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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU---------------------------------

Unité de Formation et de RechercheEn Sciences de La Santé

U.F.R. – S.D.S.

COURS DE GENIE GENETIQUE

NOTES DU COURS:

Prof. Jacques K. SIMPORE,

…AATCGCCGTCCGATTCCGTCACGC…….TTAGCGGCAGGCTAAGGCAGTGCG…

Noyau cellulaire

Double brin d’ADN

Chromosome

Cellule

…AATCTTGCCGGGTTCCCG……TTAGAACGGCCCAAGGGC…

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Le Serment éthique pour les chercheurs en sciences de lavie, adapté et inspiré du Serment d'Hippocrate médical,

(Science Vol. 286, 19 Nov. 1999, p.1475).

« Je jure d'être fidèle à l'éthique du respect des personnes et des vies humai-nes et de contribuer au développement de la connaissance et à la plus large

diffusion du savoir.

Je respecterai toutes les espèces dans leur biodiversité : ce respect inspirerames actes et mes projets, notamment au cours de mes expérimentations sur

les animaux ou les tissus humains.

Je m'efforcerai de soulager les souffrances de tous les êtres vivants.

Admis(e) à avoir accès à l'intimité tissulaire ou génétique des personnes, jetairai leur identité et m'astreindrai au secret médical.

Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contreles lois de l'humanité.

Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission.

Je m'informerai et réfléchirai au sens de mes expérimentations et à leursconséquences.

Je veillerai à ce que mes travaux et recherches ne soient pas utilisés à desfins de destruction ou de manipulation.

Je respecterai les savoirs des ethnies et des sociétés traditionnelles.

Je n'aurai garde d'oublier mes responsabilités à l'égard des générations pré-sentes et futures.

Je n'accepterai pas que des considérations de nationalité, de culture, de poli-tique ou d'avantages matériels me détournent de mes devoirs.

J'interviendrai pour défendre, s'il m'en est donné l'occasion, l'ensemble de cesrègles.

Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle àmes promesses.

Que je sois déshonoré (e) et méprisé (e) si j’y manque ».

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PagesSERMENT POUR LES CHERCHEURS EN SCIENCES DE LA VIE 02INTRODUCTION 05

PREMIERE PARTIE:LES OUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE 07

CHAPITRE I : 08TECHNIQUES D’EXTRACTION, DE CONTRÔLE DE PURETEET DE QUANTIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES,

I. Extraction, précipitation de L’ADN des eucaryotes et des procaryotes 08II. Contrôle de la pureté de l'ADN extrait 10III: Quantification de l'ADN

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CHAPITRE II : LES VECTEURS : PLASMIDES, PHAGES, COSMIDES, 13 YAC, BAC, VIRUS

I- Les vecteurs en génie génétique : l'ADN plasmidique 13II- L'ADN phagique 17III. Cosmides, YAC et BAC 20

Chapitre III: ENZYME DE RESTRICTION, ÉLECTROPHORÈSE, 24CARTE DE RESTRICTION

I. Enzymes de restriction 24II. L’électrophorèse sur gel 30III. Les enzymes utiles en génie génétique: 31

CHAPITRE IV: CLONAGE ET ÉTUDE DE L’ADN CLONÉ. 36I - Le clonage 36II - Les banques génomiques 36III - Les banques de cADN 38IV - L’étude de l’ADN cloné 40

CHAPITRE V: MUTAGENÈSE IN VITRO, EXPRESSION DES GÈNES 51EUCARYOTES DANS LES BACTÉRIES.

I - Les mutagenèses 51II. Mise en évidence des effets de la modification 56III. Transfert de l’ADN modifié 57

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DEUXIEME PARTIE : APPLICTION DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE :LE GENIE GENETIQUE 59

CHAPITRE VI: LES TECHNOLOGIE DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEESAUX MICRO-ORGANISMES 60

I. La technique de l'ADN recombinant (ADNr) 60II – Synthèse du facteur VIII humain 63III – Synthèse de l’insuline humaine 63IV - Synthèse de l’hormone de croissance (GH) 64V – Production de vaccins 64

VI - Production de nouvelles antibiotiques 65 VII – Production d’aliments fermentées 68

CHAPITRE VII:LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEES AUX VEGETAUX 71

I. – Le plasmide Ti 71II – Le Terminator 73III – Application des techniques du génie génétique à l’agriculture 77

CHAPITRE VIII :LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEES AUX ANIMAUX 82 I – Les insectes transgéniques 82 II – Les animaux transgéniques 83

CHAPITRE IX : CLONAGE DES MAMMIFERES, PARTHENOGENESE,CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES, THERAPIE GENIQUE 87

I – Clonage des organismes entiers 87 II – Les cellules souches embryonnaires 88

III - La parthénogenèse: 93 IV - La thérapie génique: 93

CHAPITRE X :LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEESDANS LA RECHERCHE SUR LE VIH/SIDA 98

I – Structure du VIH 98II - Les nouvelles molécules antivirales en développement: 99III. Vers l’espoir d’obtenir un jour un vaccin anti-VIH. 100IV. Le génie génétique et la lutte contre le VIH. 101

PHARMACOGÉNÉTIQUE ET PHARMACOGÉNOMIE 107

I - Généralité : Pharmacogénétique et pharmacogénomie 107 II - Les désordres pharmacogénétiques 111

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BIBLIOGRAPHIE 120

INTRODUCTION

Les méthodes et les techniques de biologie moléculaire développées durantces dernières décennies, pour séquencer, « recombiner », transférer et analyser lesproduits de l’expression du matériel génétique des diverses espèces vivantes ontdonné lieu à une application sous le nom de « génie génétique ».

Le transfert transitoire ou stable d’un DNA étranger dans une cellule proca-ryote ou eucaryote s’opère grâce à des vecteurs naturels et à de nouveaux vecteursissus des constructions: plasmides, bactériophages, virus, cosmides etc. Ces tech-niques doivent permettre une meilleure compréhension génétique et fonctionnelledes organismes vivants.

Le génie génétique permet :

• d’identifier et d’isoler,• de modifier et de transférer,• de cloner et d’amplifier,• de contrôler l’expression d’un gène ou d’un transgène dansle matériel biologique.

Il s’agit donc d’un outil, aux applications très variées qui permet d’interveniravec une grande précision sur le patrimoine génétique de tous les organisme vi-vants.

Cette technique permet d’identifier un gène spécifique parmi les 30.000 gè-nes environ que compte l’être humain, de l’amplifier afin qu’il soit plus facile d’accès,de le découper et de l’isoler ensuite des autres molécules d’ADN. Le gène isolépeut, à la fin, être réinséré dans une molécule d’ADN d’origine différente, ce quipermet de transférer de l’information génétique d’une cellule vers une autre danslaquelle il pourra diriger la production d’une protéine particulière, dont il code et dé-termine la structure (Projet Séquençage génome humain février 2001).

Le résultat obtenu au cours de cette manipulation est la protéine originelle dupremier organisme. Cependant, le génie génétique permet également d’apporter desmodifications à des gènes par une mutagenèse dirigée qui par conséquent produi-ront des protéines modifiées ou recombinantes.

Les applications directes de la biologie moléculaire:

• En biotechnologie: le génie génétique permet de faire produire par desmicro-organismes recombinants des protéines eucaryotes comme des hormones,des vaccins, des anticorps monoclonaux et il offre des perspectives nouvelles dans

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l’industrie agroalimentaire, dans l’amélioration génétique des espèces animales etvégétales.

• En médecine: le but du génie génétique est la prédiction, le diagnostic desmaladies héréditaires et leur soin à travers la thérapie génique et la pharmacogéné-tique. La thérapie génique somatique qui est différente de la thérapie génique ger-minale, consiste à transférer certains gènes dans les cellules du patient pourprévenir l’apparition d’une maladie ou en ralentir l’évolution. Ce type degénothérapie suscite de très grands espoirs.

• Protection sociale et législation: La médecine «légale» à travers la tech-nique de l'ADN «finger printing» peut individualiser une personne humaine sanséquivoque car cette technique ne requiert que quelques cellules de la personneconcernée (cellules sanguines, cellules épithéliales, cellules osseuses ou simple-ment quelques boucles de cheveux).

• Perspective pour demain: avec le projet du génome humain et la techni-que du clonage positionnel, les génies généticiens cherchent à localiser et à sé-quencer non seulement les gènes responsables des maladies héréditaires maisaussi la totalité du génome humain pour créer la cartographie génique de l’homme,des micro chips. Aujourd’hui, le génome humain a été entièrement séquencé ; maisune nouvelle problématique se pose: comment déterminer les interactions existan-tes entre les 20.000 à 30.000 gènes de l’organisme humain ?

Le génie génétique possède, sans doute, aujourd’hui un champ d’applicationtrès large et nous ouvre des perspectives nouvelles. Il s'agit incontestablementd’une technologie clé pour ce troisième millénaire. Cependant, comme toute techni-que, le génie génétique a ses limites. Ainsi, dans un organisme vivant, la productiond’une protéine de nature et de fonction données peut nécessiter des informationsprésentes à plusieurs endroits de l’ADN. Ces informations plus complexes et pluscomplètes peuvent amener un gène à produire de façon différente une même pro-téine selon l’état physiologique de la cellule, de son stade de développement ou dedifférenciation. Plusieurs gènes doivent donc s’associer dans ce processus, afin defournir à l’organisme les quantités et les qualités précises de cette protéine en fonc-tion de son rôle biologique.

Si la technologie génétique sait parfaitement identifier, isoler et modifier ungène particulier, elle a beaucoup plus de difficultés à l’heure actuelle pour détermi-ner les liens existant entre les différents gènes. Leur transfert et leur expression,parfois ectopique, posent encore des problèmes qui restreignent, pour l’instant, lechamp d’application du génie génétique.

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PREMIÈRE PARTIE :

LES OUTILSDE LA BIOLOGIEMOLECULAIRE

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CHAPITRE I :TECHNIQUES D’EXTRACTION, DE CONTRÔLE DE PURETEET DE QUANTIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES,

I. EXTRACTION, PRÉCIPITATION DE L’ADN DES EUCARYOTESET DES PROCARYOTES

Toutes les méthodes biochimiques qui permettent d’extraire l’ADN dans lesdifférents tissus peuvent être utilisées en fonction des espèces, et en tenant comptede la structure anatomique des cellules. Nous prendrons comme exemple, les cellu-les eucaryotes humaines, en l’occurrence les cellules sanguines qui sont très ac-cessibles compte tenu de la moralité et du bénéfice du doute.

Pour ce qui concerne le génome humain comme pour tous les mammifères,les leucocytes sanguins constituent une source simple de DNA pour les études debiologie moléculaire.

Un prélèvement de 5 à 10 ml de sang recueilli sur un anticoagulant commel'EDTA, permet d’obtenir quelques centaines de microgrammes de DNA sous laforme de fragments de taille supérieure à 20 kbases. Cette quantité est suffisantepour entreprendre une expérience d’application en génie génétique.

1. La lyse des cellules eucaryotes.

La lyse des cellules sanguines met en jeu l’intervention de détergents ioni-ques qui désorganisent la double couche de phospholipides des membranes cellu-laires. Le sang fraîchement recueilli (avec un anticoagulant comme l’EDTA) ou dé-congelé est vigoureusement mélangé à une solution hypotonique pour faire éclaterles hématies dépourvues de noyaux. Les leucocytes sont alors récupérés par centri-fugation suivie d’un lavage avec la même solution hypotonique.

Ils sont ensuite traités par un mélange de détergent, comme le SDS (SodiumDodécylSulfate) qui permet de désagréger les membranes cellulaires et de libérerles contenus cytoplasmiques et nucléaires. En biochimie classique et pour d’autresapplications, il faut d’abord séparer les noyaux du contenu cytoplasmique et de cesorganites cellulaires. Un traitement par la protéinase K (une protéase) permet delibérer le DNA nucléaire en digérant les histones qui lui sont associées dans leschromosomes eucaryotes.

L'élimination des protéines non digérées et des lipides se réalise par des pré-cipitions et des extractions sélectives. Le mélange phénol-chloroforme permet dedénaturer les protéines car non miscible à l’eau et de densité supérieure à cette der-nière. Les acides nucléiques n'y sont pas non plus solubles et restent dans le sur-nageant aqueux.

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Pour les tissus, il est conseiller de les désagréger par les techniques couran-tes de biochimie comme le broyage ou les ultrasons. Une congélation préalablepermet de transformer les tissus en une masse solide qui se prête alors à unconcassage par les techniques courantes de broyage. L’extraction et la purificationsuivent alors le même protocole.

2. L’ADN des procaryotes

Le schéma de la figure I.2 résume les différents étapes de l’extraction et de lapurification de l’ADN d’Escherischia coli, la bactérie la plus utilisée pour les analysesen biologie moléculaire. La lyse cellulaire utilise ici une enzyme : le lysozyme quipermet de dégrader la membrane cellulaire. La purification suit le même schéma quepour celle de l’ADN des eucaryotes.

3. L’extraction de l’ADN par le mélange phénol / chloroforme.

Le mélange phénol-chloroforme non miscible à l’eau permet de transférer lesprotéines dans la phase organique alors que les acides nucléiques restent dans laphase aqueuse. La phase aqueuse résultante peut subir plusieurs extractions par unmélange chloroforme-éther pour éliminer les peptides restants, les traces de phénolet des composés organiques qui y sont solubles. Les acides nucléiques sont alors àrécupérer de la phase aqueuse par des précipitations à l’alcool éthylique ou àl’isopropanol en fonction des besoins. On obtient alors les acides nucléiques sous laforme de fibres solides que l’on récupère par centrifugation.

Pour des études biochimiques fines de structure, il convient de procéder àd’autres purifications. Pour les analyses génétiques (application des diagnostics deroutine), le DNA obtenu est de qualité suffisante et peut être quantifié par simplepesée.

L'élimination de l'ARN peut être effectuée à la fin ou avant l'étape phénoli-que. Pour cela, on utilise une RNAase pure ou "DNAase free", c'est à dire, dépour-vue d'activité DNAase.

L’ADN récupéré sous forme de fibres peut être conservé sous la forme solidependant des temps très longs. Il peut aussi être re-dissout dans un tampon stérile deforce ionique moyenne contenant de l'EDTA et dont le pH est compris entre 7 et 8

Figure I.1 : Méthode classique de l’extraction et de la purification de l’ADN

Figure I.2/I.3 : Organigrammes de l’extraction et de la purification de l‘ADN des pro-caryotes

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4. Extraction des ARN

Les ARN sont plus difficiles à étudier parce qu’ils sont très sensibles aux ri-bonucléases (RNase A) qui sont très actives et présentes même sur les doigts dumanipulateur. Elles peuvent résister à un traitement à 90°C pendant une heure. Ilfaut donc des conditions de stérilité parfaite pour travailler avec ces acidesnucléiques. Pour l’extraction, les tissus ou les cellules sont homogénéisés dans un tam-pon acétate contenant : - Un détergent puissant (SDS ou sarcosyl) - Un agent dissociant (thiocyanate ou guanidine) - Un agent réducteur (DTT ou 2-mercaptoéthanol)

Ce type de tampon permet d’inhiber les RNases endogènes, de dénaturer lesacides nucléiques et de dissocier les protéines. Après une centrifugation pour élimi-ner les débris cellulaires, les RNA sont extraits suivant plusieurs techniques. Latechnique par précipitation différentielle du RNA et du DNA en fonction du pH et dela concentration en éthanol donne de très bons rendements. On peut également uti-liser l’ultracentrifugation. Le culot est récupéré, lavé avec le tampon acétate et pré-cipité à l’éthanol. Il peut se conserver congelé à –70°C pendant un an.

II. CONTRÔLE DE LA PURETÉ DE L'ADN EXTRAIT

Le maximum d'absorption des acides nucléiques se situe à 260 nm. Les pro-téines, principaux contaminant des préparations absorbent aussi à 260 nm, maisavec maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à cause des acides aminésaromatiques. Le rapport R= A260nm / A280nm constitue alors un bon moyen pour appré-cier une éventuelle contamination de la préparation d'ADN par les protéines ou parles RNA. Une contamination par les ARN se traduit par une augmentation du rapport R.Les ARN étant en simple brin, le coefficient moyen d’absorption d’un nucléotide estsupérieur à celui du même nucléotide dans la double hélice à cause del’hypochromisme.

*R = A260nm/A280nm

* ADN pur: 1,8 < R < 2 * ADN contaminé par les protéines: R < 1,7 * ADN contaminé par les ARN: R > 2

Le spectre d'absorption U.V. permet également d’estimer les contaminationséventuelles et permet aussi de quantifier l’ADN de la préparation. L’apparitiond’épaulements donne une idée des différents contaminant. -Un épaulement à 280 nm indique une contamination protéique. -Un épaulement à 270 nm indique une contamination par phénol.

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-Un épaulement à 230 nm indique une contamination par les glucides. -En absence d'impuretés l'absorbance de la solution d’ADN à 320 nm doit

être autour de zéro.Figure I.4 : Spectre d’absorption de l’ADNIII: QUANTIFICATION DE L'ADN

a. - Dosage colorimétrique de l'ADN

Il est basé sur la réaction spécifique des 2-désoxypentoses avec la diphény-lamine. En milieu acide à chaud, le 2-désoxyribose des nucléotides puriques peutêtre libérés et former un composé bleu dont le maximum d'absorption se situe à 595nm. C’est la méthode classique pour mesurer des quantités importantes de DNA (del’ordre de quelques milligrammes).

b: Dosage par absorption U.V. de la concentration en ADN

A 260 avec un trajet optique de 1 cm, une unité d'absorbance correspond àune concentration d’ADN double brin de 50 µg / ml. La concentration de l’ADN d’unepréparation peut être alors calculée par la relation :

A= ε.C.l =

Une unité d’absorbance correspond à 25 g/ml de RNA ou d’ADN simple brin.Malheureusement, cette méthode est peu sensible pour manipuler des concentra-tions d'ADN inférieures à 250 ηg/ml

c. Dosage de l'ADN par fluorescence en présence de BET

Le Bromure d'Ethidium (BET) interagit avec l'ADN en s’y intercalant et unefois intercalé, le rendement de fluorescence du colorant devient cent fois plus impor-tant. Le principe de la quantification consiste à comparer à l’ il nu (estimation), oumieux après photographie, l'intensité de la fluorescence émise par l'ADN sur un geld’électrophorèse. La quantification exacte consiste alors à établir une courbed’étalonnage donnant l’intensité de fluorescence d’une solution de BET à laquelle onajoute des quantités croissantes de DNA de concentration connue. (Gamme d'éta-lonnage). Par cette méthode on peut déceler des quantités de DNA de l’ordre de 50ηg/ml.

d. Dosage fluorimétrique classique de l'ADN.

On utilise un spectrofluorimètre pour mesurer l'intensité de la fluorescenced'une solution d'ADN en présence d'un excès de BET. On compare ensuite les va-leurs de ces intensités avec celle d'une solution d'ADN standard (courbe standard).Le BET peut être remplacé par un autre colorant pour augmenter la sensibilité de lamesure. Cette méthode permet de mesurer des quantités d’ADN de l’ordre de quel-ques picogrammes.

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CHAPITRE II : LES VECTEURS : PLASMIDES, PHAGES, COSMIDES,YAC, BAC, VIRUS

I - LES VECTEURS EN GÉNIE GÉNÉTIQUE : L'ADN PLASMIDIQUE

1. Les plasmides.

a : Définition :

Les plasmides sont de petites molécules d'ADN bicaténaires, circulaires,extra-chromosomiques, susceptibles de se répliquer de façon autonome (réplicons).Ils sont présents dans le cytoplasme de nombreuses espèces bactériennes. LeurADN comprend au minimum les gènes intervenant dans la réplication et la ségréga-tion de leur matériel génétique dans les cellules filles à chaque cycle de division cel-lulaire de la cellule hôte Figure II.1.

La plupart des plasmides naturels contiennent des gènes qui confèrent àl'hôte des propriétés supplémentaires comme la résistance aux antibiotiques. Unebactérie peut posséder en même temps plusieurs plasmides différents sauf si leurco-habitation est incompatible avec la survie de la bactérie.

Une bactérie peut posséder un très grand nombre de copies plasmidiques. el-les sont transférables d’une bactérie à une autre au cours de la conjugaison bacté-rienne. Leurs utilisations majeures comme vecteurs en génie génétique sont :

Le clonage et l'amplification d'une séquence d'ADN exogène. L'étude des mécanismes de l'expression d'une séquence d'ADN exogène. L'introduction des gènes dans les cellules bactériennes (transformation) ou

animales (transfections) ou dans des organismes entiers (animaux transgéniques). A l'échelle industrielle, la production des protéines codées par les gènes

contenus dans l’ADN inséré.

b : Caractéristiques des plasmides utilisés en génie génétique

La cellule hôte la plus utilisée est Escherichia coli. Les plasmides naturels ditsde première génération ont été utilisés dans le passé comme vecteur de clonage,mais les plasmides utilisés actuellement sont modifiés et sont donc des chimèresobtenues par des recombinaisons de différents plasmides naturels et de DNA viral.Ils sont petits de taille pour permettre l'insertion d'une importante quantité d'ADNexogène tout en maintenant une bonne efficacité de transformation. Ils possèdent :

Une origine de réplication de type relâché : la séquence ori. Le nombre decopies par cellule est très important (plusieurs centaines par cellule)

Un gène de résistance à un antibiotique auquel la souche hôte est sensi-ble, ce qui permet la sélection des cellules résistantes qui survivent sur un milieucontenant l’antibiotique en question.

Un second gène marqueur phénotypique (soit un deuxième gène de résis-tance à un second antibiotique ou le gène Lac Z' ) qui permet de reconnaître parmiles colonies transformées celles qui hébergent un plasmide recombinant.

Un ou plusieurs sites de restriction (polylinker) qui permettent la linéarisa-tion du plasmide préalable à l'insertion de l'ADN exogène.

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c : Deux vecteurs plasmidiques : pBR 322 et pUC18

Le plasmide pBR322 est très simple dans sa structure. Il contient 2 gènes derésistance aux antibiotiques, tetR et ampR. Chacun de ces gènes contient un site derestriction qui est utilisé pour le clonage. L'ADN du donneur peut être, par exemple,inséré dans le gène tetR. Une insertion réussie se traduira par l'inactivation de cegène qui ne sera plus capable de conférer la résistance à la tétracycline à la cellulehôte. C'est pourquoi le protocole de clonage consistera à mélanger l’ADN du plas-mide et l’ADN du donneur digérés par une même enzyme de restriction suivi d’uneligaturation.

Cette préparation est alors utilisée pour transformer les bactéries et sélec-tionner les colonies résistantes à l'ampicilline. Ces dernières doivent avoir ététransformés avec succès par une molécule de plasmide recombinante.

Parmi les colonies AmpR, seules celles qui s'avèrent sensibles à la tétracy-cline contiennent une insertion, en d'autres termes, seules les colonies ampR tetS

contiennent de l'ADN recombinant (ADN du plasmide et ADN inséré). L’insertion del’ADN étranger dans pBR322 est détectée par l’inactivation du gène de résistance(tetR), indiqué par le phénotype tetS (sensible).

Figure II.2 : Le plasmide pBR322

d : Les plasmides pUCLes plasmides de la famille pUC sont des vecteurs plus élaborés dont la

structure permet la sélection visuelle directe des colonies contenant l’ADN inséré.L'élément clé est une petite portion du gène de la β-galactosidase d’Escherichia coli.Un segment d'ADN synthétique appelé adaptateur (en anglais, polylinker ou clo-ning site) contient de nombreux sites de restriction utiles pour l'insertion des frag-ments de l'ADN du donneur. L'adaptateur est en phase avec la séquence codant laβ-galactosidase mais n'interfère pas avec son fonctionnement.Figure II.3 : plasmides pUC L’origine de réplication ori des plasmides pUC diffère légèrement par muta-tions de celle de pBR322, ce qui explique le très grand nombre de copies des plas-mides pUC dans une cellule bactérienne et par suite des vecteurs de troisième gé-nération qui en dérivent.

L'insertion d’un vecteur dans pUC est détecté par l'inactivation de la fonctiongalactosidase du gène Z', qui se traduit par l'incapacité de la cellule hôte à convertirle substrat artificiel X-Galactoside en un colorant bleu (X= paranitrophénol).

X-Galactoside → X (colorant bleu) + Galactose

En résumé, les plasmides sont des fragments d'ADN extra-chromosomiquescirculaire présents dans les bactéries et susceptibles de se répliquer de façon auto-nome. Ils peuvent porter des gènes de résistances aux antibiotiques. Expérimenta-lement ils sont utilisés comme vecteur pour transporter de l’ADN exogène.

