Genoma Umano e malattie genetichelezione 3-4

Martedì 5 Maggio

le regioni regolative

non ci sono molti esempi già studiati

il primo classico è quella del locus della globina

una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico

a livelli superiori mancano degli esempi più chiari

potrebbero mancare oppure sono da scoprire

regioni regolative con funzione bidirezionale

per ora gli esempi più chiari stanno nelle Regioni Regolative costituite da Enhancers

questo livello è molto vicino alla attività trascrizionale dei geni che controllano e che costituiscono il cluster genico

questo tipo di controllo può essere bidirezionale:

TOP - DOWNBOTTOM - UP

esempio del cluster delle Ig

con la regolazione dell’espressione delle Ig sono collegate molte altre funzioni che sono coregolate o coordinate

il coordinamento deve prevedere: - interazioni intracellulari- “ extracellulari

intracellulari: sopravvivenza, selezione, controllo moltiplicativo

extracellulari: interazioni con le altre cellule della risposta immune “cross talking” tramite interleukine

la risposta immunitaria è data dall’interazione di molte cellule e di molte funzioni collegate

partiamo da un esempio

un sistema piuttosto noto ed interessante

la regolazione delle immunoglobuline e dei linfociti B

la maturazione e l’attivazione vanno di pari passo

sistema multifattoriale

esempio di interazione genoma ambiente

the study of the 3’RR

different aspects of the study of a regulatory region

interactions of a regulatory region: unidirectional flux ?

the jerarchy of the regulation

interactions of genome and environment

the genome is controlled by epigenetic events

these events open the possibility of a non univocal flux

needs to be bidirectional

TOR VERGATA

interactions and jerarchy

epigenetic modifications of the region:

nucleosome remodeling; methylation

TOR VERGATA

tools for a RR study

the tools : - evolutionary conservation and transformations - polymorphisms in humans (any kind!) - transgenic models in mouse - in vitro assays with cell lines (mouse and human)

TOR VERGATA

“La regione regolativa 3’ della catena pesante delle Ig: struttura e funzioni”

- processi di maturazione ed interazioni- cluster delle IgH (heavy) e struttura della regione regolativa

- processo evolutivo- instabilità e regioni duplicate

- nell’uomo la regione IgH3’RR duplicata - l’enhancer HS1,2-A/B è duplicato e polimorfico- studio dell’attività tramite geni reporter in cellule trasfettate- studio dei fattori che legano la sequenza enhancer EMSA

La tragedia dei linfociti B nati per morire all’ 80%Il 20 % che sopravvive svolge il suo ruolo solo nella vecchiaia(a parte le memory cells che sono minoranza)

cascata di fosfatasi e kinasi

nel processo di maturazione dei linfociti B si verifica una cascata di segnali

CD45Rap 1 MAPKs

prima degli eventi di riarrangiamento messo in moto dal preBCR

ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE

CE

LL

UL

E B

VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana

Locus Catene pesanti

Locus Catene leggere

VDJriarrangiato

VJriarrangiato

VJriarrangiato

V-Jprocessing

VDJriarrangiato

V-DJprocessing

D-Jprocessing

VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana.

Lo splicing produce anche

IgD

Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

maturazione

CE

LL

UL

E B

Locus Catene pesanti

Locus Catene leggere

ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE

VJriarrangiato

VJriarrangiato

VJ riarrangiato Ipermutazioni

somatiche

VJ riarrangiato Ipermutazioni

somatiche

VJ riarrangiato Ipermutazioni

somatiche

PlasmacellulePlasmacelluleCellule MemoriaCellule B attivate

Centrociti

VDJ riarrangiato. Le catene prodotte in

forma di membrana

Switch isotipico a C, C o C. Ipermutazione

somatica

Switch isotipico. Ipermutazione

somatica. Catene pesanti prodotte in

forma di membrana

Switch isotipico. Catene pesanti

prodotte in forma secreta.

VDJ riarrangiato Catene prodotte in forma secreta.

Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

maturazione II

PLASMACELLULE

Cellule B proliferanti

Cellula B attivata (centroblasto)

IL-2; IL-4; IL-5;

IgG2a o IgG3

IgA o IgG2b

IgE o IgG1

IgM

IFN-

IL-4

TNF-

IL-2; IL-4; IL-5;

Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5;

Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-TNF-

Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)

cellule denditriche e T-helper

induzione dello switch

VH DH JH CH

Ricombinazione V(D)J

V(D)J

Risultato dello switch Circolo exciso

Ricombinazione class switching (CSR)

b a

V(D)J

IgM

IgE

2b

2a

Switch region:

• Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb

• Il filamento non stampo è ricco in G

• S, S ed S hanno un repeat di 5 bp. S ha un repeat di 49 bp.

