacterianas proveniente de estos

genomas llegará al millón muy rápidamente

• Pero el análisis funcional y una caracterización detallada van a

exsitir sólo en unos pocos casos:

– todas las proteínas de organismos modelo (E. coli, B. subtilis)

– proteínas involucradas en patogénesis (interés médico e

industrial)

– proteínas involucradas en vías metabólicas específicas (interés

biotecnológico)


Prioridades del proyecto HAMAP

• Anotación de proteínas huérfanas

• Pre-anotación de proteínas pertenecientes a

familias grandes/complejas (transportadores ABC,

HTH, sistemas de dos componentes, SDH)

• Anotación de alta calidad de proteínas

pertenecientes a familias bien caracterizadas

• Anotación manual de proteínas caracterizadas

experimentalmente en ese organismo

• Anotación manual de proteínas no caracterizadas

que muestren similitud con otras proteínas


Estrategia HAMAP

ORFans


HAMAP: ORFans

• No tienen similitud con otras proteínas (excepto

tal vez otras proteínas de organismos muy

cercanos)

• No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS,

Pfam, ProDom, SMART)

• Qué se hace:– Predicción de señales

– Predicción de regiones trans-membrana

– Predicción de coiled-coils

– Anotación de repeticiones


HAMAP: ORFan antes


HAMAP: ORFan después


HAMAP: large/complex families


HAMAP: anotación automática

• Transferencia automática de anotación– Usando reglas específicas para cada famila de proteínas

– Usando reglas específicas para un organismo particular

• La transferencia de anotación puede ir

acompañada de advertencias para el curador– Por ejemplo:

• WARNING: this genome contains MF_00031 (ruvA) but not

MF_00016 (ruvB)


HAMAP: ejemplo reglas


HAMAP: Escherichia coli

• De acuerdo al análisis original: 4286 proteínas

– 60 proteínas no detectadas (casi todas < 100 aa)

– 120 muy probablemente no existan

– 50 pares o tripletes de ORFs tuvieron que ser fusionados

– 719 con errores en la asignación del codón de inicio

– ~1800 todavía sin caracterización bioquímica

(aproximadamente una asignación funcional por semana)

Malaria

Plasmodium falciparum & vivax

Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis

Leprosy

Mycobacterium leprae

Toxoplasmosis

Toxoplasma gondii

Filariasis

Brugia malayi

African trypanosomiasis (Sleeping sickness)

Trypanosoma brucei

Leishmaniasis

Leishmania major

American trypanosomiasis (Chagas Disease)

Trypanosoma cruzi

Schistosomiasis

Schistosoma mansoni

TDR Targets is an online [resource, database, tool] that integrates genomicinformation relevant for drug discovery on pathogens that cause human diseases.

TDR Targets facilitates the prioritization of targets in complete genomes by allowingusers to search for targets using defined criteria AND to weight these searches.

Annotation of phenotypes in TDR Targets

http://tdrtargets.org

Agüero F. et al. (2008) Nat Rev Drug Discov 7: 900

Curation of phenotype data

• Human curator– Reads the literature

– Extracts knowledge about target validation

– Is target essential for growth / survival?

– Is target assayable?

– Is target expressed in a relevant stage?

– Is target druggable?

– Incorporates these data into the database using a controlled ‘pheno-syntax’

• Pheno-syntax – Uses controlled vocabularies (ontologies)

– Builds easily readable phenotype descriptions

– Mungall C. et al. (2010) Genome Biol 11: r2

Annotation using pheno-syntax

53 Fernán Agüero

GO:Catalytic activity

PATO:Decreased

MI: in vitro

Decreased catalytic activity in vitro, inferred from specific protein inhibition

ECO: inferred from specific protein inhibition

Ontologies Phenotype Desctiption


54 Fernán Agüero

Normal gene expression in amastigotes, inferred from protein expressionDecreased catalytic activity in vitro, inferred from specific protein inhibition


• cAMP raising drugs– Decreased growth in promastigotes, inferred from bioassay

– Disrupted cell differentiation in promastigotes, inferred from bioassay

• Antimicrotubule agents– Abnormal morphology in promastigotes, inferred from visible phenotype

– Discontiunous cytokinesis in promastigotes, inferred from visible phenotype

• Double knockout– Disrupted autophagy in metacyclic form, inferred from loss-of-function mutant

phenotype

• Some numbers– 737 genes with annotated phenotypes

– 407 genes with phenotypes corresponding to ‘genetic validation’

– 306 genes with phenotypes corresponding to ‘pharmacological validation’

55 Fernán Agüero

56 Fernán Agüero


Chromosome browsers

• UCSC Genome Browser– provee un display rápido de cualquier región genómica

– con varios “tracks” de anotación alineados al genoma

– Por el momento sólo: Human & Mouse

• Annotation tracks– genes conocidos (RefSeq, GenBank)

– predicted genes (Genscan, FGENESH, GeneID, Acembly)

– spliced ESTs

– CpG islands

– assembly gaps

– cobertura

– bandas cromosómicas

– elementos repetitivos

– etc


UCSC Genome browser

• UCSC sólo genera la mitad de los tracks

• El resto proviene de la comunidad biomédica

• El Genome Browser es una herramienta de visualización

• No saca conclusiones! Simplemente integra en forma gráfica toda la información que posee sobre una región, dejando la exploración y la interpretación al usuario.


UCSC Genome Browser: gene expression


UCSC Genome browser: alternative splicing


UCSC Genome browser: complex transcription


UCSC Genoma browser: user tracks

• Ustedes pueden agregar sus propios tracks

• Pueden ser públicos o privados

• No necesitan saber programar

• Tienen que proveer información en formato GFF (u otros similares: GTF, BED)

chrom start end [name strand score]

chr1 1302347 1302357 SP1 + 800

chr1 1504778 1504787 SP2 – 980


Ejemplo

• Secuenciación de ESTs de Tupaia belangeri– Mamífero pequeño

– Bibliotecas de cDNA sustractivas de hipocampo

Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702


Anotación ESTs

• Anotación y clasificación funcional de los ESTs

Alfonso et al J Neurosci Res (2004) 78: 702


ESTs Tupaia

• ESTs que mapean en intrones de genes conocidos


ESTs Tupaia

• ESTs que mapean dentro de intrones de genes conocidos


Acknowledgements

• Nicola Mulder, EBI

• Daniel Lawson, Sanger Centre