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Vecteurs Taille enbp

Nombres decopies par cel-lule

Marqueur phénoty-pique

Quelques sitesuniquesde restriction

pBR322 4363 15 à 20 TétracyclineAmpicilline

EcoR I, Hind III, PvuII, Nde I, Afl III

pPUC18 686 ≈ 500 Ampicilline Lac Z' 13 sites de restric-tionsur un polylinker

Tableau I. 1 : Quelques caractéristiques des deux plasmides utilisés en géniegénétique.

Les plasmides de première génération: ce sont les plasmides rencontrés dansla nature. Il s'agit des plasmides ColE1, RSF2124, pSC101. Ces types de plasmidesn'ont pas les propriétés requises pour les manipulations génétiques.

Les plasmides de seconde génération: ce sont les plasmides de la famillepBR. (pBR312 à 328) obtenus par construction. Le plus utilisé est le plasmidepBR322, constitué de 4 363 paires de bases. Il possède deux gènes de résistanceaux antibiotiques : l’un pour la tétracycline TcR et l’autre pour l’ampicilline AmpR et20 sites uniques pour les enzymes de restriction. Parmi les sites uniques, 11 sontlocalisés dans les gènes de résistance aux antibiotiques.

EcoR V, BamH 1, Sph 1, Sal 1, Xma 1 et Nru 1 dans le gène TcR

Cla 1 et Hinh III dans le promoteur du gène TcR

Pst 1, Pvu 1, et Sca 1 dans le gène AmpR

L'insertion d'ADN étranger dans un quelconque de ces sites se traduit par laperte de la résistance à l'antibiotique.

Les plasmides de 3ème génération : Ces plasmides ont été construits pour facili-ter le travail de sous clonage et pour une sélection des clones recombinants.

la famille pUC: Ce plasmide de 2 600 paires de bases environ dontpUC18 possèdent : un promoteur et un opérateur efficace de transcription, le gènede résistance à l’ampicilline AmpR et une partie du gène lacZ. Un polylinker est insé-ré dans le gène lacZ. La présence de ce polylinker n’interfère pas avec le fonction-nement du gène de la -galatosidase. Le gène LacZ permet la sélection des recom-binants par la couleur des colonies. Il faut donc pour cela utiliser les bactéries lac-.Les différents plasmides de cette famille diffèrent les uns des autres par la taille deleur polylinker. Leur petite taille permet l’insertion d’un ADN assez grand et unecroissance rapide des plasmides.

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La famille pSP . Ils sont plus petits que pBR322 (entre 2900 et 3000 bp).Ces plasmides possèdent : un polylinker, le gène de résistance AmpR et le promo-teur de la RNA polymérase du phage SP6 qui provient de Salmonella. typhimuriumimmédiatement adjacent au polylinker. Ces types de plasmides offrent un avantage,car ils permettent de transcrire en ARN la séquence d’ADN qui a été insérée dans lepolylinker.

Les plasmides Gemini (1 à 4) dérivent des précédents. Ils possèdent enplus sur le brin complémentaire, de l’autre côté du polylinker, un promoteur de laRNA polymérase du phage T7. L’avantage de ces plasmides est de pouvoir trans-crire l’ADN inséré en une grande quantité d’ARN sur les deux brins pour servir deribosondes ou pour la traduction en protéines.

Les plasmides Blue-Script. Ce sont les plasmides les plus complexescar ils combinent tous les avantages des vecteurs précédents. Le plasmide Blue-Script est un petit plasmide de 2961 paires de bases à haut nombre de copies, plusde 500 exemplaires par cellule. Il possède, outre le gène de résistance àl’ampicilline, le gène lacZ’ (codant pour le peptide de la -galactosidase et conte-nant les séquences régulatrices de l’opéron lactose) qui permet la sélection des co-lonies. De plus, l’ADN inséré est sous la dépendance du promoteur du gène lacZ’.Chaque fois que ce gène est exprimé, l’ADN inséré est aussi exprimé d’ou la pro-duction de la protéine correspondante. La haute efficacité de transformation, due àsa petite taille, constitue un intérêt avantageux pour ce vecteur en biotechnologie.Figure I.6 : Le plasmide pUC18.

Figure II.4 : Le plasmide Blue-Script II ;

2. Extraction et purification de l’ADN plasmidique

Il existe de nombreuses méthodes d'extraction et de purification des plasmi-des . Toutes comportent cependant trois (3) étapes principales :

1-Croissance des bactéries hôtes avec éventuellement amplification duplasmide en ajoutant par exemple du chloramphénicol qui bloque la croissance bac-térienne sans affecter la réplication de l’ADN plasmidique.

2-Lyse des bactéries pour libérer le plasmide : La lyse des cellules est réali-sée dans les conditions permettant d'obtenir l'ADN plasmidique purifié dans une so-lution ne contenant que très peu d'ADN chromosomique et de protéines: Le traite-ment des bactéries par le lysozyme suivi d’un traitement avec un détergent (Triton100 ou SDS) ou d’un traitement basique fait passer les RNA et les plasmides en so-lution tandis que l’ADN bactérien reste emprisonné dans les fantômes bactériens .Cette solution est appelée lysat clair.

3-purification du plasmide à partir du lysat. Les principales techniques depurification sont :

Le lysat clair est soumis à une ultracentrifugation dans du chlorure de cé-sium (CsCl ) en présence de bromure d’éthidium (BET) saturant.

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La précipitation différentielle de l'ADN plasmidique par le polyéthylène gly-col (PEG ) permet aussi d'éliminer les petits fragments d'ADN et d'ARN non précipi-tés et d’obtenir des plasmides de pureté appréciable.

La chromatographie d'échange d'ions, dans les conditions appropriées deforce ionique et de pH, permet également à l'ADN plasmidique d’être absorbé sélec-tivement.II- L'ADN PHAGIQUE

Les bactériophages ou phages sont des particules virales qui infectent lesbactéries. Leur multiplication est rapide et le nombre de copies par cellule bacté-rienne est très important. Figure II. 5.

Lorsque l’ADN du phage pénètre dans une bactérie, deux types de réponsespeuvent se produire :

Une réponse lytique : Dans ce cas, l’ADN du phage intégré dans lechromosome bactérien prend immédiatement en charge le système de transcriptionet de traduction de la cellule hôte qui commence la synthèse des constituants pro-téiques du phage. Ces différents constituants s’assemblent et forment de nouvellesparticules phagiques dès que commence la réplication de l’ADN phagique. La bacté-rie éclate et les nouvelles particules virales infestent les bactéries voisines. Il seforme alors une plage de lyse sur une boite de Pétri. Figure II. 6

Réponse lysogénique : L’ADN du phage est intégré dans le chromosomebactérien. Il reste à l’état de repos, c’est à dire qu’il se réplique en même temps quele chromosome bactérien mais reste intégré à ce chromosome. Il ne se produit pasde nouveaux virions. Le métabolisme et la viabilité des bactéries ne sont pas modi-fiés tant que la bactérie reste dans cet état. Les bactéries à prophage intégré sontappelées des bactéries lysogènes. La lysogénie peut être supprimée par desagents inducteurs de la virulence des phages (rayons X, agents mutagènes…)

Deux types de phages qui infectent Escherichia coli sont d'usage fréquent engénie génétique: le phage λ et le phage M13.

1- Le phage Lambda λ

Le phage λ est un bactériophage de 1ère génération. Il est constitué d'un ADNdouble brin linéaire de 48.502 paires de bases. Les extrémités appelés COS sontconstituées par de l'ADN sous forme simple brin sur une longueur de 12 bases. Lebactériophage λ est un vecteur de clonage efficace pour plusieurs raisons:

Les extrémités cohésives permettent au phage de se concaténer et de secirculariser. La circularisation est observée dans la bactérie immédiatement aprèsl’infection.

La tête du phage λ peut encapsider spécifiquement un ADN chromosomi-que d’environ 5 kb. Cette propriété permet de sélectionner les particules du phage λnaturel des phages λ contenant des ADN étrangers. Figure II. 7

La région centrale du génome du phage λ n'est pas nécessaire pour la ré-plication ou l'encapsidation des molécules d’ADN de λ dans Escherichia coli et peutdonc être excisée par des enzymes de restriction et écartée.

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Les "deux bras" restants sont ensuite ligaturés avec l'ADN du donneur di-géré par les mêmes enzymes de restriction.

Les molécules d’ADN ainsi obtenues peuvent être introduites dans E. colipar la transformation ou être encapsidées in vitro dans les têtes d’un bactériophage.Figure II. 8

Le génome du phage λ :

Les gènes AWBCNu3DEFIFII codent pour les protéines de la têteLes gènes ZUVGTHMLKIJ codent pour les protéines de la queueLes gènes att int xis permettent la recombinaisonLes gènes cIII N cl cro cII assurent la régulationLes gènes O P assurent la réplicationLe gèneQ est également un gène de régulationLes gènes R S permettent la lyse bactérienneLa partie centrale peut être délétée pour insérer un ADN exogène

2: Dérivés du phage λ utilisés comme vecteur de clonage

Le bactériophage λ sauvage ne peut pas être toujours utilisé pour le clonagecar son ADN comporte des sites multiples pour beaucoup d'endonucléases de res-triction utilisées dans les différents processus de clonage. De plus, ces sites sontsouvent localisés dans les régions du génome indispensables pour le cycle lytiquedu phage.

La longueur de l'ADN pouvant être encapsidé ne peut dépasser 5 kb, si bienque la taille de l'ADN étranger qui pourrait être inséré est très limitée.

A partir des phages sauvages, on a construit des phages qui n'ont qu'un(pour vecteur d’insertion) ou deux (pour vecteurs de substitution) sites de restric-tions situées dans les parties non essentielles du génome de phage λ.

Le phage λgt 11 est utilisé dans la stratégie de l’insertion pour cloner lescDNA dont la longueur varie de 6 à 8 kb. Il sert de vecteur d’expression car la sé-quence insérée pourra être exprimée dans la bactérie sous forme de protéine, per-mettant la recherche du recombinant désiré à l’aide d’un anticorps dirigé contre laprotéine synthétisée.

Le phage λ ZAP II est une forme améliorée du précédent qui permet de vi-sualiser l’expression du DNA inséré. La sélection des recombinants se fait en analy-sant la coloration bleue ou blanche, lorsque la culture est réalisée sur un milieucontenant le substrat X-gal et l’IPTG.

3. : Les phages EMBL 3 et 4

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Ces deux phages sont très proches du phage λ classique. Ils en diffèrent parla présence d’un polylinker aux deux extrémités de la zone de DNA qui sera délétépour être remplacé par le DNA à cloner. Les deux phages ne diffèrent que parl’orientation du polylinker. On peut y introduire des fragments de 15 à 20 kb. Ilsconstituent des phages de choix pour la constitution des banques génomiques.

4. : Les phages GEMR 11 et 12

Ces deux phages sont destinés à la réalisation de banques génomiques etsont des versions améliorées des phages EMBL. La taille de l’ADN à insérer variede 9 à 23 kb. Ils en diffèrent par deux types d’améliorations :

- Modification du polylinker. Le polylinker de ces phages comporte un plusgrand nombre de sites de coupures uniques pour deux enzymes de restriction : Sfidans la version 11, Not dans version 12 car les sites de coupure de ces enzymessont très rare. L’addition d’un site Xho I simplifie la réalisation des banques génomi-ques. - Addition de promoteurs pour des RNA polymérases spécifiques : Unpromoteur de la T7 RNA polymérase est ajouté à l’extrémité du bras gauche avant lepolylinker et le promoteur de la T3 RNA polymérase à l’extrémité droit. Ces deuxpromoteurs permettent de synthétiser des ribosondes correspondant spécifiquementà chacun des brins de l’ADN cloné. Les ribosondes sont utilisées pour cribler denouveau la banque et ainsi isoler les segments adjacents au DNA cloné. Ainsi, il estcertain de marcher sur le chromosome sans se tromper d’avancer dans le bon sens.

5. : Le phage M13 et ses dérivésFigure II.9

Le bactériophage M13 qui infecte Escherichia coli (seules les bactéries mâlespeuvent être infectées) est un phage filamenteux dont la particularité et l'intérêt rési-dent dans son matériel génétique. Le matériel génétique de ce phage est constituéd’une molécule d'ADN circulaire monocaténaire de 6407 paires de bases notée brin(+).

La multiplication intracellulaire du phage fait intervenir une forme réplicative(RF) constituée par l'association du brin génomique (+) et d’un brin complémentairenouvellement synthétisé noté brin (-). Ce dernier devient la matrice pour la synthèsede nouveaux brins (+) qui seront encapsidés et relâchés dans le milieu.

L'ADN phagique (+) peut être extrait à partir des virions de manière analogue àl'ADN du phage λ.. La forme réplicative (RF) bicaténaire peut aussi être extraite dela cellule de la même manière que l’ADN d’un plasmide.

Le phage M13 a été modifié de manière a pouvoir introduire un ADN étrangerdans la forme réplicative au niveau d'un site unique de restriction. La forme réplica-tive recombinée peut ensuite être introduite dans une cellule hôte par transformationcomme un plasmide de manière a disposer sur le brin (+) d'une séquence connue auvoisinage de l'insertion. Sur cette séquence connue, on peut hybrider un oligonu-cléotide de synthèse qui servira alors d'amorce pour la DNA polymérase. Les modi-fications pour en faire un vecteur sont :

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- L’addition d’un polylinker pour faciliter l’insertion des séquences de DNA- L’addition d’un gène lacZ pour permettre la sélection des recombinants (sys-

tème des bactéries bleues et blanches en présence d’IPTG et de X-gal).

La possibilité de disposer d'une insertion dans un ADN monocaténaire circu-laire fait des dérivés du phage M13 des vecteurs très utilisés en génie génétiquepour :

• La création de mutations ponctuelles• La synthèse de sondes nucléiques.• Le séquençage de l'ADN par la méthode de Sanger• Dans certaines techniques de mutagenèse dirigée in vitro, on utilise alors

comme amorce (primer) un oligonucléotide complémentaire de l'insert mais possé-dant la modification de séquence souhaitée.

6. : Infection

Avec l'ADN recombiné par insertion ou substitution, on forme des particulesvirales par encapsidation in vitro en ajoutant les protéines de la capside et de laqueue. Les particules virales ainsi formés permettent une introduction très efficacede l'ADN recombinant de la cellule hôte E. coli par infection phagique. Les virions sereproduisent ensuite par le cycle lytique, ce qui permet une bonne amplification del'ADN recombinant. L'isolement des clones est obtenu en réalisant l'infection sur unmilieu semi-solide. Chaque particule virale donne alors naissance à un clone sous laforme d'une plage de lyse sur le tapis bactérien.

III. COSMIDES, YAC ET BAC

1. Les cosmides

Les cosmides sont des vecteurs hybrides constitués d’un plasmide classique auquelont été ajoutées les séquences COS du phage λ. Leur ADN peut se répliquer auniveau de la cellule hôte comme celui d'un plasmide ou être encapsidé comme celuid'un phage pour faire une infection. Les cosmides peuvent contenir des insertionsd’ADN environ trois fois plus longs que ceux portés par les phages λ (45 kb). Ceciest dû à ce que la majeure partie de la structure du phage a été déletée tandis queles séquences signaux responsables de l'encapsidation subsistent (les sites COS).Figure II.10

2. Les YACLe YAC ou chromosome artificiel de levure (Yeast Artificial Chromosome).

Les YAC permettent de cloner de 150 à 1 000 kb de fragments d’ADN. Le génomede la levure Saccharomyces cerevisiae est constitué de 16 chromosomes de taillecomprise entre 250 et 2 000 kb. Chez la levure, trois régions chromosomiques sontimportantes pour sa réplication. Les séquences télomériques (Tel), centromériques(CEN), et une séquence ARS (Autonomous Replicating Sequence).

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On a donc construit des chromosomes artificiels contenant ces régions es-sentielles et du DNA que l’on désire cloner. La taille du DNA cloné peut donc attein-dre de 1 000 à 2 000 kb. Les YAC n'exigent que les cellules de levures comme hô-tes. On peut cependant introduire dans l’ADN cloné des séquence bactérienne pourla sélection.Figure II.11

3 . les PACPAC : Chromosomes artificiels dérivés du phage P1(PAC, P1-derived artificial chromosomes)Mise au point dans les années 1990 un vecteur dérivé du bactériophage P1. Le vec-teur pCYPAC1 permet de cloner des fragments qui ont une taille de 130 à 150 kbavec une efficacité qui est intermédiaire entre celle des cosmides et celle des YACs(1,5x10+5 colonies/µg insert). Figure II.124. Les BACFigure II.13

Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ont pour base le facteur sexuel F de 7 kbde Escherichia coli. Ce facteur peut contenir de grands fragments d'ADN d'E. colisous la forme de dérivés F'. De manière similaire, les BAC peuvent incorporer desinserts d'ADN étranger pouvant atteindre 300 kb. Le plasmide F porte des gènes quisont essentiels pour réguler sa propre réplication et pour contrôler aussi le nombrede copies du plasmide F. Le plasmide F a aussi la capacité de s'intégrer dans lechromosome bactérien et de s'en exciser. Un plasmide qui a cette capacité est ap-pelé un épisome.Les gènes oriS et repE régissent la réplication unidirectionnelle du plasmide tandisque les gènes parA et parB maintiennent le nombre de copies de celui-ci à 1 à 2copies par cellule.Le vecteur pBeloBAC11 porte ces gènes essentiels ainsi qu'un gène de résistanceau chloramphénicol et la portion lacZa du gène b-galactosidase avec 2 sites derestriction HindIII et BamHI qui permettent le clonage de fragments d'ADN étranger

Le facteur de fertilité F est utilisé lors de la conjugaison bactérienne. - Les bactéries qui le possèdent dans leur cytoplasme sont dites F(+) - celles qui ne l'ont pas dans leur cytoplasme sont dites F(-) - Celles qui l'ont intégré dans leur chromosome sont dites Hfr - Celles qui l'ont perdue, après l'avoir intégré dans leur chromosome sont F'.

ConclusionLes plasmides sont très utilisés pour le génie génétique. Ils acceptent des fragmentsde taille moyenne (jusqu'à 10 kb), par exemple des sous-fragments de l'insert d'unphage ou d'un cosmide recombinant. La taille des fragments d'ADN étranger quipeuvent être acceptés par le bactériophage lambda (10 à 20 kb), les cosmides (35 à45 kb), les PAC (130 à 150 kb), les BAC (160 à 200 kb) et les YAC (250 à 1.500 kb)en font les vecteurs de choix pour construire et amplifier des banques d'ADN géno-mique. Les BAC et les PAC sont devenus les vecteurs principaux pour le séquen-çage du génome humain. Les ADNc (voir plus loin) sont clonés dans des plasmidesou des phages d'insertion.

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Chapitre III: ENZYME DE RESTRICTION, ÉLECTROPHORÈSE,CARTE DE RESTRICTION

I. ENZYMES DE RESTRICTION

1. Définition et origine

Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent d’une ma-nière définie et reproductible l’ADN double-brin quelle que soit son origine. Elles ontpermis de caractériser un génome entier en une série de fragments reproductibles.Les gènes ou fragments de gènes deviennent ainsi des entités physiques isolableset non plus de l’information noyée dans la masse du contenu génomique. Ces en-zymes ont été mis en évidence par le phénomène de la lysogénie.

Les cellules bactériennes contiennent beaucoup d'endonucléases spécifiquescapables de reconnaître l'ADN des autres espèces et l’ADN des virus qui les infec-tent. Ces enzymes constituent un système de défense de la bactérie surtout contrel'ADN des virus au cours de leur infection. Ces enzymes de restriction reconnaissentdes sites particuliers sur l'ADN et coupent la molécule double brins soit au niveau dusite de reconnaissance soit quelques nucléotides plus loin. La souche d'Escherichiacoli B possède une endonucléase appelée EcoR1 qui reconnaît spécifiquement laséquence bicaténaire suivante:

CH3↓ ↓ |

5’G AATT C3’ 5’G *AATT C3’ 3’C TTAA G5’ 3’C TTAA* G5’

↑ | ↑ CH3

Coupure Pas de coupure

L'enzyme catalyse l'hydrolyse d'une liaison phosphodiester dans le site re-connu au niveau des deux flèches. Cependant, la coupure ne peut avoir lieu que siles adénines (A) figurées en gras ne sont pas méthylées. Le phénomène de restric-tion résulte de l’existence dans la bactérie de deux types d’activité enzymatique :

Une activité de restriction qui coupe le DNA lorsqu’il est reconnu commeétranger à la cellule hôte.

Une activité méthylase qui méthyle une base donnée (A ou C) au niveaudu site de restriction du génome de la cellule bactérienne pour empêcher sa propredégradation par l’activité restrictive.

Les souches d’Escherichia coli R possèdent en plus de l’enzyme qui coupe laséquence reconnue par (EcoR1) une autre qui assure la méthylation (EcoR1 méthy-lase ou MEcoR1) qui reconnaît la même séquence mais méthyle les deux adénines.Le système de restriction formé par le couple EcoR1 / MEcoR1 permet aux cellulesbactériennes d'hydrolyser un éventuel ADN étranger, phagique en particulier, touten conservant l'intégrité de leur propre génome. Les enzymes de restriction consti-tuent donc un système de défense de la bactérie.

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Il existe 3 types d'enzymes de restriction qui diffèrent les unes des autres, parla localisation de leur activité catalytique.

Enzyme de type I: Ayant reconnu la séquence cible, l'enzyme se déplacesur l'DNA et coupe de manière aléatoire mille à quatre mille bases plus loin (Sys-tème de boucles d’ADN ?).

Enzyme de type II: L'enzyme coupe l'ADN au niveau de la séquence re-connue.

Enzyme de type III : L'enzyme reconnaît la séquence cible et coupe la mo-lécule de DNA 20 à 25 bases plus loin.

Seules les enzymes de type II qui coupent au niveau du site de reconnais-sance sont utilisés en génie génétique parce qu’on peut contrôler parfaitement lesite de coupure et donc les extrémités engendrées.

En 1990, on avait recensé plus de mille endonucléases isolées à partir de867 espèces bactériennes différentes.

2. Nomenclature des enzymes de restriction.

En 1973, Smith et Nathan ont proposé une nomenclature qui est définitive-ment adoptée. Chaque endonucléase a un nom de code déterminé selon les princi-pes suivants :

• La première lettre en majuscule est l'initiale du genre de la bactérie.• Les deux lettres suivantes, en minuscule désignent l'espèces de la bacté-

rie.• La 4ème lettre en majuscule, (pas toujours présente) désigne la souche

bactérienne.• Un chiffre romain distingue les enzymes d'une même souche dans l'ordre

de leur découverte.

Exemple : EcoR 1:E = EscherichiaCo = espèce ColiR = Souche RY13I = 1ère endonucléase isolée

3. Mécanisme d'action des endonucléases de restriction

a: Caractéristique de l'hydrolyse.

Une endonucléase de restriction se lie à une séquence spécifique qu'elle re-connaît sur l'ADN: c’est le site de restriction. Elle catalyse ensuite un clivage doublebrin au niveau des liaisons phosphodiester spécifiques à l'organisation de la sé-quence de reconnaissance. L'hydrolyse d'une liaison phosphodiester, entre legroupe 3' OH et le phosphate génère une extrémité 5' phosphate d'un côté de lacoupure et un groupe 3' OH de l'autre. Figure III.1

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b: Sites de restriction

La plupart des sites de restriction comporte de 4 à 6 paires de bases. Unnombre assez restreint d’enzymes de restriction reconnaît des séquences plus com-plexes. Les séquences de restriction présentent toujours une double symétrique parrapport à un centre ou à un plan de symétrie. De telle séquence sont dites palin-dromiques. On observe sur les 2 brins la même séquence (5’→3’) mais en sensinverse.

↓Exemple : EcoR 1 : 5’G AATTC3’ 3’CTTAA G5’

↑c: Différents types de coupure

Les enzymes de restriction de type II peuvent donner deux types de coupu-res :

Les coupures à bouts francs (blunt ends ou flush ends). L’enzyme coupeexactement au même niveau sur les deux brins de la séquence reconnue soit auniveau de l’axe ou du centre de symétrie.