Fig. Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

ricombinazione

Locus catena leggera

Locus catena leggera

Locus catena pesante

Cromosoma 22

Cromosoma 2

Cromosoma 14

LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig

mappe dei loci IgH e IgL

A B C D FETrascrizione regione S

RNA editing ?

AID? AID?

AID?AID?

CSR ricombinasi?

Riconoscimento delle regioni S accessibili

Formazione di breaks al DNAA

B C D FE

AB C

AB C D FE

AB C

CSR ricombinasi?

Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili

Formazione di strutture secondarie (R loop?)

Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA

Riparazione dei breaks

SSS S c-myc

una regione Sdue regioni S Switch su un altro cromosoma

traslocazioneClass switching recombination

AAA B B E FC

Delezioni intra-switch

Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).

1

2

il riarrangiamento

Activation-induced cytidine deaminase (AID)

espressione nelle fasi di sviluppo Sviluppo dei linfociti B indipendente dall’ antigene

pro-B “committed” esprimono B220 (CD45) e anche CD 43,TdT terminal deossitransferasi, RAG-1, RAG-2, CD19

pre-B diminuzione di CD43, RAG-1 e 2, scomparsa di TdT,riarrangiamento della catena pesante, pBCR pre B cellreceptor, riarrangiamento produttivo della catena leggeraespressione di membrana di IgM

Trascrizione dei surrogati delle catene leggere Ig /formano il pre-B cell receptor complex di membranaessenziale per le fasi di sviluppo

(CD45 - B220 - fosfotirosin fosfatasi PTPase integra i segnali durante lo sviluppo, non necessario per la linfopoiesi, forse è un’attività ridondante)CD19 interagisce con le tirosin-kinasi, non è essenziale, però favorisce l’entrata nel circolo periferico

maturazione nel germinal center

avviene in associazione intima con cellule THelper e cellule dendritiche del follicolo :

-proliferazione clonale

-ipermutazioni somatiche

-selezione di affinità (self ed altro)

-selezione negativa

-switch isotipico

strutture regolative della trascrizione e indirettamente del riarrangiamento delle IgH

promotori dei geni V enhancer intronico iEECS (evoluz. conserved seq.) intervening 5’ CH genes

3’ Ig heavy 3’ enhancer complex o regulat. regionk intronico iE3’E light chain E

si attivano per la trascrizione sterile insieme a RAG1/2 con altri enzimi del riparo, variazione di metilazione e di struttura cromatinica, gli enhancers necessari anche per la ricombinazione V(D)J

I riarrangiamenti sono regolati da fattori di trascrizione ubiquitari e tessuto specifico

Cluster organization:

Translocon organization:

Sharks (hom shark)- multiple loci of each type except IgMgj

Channel catfish (700 - 800kb)

lungfish

coelacanths

Xenopus (~800 kb)

Duch and chicken

Cattle

Rabbit

Mouse

Human

IgM

IgM

IgM

IgM

IgNAR IgW IgM1gj

IgW

IgY IgX

E

E

E E

(V DDJ C)200 (V DDDJ NAR)>2 (V DD J C)<10 (VD J C1gj)<10 (multiple chromosomes)(not L chain-associated)

many V’s VDJ D,J’s

C

100-200 V’s D’s

9J’s

C Csec Cmem

several V’s Presumptive arrangement

CD, J’s several V’s CD, J’s

VD’s(>100) J’s C VD’s(>100) J’s C

V’s(100-200) D(>15) J(8-9) CS C S C S

pseudoV’s(~100) V D’s J CS C SC S

V’s(~15) D(>3)

J(2)

SC SC

SC

SCSCSCSC

V’s(~100) D(14)

J(6)

SC SCSCSC SCSC SCSCSC

V’s(~100) D(14)

J(4)

SC S CS CC SCb SCaSC SC

V’s(~100) D(27)

J(6)

SC S CS CC S SC SC SCS CS C

350 kb

200 kb

13 C genes

150 kb (cattle)

48 kb (duck); 80kb (chicken)

Transcriptional orientation

E

E

E

?

7 geni costanti

forse 13 geni costanti

8 geni costanti

10 geni costanti

dipnoi

crossopterigi (latimera)

teleostei

evoluzione delle Ig

Mouse Igh cluster Chromosome 12

Human Igh cluster Chromosome 14

12F1

14q32.33

mta1

mta1

JDV

JDV

mta1 crip2 crip1 hole

mta1 crip2 crip1 hole

a b

J D V

J D V

elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 1

3’1

hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs320bp 2

3’2

hs 4

hs 3

Bhs

1,2

hs 3

A

hs 4

hs 1

,2hs

3

hs 4

hs 1

,2hs

3

3’2 3’1

BAC199M11(AF450245)

86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,00086,060,000

85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500

centromero telomero

trascrizione

IgH3’RR-A

IgH3’RR-B

(rischio riarrangiamenti)

cluster Ig topo-uomo