↓Hae III5' GGCC 3' → 5'GG + CC 3'3' CCGG 5' → 3'CC + GG 5'

↑

Ces types de coupes sont utilisées lorsqu’on désire faire un tailing (allonge-ment de l’extrémité 3’OH) ou un marquage pour un séquençage.

les coupures décalées donnent des extrémités cohésives. Les extrémitésdébordantes résultent d'une coupure décalée et les extrémités obtenues sont autocomplémentaires entre elles. Elles peuvent donc se réapparier spontanément si lesconditions sont favorables. On parle alors d'extrémités cohésives ou de bouts col-lants "Sticky ends". Ces enzymes sont très utilisées pour fabriquer des ADN recom-binants, car les fragments de différents ADN coupés par la même enzyme donnentles mêmes bouts qui peuvent s'associer par leur extrémités cohésives. L'associationest ensuite rendue covalente par l’action d'une ADN ligase.

Coupure décalée du coté 5’ : Ce type de coupure génère des extrémités 5’Pdébordantes ou sortantes. Exemple, les coupures de EcoR 1 :

5’ G/AATTC → 5’ G 3’ + 5’AATTC 3’3’ CTTAA/G 5’ → 3’ CTTAA 5’ + 3’G 5’

Coupure décalée du coté 3’: Ce type de coupure génère des extrémités 3’OHdébordantes ou sortantes. Exemple : les coupures par Pst I :

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5’ CTGCA/G 3’ → 5’ CTGCA 3’ + 5’ G 3’3’ G/ACGTC 5’ → 3’ G + 3’ ACGTC 5’

Les coupures franches ; L’enzyme coupe les deux brins de l’ADN au niveaudu centre ou de l’axe de symétrie. On obtient des extrémités franches (blund ends)qui n’ont pas un grand intérêt en génie génétique sauf pour réaliser des « taillings àl’extrémité 3’OH). Exemple : Hae III :

5’ GG/CC 3’ → 5’ GG + 5’CC 3’ 3’ CC/GG 5’ → 3’ CC + 3’GG 5’

Le tableau II.1 ci-dessous donne la liste de quelques enzymes de restrictionet leur sites de coupure.

Micro-organisme Sigle de l’enzyme SéquenceThermus aquaticus TaqI 5’...T/CGA...3’

3’...AGC/T...5’Haemophilus haemolyticus HhaI 5’...GCG/C...3’

3’...C/GCG...5’Desulfovibrio desulfuricans DdeI 5’...C/TNAG...3’

3’...GANT/C...5’Escherichia coli EcoRV

EcoRI

5’...GAT/ATC...3’3’...CTA/TAG...5’

5’...G/AATTC...3’3’...CTTAA/G...5’

Providencia stuarti PstI 5’...CTGCA/G...3’3’...GA/CGTC...5’

Microcoleus MstII 5’...CC/TNAGG...3’3’...GGANT/CC...5’

Nocardia otitidis-caviarum NotI 5’...GC/GGCCGC...3’3’...CGCCG/GCG...5’

Tableau II.1 : Quelques enzymes de restriction de type II et leur site de coupure N = Toute base (purine ou pyrimidine)

e: Isoschizomères et enzymes compatibles:On appelle isoschizomères 2 enzymes différentes qui reconnaissent le

même site de restriction. Exemple :

Msp I: NNC/CGGNN et Hpa II NNC/CGGNN NNGGC/CNN NNGGC/CNN

Deux enzymes compatibles ont des sites de restriction différents mais don-nent naissance aux mêmes extrémités cohésives. C'est le cas de BamH I et Sau3AIqui donnent les même extrémités cohésives car le site de reconnaissance deSau3A1 est contenu dans celui de BamH 1.

BamH I NNNG/GATCCNN et Sau 3A I NNN/GATCNNN

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NNNCCTAG/G NNNCTAG/NNN Ainsi, BamH I donne les mêmes extrémités cohésives que Sau3A I avec quielle est compatible.

4. Carte et fragments de restriction

L'hydrolyse d'un ADN par une endonucléase de restriction conduit à une sériede fragments dits de restriction dont le nombre est fonction du nombre de sites derestriction présent sur cet ADN. La longueur des fragments est déterminée par ladistance séparant les séquences de restrictions reconnues par cette endonucléase.On obtient pour un ADN donné, toujours le même nombre de fragments qui donnece que l’on appelle RFLP (pour longueur des fragments de restriction polymorphi-ques ou Restriction Fragments Lengh Polymorphism en Anglais). Une moléculed'ADN déterminée, donne toujours les mêmes fragments et cette série de fragmentconstitue une empreinte caractéristique de l'ADN hydrolysé. On parle alors de carted'identité moléculaire.

Exemple : CARACTERISATION DE L’HAPLOTYPE DREPANOCYTAIRE

Des variations de la séquence nucléotidique, sans conséquence pathologique di-recte, sont fréquentes.Elles sont désignées sous le terme de polymorphisme.Lorsque ces modifications portent sur des sites reconnus très spécifiquement parcertaines endonucleases (enzymes de restriction) elles sont faciles à mettre en évi-dence par les méthodes de cartographie génique (polymorphisme de taille des frag-ments de restriction) RFLP. L'association de plusieurs de ces polymorphismes défi-nit un haplotype. L'un des résultats les plus intéressants des études des polymor-phismes de l'environnement du gène drépanocytaire a été l'observation d'un désé-quilibre de liaison : les polymorphismes ne sont pas distribués au hasard mais for-ment un petit nombre d'haplotypes bien définis. Il a été ainsi observé que la mutationdrépanocytaire a été trouvée associée à 5 haplotypes désignées d'après leur épi-centre. Figure III.2

Figure III.1 : Les haplotypes

E Gγ Αγ ψβ δ β

Haplotype HbS

Bénin - - - - - + - + - - + + - +

Bantou - - + + - + - - - + + + + +

Sénégal - + + + - + + + + - + + + +

Arabo Ind. + + + + - + + + - + + - + -

Cameroun - - + + + + - + + - + - + -

Hinc II XmnI Hind III TaqI HindIII PvuII Hinc II Hinf I Rsa I AvaII HinfI HpaI BamHI

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Une carte de restriction est une séquence de sites de restriction séparés pardes distances précises sur l'ADN et mesurée en paire de bases (bp). Diverses tech-niques permettent d'obtenir de telles cartes. Elles passent toutes par une digestionde l'ADN à analyser par une enzyme de restriction suivie d’une électrophorèse pourla séparation des fragments et la détermination de leurs tailles.

L'analyse par double digestion est obtenue quand l'ADN est digérée sépa-rément par 2 enzymes différentes A et B. On obtient un certain nombre de fragmentspour chaque enzyme. Ces fragments sont ensuite analysés par électrophorèse surgel d’agarose. Chaque fragment produit par l’enzyme A est d’abord élué du gel etdigéré ensuite par l’enzyme B et inversement. La confrontation des différents résul-tats permet de situer les sites de coupure les uns par rapports aux autres sur la sé-quence nucléotidique.

Figure III.3 Exercice et corrigé: Détermination des sites de coupure de deux enzy-mes de restriction A et B sur un fragment d’ADN .

- L’enzyme A coupe et donne deux fragments : 2 Kb et 8 Kb- L’enzyme B coupe et donne deux fragments : 3 Kb et 7 Kb- Les enzymes A et B coupent et donnent trois fragments 2 Kb, 3Kb et 5 Kb

Déterminez les sites de coupures :

2 Kb A 8 Kb

7 KbB

2 Kb 5 Kb 3 KbA B

10 Kb d ADN

3 Kb

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II. L’ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL

Figure III.4.

Les différents types d'électrophorèse utilisés dans les laboratoires de biologiemoléculaire, permettent de séparer les acides nucléiques en fonction de leur taille:

L'électrophorèse horizontale sur gel d'agarose permet de séparer lesfragments d'ADN de 300 à 10 000 paires de bases en fonction de la concentrationdu gel en agarose

L'électrophorèse verticale sur gel de polyacrilamide permet de séparer lesfragments d'ADN dont les longueurs vont de 1 à 1 000 nucléotides en fonction de lalongueur du gel et de la tension appliquée (de 1 000 à 2000 volts / cm).

L’électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé (PFGE) permet deséparer des fragments d'ADN double brin dont la taille peut varier de 220 000 à 2500 000 paires de bases. Cette technique est aussi mise à profit pour la séparationdes chromosomes interphasiques. (PFGE pour Pulsed Field Gel Electrophoresis).

1 - Suivi de la migration .

Les échantillons d'ADN, avant d'être déposés dans les puits, sont mélangésavec une solution de charge qui contient :

un alourdisseur (glycérol ou saccharose ) pour entraïner l'ADN au fond dupuits

des marqueurs de mobilité (colorants visibles : bleu de bromophénol et xy-lène cyanol)

Des marqueurs de taille pour l’identification (dans le puits de référence) un agent dénaturant comme le SDS ou l’urée pour arrêter les réactions en-

zymatiques suivant la nature du gel.

Les deux marqueurs (colorants) migrent à des vitesses différentes. Le bleu debromophénol (violet ) migre avec les fragments de petites tailles (donc plus vite )alors que le xylène cyanol (bleu turquoise ) migre avec les fragments de grandetaille. On peut ainsi suivre indirectement la migration de l'ADN sur le gel.

2 - Etalonnage d'un gel

On étalonne les gels avec des marqueurs de taille. Un marqueur de taille estun mélange de fragments d'ADN linéaire bicaténaires dont les tailles sont connues.il existe deux type de marqueurs de tailles :

Des marqueurs fabriqués à partir d'une molécule d'ADN naturelle digéréepar des enzymes de restriction,

Des marqueurs composés d'une série de fragments, chacun constitué d'uneà plusieurs répétition d'un même fragment d'ADN de taille connue. Un exemple est

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l'échelle d'ADN de 1 Kb de GIBCO BRL. Les différents fragments sont formésde 1 à 12 répétitions d'un même segment de 1018 bp.

3. Révélation :

Les bandes d'ADN sur un gel de polyacrylamide ou d'agarose ne sont pas vi-sibles si l'ADN n'est pas marqué ou coloré.

Une méthode sensible de coloration de l'ADN consiste à plonger le gelaprès électrophorèse dans du bromure d'éthidium (BET) qui devient cent fois plusfluorescent sous illumination ultra-violette lorsqu'il est lié à l'ADN. Le BET est uneproduit hautement mutagène, donc il doit être manipulé avec beaucoup de soins.

Une détection encore plus sensible implique l'incorporation d'un radio iso-tope dans les molécules d'ADN avant électrophorèse. Le 32P est actuellement utilisépuisqu'il peut être incorporé dans les phosphates 5' de l'ADN et émet des particules

très énergétiques facilement détectées par autoradiographie.Figure III.5

III. LES ENZYMES UTILES EN GÉNIE GÉNÉTIQUE:

1. La DNA polymérase I.

Cette enzyme extraite d’Escherichia Coli intervient dans les activités de répa-ration du chromosome bactérien par le phénomène de nick translation. Elle est uti-lisée sous sa forme de «fragment de Klenow» qui est dépourvu de l’activité exonu-cléasique (5’→3’) par suite d’un traitement protéasique pour:

Déterminer les séquences nucléotidiques d’un ADN par la méthode deSanger.

Pour convertir les bouts cohésifs en bouts francs Pour le marquage des DNA Pour la construction de sondes ou de vecteurs à partir d’un ADN simple ou

double brin.2. La T4 DNA polymérase.

L’enzyme est produite par les bactéries E. Coli infestées par le bactériophageT4. Elle possède les mêmes propriétés que le fragment de Klenow et possède lesmêmes utilisation en biologie moléculaire.

3. La Taq polymérase

C’est une enzyme extraite de la bactérie Thermus aquaticus, espèce bacté-rienne vivant dans les eaux chaudes et qui présente une grande résistance à la dé-naturation thermique. Elle peut toujours travailler entre 80 et 94°C, d’où son utilisa-tion en PCR. Il en est de même des polymérases extraites des archéobactériescomme des bactéries du genre Thermus comme la polymérase de Bacillus steato-thermophilus. Ces enzymes ne possèdent pas une activité de correction des épreu-

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ves (proof reading = activité exonucléasique 3’→5’) et de ce fait introduisentbeaucoup d’erreurs au cours de la réplication.

4. La transcriptase inverse.

La transcriptase inverse est un enzyme produite par les rétros virus qui per-met de recopier un ARN en un DNA. Elle possède aussi une activité RNAase H quipermet de dégrader le RNA dans un hybride ADN-ARN. Elle est utilisée chaque foisqu’il est nécessaire de transformer un ARN en un ADN.

Pour la construction des banques de cDNA Pour détermination des séquences nucléotidiques par la méthode

de Sanger Pour la PCR sur les RNA messagers (R-PCR).

5. La terminal transférase

C’est une enzyme couramment extraite du thymus de veau qui permetl’addition de désoxyribonucléotides, sans besoin d’amorce à l’extrémité 3’OH libred’un DNA simple ou double brin. Elle permet donc:

de rajouter une queue (tailing) à l’extrémité 3’ en vue de créer des extrémi-tés cohésives pour l’insertion d’un ADN

de marquer l’extrémité 3’OH pour le séquençage des acides nucléiquespar la méthode de Maxam-Gilbert.

6. La polynucléotide phosphorylase

Cette enzyme d’origine bactérienne (E. coli ou M. luteus) catalyse la polymé-risation de ribonucléotides diphosphates pour donner un ARN. La séquence del’ARN résultant dépend de la concentration relative des différents nucléotides pré-sents dans la solution.

n XDP → (XMP)n + n Pi

Elle a été utilisée pour déchiffrer le code génétique.Actuellement, elle permet:

La synthèse de polyribonucléotides froids ou radio-actfs La dégradation de la queue polyrA des mARN eucaryotes à cause

de son activité nucléolytique Un marquage intensif des extrémité 3’OH des ribonucléotides Le marquage sur le phosphore des ribonucléotides diphosphates

à cause de son activité d’échange de phosphate.

7. La poly A polymérase

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Enzyme eucaryote, elle catalyse l’addition d’une queue polyrA à l’extrémité3’OH des ARN messagers eucaryotes. Son substrat est spécifiquement l’ATP. Ellepossède donc les mêmes utilisations que la polynucléotide phosphorylase et la ter-minal transférase.

8. Les ARN polymérases

Les ARN polymérases de tous les organismes transcrivent l’un des deux brinsde la double hélice de l’ADN en un ARN simple brin. La synthèse s’effectue sansamorce à partir du promoteur (site de fixation et d’initiation de l’enzyme) et nécessitetoujours les ribonucléotides triphosphates et du Mg2+ comme cofacteur, dans le sens5’→3’. Ce sont les polymérases des procaryotes qui sont le plus souvent utilisées enbiologie moléculaire car elle possèdent des promoteurs très spécifiques qui permet-tent de conditionner et de révéler l’expression des gènes recombinés dans une cel-lule transfectée. Les plus utilisées sont: la polymérase de SP6 extraite de Salmonella typhimu-rium LT2, la T7 RNA polymérase extraite d’E. coli infesté par le phage T7 et la T3RNA polymérase extraite aussi de E. coli infesté par le phage T3. Ces polymérasespermettent:

la synthèse de sondes hautement marqués soit par un nucléotide radioactifsoit par un nucléotide biotinylé (marquage froid);

la détermination de la séquence d’un ADN cloné dans un vecteur possé-dant, devant le DNA cloné, l’un quelconque des promoteurs SP6, T7 ou T3;

les études sur les différents RNA résultant de la transcription d’un DNAcloné. Ces polymérases permettent aussi de produire, à partir d’un gène cloné, lesquantités de RNA suffisantes pour les études de structure, de régulations et des in-teractions RNA-DNA, RNA-protéines.

9. Les LigasesLa DNA ligase d’E. Coli. Les ligases assurent la formation d’une liaison

phosphodiester entre une extrémité 3’OH et une extrémité 5’phosphate de deux nu-cléotides déjà incorporés dans un acide nucléique. L’enzyme d’E. coli n’agit que siles deux DNA sont associés par des extrémités cohésives ou dans le cas d’une cas-sure sur un seul brin. Cette enzyme utilise le NAD+ comme cofacteur. Elle est doncutilisée pour la soudure des extrémités cohésives lors de la construction des vec-teurs.

La T4 ligase. Extraite d’E. coli infestée par le phage T4, elle joue le mêmerôle que la ligase de E. coli. Cependant, elle présente un avantage sur cette der-nière car elle utilise l’ATP au lieu du NAD+ comme source d’énergie, ce qui lui per-met de relier les extrémités cohésives, mais aussi les extrémités à bouts francs enprésence d’éthylène glycol.

La RNA ligase. Extraite d’E. Coli infesté par le phage T4, elle réalise la liga-tion entre deux RNA en créant entre eux une liaison phosphodiester entre l’extrémité3’OH libre et l’extrémité 5’phosphate libre de l’autre molécule. Elle utilise aussi l’ATP

31

qui est hydrolysé et AMP et en pyrophosphate. Elle permet donc soit un marquagedes ARN, soit la construction de liaisons inter ou intra - RNA (RNA mixtes).

10. Les nucléases.

La DNase I Cette enzyme extraite du pancréas est une endonucléase quicoupe le DNA après un base pyrimidique, libérant une extrémité 3’OH et une extré-mité 5’phosphate. Elle coupe aussi bien les acides nucléiques en simple ou en dou-ble brins. Elle est utilisée pour analyser les gènes actifs de la chromatine, éliminer leDNA d’une préparation protéique ou de RNA, pour la création de cassures (nicks)pour le marquage de l’ADN par nick translation.

La nucléase S1. L’enzyme dégrade spécifiquement les acides nucléiques ensimple brin. Les DNA bicaténaires et les hybrides DNA-RNA ne sont pas attaquées.Elle permet :

Une étude des hybrides DNA-RNA L’élimination des extrémités simple brin d’un DNA double brin Le suppression des boucles dans la synthèse de cDNA La détermination des origines de la transcription

L’exonucléase III. Elle catalyse l’hydrolyse séquentielle des nucléotides d’unADN dans le sens 3’ 5 à partir d’une extrémité 3’OH libre. De plus elle possèdeune activité 3’ phosphatase. Elle permet donc d’obtenir des ADN simple brin.

11. Les RNases

La RNase A. Cette enzyme très résistante (se maintient après 1 heure à90°c) hydrolyse spécifiquement les RNA simple brin après une pyrimidine. Elle estutilisée pour éliminer le RNA dans une préparation protéique ou de DNA. Elle per-met également de détecter les mismatches dans les hybrides DNA-RNA.

La RNase H : Elle détruit le RNA dans les hybrides DNA-RNA. Elle permetdonc la détection des hybrides DNA-RNA et la destruction de l’ARN dans un hybrideaprès une transcription inverse pour la synthèse du second brin de cDNA.

32

CHAPITRE IV: CLONAGE ET ÉTUDE DE L’ADN CLONÉ.

I - LE CLONAGE

Le clonage des micro-organismes est différent de celle des organismes supé-rieurs comme les mammifères.

1. Le clonage des animaux supérieurs: les mammifères.

Le principe du clonage n'est pas très compliqué en soit. Dans le cas de Dolly(la première brebis clonée), on a prélevé une cellule dans le pis d'une brebis de raceFinn Set à face blanche. On a prélevé également un ovule sur une autre brebis. Surcet ovule, on a enlevé le noyau qui contient le matériel génétique. Pourquoi unovule? Pour qu'il devienne éventuellement un embryon.

À l'aide d'un choc électrique, on a fusionné in vitro la cellule du pis quicontient tous ses gènes et l'ovule vidé de tout son matériel héréditaire. C'est la rai-son pour laquelle Dolly n'a eu pour tout bagage génétique que celui que contenait lacellule du pis. L'ovule ainsi " électrisé " se divise et le processus de vie s'enclenche.Après s'être divisé un nombre suffisant de fois, l’embryon au stade blastocyte a étéplacé dans l'utérus d'une brebis porteuse. Dolly est née de cette technique, identi-que en tous points à la brebis qui a fourni la cellule du pis.

2. Clonage de l’ADN dans les micro-organismes:

Le but du clonage est d’obtenir un grand nombre de copies absolument puresd’une séquence donnée d’ADN. Stricto sensu, le clonage est la sélection d’un cloneparmi un ensemble de clones bactériens recombinants qui porte le nom de banque(library). Il existe 2 types de banques d’ADN : les banques génomiques et les ban-ques d’ADNc.

33

II - LES BANQUES GÉNOMIQUES

1 - La fragmentation de l’ADN tout entier d’une cellule et son introduction dansdes vecteurs

Construire une banque génomique consiste à fragmenter l’ADN tout entierd’une cellule (la méthode du shotgun) et à introduire chaque fragment dans un vec-teur, puis dans un hôte approprié. Si la banque est correctement établie, ellecontiendra, sous une forme morcelée, l’ensemble de l’information d’un individu tellequ’elle existe dans son génome, d’où le terme de banque génomique.

Une banque génomique ne sera représentative que si elle contient, au moinsune fois, l’ensemble des séquences du génome. Il est donc évident que plus les in-serts seront longs, plus faible sera le nombre des clones nécessaires. Clarke et Car-bon ont établi une formule statistique permettant de déterminer le nombre de clonesnécessaires, compte tenu de la longueur des inserts. Cette formule, qui dérive de laloi de Poisson est :

log ( 1-P )N =- --------------

log ( 1-1 / n)

P = Probabilité de présence d une séquence donnéen = ( longueur du génome ) / ( longueur moyenne des fragments insérés ).

Probabilité de présenced’une séquence donnée

Longueur de l’insert en(kb)

15 20 30 35 400,99 860 640 430 370 3200,95 560 415 280 240 2100,90 430 320 215 185 1600,80 300 225 150 130 115

Tableau IV.1 : Nombre de clones (en milliers) que doit contenir une banque gé-nomique pour être représentative d’un génome.

2 – Etablissement d’une banque génomique.

Les différentes étapes principales sont les suivantes :

• Extraction de l’ADN nucléaire• Digestion du génome avec des enzymes de restriction• Insertion des fragments d’ADN dans des vecteurs (plasmide ou phage ou

YAC). Le vecteur doit être choisi en fonction de la taille des fragments d’ADN à insé-rer.

• Ligature avec l’ADN ligase• Transformation (avec des plasmides) ou infection (avec phages) des bacté-

ries• Culture des bactéries sur des milieux entiers

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• Toutes les bactéries qui portent une chimère se multiplieront et donnerontdes clones.

Figure IV.1: Schéma pour la réalisation pratique d’une banque génomique à partirde phages.

3. Amplification de la banque

Lorsque la banque n’est pas d’usage unique, mais doit servir à plusieurs clo-nages successifs, il convient de l’amplifier, c’est à dire, d’augmenter le nombre decopies de chaque fragment inséré. L’amplification n’est réalisable que lorsqu’on tra-vaille avec des phages. Avec les cosmides et les YAC, ou les BAC, les pertes deséquences sont très rapides et on est alors obligé de refaire la banque chaque fois.

4 - Les avantages des banques génomiques:

Les banques génomiques permettent de connaître:

- Les régions non transcrites des exons- Les séquences de régulation- Les gènes silencieux- Les introns

Malheureusement l’ADN génomique est fragmenté au hasard, donc, dans laplupart des cas, on obtient des gènes fragmentés incapables de coder pour des pro-téines biologiquement actives. Pour pallier à cet inconvénient, il faut utiliser les chromosomes artificiels delevure (YAC) comme vecteur de clonage. Les YAC.peuvent recevoir des fragmentsd’ADN de 150kb à 1 000 kb. Ces vecteurs permettent de marcher sur le chromo-some.

III - LES BANQUES DE CADN

L’ADN complémentaire (ADNc) est la copie sous forme d’ADN d’un ARN mes-sager (ARNm). Un banque de cDNA doit contenir au moins une copie de tous lesARNm présents dans la cellule. Ces banques sont essentiellement tissulaires puis-qu’une cellule d’un tissu donné ne possède pas tous les ARN messagers del’individu, mais ceux dont l’état de différentiation cellulaire permet la transcription. Leprocessus de formation de l’ADNc comprend deux étapes:

1 - L’isolement de l’ARN poly A+ (poly adénine):

Dans la cellule eucaryote, il existe plusieurs types d’ARN : l’ARN messager,l’ARN de transfert et l’ARN ribosomal. La majeure partie des ARN messagers deseucaryotes possède une queue poly(A) rajoutée après le transcription et avant letransfert vers le cytoplasme.

ARNm (eucaryote)

35

5’ GGGAUCACUUGCGCAGCGCAUGCU(AAAAAAAAAA)n 3’ queue poly(A)

On utilise les queues poly rA pour purifier l’ARNm en écartant les autres typesd’ARN. Sur une colonne chromatographique, les oligo-désoxythymidine (dT) sontliés à la cellulose ou à l’agarose par des liaisons covalentes. On fait alors passerl’ARN cellulaire dans la colonne. Seuls les ARNm qui possèdent les queues poly rAseront retenus sur la colonne par hybridation par les oligo-thymidilates. Les autresARN sont éliminés par un lavage avec le tampon. Les ARNm sont ensuite « élués »par un agent dissociant. La figure III.3 résume les principales étapes de la purifica-tion des ARN messagers eucaryotes ayant une queue poly-rA.

Figure IV.2 : Les principales étapes de la purification des ARN messagers eucaryo-tes ayant une queue poly-rA en utilisant la chromatographie d’affinité.

2 - Le passage de l’ARN à l’ADN

Cette étape est toujours réalisée grâce à la transcriptase reverse isolée d’unrétrovirus. Plusieurs techniques sont utilisées pour la préparation de l’ADNc :

la transcriptase reverse :

La synthèse de l’ADNc commence en 3’ de l’ARNm. Cependant, la transcrip-tion par la transcriptase reverse n’est pas parfaite, elle tend à baisser lorsqu’ellerencontre des obstacles que sont les structures secondaires de l’ARN. Si la molé-cule de l’ARNm est longue, la transcription peut ne pas aboutir à l’extrémité 5’ àcause de la boucle formée à cette extrémité par la transcriptase reverse. La boucleest détruite par l’action de la nucléase S1. Il y a cependant une perte d’informationau niveau de l’extrémité 5’.

Figure IV.3 : La technique de base de la synthèse du cDNA à partir du mRNA par lareverse transcriptase.

La technique « copie entière » par addition de queues uniformes « tai-ling »

Après la synthèse du premier brin de cDNA par la reverse transcriptase, unequeue poly dC est créée à l’extrémité 3’ par la terminal transférase en présence dedCTP. Un poly dG synthétique est alors utilisé pour s’hybrider à la queue poly dC etservir d’amorce pour la synthèse du brin complémentaire par le fragment de Klenowde la DNA polymérase I.

La technique « copie entière » par cassure à la RNase H.

Le début de l’opération est identique aux techniques précédentes. Après lasynthèse du premier brin par la reverse transcriptase, le brin de RNA est coupé enplusieurs endroits par la RNase H. Les courts fragment d’ARN servent alorsd’amorce pour la DNA polymérase I qui synthétise le brin d’ADN par son activité po-lymérasique 5’ ? 3’ et détruit les restes d’ARN par son activité exonucléasique

36

3’ ? 5’. On peut alors utiliser la T4 DNA polymérase pour parfaire la synthèse au ni-veau des extrémités. Figure IV.4

La technique du multi-amorçage au hasard : Cette méthode utilise la tech-nique de synthèse de l’ADNc utilisant un multi-amorçage au hasard avec des oligo-nucléotides de 6 à 10 nucléotides de long : « Random primer ». la suite est identi-que à la méthode par la RNase H.

La PCR : Cette technique permet d’obtenir rapidement une grande quantitéde l’ADNc une fois l’ADNc disponible .(Polymerase Chain Reaction pour Réaction dePolymérisation en Chaîne) Figure IV.5

IV - L’ÉTUDE DE L’ADN CLONÉ

Le criblage ou la recherche du bon clone au sein d’une banque génomiqueest toujours un problème difficile à résoudre en fonction des vecteurs utilisés. Beau-coup de techniques ont été utilisées pour le criblage des colonies, mais les techni-ques les plus sensibles et les plus utilisées sont:

- Celles qui emploient les oligonucléotides de synthèse,- Celles qui utilisent les anticorps.

Les autres techniques comme l’hybridation de sélection, l’hybridation différen-tielle et la complémentation d’un défaut génétique de l’hôte qui ont eu gloire dansles années 1975-1980 ne sont pratiquement plus utilisées à cause de leur lourdeur.Le processus général utilisé pour le screening se pratique ainsi :

- Une réplique des clones est réalisée sur un filtre de nitrocellulose ou sur ny-lon

- On utilise ensuite une sonde spécifique marquée par un radio-isotope ( 32P,35S) pour une hybridation. Dans ce cas, la révélation de la séquence inséréeest réalisée par une simple autoradiographie.

- On peut utiliser un anticorps dirigé contre le produit de l’expression de l’ADNinséré dans le cas d’une banque d’expression.

1. Le criblage par des oligonucléotides de synthèse :

Le principe consiste à utiliser, dans un criblage classique, une sonde oligonu-cléotidique marquée synthétisée à partir des données de séquençage d’une fractionde la protéine. Le code génétique permet de déterminer les séquences possibles dugène correspondant (dégénérescence du code). On utilise généralement un poold’oligonucléotides courts de 18 à 25 bases ou quelques oligonucléotides longs de40 à 45 bases. Les appareils automatiques permettent actuellement de séquencer une pro-téine en 24 heures et de synthétiser des oligonucléotides dans le même laps detemps. Les oligonucléotides purifiés sont marqués au 32P et utilisés comme sonded’hybridation in situ d’une banque génomique.

2. Le criblage par des anticorps :

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Cette technique ne peut se réaliser que sur une banque d’expression puis-qu’elle vise à révéler le produit d’expression d’un gène cloné. Il faut pour cela dispo-ser d’un anticorps, de préférence polyclonal dirigé contre le produit du gène. Lecomplexe antigène-anticorps est révélé par un autre complexe protéique possédantsoit une activité enzymatique dont les produits sont colorés ( -galactosidase), soitmarqué à l’iode 125.

Figure IV.6: Criblage d’une bibliothèque d’expression avec une sonde

Figure IV.7 : Criblage d’une bibliothèque d’expression avec les anticorps

3. Electrophorèse (Cf. ci-dessus)

Elle permet de récupérer les fractions d’intérêt pour un séquençage de l’ADNinséré. La révélation des différentes bandes est faite soit par :

- Une utilisation du bromure d’éthidium et une lecture sous une illuminationultra-violette.

- Un marquage chimique ou enzymatique des produits obtenus pour le sé-quençage (utilisation de radio-isotopes, 32P, 35S) suivi d’une autoradiographie.

4. Le séquençage :

Il a pour but la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN isolépour définir les introns, les exons et les zones de régulation de l’ADN inséré dans levecteur. Deux méthodes classiques sont alors utilisées.

a - La méthode de Maxam et Gilbert: la méthode chimique.

L’ADN double brin à séquencer est d’abord marqué au 32P au niveau duphosphate en 5’. Il doit ensuite être digéré par une endonucléase de restriction endeux fragments différents de taille, qui sont séparés par électrophorèse. On obtientainsi un fragment dont une seule extrémité 5’ est marquée. Il est séparé en 4 lots etdans chaque lot, au moyen de réactifs chimiques différents, on réalise une coupureau niveau d’un type de base différent. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide des 4 produits de réaction etautoradiographie, les positions relatives des différentes bases sont déduites de lacomparaison des distances de migration des fragments marqués en 5’.

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Séquence détectée sur le gel Lecture3 →-5’

Ordredestaches

T C G A Lecture3’→5’

32PTGCACTTGAACGCATGCT 18 T32P- TGCACTTGAACGCATGC 18 17 C32P- TGCACTTGAACGCATG 17 16 G32P- TGCACTTGAACGCAT 16 15 T32P- TGCACTTGAACGCA 15 14 A32P- TGCACTTGAACGC 14 13 C32P- TGCACTTGAACG 13 12 G32P- TGCACTTGAAC 12 11 C32P- TGCACTTGAA 11 10 A32P- TGCACTTGA 10 9 A32P- TGCACTTG 9 8 G32P- TGCACTT 8 7 T32P- TGCACT 7 6 T32P- TGCAC 6 5 C32P- TGCA 5 4 A32P- TGC 4 3 C32P- TG 3 2 G32P- T 2 1 T32P- 1 0

Figure IV.8 : La méthode de séquençage des acides nucléiques de Maxam Gilbert :Un traitement chimique permet de cliver spécifiquement au niveau de chaque basequi produit alors des fragments radioactifs de tailles différentes.La séquence de l’ADN, lue directement de bas en haut du gel, est alors :

5’-TGCACTTGAACGCATGCT-3’

b - La méthode de Sanger: la méthode enzymatique.

La méthode de séquençage enzymatique mise au point par Sanger parl’incorporation de didésoxyribonucléotides terminateurs de chaîne a été universelle-ment adoptée. Cette méthode met à profit l’absence d’un hydroxyle en 3’ d’un ddXTP qui nepermet pas la formation d’une liaison phosphodiester. la conséquence est un arrêtde l’élongation lorsqu’un didésoxyribonucléotide est incorporé dans un brin d’ADNen synthèse. Ce phénomène est à la base de la méthode de Sanger.Figure IV.9 : Séquençage, méthode enzymatique

39

5. Analyse du génome et de ses modifications: Le Southern blot

C’est la méthode d’analyse de l’ADN imaginée par Southern en 1975 pourvisualiser les gènes ou toute séquence d’un ADN génomique, par une hybridationavec une sonde, marquée et spécifique, avec des fragments de restriction d’ADN,préalablement séparés par électrophorèse, dénaturés et transférés sur une mem-brane. Le processus est le suivant:

• L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restriction appropriée

• Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose,• L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,• L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support so-lide (filtre de nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plusutilisées car par un traitement au UV (254 nm), on forme des liaisons covalen-tes entre le DNA et le nylon de sorte que le support peut être utilisé plusieursfois avec d’autres sondes.• Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin marquée à faible

stringence puis lavé• Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de

l’autoradiographie.

Figure IV.10 : Southern Blot

Cette technique permet :

• L’établissement des cartes de restriction : Les enzymes de restrictioncoupent l’ADN au niveau de séquences bien définie. Il est donc facile d’établir unecarte de restriction par cette méthode.

• La mise en évidence de pseudo-gènes et de gènes apparentés : Unesonde suffisamment longue peut s’hybrider avec des séquences non totalementcomplémentaire : pseudogènes, gènes d’une même famille ou gènes homologuesd’une espèce différente. Ces gènes sont mis en évidence en fonction des conditionsd’hybridation (stringence).

• Les mutations par délétions : Cette technique permettant de visualiser ungène, il est possible de mettre en évidence une délétion pourvue qu’elle ne soit pastrès grande.

• La détection de mutation ponctuelle : Le remplacement d’une base parune autre peut se traduire par la disparition ou la création de sites de coupures pourune enzyme de restriction donnée. Cette variation des sites de coupure se traduitpar la disparition d’une ou de deux bandes (suivant la longueur de la sonde utilisée)et l’apparition d’une bande de taille supérieur dont la longueur est égale à la sommedes longueurs des deux bandes disparues. La création d’un nouveau site de cou-pure donne le résultat contraire.

40

• La détection des recombinaisons : L’échange entre chromosomes homo-logues au cours de la méiose est la recombinaison. Dans certains cas, il est possi-ble de mettre en évidence ces recombinaisons par cette technique.Figure IV.116. La PCR

Définition:

La PCR (Polymerase Chain Reaction), la réaction de polymérisation enchaîne consiste à amplifier sélectivement une séquence particulière d’ADN parl’action répétée d’une ADN polymérase. Le fragment d’ADN à amplifier est comprisentre deux séquences (complémentaires des amorces) qui doivent être connues etla longueur ne peut excéder 10 kb.

Æ Processus:

Pour faire la PCR, on utilise l’ADN polymérase d’une bactérie: Thermophilusacquaticus qui vit à 75°C dans les eaux thermales. Cette polymérase (Taq polymé-rase) est toujours active à 94-96°C. La réaction de la PCR comporte trois étapes quiconstituent un cycle au cours duquel la quantité d’ADN à amplifier est doublée. Cescycles sont renouvelés entre 20 et 50 fois en fonction de la quantité d’ADN cible dedépart et du but recherché.

• la dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C,• l’hybridation avec une amorce, appariement primer, annealing à 64°C• extension de l’amorce à 70 - 72°C par la Taq polymérase.

L’amplification est effectuée par la répétition des cycles qui assure une dupli-cation exponentielle de chaque brin.

Æ Les éléments de la PCR:

les réactifs et le matériel:

• l’ADN à amplifier• 2 amorces: sens et anti sens• tampon de réaction (Buffer)• MgCl2• dNTP• Taq polymérase• L’appareil thermocycleur pour PCR• H2O bi-distillée et stérile

Æ L’intérêt et application de la PCR:

La PCR est la méthode actuelle la plus efficace et la plus rapided’amplification d’un ADN cible, c’est pourquoi elle est maintenant largement utilisée.Elle permet de mettre en oeuvre les techniques habituelles de génie génétiquemême si l’on ne dispose au départ que d’une faible quantité d’ADN.CF Figure IV.5 : Les cycles de la PCR

41

7. Étude des polymorphismes : RFLP, VNTR, SSTR, SSCPLes RFLP (restriction frament length polymorphism) sont des variations de séquencede l’ADN révélées par des modifications de la carte de restriction. L’ADN est soumisà une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction suivie d’un Southernblot. En d’autres termes : l’hydrolyse d’un ADN par une endonucléase conduit à unesérie de fragments, appelés fragments de restriction. La longueur des fragments estdéterminée par la distance séparant les séquences spécifiques reconnues par cetteendonucléase. Nous avons les RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).Une molécule d’ADN donnée coupée par une enzyme de restriction donnée produittoujours les mêmes fragments : cette série de fragments fournit une empreinte ca-ractéristique de l’ADN hydrolysé, on parle de carte d’identité moléculaire. Nous avons aussi les polymorphismes de répétition : ce sont les minisatelitesou VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Les VNTR sont des séquencesparticulières. Elles sont répétitives, dispersées et très polymorphes. Elles ont sou-vent 11 à 16 bp (GGAGGTGGGCAGGA [A/G] G. Elles permettent la réalisation del’empreinte genetique (ADN finger printing)

Les microsatelites de type (CA)n sont plus fréquent et les mieux caractérisés :les SSTR (Short Sequences of Tandem Repeats). Ils sont favorisé par des crossingover inégales lors de la méiose. La chorée de Hungtington qui est une maladie neu-rodégénérative est provoquée par des crossing-over inégaux. La technique desSSTR permettent d’établir des polymorphismes à plus de 99,99%. Cette techniqueest utilisée dans les tribunaux pour découvrir le coupable, pour déterminer la pater-nité ou la maternité et elle est désormais utilisé dans la pharmacogénétique.

La mise en évidence des mutations ponctuelles utilise le système de l’analysedes polymorphisme de conformation de l’ADN simple-brin : SSCP (single StrandConformation Polymorphism). La structure secondaire que prend un segment del’ADN simple-brin est fonction de sa séquence. Une mutation ponctuelle au sein decette séquence modifie la structure secondaire pour qu’il en résulte une modificationde la migration en électrophorèse. Cette propriété permet de mettre en évidence laprésence d’une mutation ponctuelle.

Processus :- La séquence où l’on souhaite rechercher une mutation est amplifiée

par PCR.- Cette séquence ne doit pas dépasser 300 à 500 bp.- L’ADN est marqué par un iso-radioactif au cours de l’amplification.

On peut introduire un nucléotide α32P dCTP ou alors utiliser des pri-mers marqués.

Technique d’empreintes par didéoxynuclotides ou ddF

Les amplicons de la PCR

Réaction de séquence à l’aide de la Taq DNA polymérase avec un primer interne

42

Migration sur un gel d’acrylamide non dénaturantPar exemple, on a la séquence suivante avec une mutation Cà A

5’ ---- AGTGTTACGTGCTA ----à 3’ Pour l’allèle normal

5’ ---- AGTGTTAAGTGCTA ----à 3’ Pour l’allèle muté

Après PCR, on ajoute un seul didéoxynucléotide (par exemple, ddGTP) et desdNTPs. Puis, une réaction de séquence utilisant la Taq polymérase est réalisée(avec une amorce marquée).

5’ ---- AGTGTTACG TGCTA ----à 3’ Pour l’allèle normal3’ ---- TCACAATddG

5’ ---- AGTGTTAAGTGC TA ----à 3’ Pour l’allèle muté3’-----TCACAATTCACddG

NB. L’altération de la conformation spatiale de l’ADN permet de détecter dans un gella mutation (SSCP)

Normal Muté

Fig. IV.12 : d’un gel de polyacrylamide en utilisant la techniquede dideoxyfinger-printing

8 . Puces à ADN (microarray) ou ADN chips

La technologie des puces ADN permet l’analyse de l’expression de milliers degènes simultanément. Employer les puces ADN vise à caractériser les relationsgène-fonction ou définir et comparer les profils d’expression des messagers expri-

Normal Muté

Bande de faille normale

Bande de faille anormale correspondant à la mutation

43

més dans des cellules isolées dans différentes conditions (exemple : cellules norma-les comparées aux cellules tumorales) ou soumises à différents traitements (défini-tion du profil d’action d’une drogue). Les puces ADN sont un outil de choix dans larecherche et la caractérisation de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Principe :

Synthétisons une série d’oligonucléotides de 8 bp (octamères) représentanttoutes les combinaisons possibles 48 = 65.536 : ces 48 oligonucléotides sont fixés demanière ordonnée sur une plaque de silice. La séquence dont on cherche à déter-miner la composition est hybridée sur ce filtre. Les conditions de stringence sonttelles que, seules, les appariements strictement homologues se réalisent. Un traite-ment informatique permet d’analyser les résultats.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

xxxx B

C

D

xxxx E

F

G

xxxx H

I

xxxx J

K

xxxx L

Figure IV.13 : schéma simplifié d’une puce.

Prenons cette puce sur laquelle sont fixés des octamères de séquences che-vauchantes différentes et ordonnées. Supposons que nous ayons un ADN de 12 bpet hybridons-le à cette puce. Dans cet exemple nous avons cinq hybridations deséquences.

Par exemple, si les ADN fixes sur les cases ci-après ont la séquence décrite :

B9 : C A G C C A A T

44

E4 : A G C C A A T A

H12: G C C A A T A C

J1 : C C A A T A C G

L12 : C A A T A C G A

Figure IV.14

La séquence reconstituée est alors : 5’ – CAGCCAATACGA.

Le support utilisé pour fixer les oligonucléotides peut être une plaque de silice. Lasynthèse des oligonucléotides se fait in situ : réactions chimiques avec adresse spé-cifique sur le verre. Ces puces sont très petites, environ 1,6 cm2 avec un espaceentre les sondes d’environ 50 µm (65.000 sondes fixées).On peut encore diminuerleur taille. Ainsi, des puces, avec espacement des sondes de 20 µm, permettent defixer plusieurs centaines de milliers de sondes, ont été fabriquées. Les industrielsespèrent pouvoir réaliser des puces de 1 µm et pourquoi pas, comme dansl’industrie informatique, des puces de 0,3 µm !

Secteurs d’application :

• Dans le séquençage de l’ADN mitochondrial (16,6kb).

• Détection de mutations et de polymorphismes,

• Expression de gènes,

• Pharmacogénétique ou pharmacogénomie.

C A G C C A A T A C G A

45

CHAPITRE V: MUTAGENÈSE IN VITRO, EXPRESSIONDES GÈNES EUCARYOTES DANS LES BACTÉRIES.

La fin des années 1970 et le début des années 1980 ont vu se développerdes techniques qui permettent de modifier des paires de bases bien spécifiquesdonc de créer différents types de mutations ponctuelles, de délétions et d’insertionsdans des fragments d’ADN cloné. Les fragments d’ADN ou les gènes ainsi modifiéspeuvent ensuite être réintroduits dans l’organisme d’origine pour observer les effetsdes mutations sur le phénotype ou sur la régulation de l’expression génétique.

I - LES MUTAGENÈSES

1. Mutagenèse par délétions L’un des moyens les plus drastiques pour évaluer le rôle d’une séquence deDNA donnée est de la supprimer. L’analyse des modifications physiologiques quisuivent cette excision permet alors de connaître le rôle de la séquence « délétée ».Pour être pleinement informative, la suppression doit être progressive. On emploialors la stratégie suivante :

ñ Création d’une délétion étendue dans l’ADN considéré afin de connaître lerôle de la séquence

ñ Création de délétions de plus en plus courtes pour circonscrire les régionsd’intérêt.

ñ Insertion de séquences plus ou moins longues en fonction de la carte derestriction.

ñ Création de mutations ponctuelles pour connaître le rôle de chaque basedans les mécanismes de régulation ou dans la séquence peptidique.

Le principe consiste à utiliser les enzymes de restriction soit pour « déléter »,soit pour insérer des portions plus ou moins grandes de DNA dans le gène clonéafin d’élucider son rôle dans le génome. On utilise pour cela plusieurs stratégies enfonction des sites restriction :

ñ Une coupure par une enzyme de restriction suivie de l’action de la nu-cléase S1 permet de retirer de 3 à 8 paires de bases suivant le type d’enzyme derestriction (largeur du site de reconnaissance)

ñ Une coupure par une enzyme de restriction suivie de l’action del’exonucléase III permet également de retirer plus de bases en fonction du tempsd’incubation. La nucléase S1 est toujours utile pour raboter les extrémité 5’.

ñ Une coupure par une enzyme de restriction suivi de l’activité de la nu-cléase Bal 31 qui dégrade les deux extrémités de l’ADN à la fois. L’étendue du re-trait dépend du temps d’incubation. La fermeture des deux extrémités restantes esttoujours réalisée par la T4 ligase qui peut joindre deux molécules de DNA ayant desbouts francs.

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2. Mutagenèse par insertion:

L’insertion d’une courte séquence dans un gène permet d’élucider l’effet deposition soit d’une base soit d’une séquence de bases dans les phénomènes de ré-gulation, ou pour connaître l’influence d’un acide aminé dans le fonctionnementd’une protéine. Le principe utilise les mêmes méthodes que pour la délétion. Lefragment que l’on veut insérer ou modifier est, soit une substitution de nucléotides,soit un fragment de restriction purifié, soit un oligonucléotide de synthèse.

a- Les substitutions de nucléotides

Les substitutions des bases peuvent être introduites dans un segment d’ADNcloné dans un plasmide, après y avoir créé de courtes régions mono-caténaires.Ces régions mono-caténaires sont alors utilisées pour substituer des paires de ba-ses ou pour introduire des nucléotides supplémentaires:

∗ soit par une digestion partielle à l’aide de l’exonucléase III (qui a une actionexonucléasique 3à 5 ) après une coupure par une enzyme de restriction. On auradonc des bouts 5’ débordants.

∗ soit en exploitant l’activité exonucléasique de l’ADN polymérase Id’Escherichia coli (qui a trois activités enzymatiques: 5à 3 polymérisante; 5à 3exonucléasique; et 3à 5 exonucléasique). En effet, en l’absence des désoxyribo-nucléotides triphosphates, cette enzyme digère un des brins d’un duplex d’ADNdans la direction 3’à 5’. On obtient encore des extrémités 5’ débordants.

Exemple : Pour créer donc un mutant contenant une substitution de base par unedésamination de la cytosine.Figure V.1 : Mutagenèse, substitutions de nucléotides

On procède alors comme il suit:

à Avec une enzyme de restriction donnée comme Hind II, on ouvre dansl’ADN un site de restriction: un smal.

à Le site est traité avec l’ADN polymérase I modifiée (appelée fragment deKlenow). En présence de dTTP, ce fragment enzymatique agit comme une exonu-cléase en effectuant une digestion simple brin 3’à5’ jusqu’à ce qu’il rencontre unrésidu T.

à L’addition du bisulfite provoque une désamination des résidus cytosines(C) des brins exposés pour donner de l’uracile (U).

à Après élimination du bisulfite, la molécule de DNA est réparée parl’addition des quatre dNTP et du fragment de Klenow de la DNA polymérase.

à Le résultat est une substitution d’une paire de bases G-C par une paire A-T.

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b - La mutagenèse dirigée au moyen d’oligonucléotides:

Les exemples que nous venons de voir possédaient un site de restriction pro-pice aux bords de la région à modifier. Mais comment créer une mutation dans uneséquence qui ne bénéficie pas de cette situation favorable ? Pour résoudre ce pro-blème, Michael Smith a inventé la méthode qui utilise des petits oligonucléotides desynthèse d’une taille de 15 à 25 bases.

Figure V.2 : mutagenèse dirigée au moyen d’oligonucléotides

Le protocole est le suivant:

1. Le gène que l’on désire muter est cloné de préférence dans un vecteur dé-rivé d’un phage dont le génome est une molécule d’ADN monocaténaire, comme lephage M13.

2. Un oligonucléotide synthétique dérivé du gène cloné et portant la mutationdésirée est ajouté dans le milieu pour servir d’amorce (primer) pour la synthèse invitro du brin complémentaire du vecteur M13.

3. L’amorce synthétique peut donc contenir n’importe quelle base « erronée »que l’on désire introduire dans la séquence. Il y aura donc un défaut d’appariementau niveau de cette base avec l’ADN du vecteur. Cependant, si l’hybridation est réali-sée à basse température et à faible stringence (faible force ionique), une ou deuxbases mal appariées peuvent être tolérées dans la formation de la double hélice.

4. Le brin complémentaire est alors synthétisé in vitro par le fragment de Klé-now de la DNA polymérase I qui utilise l’oligonucléotide modifié comme amorce.

5. Les deux brins de l’ADN obtenu sont séparés par simple chauffage suivid’un refroidissement rapide et transférés par transformation dans E. coli où il serontrépliqués in vivo et produiront finalement un grand nombre d’exemplaires de la sé-quence mutée que l’on désire (50% pour la séquence mutée et autant de copies del’ADN sauvage 50%).

6. Les bactéries ayant incorporé la séquence mutée sont sélectionnées parhybridation in situ dans des conditions de forte stringence avec l’oligonucléotide mu-té marqué comme sonde (pour différencier la molécule non mutée).

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c - La mutagenèse insertionnelle ciblée par recombinaison homologue

On peut cibler le site de la mutagenèse insertionnelle en introduisant une sé-quence homologue au gène que l’on veut léser. Celle-ci reconnaît sélectivement legène endogène et provoque une recombinaison homologue responsable soit d’uneinsertion par addition, soit une insertion par remplacement. Dans le cas d’une inser-tion par remplacement, le gène cible est inactivé. Dans le cas d’une insertion paraddition, les deux gènes sont présents dans le génome. (Figure V.3)

La première construction réussie a utilisé le protocole suivant:

1 – Le vecteur plasmidique utilisé contenait à la fois un fragment du gèneHPRT (Hypoxanthine-guanine PhosphoRibosyl Transférase) pour cibler ce gène invivo et un gène néo (ce gène marquer confère à la cellule une résistance à la néo-mycine) 2 - Le vecteur est introduit par électroporation dans des cellules embryonnai-res indifférenciées (ES cells : Embryonic Stem cells : cellules staminales em-bryonnaires indifférenciées pluripotentes et cultivables in vitro de façon prolongée). 3 - Les cellules ayant intégré l’ADN sont sélectionnées par leur résistance auG418 (un analogue de la néomycine) conférée par le gène néo. 4 - Celles où l’intégration s’est faite par le truchement d’une recombinaisonhomologue ayant inactivé le gène HPRT sont alors sélectionnées par leur résistanceà la thioguanine (sélection des cellule HPRT-).

Pour réaliser la même opération sur des gènes non sélectionnables (gènesde régulation), Mansour a élaboré un système de double sélection : le procédé desélection positive et négative dont le principe est le suivant :

ñ Si l’intégration se fait d’une manière aléatoire, c’est-à-dire par insertion, laconstruction utilisée est intégrée en totalité, et le gène cible n’est pas touché. Lacellule est sélectionnée positivement par le G418 (résistance conférer par le gènenéo) et négativement par le ganciclovir (tk+. La thymidine kinase du virus de l herpesconfère la sensibilité à une drogue antivirale, le ganciclovir, analogue de la thymine).

ñ En cas de recombinaison homologue par remplacement, les exons C, D etE endogènes sont remplacés par ceux de la construction (C, D, néo, D , E) et legène tk est éliminé en raison de sa position terminale. En ce moment, le gène cibléest inactivé car l’exon D exogène est interrompu par le gène neo. La cellule est sé-lectionnée positivement par G418 ( neo+ ) et résiste au ganciclovir (tk-). Les évè-nements de recombinaison homologue réussis peuvent être vérifiés par la PCR enutilisant une amorce correspondant à l’ADN exogène (par exemple une séquencenéo) ou une amorce correspondant à une séquence endogène (comme l’exon F dugène HPRT).

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Figure V.3 : La mutagenèse insertionnelle ciblée par recombinaison homologue

A B C D E F

C D NEO D F tk

C D NEO D E tk A C D E F

A B C D E F

C D NEO D E tk

A B C D NEO D E F

Gène ciblé

Construction

Gène ciblé

Construction

Intégrationaléatoire

Recombinaisonhomologue

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Figure V.3 : La mutagenèse insertionnelle ciblée par recombinaison homologue

Figure V.4 : La mutagenèse , mutation d’un site de restriction.3 . Mutagenèse par PCR

• La création d'une mutation artificielle peut être obtenue dans un gène par lejeu des amplifications à partir d'amorces modifiées.

• On prépare l'amplification du gène ou du cDNA grâce à deux amorces pla-cées en amont et en aval de la séquence d'intérêt. On prépare aussi par syn-thèse des oligonucléotides conformes aux séquences des deux brins du gèneautour du codon qui doit être modifié mais dont les bases sont volontairementchangées pour qu'elles permettent la synthèse d'un brin complémentairecomprenant la substitution (ou la délétion...) souhaitée.

• On fait une première amplification entre chacune des amorces modifiées etles amorces des extrémités. En réunissant ces deux amplifications et en dé-naturant l'ADN, on conduit à une renaturation entre les fragments au niveaudes amorces centrales modifiées. Cette hybridation fait apparaître des extré-mités 3'OH d'où l'élongation (Taq polymérase) peut se poursuivre jusqu'auxextrémités de la séquence d'intérêt. La poursuite des cycles en présence desamorces amont et aval conduit à l'amplification de cette séquence complètedans laquelle le codon muté a été inséré.

• La création d'une mutation artificielle peut être obtenue dans un gène par lejeu des amplifications à partir d'amorces modifiées.

• On prépare l'amplification du gène ou du cDNA grâce à deux amorces pla-cées en amont et en aval de la séquence d'intérêt. On prépare aussi par syn-thèse des oligonucléotides conformes aux séquences des deux brins du gèneautour du codon qui doit être modifié mais dont les bases sont volontairementchangées pour qu'elles permettent la synthèse d'un brin complémentairecomprenant la substitution (ou la délétion...) souhaitée.

• On fait une première amplification entre chacune des amorces modifiées etles amorces des extrémités. En réunissant ces deux amplifications et en dé-naturant l'ADN, on conduit à une renaturation entre les fragments au niveaudes amorces centrales modifiées. Cette hybridation fait apparaître des extré-mités 3'OH d'où l'élongation (Taq polymérase) peut se poursuivre jusqu'auxextrémités de la séquence d'intérêt. La poursuite des cycles en présence desamorces amont et aval conduit à l'amplification de cette séquence complètedans laquelle le codon muté a été inséré.

II. MISE EN ÉVIDENCE DES EFFETS DE LA MODIFICATION

L’effet des modifications est de suivre l’expression d’un gène soit par uneaugmentation ou une diminution de la production d’une protéine soit d’étudier lesmodifications structurale de la protéine produite. Dans le cas des changements phé-notypiques le résultat est visuel, mais dans les autres cas, il faut avoir recours soit àdes gènes reporteurs, soit à des promoteurs inductibles. La séquence de DNA modifiée est couplée à un gène reporteur que la celluled’expression ne possède pas et dont le produit est facilement analysable. Les gènes

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les plus courants sont : le gène de la Chloramphénicol-acétyl transférase (CAT), dela β-glucuronidase ‘( -Glu), de la β-galactosidase ( -Gal) et de la luciférine. (CFPhotocopies)

III. TRANSFERT DE L’ADN MODIFIÉ

Le transfert de l’ADN libre dans les cellules s’effectue par transfection avecdifférentes techniques suivant le type cellulaire : La transfection par le phosphate de calcium fait intervenir une internalisationdu complexe DNA-calcium par phagocytose La transfection par le complexe DEAE dextran est également une internalisa-tion par phagocytose L’électroporation utilise l’effet d’une tension électrique sur des cellules ensuspension qui provoque la formation transitoire de pores permettant au DNA depénétrer dans la cellule. Le DNA peut aussi être introduit par des projections de micro-particules enro-bées de DNA surtout pour les plantes. Le DNA peut aussi être introduit dans les cellules par micro-injection surtoutdans le cas des ovocytes fécondés. La transfert de matériel génétique utilise aussi les vecteurs viraux, rétrovirauxet les plasmides que l’on appelle alors des vecteurs navettes.

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DEUXIÈME PARTIE :

APPLICATIONDE LA BIOLOGIEMOLECULAIRE :

LE GÉNIE GENETIQUE

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CHAPITRE VI: LES TECHNIQUES DU GENIE GENETIQUE APPLIQUEESAUX MICRO-ORGANISMES

Les génomes eucaryotes sont beaucoup plus complexes que les génomesbactériens et phagiques C’est pourquoi les techniques de manipulation de l’ADNdoivent être adaptées aux différents génomes. Les exemples ci-dessous donnentune idée de la taille du génome de quelques espèces :

• Plasmides à 2 à 5 kb• Bactériophage à 4,8 kb• Bactériophage M13 à 6,4 kb• E. coli à 4 Mb• La levure (Saccharomyces cerevisiae) à 4 Mb• Neurospora crassa à 27 Mb• C. elegans à 100 Mb• Drosophila melanogaster à 165 Mb• Homo sapiens à 3000 Mb

I. LA TECHNIQUE DE L'ADN RECOMBINANT (ADNR)

La technique de l'ADN recombinant (ADNr) est simple dans son principe:L’ADN recombinant est formé en réunissant des segments d’ADN de différentessources par le processus suivant:

L'ADN d’intérêt est coupé avec une enzyme de restriction, L'ADN exogène contenant la séquence d'intérêt est mis en présence

de l’ADN du vecteur digéré par la même enzyme Les deux ADN sont ensuite ligaturés avec une enzyme appelée ligase. Le DNA obtenu est transféré dans une cellule d’expression On analyse les résultats obtenus grâce à des marqueurs présents

dans l’ADN du vecteurFigure VI.1

1 - Les organismes transgéniques et la recherche en génie génétique

Un organisme transgénique est défini comme provenant d’une cellule dont legénome a été modifié par l’introduction d’ADN extrinsèque. Cet ADN extrinsèquepeut être une séquence provenant de la même espèce mais qui a subi des modifica-tions chimiques ou provenir d’une espèce différente. Le gène d’intérêt dansl’échantillon d’ADN extrinsèque est le transgène.

L’introduction de cet ADN dans une cellule peut s’effectuer par une série demanipulation diverses : par l’électroporation, la micro-injection, les liposomes, la co-précipitation par le phosphate de calcium, par la transformation, par infection virale,ou par un bombardement avec des micro-projectiles de tungstène enrobés d’ADNdans le cas des cellules végétales.

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La construction d’organismes transgéniques constitue un bond en avant pourla recherche en génie génétique. Une des méthodes les plus importantes consisteen l’utilisation de gènes indicateurs qui permettent de mesurer l’activité d’un gènespécifique dans le tissu où il s’exprime normalement, malgré l’absence d’un phéno-type facilement détectable. La région qui contrôle l’expression du gène en question(promoteur) est alors rattachée à la région codante d’un gène dont l’activité est faci-lement mesurable et qui constitue alors le gène indicateur. Chaque fois que le gèneétudié est exprimé, le gène indicateur signale sa présence par son activité indica-trice dans la cellule ou dans les tissus concernés.

La construction de bactéries, de plantes, de champignons et d’animaux trans-géniques ouvre donc de nombreux débouchés pratiques. Nous avons déjà vu com-ment les bactéries transgéniques sont utilisées pour la production de différentes pro-téines, parfois d’origine humaine, utiles en médecine et en pharmacie. Cet aspect dela recherche est appelé biotechnologie.

L’ADN recombinant : L’action d’une enzyme permettant de souder deux frag-ments d ‘ADN , comme l’exemple de l’enzyme EcoRI explique simplement le principede l’ADN recombinant.

2. Intérêt de la transgenèse

Sur le plan de la biotechnologie :

- Au plan zootechnique : l’un des intérêts majeurs de la transgenèse estl’amélioration des caractères phénotypiques des animaux de rente: amélioration dela croissance des animaux, comme le porc, le saumon, l’acquisition de résistancesaux maladies causes de mortalité dans les élevages de lapins, de truites, de car-pes….

- Au niveau des plantes : La création de plantes résistantes aux insectes, austress hydrique et pour la production de protéines utiles comme les anticorps : (maïsrésistant aux insectes, tomates transgéniques à mûrissement lent, bananes vacci-nantes….)

Sur le plan médical :

â Production de protéines d’intérêt pharmaceutique : Certaines protéi-nes trop complexes (glycosylées, carboxyméthylées…) ne peuvent être synthétiséescomplètement par les bactéries in vitro. Il faut donc chercher à en obtenir par unanimal transgénique (dans le lait, le sang, les urines…..). L’obtention de ruminantstransgéniques producteurs de protéines d’intérêt pharmaceutique à haute valeurajoutée (facteurs VIII et IX de la coagulation, anti-thrombine III, alpha-1-antitrypsine,activateur du plasminogène, sérum albumine…) représente aujourd’hui un intérêtfinancier énorme.

â Xéno transplantation : Face à l’insuffisance des organes humains dispo-nibles pour les greffes, la recherche d’organes animaux peut représenter une solu-

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tion palliative. Le porc, physiologiquement proche de l’homme est à l’heure actuellele meilleur candidat, d’autant plus que très peu de maladies sont transmissibles duporc à l’homme. Pour éviter le rejet d’organes porcins transplantés chez l’homme,les gènes humains des protéines régulatrices du complément sont transférés auporc. Les c urs et les reins de porcs transgéniques obtenus en Grande Bretagne,aux Etats Unis et en Australie survivent pendant plusieurs semaines quand ils sontgreffées à des primates.

â Modification de la composition du lait : Elle a pour but de mieux adap-ter le lait des ruminants à la consommation humaine et d’améliorer sa transformationpar l’industrie laitière. L’expression de la lactoferrine humaine dans le lait de vache adéjà été réalisée. Il s’agit d’un composé du lait humain qui est absent du lait de va-che. Elle joue un rôle de transporteur de fer, mais aussi un rôle antibactérien (Elleassure une protection du tube digestif du nouveau-né contre les infections bacté-riennes). Le taureau hollandais HERMANN est un mâle fondateur transgénique dece gène.

A l’inverse, il est envisagé de diminuer la concentration de la béta-lactoglobuline qui participe à l’intolérance au lait dont souffre une grande partie de lapopulation mondiale.

Un lait enrichi en anticorps ou en lysozymes pourrait être protecteur du tubedigestif et pourrait même être utilisé chez les nourrissons. Le lait devient alors un« alicament », c’est à dire simultanément un aliment et un médicament.

â Création de modèles animaux des maladies humaines : Des souris,mais aussi des ruminants transgéniques peuvent servir de modèles pour l’étude desmaladies humaines à prions. Les souris de même que les lapins peuvent servir aus-si pour l’étude du SIDA et pour des tests thérapeutiques.

â Risques liés à la transgenèse : Les applications et les espoirs que fontnaître la transgenèse sont très nombreux. Néanmoins, l’utilisation de la transgenèsechez les végétaux et les animaux fait l’objet de vives réserves et controverses :

_ L’utilisation de l’hormone de croissance humaine chez les animaux per-turbe leur croissance et leur reproduction. Les moutons qui sur-expriment GH (hor-mone de croissance humaine) sont diabétiques et meurent avant l’âge d’un an.

_ Les risques liés à la consommation des produits OGM comme les protéinesde la vache folle qui provoque des troubles chez l’homme. Les maïs transgéniquespossèdent aussi des gènes de résistance aux ampicillines. Ces transgènes peuventdonc s’intégrer dans les bactéries du tube digestif humain et conférer des résistan-ces bactériennes aux antibiotiques que nous utilisons pour nos traitements.

_ Les risques liés à l’environnement : Ces risques sont liés à la dissémina-tion des organismes transgéniques. Des bactéries et des souris transgéniques quis’échappent d’un laboratoire de recherche ou d’un centre de production, les déchetsdes produits transgéniques déversés dans la nature constituent de grands dangersqui guettent sans cesse notre écosystème.

II - SYNTHÈSE DU FACTEUR VIII HUMAIN PAR L’E. COLI

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Le vecteur utilisé dans cet exemple est le phage T7. Au début de l’infection,l’ARN polymérase du phage T7 transcrit les gènes précoces à partir d’un promoteurdit précoce du phage T7. En fin d’infection, la bactérie synthétise des quantitésénormes des produits des gènes dits tardifs du phage T7 (les protéines de la cap-side et de la queue). A ce moment, les gènes de la bactérie hôte ne sont plus trans-crits. Par conséquent seules les protéines du phage sont encore synthétisées. Cettepossibilité est utilisée pour produire de grande quantité des protéines d’intérêtcomme le facteur VIII de la coagulation sanguine qui est défectueux chez les hé-mophiles.

On insère le gène de l’ARN polymérase de T7 dans le chromosomed’Escherichia coli sous le contrôle du promoteur de l’opéron lactose. Le gène del’ARN polymérase de T7 est transcrit à partir du promoteur lac et se trouve norma-lement réprimé par le répresseur lac. L’addition de l’inducteur IPTG (analogue dulactose), inactive le répresseur et autorise alors la synthèse de l’ARN polymérase duphage T7.

Le gène d’intérêt, en l’occurrence, le gène humain (ADNc) du facteur de coa-gulation du sang, le facteur VIII, a été inséré dans un plasmide à côté d’un promo-teur tardif du phage T7. L’ARN polymérase du phage T7 produite alors par la bacté-rie transcrit abondamment ce gène dans le plasmide. Il en résulte une production dequantités importantes de facteur VIII par les bactéries contenant le plasmide.

Le schéma représente un système de deux vecteurs pour la production endeux étapes du facteur VIII humain. Le Chromosome d’E. coli est manipulé pourcontenir le gène de l’ARN polymérase du phage T7 placé sous le contrôle du promo-teur lac. Lorsque la transcription à partir du promoteur lac est induite par l’additiond’IPTG, le gène de la polymérase du phage T7 est aussi transcrit et traduit en pro-téine.

Les RNA polymérase de T7 ainsi produites transcrivent activement à leur tourle gène du facteur VIII à partir du promoteur tardif du T7 présent sur le plasmide. Lagrande quantité de mRNA ainsi produite est traduite pour donner une grande quanti-té de la protéine facteur VIII.

III - SYNTHÈSE DE L’INSULINE HUMAINE PAR E. COLI:

Expression de l’insuline humaine chez Escherichia. coli : Les deux chaînesd’insuline sont synthétisées séparément sous forme de protéines fusion avec la -galactosidase. Elles sont ensuite libérées par un traitement chimique puis mélan-gées. L’insuline active est obtenue par une réaction d’oxydation chimique des cys-téines. Actuellement l’insuline est produite en grande quantité par E. coli par uneinsertion de son gène dans un plasmide. Figure VI.2 : Synthèse de l’insuline

IV - SYNTHÈSE DE L’HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE PAR ESCHERICHIA COLI

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Le schéma de la figure IV.8 donne le protocole de construction pour la syn-thèse de l’hormone de croissance humaine dans E. coli :

(a) : Dans la première construction, la séquence signal humaine de l’insuline est éli-minée pour permettre l’expression de la protéine dans les cellules bactériennes. Ilen résulte une méthionine à l’extrémité N-terminal qu’il faut enlever pour avoir la pro-téine active.

(b) : Dans cette construction, une séquence signal bactérienne est ajoutée pour fa-voriser la sécrétion du produit de traduction dans l’espace périplasmique. Dans cecas, il n’y a plus de méthionine supplémentaire et le produit excrété est de l’hormonede croissance pure.

V – PRODUCTION DE VACCINS PAR LA TECHNIQUE DE L’ADNRECOMBINANT :

1 - Les levures transgéniques

La levure Saccharomyces cerevisiae est devenue l’Escherichia. coli deseucaryotes. L’une des raisons est que la génétique de cette levure est extrêmementbien développée. Les vecteurs de levure les plus simples sont dérivés de plasmides bactériensdans lesquels un fragment d’ADN de levure a été inséré. Quand ils sont introduitsdans les cellules de levure, ces plasmides peuvent s’intégrer dans les chromosomespar recombinaison homologue faisant intervenir un seul ou deux crossing-over.Ces plasmides bactériens ne peuvent cependant pas se répliquer dans la levure.

• Dans le premier cas, le plasmide entier est intégré dans le chromosome.• Dans le second cas, l’allèle cellulaire est remplacé par celui qui est porté

par le plasmide par recombinaison.

Il est alors possible d’introduire des gènes étrangers dans la levure pour enétudier l’effet sur le phénotype, puis de re-transférer le plasmide dans Escherichiacoli pour manipuler le gène de la levure, pourvu qu’il contienne une origine de répli-cation bactérienne et un marqueur sélectionnable dans la bactérie. Ces vecteursnavettes que sont les chromosome artificiels de levure (YAC) sont extrêmement in-dispensables pour le clonage de grands fragments de génome humain. Commeexemple :

• le gène qui code pour le facteur VIII de la coagulation sanguine est long de190 kb

• le gène responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne fait 1000 kb.

On réalise alors, l’importance d’avoir des vecteurs à grande capacitéd’emmagasinage pour étudier les gènes humains ou pour produire des protéineshumaines à intérêt thérapeutique.2 – L’élaboration du vaccin contre l’hépatite B.

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Chaque année, le virus de l’hépatite B infecte plusieurs centaines de milliersde personnes dans le monde. On estime qu’aux Etats-Unis, il y a 150 000 infectionspar l’hépatite B chaque année. 16 à 19 % de la population du Burkina Faso sontaussi atteints par l’infection à l’hépatite B. Le virus de l’hépatite B (HBV) qui infectele foie, provoque des lésions et dans certains cas des cancers. La particule viraleest recouverte d’un antigène de surface : HbsAg. Cette protéine se retrouve dans lesang des personnes infectées sous la forme de gros agrégats protéiques.

La fabrication du vaccin contre l’hépatite B, appelé Engérix-B a utilisé latechnologie de l’ADN recombinant. Pour ce faire, le gène de l’antigène de surface duvirus de l’hépatite B (HbsAg) a été introduit dans Saccharomyces cereviciae parl’intermédiaire d’un YAC. Dans les cellules de levures transgéniques, le gène esttranscrit et traduit en antigènes viraux. Après purification, ces antigènes injectés àl’homme provoquent une réponse immunitaire par la production des anticorps anti-Hbs ou anti HbsAg. Cette protéine est actuellement commercialisée et constitue unvaccin contre l’hépatite B. Figure VI.3 : Production de l’antigène HbsAg

VI - APPLICATION DU GÉNIE GÉNÉTIQUE À L'AMÉLIORATION DE LAPRODUCTION DES ANTIBIOTIQUES PAR DES BACTÉRIES

L'apparition de bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques poseun grave problème médical. Par exemple, la vancomycine, qui a longtemps été l'an-tibiotique de référence contre les infections sévères à bactéries Gram+ (endocardi-tes, septicémies...) est inopérante dans un nombre croissant de cas. Cela rend né-cessaire la recherche de nouvelles molécules actives contre ces pathogènes.

La synthèse de la pristinamycine par des Streptomyces pristinaespiralis re-combinants

Les chercheurs ont eu l’idée de construire une souche génétiquement modi-fiée de Streptomyces pristinaespiralis, bactérie Gram+ qui produit la pristinamycine.Cette nouvelle souche bactérienne transgénique est stable dans les conditions in-dustrielles et l'antibiotique est obtenu dans la forme souhaitée.

Les Streptomyces sont des bactéries du sol à Gram+ qui appartiennent à laclasse des Actinomycètes. Elles présentent des phénomènes de différenciation uni-ques chez les procaryotes, tels que la formation de mycélium et de spores. Cettedifférenciation morphologique s'accompagne d'une différenciation métabolique et dela production d'une grande variété de métabolites secondaires, présentant tout unéventail de structures chimiques et d'activités biologiques. Cela rend la productionindustrielle de ces métabolites particulièrement intéressante. On peut trouver desmolécules ayant une activité herbicide, anticancéreuse, antihelminthique, anaboli-sante, antibiotique. Mais les plus connus restent les antibiotiques. L'abondance et ladiversité structurale des antibiotiques synthétisés par les Streptomyces ne se re-trouvent dans aucun genre bactérien, au point que les Streptomyces sont à l'originede 70 % des antibiotiques produits industriellement. Les Streptomyces étaient donctout indiquées pour mettre au point de nouvelles molécules actives. Les antibioti-ques de la famille des streptogramines, en particulier la nouvelle pristinamycine in-

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jectable, développée par Rhône-Poulenc-Rorer, peuvent fournir un nouveau moyende lutter contre les bactéries pathogènes.

La pristinamycine est utilisée en médecine humaine depuis une vingtained'années, mais à cause de sa faible solubilité, son utilisation était limitée, c'est pour-quoi une forme injectable de pristinamycine constitue une solution intéressante pourremplacer la vancomycine. La pristinamycine est produite par Streptomyces pristi-naespiralis. C'est un mélange de deux composants, la pristinamycine I et la pristina-mycine II. Ces deux composants agissent de façon synergique pour bloquer la syn-thèse protéique et possèdent, de plus, un effet post-antibiotique puissant (le blocagese maintient même après disparition de l'antibiotique). Le composant PII est lui-même un mélange de deux molécules : la PIIA, produit final de la voie de biosyn-thèse, et la PIIB, le précurseur de la PIIA. La conversion de PIIB en PIIA est obtenuepar oxydation d'un acide aminé, la proline (Fig.). S. pristinaespiralis produit un mé-lange de ces deux formes dans les proportions de 80 % de PIIA et de 20 % de PIIB.L'un des composants de la forme soluble mise au point par Rhône-Poulenc-Rorerest obtenu par modification chimique de la PIIA. Cependant, les souches actuellesde S. pristinaespiralis sont incapables de réaliser la bioconversion totale de PIIB enPIIA et la modification par génie génétique de cette souche a permis de la réaliser.

Pristinamycine IIB Pristinamycine IIA

FMN reductase

NADH + H+ + FMN --------------------------à NAD+ + FMNH2

PIIA sybthase

PIIB + FMNH2 + O2 --------------------------à PIIA + FMN + 2H2O

Figure VI.4

La pristinamycine produite naturellement par S. pristinaespiralis est constituéed'un mélange de deux composants, la pristinamycine I et la pristinamycine II. Cettedernière est elle-même un mélange de deux molécules : la PIIA, produit final de lavoie de biosynthèse, et la PIIB, précurseur de la PIIA. L'un des composants de laforme soluble est obtenu par oxydation chimique de la PIIB. Les souches de S. pris-tinaespiralis sont incapables de réaliser naturellement la bioconversion totale de

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PIIB en PIIA. Industriellement parlant, il était souhaitable d'obtenir uniquement lecomposé PIIA.

Afin d’obtenir une composition totalement soluble, les chercheurs ont introduitdans une souche de S. pristinaespiralis, par génie génétique, les gènes snaA etsnaB de S. pristinaespiralis codant la PIIA synthétase (enzyme responsable de laconversion de PIIB en PIIA). La souche de S. pristinaespiralis, nouvellement cons-truite, est capable de réaliser complètement cette conversion et ne synthétise que ledérivé PIIA. L'idée de base était que la surexpression de gènes snaA et snaB de S.pristinaespiralis codant la PIIA synthétase (enzyme responsable de la conversion dePIIB en PIIA) permettrait une conversion totale. Cette surexpression pouvait êtreobtenue en réintroduisant ces gènes sous contrôle d'un promoteur fort dans unesouche de S. pristinaespiralis. L'équipe de Rhône-Poulenc-Rorer a isolé et caracté-risé les gènes en question.

Processus :

1 - Utilisation d’éléments intégratifs originaux de S. ambofaciens, pSAM2, généti-quement propres aux Actinomycètes. Ces éléments sont appelés intégratifs car ilsportent des gènes qui permettent une intégration très efficace à un site spécifiquedans le chromosome de la bactérie hôte. Dans le vecteur pSAM2, on intégra lestransgènes du S. pristinaespiralis dont on souhaite l’expression. Ce chimère est uneconstruction stable. L'ADN intégré dans le chromosome grâce à ce type de vecteursest très stable et est transmis à toutes les cellules filles.

2 – clonage de deux gènes snaA et snaB sous contrôle d'un promoteur de transcrip-tion fort (ermE promoter) dans des vecteurs intégratifs dérivés de pSAM2

3 – Introduction de la construction contenant les deux gènes snaA et snaB dans S.pristinaespiralis.

4 - La souche ainsi construite est stable dans les conditions industrielles et synthé-tise de la pristinamycine qu’on extrait et qu’on purifie en vue d’une utilisation théra-peutique.

5 - Ces résultats montrent que les vecteurs employés sont maintenus de façon sta-ble en l'absence de pression de sélection, et qu'ils permettent d'éviter les problèmesd'instabilité structurelle ou ségrégationnelle souvent rencontrés avec des vecteursréplicatifs chez Streptomyces. Ils montrent également que la quantité de PIIA syn-thétase était bien le seul facteur limitant la conversion totale de PIIA en PIIB et qu'ilest possible de réaliser cette conversion sans affecter le niveau total de production.

Référence :- Sezonov G., Blanc V., Bamas-Jacques N., Friedmann A., Pernodet J.-L. et Guérineau M., 1997.Complete conversion of antibiotic precursor to pristinamycin IIA by overexpression of Streptomycespristinaespiralis biosynthetic genes. Nature Biotechnology, 15, 349-353, 1997.

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VII – PRODUCTION DES ALIMENTS FERMENTÉS PAR DESMICRO-ORGANISMES TRANSGÉNIQUES

Depuis fort longtemps, l’homme consomme des aliments fermentés comme lepain, le fromage, le yoghourt et aussi des boissons fermentées comme la bière, levin, le cidre, le dolo. Ces fermentations sont le résultat du métabolisme des bactéries fermentairescomme, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus heveticus, Lactobacillus casei, Lacto-bacillus acidophilus, Lactobacillus lactis,Pediococcus acidilacticus et des levurescomme Saccharomyces cerevitiae.

1. La production de fromage

La présure est une enzyme produite par la caillette des veaux qui coupe lacaséine pour provoquer la coagulation du lait. La production du lait caillé constituela première étape dans la production du fromage. Il faut beaucoup de présure pourla fabrication du fromage alors que sa production par les veaux n’est pas suffisante. En appliquant la technique de l’ADN recombinant aux bactéries lactiques ouaux levures, on a pu améliorer la qualité des aliments fermentés. Pour cela, on acloné le gène de la présure de veau dans un vecteur d’expression qu’est Saccharo-myces cerevisiae qui produit alors de la présure de levure. On peut également utili-ser une bactérie lactique en fonction de son métabolisme et de la rentabilité.

2. La production de la bière

Le moût du malt (comme de mil rouge) est un mélange de mono, di, tri poly-saccharides et de dextrines qui proviennent de l’hydrolyse de l’amidon par les amy-lases. Saccharomyces cerevisiae peut faire fermenter tous les polysaccharides saufles dextrines qui constituent cependant 22% des hydrates de carbone des céréalesutilisées (orge, seigle, riz, maïs, mil…) pour la production de la bière. Pour améliorerle goût et la limpidité de la bière, on peut procéder comme suit :

Amélioration du goût de la bière : Saccharomyces diastaticus possède desenzymes qui dégradent les dextrines pour donner du glucose fermentescible. C’estle gène DEX qui code pour l’amidon- -1,4-glucosidase. Ce gène est cloné dansSaccharomyces cerevisiae pour augmenter la teneur en glucose et donc en éthanolpar fermentation. Le goût de la bière se trouve ainsi amélioré.

Amélioration du goût et de la limpidité de la bière : Aspergillus abwamoriest un champignon qui produit une enzyme : « la glucoamylase » qui dégradel’amidon brut en glucose. En clonant les deux gènes responsables de la formationde ces enzymes dans Saccharomyces cerevisiae on améliore et le goût parl’hydrolyse de l’amidon et la limpidité de la bière par l’hydrolyse des protéines.

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CHAPITRE VII: LE GENIE GENETIQUE APPLIQUE AUX VEGETAUX

Les plantes transgéniques

L’avènement de la technologie de l’ADN recombinant a introduit une dimen-sion nouvelle dans la recherche, parce qu’elle permet désormais de modifier le gé-nome presque à volonté. L’amélioration n’est plus limitée à la sélection de variantsau sein d’une espèce par la génétique classique. Il est alors possible d’introduiredans le génome d’une plante de l’ADN provenant d’autres espèces végétales,d’animaux ou même de bactéries. Le plasmide Ti constitue l’exemple classique pourles études des plantes transgéniques. Figure VII.1 : Plasmide Ti

I . LE PLASMIDE TI:

1- Définition et action du plasmide Ti dans la nature : Le plasmide Ti (Tumor Inducing) dérive d’une bactérie du sol appelée Agro-bacterium tumefaciens. Cette bactérie provoque chez les plantes qu’elle infecte unemaladie du nom de « gale » du collet.Figure VII.2: Infection par l’agrobacterium tumefaciens.

Les plantes infectées présentent des lésions constituées de cellules dont lacroissance est incontrôlée (des tumeurs ou gales), généralement localisées à labase (ou collet) de la plante. La production de la tumeur est déterminée par ungrand plasmide circulaire de 200 kb présent dans la bactérie, le plasmide Ti. Lors-que le plasmide Ti est inséré dans l’ADN chromosomique de la plante, une partie deson ADN appelé « ADN-T » inséré dirige alors la synthèse d’hormones végétalesqui perturbent la régulation de la croissance des cellules infectées de la plante (cequi donne lieu à la formation d’une tumeur) ainsi que la synthèse de nopaline quipeut être utilisée comme source de carbone et d’azote par la bactérie (symbiose).

Lors de l’infection, la partie du plasmide, appelée « ADN-T », est transféréedans la plante et insérée au hasard dans le génome cellulaire. La séquence ADN-Tcontient:

des gènes qui codent pour des hormones de croissance végétales et sontresponsables de la tumorisation des cellules de la plante,

des gènes qui codent pour des enzymes qui conduisent les cellules tumo-rales à synthétiser des substances appelées opines (nopaline et octopine).

Les gènes qui contrôlent la synthèse des hormones et des opines (nos, ocs)sont exprimés dans la plante à partir de séquences régulatrices eucaryotes. Parcontre, ceux qui contrôlent la synthèse des enzymes de dégradation des opines(noc, occ) se trouvent dans la bactérie sous le contrôle de séquences régulatricesprocaryotiques.

Figure VII.3: Processus d’Infection

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2. Utilisation du plasmide Ti comme vecteur en génie génétique.

En principe, tout fragment d’ADN cloné au sein de l’ADN-T peut comme luis’insérer de façon stable dans le génome de la plante qui le reçoit. Le plasmide Tiest très grand pour les manipulations. Il faut donc construire des dérivés plus petitsqui contiennent l’essentiel de l’ADN-T et l’ADN d’intérêt. On peut construire un plas-mide intermédiaire par le processus suivant :

Un vecteur intermédiaire qui contient:• deux segments d’ADN-T qui portent les fragments L et R de la nopaline,• un marqueur de sélection bactérien de résistance à la spectinomycine

(spcR)• un marqueur de sélection bactérien de résistance à la kanamycine (kanR).• ce vecteur intermédiaire doit posséder des sites de restriction pour l’étude

de l’ADN cloné. (CF Photocopies)

Construire un vecteur Ti désarmé:

• on retire toute la région droite de l’ADN-T, y compris les gènes inducteursde tumeurs qui constituent l’aspect gênant de l’ADN-T.

• Ti désarmé conserve l’extrémité gauche (L) de l’ADN-T qui servira de sitede recombinaison pour l’intégration du vecteur intermédiaire.

Les bactéries qui contiennent le plasmide co-intégrat (qui est le résultat dela fusion du plasmide désarmé et du vecteur intermédiaire), peuvent être utili-sées pour inoculer des fragments du tissu végétal comme par exemple de petits dis-ques de feuille.

Si l’infection par la bactérie réussit, son ADN-T sera transféré aux cellulesvégétales et tout l’ADN localisé entre les extrémités droite et gauche de l’ADN-Ts’intégrera dans un chromosome de la plante.

Si on place les disques de feuilles sur un milieu nutritif qui contient de la ka-namycine, seules les cellules qui contiennent l’ADN-T, pourront se multiplier. La croissance de ces cellules donne lieu à la formation d’un petit amas ou cal,qui constitue la preuve que les cellules de plantes ont été transformées. Ces calspeuvent donner des radicelles et fournir par la suite, des plantes transgéniques.Figure VII.4: Génération de disques de feuilles

3. Expression de l’ADN intégré.

Qu’en est-il de l’expression de l’ADN intégré en même temps que l’ADN-T? Ilpeut s’agir de n’importe quel ADN dont on veut tester l’expression dans la planteprise comme hôte. Dans tous les cas, il faut utiliser un gène d’expression « gèneindicateur » dans le vecteur pour suivre la manifestation de l’ADN intégré. Un cer-tain nombre de ces gènes indicateurs sont utilisés actuellement avec succès :

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L’enzyme luciférase catalyse la réaction d’une substance appelée lucifé-rine avec ATP. Cette réaction s’accompagne d’une émission de lumière et c’est cequi explique la luminescence de la luciole en vol.

Une plante de tabac transgénique par exemple qui exprime le gène de laluciférase s’illumine dans l’obscurité si on la badigeonne avec une solution de lucifé-rine.

Le gène de la luciférase peut donc être utilisé comme indicateur pour étu-dier, au cours du développement, la régulation de l’expression de l’un ou l’autregène de la plante ou de l’ADN intégré.

Le processus est le suivant:

• On fusionne les séquences régulatrices localisées en amont de n’importequel gène intéressant au gène de structure de la luciférase,

• La construction est introduite dans une plante en utilisant l’ADN-T.• L’expression de la luciférase suivra le schéma d’expression du gène dont on

a utilisé la séquence régulatrice.• L’expression de la luciférase est alors observable en badigeonnant la plante

avec de la luciférine et en observant la luminescence.

Autres indicateurs utilisés dans les plantes:

• Le gène bactérien « gus » qui code pour la β-glucuronidase. Cette enzyme produit une coloration bleue par hydrolyse du substrat X-gluc.

• Le gène bactérien « lacZ » qui code pour la β-galactosidase. Cette enzyme produit une coloration bleue par hydrolyse du composé X-gal.

II – LE TERMINATOR CHEZ LES SEMENCES

Le concept Terminator, auquel correspond un brevet détenu par la compagnieMonsanto, désigne une technique consistant à introduire un transgène, un gèneexogène tueur qui empêche le développement du germe du grain récolté: la plantese développe dans les conditions habituelles, donne une récolte normale, mais elleproduit un grain biologiquement stérile.La technologie fonctionne avec trois gènes et un inducteur chimique:

- Le gène I est un répresseur qui code pour une protéine régulatrice qui se fixesur un site opérateur en amont des gènes de structure et inhibe leur trans-cription. La protéine régulatrice du gène I se fixe sur le « binding site » dugène II

Gène répresseurGENE I :

Protéine régulatrice Répresseur

- Le gène II de l’enzyme recombinase est placé sous le contrôle d’un promo-teur. Entre le Promoteur et le gène de la recombinase se trouve le « bindingsite ». Le gène II produit une enzyme de restriction qui coupe et excise l’ADN« blocker » du gène III.

Promoteur Binding site gène codant l’enzyme

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GENE II :

- Le gène III produit une toxine qui est létale pour l’embryon. Ce gène est sousle contrôle d’un promoteur tardif qui est activé seulement durant le dévelop-pement de la graine, lors de la croissance de l’embryon. Entre le promoteurtardif et le gène III se trouve l’ADN « blocker » qui favorise, s’il est excisé, latranscription et l’expression du gène toxine, produisant la toxine qui tuel’embryon rendant ainsi stérile les nouvelles semences pour la reproduction.

GENE III :

Promoteur tardif blocker gène de la toxine

- L’inducteur chimique est répandu sur les semis par les compagnies de se-mences comme Monsanto et Syngeta afin d’activer le gènes II et le gène III.Une fois ces gènes activés dans ces semences, nous pouvons avoir la pro-duction mais pas le reproduction.

Processus d’activation du gène terminator dans les semences de vente aux agri-culteurs :

1 – Introduction de l’inducteur (par exemple du tétracycline) dans les semences,

2 – L’inducteur bloque le « binding site » au niveau du gène II et empêche le répresseur de se lier,

3 – L’ARN polymérase se lie au promoteur et entame la transcription du gène dela recombinase(isomérase) en ARNà synthèse de l’enzyme recombinase.

4 – La recombinase taille et excise la séquence « blocker »,

5 – L’ARN polymérase se lie au « late promoteur » et transcrit le gène de la toxine,à synthèse de la toxine qui tue les embryons des graines avant les récoltes.(Schéma) :

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Inducteur

Graine

Gène répresseurGENE I :

Protéine régulatrice

Le répresseur se délie

Promoteur gène codant l’enzyme recombinase

GENE II :

Binding site

Synthèse de l’enzyme recombinase

gène de la toxineGENE III :

Promoteur tardif blocker

Synthèse de la toxine qui tue l’embryon

Figure VII.5 : Processus d’activation du Terminator

NB. En absence de l’inducteur, le répresseur se lie au « binding site » et empeche latranscription du gène de la recombinase. Dans ce cas tout est bloqué car il n’y a pasde recombinase pour exciser la séquence « blocker » et par conséquent, il n’y a pasde toxine qui puisse tuer les embryons des semences.

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GENE I :

Protéine régulatrice Répresseur

Promoteur gène codant l’enzyme recombinase

GENE II :

Binding site

Pas de synthèse de l’enzyme recombinase

gène de la toxineGENE III :

Promoteur tardif blocker Pas de production de la toxine

Figure VII.6 : En absence de l’inducteur, le gène codant pour la recombinase ne transcrit pas.

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III . L’APPLICATION DU GÉNIE GÉNÉTIQUE À L’AGRICULTURE:

Les applications sont et deviendront de plus en plus nombreuses en fonctionde l’évolution des connaissances des caractéristiques génétiques des plantes et desréserves humaines contre les OGM. La problématique des OGM est que le gèneTERMINATOR inséré, à travers les techniques du génie génétique, dans le génomede ces végétaux fait que leurs graines ont seulement une capacité de production etnon de reproduction. L’agriculteur doit toujours dépendre de ces maisons de fabrica-tion des semences qui ont le brevet. Nous en donnons quelques exemples qui fonc-tionnent déjà dans ce siècle.

1: L’enzyme luciférase :

L’enzyme luciférase catalyse la réaction de la luciférine avec l’ATP. La réac-tion s’accompagne d’une émission de lumière et c’est ce qui explique la lumines-cence de la luciole en vol (la luciole produit cette enzyme d’où son nom). Cette en-zyme est actuellement utilisée pour suivre la régulation et le génotype du tabac. Une plante de tabac transgénique qui exprime donc le gène de la luciférases’illumine dans l’obscurité si on la badigeonne avec une solution de luciférine. Le gène de la luciférase peut donc être utilisé comme indicateur pour étudier,au cours du développement, la régulation de l’expression de l’un ou l’autre gène dela plante ou de l’ADN intégré.

2. Le maïs transgénique

Chaque année les agriculteurs du monde entier perdent 1/10 de leurs récol-tes de maïs à cause des insectes nuisibles. Le maïs transgénique contient dans songénome un gène qui code pour une protéine que détestent les insectes et qui enprincipe ne doit pas causer de nuisances à l’homme. Cette variété augmente donc lerendement en éliminant le facteur insecte.

3. Les tomates « flavrsavr »

Ces tomates transgéniques contiennent un gène freinant le mûrissement dufruit, ce qui leur confère une meilleure résistance au transport et une longue conser-vation.

Désormais avec l’avènement du génie génétique, non seulement la qualitédes espèces animales et végétales peut être améliorée, mais ces organismes trans-géniques sont utilisés comme des usines pour produire des protéines « utiles » co-dées par des gènes d’organismes étrangers.

4. La protection des plantes contre l’infection virale

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Les virus des plantes représentent un sérieux problème pour l’agriculture carleurs infections entraînent une diminution de la croissance des plants, du rendementdes récoltes et de leur qualité. Le virus de la mosaïque du tabac (TMV) infecte lesplants de tabac. Une plante transgénique qui exprime la protéine du manteau (coatProtein : CP) du TMV résiste aux infections par ce virus. La plante transgénique estdéjà produite aux Etats-Unis.Figure VII.7: production de la protéine CP

5. Lutte contre les insectes ravageurs

Chaque année des milliards de dollars de récoltes sont perdues à cause desinsectes. Les armes les plus utilisées pour lutter contre les insectes sont « les in-secticides et les pesticides » qui posent actuellement de graves problèmes depollution à l’environnement.

_ Le Baccilus thuringensis (Bt), lors de sa sporulation, produit une protéinecristallisée toxique contre les larves d’un certain nombre d’insectes ravageurs descultures et qui ne semble pas être nocive pour les vertébrés. Les plants transgéni-ques de tabac, de tomates et de coton qui expriment le gène de cette toxine résis-tent aux larves des insectes.

_ L’utilisation de l’expression transgénique d’inhibiteurs de sérines protéasesdes systèmes digestifs des insectes dans les tomates, la pomme de terre, le petitpois et autres céréales protègent aussi les plantes contre les insectes nuisibles.Figure VII.8: production de la protéine Bt

6. Eradication des mauvaises herbes et plantes transgéniques tolérantes auxherbicides

Le glyphosate est la substance active de l’herbicide commercial « Roundup »beaucoup utilisé à l’heure actuelle. Ce produit tue les plantes en inhibant la 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthétase (EPSPS), une enzyme du chloro-plaste qui intervient dans la biosynthèse des acides aminés essentiels. Une plantetransgénique qui porte un gène de résistance au glyphosate pousse quatre (4) foisplus vite en présence de cet herbicide. L’Insertion réussie du gène bactérien de larésistance au glyphosate a conféré à la plante transgénique une résistance àl’herbicide et lui permet de survivre à des épandages normaux de glyphosate.Figure VII.9: résistance aux herbicides

7. Production d’ammoniac (NH4) et de nitrate (HNO3) par les plantes

Les plantes courantes ne sont pas capables d’assimiler directement l’azotemoléculaire (N2). Les paysans américains et européens dépensent chaque année unpeu plus de huit cents milliards des francs CFA pour la fertilisation de leurs champspar un épandage d’engrais composé essentiellement de sel d’ammonium (NPK). Onpeut donc fabriquer des plantes transgéniques capables d’utiliser directementl’azote moléculaire par le processus théorique suivant :

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Le gène nif (nitrogen-fixation apparatus) permet à la bactérie Rhizobium deslégumineuse de fixer directement l’azote moléculaire pour donner des selsd’ammonium (Nitrate, Nitrite, Ammonium). Ce sera le gène d’intérêt. Le gène nif est inséré dans le plasmide Ti de la bactérie Agrobacterium tume-faciens La plante d’intérêt est alors transformée par ce plasmide Les cellules tumorales de la plante transformée sont prélevées et cultivées invitro puis transférées sur différents terrains sous serre. Les plants capables de pousser rapidement sans un apport d’engrais sontceux capables de fixer l’azote moléculaire Un gène marqueur permet de sélectionner les plants ayant intégré le plas-mide avec le gène nif.

8. Production d’anticorps monoclonaux par les plantes

Les plantes peuvent aussi servir de bio-réacteurs pour la productiond’anticorps. Cet aspect représente un intérêt commercial pour la production de pro-téines parmi lesquelles les anticorps monoclonaux. L’expérience réussie a utiliséune chaîne lourde (H) et une chaîne légère (L) dans deux expériences séparéespour transférer les gènes des anticorps par l’intermédiaire de l’ADN-T dans deuxplants de tabac. Les plantes transgéniques contenant les gènes des chaînes lourdeet légère ont été croisées afin de produire une descendance contenant les deux gè-nes. Les feuilles de ces plantes produisent l’anticorps monoclonal inséré (environ1,5% des protéines traduites).Figure VII.10: Production d’anticorps monoclonaux

9. La production de la taumatine

La taumatine est un aliment très sucré et même plus doux que le saccharose.elle est produite par une plante : « Thaumatococcus danielli » qui pousse en Afriqueoccidentale. Ce peptide, composé de 207 acides aminés constitue une source im-portante pour l’apport en acides aminés dans l’alimentation en plus de sa saveur.Elle est actuellement produite par des bactéries suivant le protocole ci-après :

Il a été construit une molécule chimère ayant des séquences des plasmidespCI62-8, pBS42, pCI72 et qui porte le gène « tau ». Cette construction chimère est utilisée pour transformer Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis transformé synthétise la taumatine. Une extraction, suivie d’une purification donne de la taumatine pure

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CHAPITRE VIII: LE GENIE GENETIQUE APPLIQUE AUX ANIMAUX

I - LES INSECTES TRANSGÉNIQUES

1. Les drosophiles transgéniques.

Dans la drosophile, on a trouvé trois catégories de séquences d’ADN qui ontla faculté de se transposer, c’est à dire de se déplacer dans le génome d’un chro-mosome à l’autre. Ce sont des transposons. Les mieux étudiés sont :

• les éléments du type copia : Il existe au moins sept (7) familles d’élémentsde type copia dont la longueur varie de 5 à 8,5 kb. Les membres de ces différentesfamilles sont au nombre de 10 à 100 exemplaires par génome. Les éléments de typecopia contiennent deux longues séquences terminales en répétition directe et decourtes séquences répétées de manière inverse et imparfaite.

• les éléments à rabat ou type FB (pour fold-back) : Ces éléments sontlongs de quelque centaines à quelques milliers de paires de bases. Ils contiennenttous de longues extrémités en répétition inverse. L’élément peut se rabattre sur lui-même lors des expériences de renaturation thermique d’ou son nom de rabat. Cetype d’élément provoque des réarrangements chromosomiques lors de son insertionet de son excision.

• les éléments P : D’une longueur égale à environ 2,90 kb, Ils portent à leursextrémités une séquence répétée inversée de 31 paires de bases. La partie centralepossède trois cadres ouverts de lecture et peut coder pour au moins trois protéinesdont la transposase et le répresseur de la transposase.

â Les éléments P permettent d’avoir des drosophiles transgéniques

Les éléments P sont des transposons qui sont capables de changer de locali-sation dans le génome. L’élément P peut donc être facilement utilisé en génie géné-tique. Ils codent pour une enzyme nommé « transposase », responsable des dépla-cements de cet ADN dans tout le génome. Ils peuvent donc être utilisés pour :

• effectuer des mutagenèses,• transférer des gènes spécifiques dans des mouches d’un génotype donné.

Le processus suivant permet d’étudier la génétique moléculaire des mouches

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a - On injecte dans un embryon de drosophile l’ADN d’un plasmide bactérienqui contient un élément P dans lequel on a cloné un gène ry+ de la drosophile (cegène donne la coloration rose de l’ il) mais ayant subi une délétion partielle. Cetélément P modifié ne peut plus se transposer à cause de la délétion.

b - On injecte dans le même embryon (co-injection) de l’ADN qui contientl’élément P normal qui pourra fournir la « transposase » à la copie du transposon Pcontenant la délétion.

Les mouches issues de cet embryon ont toujours le phénotype ry-, mais dansleur descendance, on retrouve une grande proportion d’individu ry+. Le gène ry+

nouvellement acquis montre une hérédité mendélienne et stable, ce qui suggèrequ’il est bien localisé sur un chromosome. L’hybridation in situ montre que le gènery+ (P modifié) et l’élément P normal se retrouvent en différentes positions sur diffé-rents chromosomes et non à la position normale du locus rosy. Le transposon nor-mal P a donc fourni la transposase pour permettre l’insertion du transposon anormalcontenant le gène ry+.

2. Bio-insecticide et lutte contre le paludisme

En 1976, un entomologiste israélien remarqua une grande quantité de larvesd’insectes mortes dans le désert de Negev au demeurant très infesté par les mousti-ques et les mouches responsables de deux grands fléaux. Après une étude appro-fondie au laboratoire, il s’aperçut que les bactéries du genre Bacillus thuringiensissubsp. israelensis présentes dans les lacs de ce désert tuaient systématiquementles larves des moustiques et des mouches. A partir de cette découverte, une nou-velle stratégie de lutte contre l’anophèle et la glossine vecteurs du plasmodium et dutrypanosome a débuté en utilisant la stratégie suivante :

Une production de bio-insecticides par Bacillus thuringiensis capables de tuerles larves des mouches et des moustiques Une utilisation des moyens de transport aérien (hélicoptères) pour la pulvéri-sation de ces bio-insecticides au niveau des fleuves et des plans d’eau infestés parces insectes vecteurs.

II - LES ANIMAUX TRANSGÉNIQUES :

1. Les souris transgéniques

Figure. VIII.1

On peut actuellement insérer n’importe quel gène dans la souris afin d’obtenirl’expression génique de ce transgène. Dans cette transgenèse, la souris qui intègrepar exemple le gène de l’hormone de croissance humaine (GH) acquiert une masseénorme double ou triple par rapport à ses s urs jumelles. Ce type de démarchepeut être appliqué à tous les mammifères pour accroître leur rendement en poids etdonc en intérêt économique.

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Les organismes transgéniques peuvent être produits par l’injection de vec-teurs dans des ufs fécondés et réimplantés dans les femelles. Au cours del’embryogenèse l’ADN exogène se fraie son chemin jusqu’aux cellules germinales etse comporte désormais comme un gène endogène. Il passe donc à la descendancecomme un gène nucléaire normal.

On peut aussi transférer l’embryon possédant le transgène dans l’utérusd’une souris saine pseudo-gestante. La souris qui sera mise bas portera les caractè-res du transgène mais pas les autres s urs.

2. Les bovins transgéniques

La trypanosomiase est causée par un protozoaire parasite qui est transmispar un insecte vecteur « la glossine hématophage » ou encore « mouche tsé-tsé ».Le trypanosome empêche la majeure partie des races bovines d’habiter une superfi-cie de près de dix millions de Km2 en Afrique. Cette zone qui est la plus fertile ducontinent est plus vaste que les Etats-Unis d’Amérique. Le trypanosome possèdedes antigènes de surfaces VSGs (glycoprotéines superficielles variables) dont lesgènes mutent à chaque phase de son développement. C’est pour cette raison queles bovins n’arrivent pas à élaborer des anticorps contre ces types d’antigènes quichangent constamment de conformation tridimensionnelle par mutation génétique duprotozoaire. (Colonisation du milieu ou Evolution ?).

Lorsque la mouche tsé-tsé inocule le trypanosome dans un bovin,l’organisme de ce dernier réagit et synthétise les premiers anticorps pouvant réagiravec les antigènes présents sur la membrane du trypanosome (VSGs).

Lorsque le système immunitaire du bovin est en mesure d’éliminer totale-ment les trypanosomes, les dernières cellules qui survivent changent leurs man-teaux protéiques antigéniques et se transforment en un second type de parasite.

L’organisme du bovin se prépare alors de nouveau pour combattre le nou-veau parasite en secrétant de nouveaux anticorps. Mais dès que le parasites’aperçoit qu’il est en train d’être totalement exterminé, il se transforme de nouveauen un second parasite.

De cette manière, le trypanosome échappe à la défense immunitaire deson hôte par des mutations et recombinaisons successives.

Beaucoup d’études récentes ont montré que certaines races bovines résistentbien à l’infection par le trypanosome. Ce type de résistance, appelée « trypano-tolérance », se rencontre dans les populations bovines d’espèce Bos taurus, locali-sée en Afrique occidentale. La race N’Dama, caractérisée par de longues cornes etune absence de bosse en est un exemple. Ce type de bovin domestique et d’autres animaux sauvages comme le « buf-fle » qui ont vécu en Afrique depuis plus de 5 000 ans a.C. ont développé des résis-tances contre les attaques du trypanosome et sont par conséquent adaptés au mi-lieu infesté par le parasite.

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L’espèce bovine comme Bos indicus qui est actuellement très répandue enAfrique, est arrivée dans ce continent avec l’invasion arabe vers les années 660 p.C.Elle n’est pas « trypano-résistante »

Cependant, l’économie de plusieurs pays africains est actuellement fondéesur l’élevage de ces bovins qui ne sont plus trypano-tolérants. Pour leur conférercette résistance, on peut employer deux stratégies :

Stratégie I. :

Identifier le gène qui confère la résistance aux trypanosomes chez les bo-vins de la race D’Dama

Cloner ce gène dans un vecteur Transférer le vecteur dans des cellules bovines de l’espèce Bos indicus

pour leur conférer la trypano-tolérance.Stratégie II :

Importer des embryons de la race N’Dama trypano-tolérante Les implanter dans les utérus de femelles de la race Bos indicus sensible à

l’infection Réaliser ensuite des croisements des descendances pour disséminer les

gènes de tolérance.

3. Les moutons transgéniques.

On peut manipuler les animaux domestiques non seulement pour améliorerleurs qualités intrinsèques mais aussi pour produire des protéines étrangères. Une protéine dont les propriétés thérapeutiques intéressent l’industrie phar-maceutique est produite dans le lait de moutons transgéniques. Le gène en questioncode pour l’activateur tissulaire du plasminogène qui sert à dissoudre les caillotssanguins chez l’être humain.Figure VIII.2: Production du plasminogèneLa démarche technologique utilisée et réussie est la suivante :

1 - On a placé le gène dans un plasmide, sous le contrôle du promoteur de laβ-lactoglobuline, qui n’est exprimée que dans les tissus mammaires. 2 - Le vecteur d’expression est micro-injecté dans le pronoyau des ovules demouton. 3 - Les ovules injectés sont implantées dans des mères porteuses. 4 - Les descendances qui expriment le transgène sont identifiés par amplifica-tion PCR d’un segment d’ADN chromosomique en utilisant des amorces correspon-dants à des séquence interne du gène d’intérêt. 5 - Les moutons transgéniques n’expriment ce gène que dans leurs tissusmammaires et sécrètent alors des quantités importantes de la protéine correspon-dante dans leur lait à partir duquel la protéine d’intérêt est purifiée.

4 – Le porc transgénique

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Pour pallier le manque d'organes: xénotransplantation avec le porc.Le problème majeur qui empêche la réalisation des xénogreffes d'organes aujour-d'hui est l'existence du rejet hyper aigu qui survient entre les espèces animales phy-logéniquement distantes. En effet, il serait tout à fait possible de réaliser des xéno-greffes d'organes à partir de primates supérieurs (chimpanzés) mais cette possibilitésemble peu réalisable car ces espèces animales sont protégées et représentent unesource incontrôlable de transmission de virus à l'homme (Ebola, SIV…) La protéineDAF (Decay Accelerating Factor) neutralise le complément des primates et favoriseles greffes d’organes.Tandis que dans les greffes allogéniques on utilise surtoutles médicaments immunosuppresseurs comme la cyclosporine pour lutter contre lephénomène de rejet.Figure VIII.3 : LE PORC TRANSGéNIQUE.

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CHAPITRE IX:CLONAGE DES MAMMIFÈRES, PARTHÉNOGENÈSE, CELLULES SOUCHESEMBRYONNAIRES (EMBRYONIC STEM CELLS) ET THÉRAPIE GÉNIQUE.

I. - LE CLONAGE DES ORGANISMES ENTIERS:

Un clone de mammifère est une copie génétique d'un organisme entier. Dolly(première brebis clonée en Angleterre), est un clone de sa mère, ou de ses gènes.Comme les brebis, les hommes vont-ils eux aussi passer à la "photocopieuse La technique du clonage est relativement simple dans son principe. Dans lecas de la brebis Dolly, on a prélevé une cellule dans le pis d'une brebis de race FinnSet à face blanche. On a prélevé également un ovule sur une autre brebis et on lui aenlevé le noyau qui contient le bagage génétique. Pourquoi un ovule? Pour qu'il de-vienne éventuellement un embryon. À l'aide d'un choc électrique, on a fusionné invitro la cellule du pis qui contient tous ses gènes et l'ovule vidée de tout matérielhéréditaire.

C'est la raison pour laquelle Dolly n'aura pour tout bagage génétique que ce-lui que contenait la cellule du pis. L'ovule ainsi " électrisé " se divise et le processusde vie s'enclenche. Après s'être divisée un nombre suffisant de fois, l'embryon(stade blastula) est placée dans l'utérus d'une brebis porteuse. Dolly est née decette technique, identique en tous points à la brebis qui a fourni la cellule du pis.

Le processus du clonage d'un organisme entier est simple:

a - On prend une cellule uf et on la vide de son noyau. b - On prélève le noyau d'une cellule que l’on veut cloner et on le met dansl' uf privé du noyau c - implantation dans l’utérus d’une porteuse

d - L’organisme qui naît porte les caractères du noyau transféré donc del’organisme cloné. Cependant certains caractères de l’ uf restent présents à causedu matériel génétique contenu dans les mitochondries.

Figure IX. 1 : Clonage de Dolly

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II. LES CELLULES ES (EMBRIONIC STEM CELLS)OU CELLULES EMBRYONNAIRES PLURIPOTENTES).

Le 6 novembre 1998, le New York Times titrait : « Des scientifiques isolent les cellu-les à l origine de la vie ». En effet, en fin 1998, deux équipes de recherches différentesdécouvraient presque simultanément avec des méthodes distinctes les cellules souchesembryonnaires, « Embryonic Stem » (ES). L’une travaillait sur des blastocystes desembryons précoces de moins de sept jours () et l’autre équipe sur des cellules germina-les primitives ovogonies et spermatogonies (). Chacune de ces cellules ES a la potentiali-té de devenir n'importe quel tissu du corps humain: c ur, muscles, sang, os, cheveux,nerfs (). D'où leur mystère, leur importance biomédicale et la fascination des biologistes.Ce sera une technique de photocopie magique pour reproduire un individu à volonté eten plus, ce système offrira un fond inestimable de pièces de rechange d’organeshumains !

A – Qu’est-ce qu’une cellule souche ?

Une cellule souche est une cellule indifférenciée qui reste capable de se divi-ser de façon autonome tout au long de la vie, assurant le renouvellement des cellu-les d’un individu. La division d’une cellule souche produit deux nouvelles cellules :une cellule souche de « réserve » et une cellule s’engageant dans un processus dedifférenciation qui la conduira à remplir une fonction précise. Tous les êtres vivants pluricellulaires possèdent des cellules souches. Ellessont à l’origine de tous les tissus et en assurent le renouvellement (remplacementdes cellules disparaissant par vieillissement ou par lésion). Les cellules souchessont à l’origine de la régénération des membres chez certains animaux (lézards, tri-tons, etc.). Chez les plantes, elles favorisent le processus du bouturage. Ainsi àpartir d’une seule cellule peut être créée une plante entière.

Nous distinguons quatre catégories de cellules souches en fonction de la diversitédes types cellulaires auxquels elles peuvent donner naissance :

1 - Les cellules souches totipotentes : A elles seules, elles peuvent conduire audéveloppement d’un être humain. Il s’agit de l’ uf fécondé et des cellules del’embryon des premiers jours de sa croissance (morula de 2 à 8 cellules). Avant leseptième jour, cet embryon qui est un blastocyste a au plus 8 blastomères. Il est dé-jà composé de trois parties : le trophoblaste constitué de blastomères périphériques(grosses cellules résultant des premières divisions de l’ uf fécondé), la masse cel-lulaire interne (MCI) constituée d’autres blastomères plus centraux, et le blastocèlequi est une grande cavité remplie de liquide à l’intérieur de l’embryon. Le tropho-blaste et la masse cellulaire interne donneront respectivement : le placenta etl’ensemble de l’embryon. Quant au blastocèle, il est appelé à régresser lors del’embryogenèse par l’agrandissement de la cavité amniotique de l’embryon. Spéci-fions que c’est au stade de cellules souches totipotentes que l’on peut pratiquer leclonage reproductif par scission embryonnaire.

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2 - Les cellules souches pluripotentes : Précisons tout de suite quelque chosed’absolument essentiel qui doit être en permanence dans l’esprit : les cellules sou-ches pluripotentes qui constituent la masse interne sont destinées à former tous lestissus de l’organisme mais ne peuvent à elles seules aboutir à la formation d’un indi-vidu complet car elles ont perdu, à ce stade, la faculté de produire le trophoblaste,précurseur du placenta. Le placenta a pour fonction de nourrir l’embryon et de leprotéger de tout rejet par le système immunitaire. Les cellules de la masse cellulaireinterne, bien que pouvant donner toutes les cellules de l’organisme, sont incapa-bles, si on les réimplante dans un utérus, de donner un embryon puis un f tus. Cer-tes, ces cellules pluripotentes ne peuvent pas évoluer pour former une person-nes mais de multiples questions se posent : comment peut-on les obtenir tout enrespectant les règles d’éthique ? Peut-on les utiliser dans les recherches du clonagethérapeutique ?

3 - Les cellules souches multipotentes : Elles sont des cellules souches capablesde donner naissance à un ou plusieurs groupes de cellules ayant une fonction par-ticulière. Par exemple, les cellules souches présentes dans la moelle osseuse pro-duisent les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. Elles jouent unrôle essentiel en assurant le renouvellement des cellules. Elles sont appelées aussicellules souches adultes ou cellules souches somatiques. Les cellules souchesadultes peuvent être extraites de la plupart des tissus, y compris du cerveau et de lamoelle épinière. Cependant, elles sont rares et par conséquent très difficiles àidentifier (une cellule souche pour dix ou quinze mille autres cellules dans la moelleosseuse. La moelle osseuse et le sang du cordon ombilical sont particulièrementriches en cellules souches adultes. Les cellules souches du sang de cordonombilical peuvent être prélevées à la naissance et conservées pour un usageultérieur (un tel service est proposé par certaines fondations aux Etats-Unis). Lescellules souches issues de la moelle ou du cordon peuvent être utilisées pour unethérapie cellulaire bénéficiant à l’individu ou à ses frères et s urs.4 - Les cellules souches unipotentes : elles ne donnent qu’un seul type de cellu-les différenciées (peau, foie, muqueuse intestinale, testicule…). Dans certains orga-nes, tels que le c ur et le pancréas, les chercheurs n’ont pas encore découvert decellules souches ; par conséquent ils pensent que ces organes n’ont aucune possi-bilité de régénération en cas de lésion.

B – Recherche sur les cellules souches et l’embryon ?

1 – Les processus génétiques de l’embryogenèse de la fécondation au clivage.Nous avons choisi délibérément la section fécondation-clivage pour étudier

sommairement les régulations génétiques car c’est à ce stade que nous avons lesdifférentes manipulations des cellules souches embryonnaires. Le développement embryonnaire des métazoaires est classiquement subdivi-sé en quatre phases, essentiellement définies suivant des critères morphologiques :la fécondation, la segmentation (clivage), la gastrulation et l’organogenèse. On en-tend par gène de développement ceux qui interviennent précocement au cours dudéveloppement embryonnaire et sont responsables de l’établissement des polarités(antéro-postérieure, dorso-ventrale) de l’embryon, de la mise en place du plan de

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base du corps et de la spécification des cellules et des territoires devant donner lesdifférents organes. A l’échelle de la cellule, il existe différents niveaux de contrôle du développe-ment : prolifération cellulaire, migrations, engagement dans une voie de différencia-tion. Le développement embryonnaire étant un processus continu et progressif, lesdifférents gènes impliqués ne peuvent être considérés isolément ; au contraire, leurséquence spatio-temporelle d’expression est largement hiérarchisée et interdépen-dante. La multiplication cellulaire, régulée par les oncogènes et les facteurs decroissance, les migrations cellulaires et l’engagement d’une cellule dans une voie dedifférentiation constituent en effet des choix de développement non indépendants.Ils peuvent par ailleurs être autonomes-cellulaires, c’est-à-dire ne dépendre que del’information contenue dans la cellule considérée ou être non autonomes, c’est-à-dire permis par des interactions avec les cellules voisines.

- Des gènes maternels contrôlent les premières divisions de l' ufLes premières divisions de l’ uf fécondé s'effectuent sans que les premiers gèneszygotiques ne soient exprimés. Cela est parfaitement vérifié chez des espèces infé-rieures (batraciens). La mise en route du génome embryonnaire s'effectue cepen-dant à un stade précoce, mais très probablement seulement au stade 8 cellules chezl'homme. En effet, notons qu'il n'y a pas de régionalisation de l'information dans lecytoplasme du zygote des mammifères jusqu'au stade 8 cellules, contrairement àd'autres classes de vertébrés : chaque blastomère peut donc être considéré commeéquivalent aux autres.

L'étude des gènes maternels dans le développement embryonnaire pré-coce est cependant rendue difficile par la très faible quantité de matériel génétiquedisponible. Nos connaissances sont donc encore rudimentaires chez les mammifè-res, encore plus chez l'homme. La distinction entre une information seulement ap-portée par des ARNm provenant de l'ovule, et celle qui serait apportée par unetranscription persistant selon un patron transcriptionnel conservant le profil d'ex-pression maternel, est loin d'être résolu (eu égard à la durée de vie des messagersde la première hypothèse n'est plausible que chez des espèces où les premiers cli-vages se font dans un espace de temps excessivement court ; c'est le cas des oeufsde batraciens. Néanmoins, on sait que la durée de vie des ARNm est beaucoup pluslongue dans l’ uf fécondé).

Chez les mammifères il existe le phénomène de imprinting : les génomes pa-ternel et maternel apportés par les gamètes ne sont pas transcrits de façon équiva-lente par le zygote, l’origine paternelle ou maternelle de certains gènes entraîne leurinactivation. L’analyse d’anomalies de ségrégation chromosomique ou d’expériencesde transplantation de pronucléus montre que cette inactivation est nécessaire à undéveloppement embryonnaire normal. Elle concerne un nombre relativement res-treint de gènes, impliqués généralement très précocement au cours du développe-ment, et pourrait être due à une méthylation différentielle des copies paternelle etmaternelle de ces gènes. La méthylation différentielle semble être le processus per-mettant l’inactivation transcriptionnelle d’un des chromosomes X chez le mammifèrefemelle et rétablissant une dose identique à celle du mâle, des facteurs issus de latranscription de ce chromosome. Le contrôle de l’initiation et du taux de traductiondes ARNm maternels « dormants » dans l’ovocyte est le principal niveau de régula-tion d’expression génique aux stades de développement précédant la transcriptionzygotique. Ce mécanisme permet de contrôler la production de facteurs impliqués

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dans l’établissement des polarités et dans la régulation du cycle cellulaire.

Des données récentes attribuent à l'ARN maternel oct-3 un rôle dans la premièredivision de l’ uf et au PDGF-alpha (platelet-derived growth factor) codé par un ARNmaternel un effet autocrine activateur de la division cellulaire.

Le début de l'expression génique embryonnaire n'est donc effective qu'après lestade 8 blastomères. Elle est concomitante de l'expression sur la membrane plasmi-que de Cadhérines E, aboutissant à la mise en place de jonctions inter-cellulaires :c'est l'initiation de la compaction et des phénomènes de polarisation. Ultérieurements'exprimeront dans la morula des cadhérines E (épithéliales) et P (dans le tropho-blaste, futur Placenta), ce qui contribuera largement à la ségrégation cellulaire entreembryoblaste et trophoblaste.

De la gastrulation à l’organogenèse, d’autres gènes s’activeront et par consé-quent de nouvelles protéines seront synthétisées afin d’assurer différents contrôlesgénétiques. Ainsi aurons-nous un contrôle génétique de la mise en place des polari-tés embryonnaires, un contrôle génétique de l’établissement du plan de base del’organisme et une acquisition d’une identité positionnelle au sein des différents tis-sus ou champs d’organisation.

2 – Recherche sur l’embryon et manipulation des cellules souches : La possibilité de cultiver et de manipuler l'embryon préimplantatoire de mam-mifère requiert une haute technologie et par conséquent un laboratoire de recherchebien spécialisé. De nombreuses méthodes sont utilisées en recherche fondamentalepour étudier l’embryogenèse :

a – le clonage- Le clonage par transfert de noyau

Transfert du noyau d une cellule d un sujet donné dans un oocyte humain énu-cléé, suivi d’un développement embryonnaire jusqu’au stade de blastocyste et del’utilisation des cellules de la masse cellulaire interne (ICM), en vue d’obtenir les ESet, à partir d’elles, les cellules différenciées souhaitées. La technique de transfertnucléaire, dérivée d'expériences menées chez les batraciens dans les années 60consiste d'abord à retirer la métaphase II et le premier globule polaire d'un ovocyte IImaturé. Ensuite, une cellule diploïde est insérée dans la zone pellucide, à côté del'ovocyte énucléé. Un choc électrique est appliqué. Il engendre à la fois la fusiondes deux membranes plasmiques et l'activation de l'ovocyte. Le noyau de la cellulediploïde se retrouve ainsi au sein du cytoplasme ovocytaire. A ce stade, on parle dezygote ou d'embryon reconstitué, ou encore d'équivalent d’une cellule. L'embryonreconstitué entame son clivage et, au stade 8-16 cellules chez le bovin, le noyautransféré prend le contrôle du développement. Au stade blastocyste, l'embryon esttransféré en mère porteuse. L'affinement de la technique a permis à une équipeécossaise de produire des agneaux en utilisant le noyau de cellules f tales (fibro-blastes) et même de cellules mammaires d'une brebis adulte. Ces résultats mon-trent qu'au moins certains types de cellules conservent intact leur potentiel nucléairede différenciation malgré leur état de cellule différenciée. Notons cependant que letaux de succès est, à l'heure actuelle, inversement proportionnel à l'état de différen-ciation de la cellule diploïde donneuse de noyau. De plus, l’analyse des télomèresdes clones obtenus semble montrer que l’ADN des cellules diploïdes donneuses de

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noyau n’est pas “ rajeuni ” par le transfert nucléaire. Ceci signifie qu‘un clone seraitconstitué de cellules dont l’âge correspond à celui de l’organisme d’origine. Laconséquence serait un vieillissement prématuré de ces clones.

Transfert du noyau d une cellule d un sujet donné vers un oocyte d un autreanimal. Un éventuel succès devrait conduire - comme on le suppose - au dévelop-pement d’un embryon humain, qu’on pourrait utiliser comme dans le cas précédent.

Reprogrammation du noyau d une cellule d un sujet donné en le fusionnantavec le cytoplasme des ES, obtenant ainsi les “cybrides”: une telle possibilité estencore à l’étude. De toute façon, même cette voie semblerait exiger une préparationpréalable des ES d’embryons humains.

- Le clonage par séparation des blastomères

Cette technique fut mise au point pour l'étude de la totipotence de différencia-tion des blastomères. Le zygote est, par définition, une cellule totipotente à la foissur le plan cellulaire et sur le plan nucléaire. Qu'en est-il des deux premiers blasto-mères? A quel stade du développement chaque cellule de l'embryon devient-elleincapable de se développer en un f tus normal? Willadsen a réalisé une séried'expériences à l'issue desquelles il montra que chez le mouton, les blastomèresperdent leur totipotence cellulaire en passant au stade 8 cellules (3ème mitose).Cette technique lui permit également de produire les premiers clones de mouton enobtenant des paires et des triplés d'agneaux à partir des blastomères d'un mêmeembryon de stade 2 ou 4 cellules. Un seul agneau fut obtenu à partir d'un blasto-mère de stade 8 cellules. En fait, il semble qu'une horloge biologique compte le nombre de mitosespour déclencher le processus de blastulation au stade de ± 64 cellules (6-7ème mi-tose). Un blastomère de stade 8 cellules, isolé, poursuit son développement et dé-clenchera ce processus de cavitation après 3-4 mitoses, c. à d. lorsqu'il aura donnénaissance à un embryon composé de 8-16 cellules. Ce nombre est trop restreintpour former un blastocyste capable de s'implanter et sa masse cellulaire interne esttrop réduite pour qu'il poursuive un développement embryonnaire harmonieux. Cette technique est très délicate et ne fut jamais adoptée pour produire desclones en série.

- Le clonage chimérique par association

Cette autre technique, développée également par Willadsen, est fondée surune observation faite chez l'embryon de souris par Mulnard. Ce dernier a décrit queles premiers blastomères d'un stade 4 cellules qui subissent leur 3ème mitose four-nissent par la suite la masse cellulaire interne du futur blastocyste. Les derniersblastomères du stade 4 cellules qui se divisent donnent le trophectoderme. En as-sociant un blastomère isolé d'un stade 8 cellules d'une souche A avec un blasto-mère isolé d'un stade 4 cellules d'une souche B, Willadsen a effectivement montréque l'agneau obtenu après transfert en mère porteuse était constitué de cellulesdescendantes du blastomère de stade 8 cellules. En reconstituant 8 embryons chi-mériques en associant par paire les cellules d'un embryon 8 cellules de souche A etde deux embryons 4 cellules de souche B, il obtint un maximum de 5 agneaux dephénotype A. Comme tous les agneaux d'un groupe proviennent d'un blastomèred'un même stade 8 cellules, ils constituent un clone.

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Cette technique est également très délicate et n'a jamais été utilisée pour laproduction de clones en série. Elle a cependant permis de préciser que le premierprocessus de différenciation cellulaire, l'apparition du trophectoderme, débute austade 4-8 cellules, bien avant la cavitation.

III - LA PARTHÉNOGENÈSE:

Du grec θ = vierge ; = engendrer): Une ovule non féconderd’une lapine peut être stimulée et emprunter la voie de l’embryogenèse pour obtenirune lapine. La technique est simple:

a - On prend une ovule non fécondée d'une lapine. b - On stimule l'ovule. c - L'ovule stimulée commence à se développer et est réimplanté dansl’utérus de la lapine. Le produit sera une lapine identique à sa mère lapine.

IV - LA THÉRAPIE GÉNIQUE:

De nos jours, plus de trois mille types de maladies héréditaires ont été identi-fiées. Chaque année, la population mondiale paie un lourd tribut à cause de ces ma-ladies génétiques cause de mortalité infantile ou de déficience caractérisée.

¢ Dans le monde actuel on estime à cent millions (100 000 000), les person-nes qui sont atteintes de la mutation du gène qui code pour la glucose-6-phosphatedéshydrogénase qui conduit au favisme

¢ Environ deux cent cinquante millions (250 000 000) de personnes souffrentde plusieurs types d’anémies liées aux mutations génétiques

¢ Dans les pays développés, le tiers des hospitalisations en pédiatrie sontliées aux désordres génétiques.

¢ La mucoviscidose, cause de la fibrose cystique, touche environ un enfantsur 2 500 dans la population caucasienne. Quatre pour cent (4%) de cette popula-tion portent le gène muté de la mucoviscidose (FC).

¢ En Afrique et en Amérique, la drépanocytose tue à elle seule près de centmille enfants noirs par an sans compter les pathologies génétiques multi-factorielleset cystogéniques

¢ Au Burkina Faso, environ 30% de la population présentent une mutation dela chaine ß de l’hémoglobine (ßS ou ßC). Près de 5% des enfants sont atteints de ladrépanocytose sous ces diverses formes pathologiques (Hb SS ou Hb SC).

1. La thérapie génique germinale.

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L’objectif de la thérapie génique germinale consiste à introduire des cellulestransgéniques dans la lignée germinale et donc dans l’individu entier. Cela doit per-mettre non seulement de corriger l’individu traité, mais aussi de lui faire produire desgamètes porteurs du génotype corrigé qui seront transmis à la descendance. La cor-rection doit se faire dans une cellule germinale ou de l’embryon précoce ou les cel-lules sont totipotentes

La première expérience de thérapie génique ciblée et réussie concerne lacorrection d'une délétion du gène HPRT (Hypoxanthine PhosphoRibosyl-Transférase, un produit d'un gène du chromosome X) dans des cellules embryonnai-res pluripotentes de souris. Le gène HPRT code pour l'enzyme HPRT qui intervientdans le métabolisme des nucléotides. Grâce à une recombinaison homologue, unerestauration de l'intégrité du gène anormal a pu être obtenue. Ce succès démontreque la voie du ciblage génétique, inaugurée pour créer des modèles animaux estprometteuse. Plusieurs procédés sont utilisés à cette fin

a : La micro-injection d’un gène d’intérêt dans le pronoyau

Figure IX.2: micro-injection d’un gène d’intérêt dans le pro-noyau¢ La première étape consiste en une fécondation d’un ovule de souris¢ On injecte alors l’ADN étranger dans le pro-nucléi mâle de l’ovocyte fé-

condé¢ L’ovocyte est alors implanté dans une mère porteuse¢ La descendance transgénique est identifiée par la PCR et l’électrophorèse

De nos jours, de nombreux essais géniques se font chez les animaux dans lebut de les transposer un jour chez l’homme. Dans le cas des souris, 10 à 30% des

ufs manipulés donnent des souris vivantes. 40% de ces souris ont reçu le gèned’intérêt injecté. Le problème à résoudre est que l’ADN injecté s’intègre au hasard,parfois de manière ectopique dans les chromosomes.

b : La micro-injection du gène dans les cellules embryonnaires

Le processus est le suivant :

¢ On prélève au stade blastocyste des cellules embryonnaires porteusesd’un génotype muté

¢ On insère dans ces cellules le gène sauvage en culture¢ Les cellules transgéniques sont de nouveau ré-implantées dans l’embryon

qui se trouve dans le blastocyste.¢ Les cellules qui portent le gène sauvage vont se retrouver dans les diffé-

rents tissus de l’organisme, y compris dans les cellules germinales qui vont consti-tuer les gonades. Le transgène peut donc être transmis à la descendance par descroisements entres les souris transgéniques de la descendance portant le transgènedans leurs gonades.

De nos jours, aucune thérapie génique germinale n’a encore été entreprisechez l’homme. La plupart des fragments d’ADN s’intègrent de façon ectopique danstout le génome, ce qui constitue un sérieux handicap pour la thérapie humaine, non

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seulement à cause des possibles interruptions des gènes, mais aussi parce quel’allèle muté sera toujours présent dans le génome et pourra ségréguer du transgènedans les générations futures. Il faudrait mettre au point un système de ciblage grâceauquel le transgène de type sauvage se substitue au gène défectueux par une re-combinaison en faisant intervenir un double crossing-over. Figure IX.3 :La micro-injection du gène dans les cellules embryonnaires

2. La génothérapie somatique

La thérapie génique somatique s’attaque uniquement aux cellules du soma ettente d’éliminer le phénotype pathologique. Il est alors possible de rendre transgéni-que le corps entier d’un individu. Un certain pourcentage de cellules « guéries »peuvent atténuer la maladie en codant pour la protéine normale.

La génothérapie somatique consiste en une utilisation des rétrovirus désar-més (délétions des gènes gag, pol et env) pour l’insertion du gène exogène dansun organisme. Les premiers vecteurs utilisés ont été des rétrovirus désarmés quel’on a rendu amphotropes pour permettre leur utilisation dans différentes espèceset défectifs pour contrôler leur dissémination. Les problèmes liés à la l’insertion desrétrovirus sont énormes :

Les figures qui suivent illustrent quelques exemples de thérapie somatique dansdifférents mammifères

¢ Ils peuvent provoquer des inversions, des délétions, des mutations chezl’individu traité.

¢ Ils peuvent aussi rencontrer un autre virus dans l’individu traité, se recom-biner avec ce dernier et devenir pathogènes

¢ Il se pose également le problème de l’immunogénicité de l’organisme (nonreconnaissance du soi).Figure IX.4 : Thérapie génique somatique : Utilisation de rétrovirus pour un transfert degène

Le procédé simple est le suivant :

¢ On prélève quelques cellules somatiques du patient, qu’on cultive¢ On y introduit des exemplaires du gène sauvage cloné dans un vecteur

désarmé¢ On réimplante ces cellules transformées dans le corps du patient ou elles

pourront remplir la fonction attendue.

¢ Les figures qui suivent illustrent quelques exemples de thérapie somatiquedans différents mammifères

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3. Vers la génothérapie avec de l'ADN médicament.

La maîtrise de la méthodologie de transfert des gènes, alliée à une compré-hension de plus en plus poussée du fonctionnement des gènes, permettent d'envi-sager leur utilisation dans la lutte contre les maladies acquises. "Le principe consisteà munir certaines cellules d'une construction génique permettant la production locale(autocrine), régionale (paracrine), voire générale (endocrine) de facteurs protéiques(ou nucléiques) ayant un intérêt thérapeutique". Les cancers et les maladies viralessont candidats à ce type de thérapie.

En effet, dans la thérapie des cancers les premières expériences effectuéesavec les TIL montrent que l'on peut armer des cellules avec des facteurs cytotoxi-ques (TNF = Tumor Necrosis Factor) ou les doper avec des cytokines.

Dans la thérapie anti-virale, l'idée est de fournir à la cellule les moyens de sedéfendre spécifiquement contre le virus par une stratégie adaptée à la biologie duvirus considéré. Il s’agit de mettre à profit la masse de connaissances accumuléessur sa biologie. Dans le cas du VIH, cet démarche consiste à munir les cellules T deconstructions contenant des gènes mutants transdominants codant pour des pro-téines virales structurales ou régulatrices anormales ou modifiées.

On peut aussi fabriquer des leurres pour le virus comme la protéine CD4 so-luble comportant un signal de rétention intracellulaire pour piéger la protéine gp120du virus ou même un leurre du RNA viral comportant une pseudo séquence TAR.

Une autre approche consiste à éliminer le virus de la cellule infestée par unetoxine protéique (toxine diphtérique, ricine) dont le gène est placé dans une cons-truction qui en assure l’expression conditionnelle. Il s’agit dans ce cas d’une bombeà retardement que le virus active lui même (Une protéine régulatrice TAT).

Une autre variante de cette toxigénétique conditionnelle, "consiste à com-battre le virus HIV en lui apportant le gène de la thymidine kinase (TK) souscontrôle du LTR du HIV, cette construction étant elle-même incluse dans unadénovirus recombinant qui en assure la transduction" Dans ce cas, seules lescellules infectées produisent les signaux transactivateurs du LTR, ce qui entraînel'expression du gène TK, rendant les cellules sensibles au gancyclovir, (un analoguepyrimidique cytotoxique) administré comme médicament.

Ces essais préliminaires ouvrent la voie à une ère de thérapeutique nouvelle,permettant de s’attaquer à des maladies incurables ou héréditaires et aux maladiesvirales comme le SIDA.

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CHAPITRE X :LES TECHNIQUES DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE APPLIQUÉES DANS LARECHERCHE THERAPEUTIQUE DU VIH/SIDA

I – STRUCTURE DU VIH

Figure X.1 : Structure du VIH

L'étude de la structure génétique du VIH permet de comprendre la complexitéde ce virus, certaines de ses manifestations cliniques et biologiques, et d'envisagerdes stratégies pour la recherche thérapeutique.

Le VIH, Virus de l’Immunodéficience Humaine, est un rétrovirus de 0,1 m dediamètre, du sous-groupe des Lentiviridae, qui a un génome à ARN.

Il a été isolé pour la première fois à l’Institut Pasteur de Paris en 1983. Le VIH-1 estrépandu dans le monde entier tandis que le VIH-2 est essentiellement localisé en Afri-que. En Afrique subsaharienne on peut trouver chez le même individu une co-infection : le VIH-1 et le VIH-2 ensemble.Figure X.2 : Origine du VIH

Structure du VIH : De l’extérieur vers l’intérieur du virus, nous avons :

L’enveloppe du virion : les glycoprotéines p 120, p 41 et une double couche dephospholipides.

La matrice est constituée glycoprotéines p 17. La capside, formée par des glycoprotéines p 24 contient : deux filaments d’ARN

de 9200 bp environ enveloppés par la nucléocapside (protéine p 7), la transcriptaseinverse, l’intégrase, la protéase et la ribonucléase.

Le VIH possède 3 gènes rétro-viraux codant pour différentes protéines virales :gag (groupe antigène) code pour des protéines internes ("core") : p50 et

p40 qui se cliveront en p13, p18 et p24.pol (polymérase) code pour des enzymes nécessaires à sa réplication :

notamment p68 (reverse transcriptase) et p34 (intégrase).

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env (enveloppe) code pour des glycoprotéines (gp110 et gp41 issues degp 160). La gp 110 est une partie de l'enveloppe responsable de l'interaction avec lamembrane de la cellule cible au niveau du récepteur CD4, permettant la pénétrationdu virus. Une autre propriété de l'enveloppe (gp41) est de pouvoir induire la fusioncellulaire (syncitium) qui est un des éléments cytopathogènes du VIH.Figure X.3 :gène gag, pol, env

Le VIH possède d’autres gènes codant pour différentes protéines viralesContrairement aux autres rétrovirus, le VIH possède d'autres gènes intervenant danssa réplication. Cette complexité qui lui est caractéristique explique probablement sonhaut pouvoir pathogène. Il y a des gènes régulateurs :

tat (favorise l'augmentation du niveau de la synthèse des protéines vira-les),

rev favorise l'augmentation des ARN messagers correspondant aux protéi-nes de gag, pol et env.

Il y a aussi d'autres gènes, comme vif, qui permet d'augmenter l'infectiosité,nef (rôle mal connu) et vpu, vpr (vpx pour VIH2). La séquence LTR (Long TerminalRepeat) peut être considérée comme un promoteur fort et une région régulatricepour la production de nouveau virus.Figure X.4 Mécanisme d’infection

II - LES NOUVELLES MOLÉCULES ANTIVIRALES EN DÉVELOPPEMENT:

1 - Les inhibiteurs de l'entrée du virus :

Il existe 3 types de médicaments qui sont en cours de développement àl'heure actuelle :

Inhibiteurs de l'entrée du virus dans les lymphocytes CD4 ;Antagonistes des co-récepteurs, ces molécules se fixent sur des récep-

teurs nécessaires à la pénétration du virus dans les cellules ;Inhibiteurs de la fusion du VIH : ils empêchent le virus de fusionner avec

la cellule qu'il attaque.

2.- Les INTI et les INNTI sont des inhibiteurs de la transcriptase inverse

Des essais cliniques ont été réalisés sur de nouveaux inhibiteurs de la trans-criptase reverse : Inhibiteur Nucléosidique de la Transcriptase Inverse (INTI) et Inhi-biteur Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INNTI). Les premiers essaisont montré des résultats intéressants en terme d'efficacité sur la charge virale ou surdes virus présentant des mutations.

3. - Les IP sont des inhibiteurs de la protéase acide virale:

De nouveaux inhibiteurs de la protéase sont en cours de développement à un stadeavancé.

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4 – classification de quelques molécules antivirales :

Nucléosides : Rétrovir (AZT), Videx (ddI), Hivid (ddC), Epivir (3TC), Zérit (D4T),Combivir (AZT + 3TC), Ziagen (abacavir).

Non-nucléosides : Viramune (névirapine), Sustiva (efavirenz), Rescriptor(delavirdine).Antiprotéases : Invirase ou Fortovase (saquinavir), Crixivan (indinavir), Norvir (rito-navir), Viracept (nelfinavir), Agénérase (amprénavir), ABT-378/r (voir : Pétition Re-maides).

Nucléotide : Prévéon (adéfovir).III. VERS L’ESPOIR D’OBTENIR UN JOUR UN VACCIN ANTI-VIH.

La recherche d'un vaccin contre le VIH a continué de progresser, même sielle n'a pas accompli de progrès spectaculaire au cours des dernières années écou-lées. Près de trente essais ont été menés ou sont en cours chez l'homme, en phaseI et II (étude de la tolérance et des réactions immunitaires chez quelques dizainesde volontaires en phase I et plusieurs centaines en phase II).

De nouvelles approches sont explorées. L'utilisation de virus atténués,comme cela se pratique pour de nombreux vaccins et qui est évoquée et repousséedepuis longtemps pour le VIH, fait actuellement grand bruit aux États-Unis où elleest proposée avec force par un groupe de médecins-chercheurs et bien autres typesde vaccins.

1 - Les deux objectifs d'un vaccin contre le VIH demeurent :

L'induction d'anticorps capables de neutraliser le virus, dirigés contre lesprotéines d'enveloppe (réponse humorale).

L'induction de cellules T cytotoxiques, CTL, qui détruisent les cellules in-fectées. Cette induction nécessite que la préparation vaccinale se réplique à l'inté-rieur des cellules pour que l'antigène du VIH soit présenté au système immunitaire(réponse cellulaire).

La majorité des résultats obtenus depuis deux ans soulignent l'intérêt de stra-tégies vaccinales utilisant des combinaisons d'antigènes de plus en plus complexes,afin de stimuler les différentes composantes du système immunitaire. Un des pro-blèmes posés par l'obtention vaccinale de réponses immunitaires contre le VIH estque ces réponses doivent être dirigées contre des souches de virus très variables.

2 - Vaccins sous-unitaires et vaccins synthétiques

Les premiers vaccins sous-unitaires (immunisation par des protéines d'enve-loppe recombinantes du virus) se sont révélés incapables d'induire des anticorpsneutralisants actifs contre les souches de virus sauvages que l'on trouve chez lesmalades et qui sont différentes de celles, longtemps cultivées en laboratoire, utili-

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sées pour les vaccins (Lemoine FM et al,1999). Certains vaccins sous-unitaires VIHinduisent cependant une protection chez des chimpanzés et des macaques (Le-moine FM et al,1999). Ils sont utilisés chez l'homme en rappel (boost), après l'injec-tion d'un vaccin recombinant vivant (prime, d'où le concept de «prime-boost»).

En parallèle, on étudie l'immunogénicité de peptides et antigènes incorporésdans des liposomes (vésicules d'acides gras qui ont la propriété de pénétrer dansles cellules) ou des ISCOMS (complexes immuno-stimulateurs). Ces méthodes sem-blent capables d'induire des réponses immunitaires anti-VIH chez l'homme et anti-SIV chez le singe, mais sans qu'on sache aujourd'hui si cela procure une protection.

3 - Les virus vivants atténués

Ce sont des virus VIH, ou SIV chez le singe, toujours infectieux mais dont lepouvoir pathogène est diminué. Cette approche, généralement considérée commetrop dangereuse chez l'homme, suscite beaucoup d'intérêt depuis que plusieurs di-zaines de médecins américains ont annoncé qu'ils se portaient volontaires pour unessai de vaccination par un VIH atténué (Lemoine FM et al,1999).

4 - Vaccins vivants recombinants produit par la biotechnologie

C'est avec des vaccins vivants recombinants (un virus inoffensif auquel on aajouté des gènes du VIH) que les essais chez l'homme sont le plus avancés, puis-qu'un essai de phase II vient de commencer aux États-Unis chez 420 volontaires,avec une préparation de Pasteur-Mérieux-Connaught. Les vaccins recombinantsutilisent la vaccine ou le canarypox (virus de la variole du canari) exprimant des pro-téines du VIH. Les premiers vaccins recombinants exprimaient seulement une pro-téine d'enveloppe. Les préparations actuelles sont porteuses de gènes de plusieursprotéines d'enveloppe et de protéines internes.

5 - Pseudo-particules (virus-like particles)

Ces vaccins sont constitués de différentes combinaisons de protéines viralessous forme de particules. L'absence de génome viral les empêche de se répliquer(Lemoine FM et al,1999).

6. ADN nu

L'administration d'un ADN purifié codant pour une ou plusieurs protéines duVIH et portant un signal pour la transcription dans la cellule présente deux avanta-ges, la simplicité et la stabilité du vaccin. Les premiers essais chez l'animal ont mon-tré que ces vecteurs induisent des CTL et des anticorps neutralisants (Lemoine FMet al,1999).

Une approche originale utilise des «cochléats» (phosphatidylsérine, choles-térol et calcium) comme vecteurs de protéines et d'ADN.

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Au-delà de ces vaccins en perspectives et ces nouveaux médicaments, dontcertains seront prochainement disponibles, les recherches continuent égalementdans la direction de la thérapie génique.

IV. LE GÉNIE GÉNÉTIQUE ET LA LUTTE CONTRE LE VIH.

Aujourd'hui, la thérapie génique, instrument du génie génétique, qui consisteà intervenir sur les gènes d'une cellule pour modifier certaines de ces fonctions oucapacités, est très avancée dans la thérapie des cancers et de nombreuses patho-logies génétiques. Pour ce qui concerne le traitement de l'infection par le VIH, lespistes de recherches sont déjà nombreuses, quelques protocoles d'essais chezl'homme ont été approuvés et certains sont même en cours d'évaluation.

1 - Comment modifier les gènes d'une cellule ?

Deux approches thérapeutiques sont aujourd'hui utilisées pour combattre le VIH :

La modification directe des gènes des cellules du malade :

On injecte au malade un virus porteur du gène que l'on veut modifier. Ce virusva s'intégrer au niveau de l'ADN des cellules et insérer le transgène. Les cellulesacquièrent ainsi les nouvelles propriétés conférées par ce gène, par exemple, enproduisant une toxine contre le virus du SIDA.

L'utilisation de cellules déjà modifiées :

On injecte au malade des cellules humaines, par exemple, des cellules immu-nitaires comme les lymphocytes CD4, qui ont été génétiquement modifiées par laméthode décrite ci-dessus en laboratoire. Ces cellules chimères agissent comme unmédicament en luttant contre la maladie. Elles sont désormais capables de résisterau virus du SIDA et peuvent apporter au malade une immunité contre les infections.

2 - Mais comment, concrètement, le génie génétique peut-il développer desstratégies de combat contre le VIH ?

A travers Cinq voies de recherches :- L'immunisation intracellulaire,- La destruction sélective des cellules infectées,- La sécrétion de protéines inhibitrices,- La pharmacomodulation génétique,- L'immunothérapie génétique,

a - L'immunisation intracellulaire :

Tandis que la vaccination protège les sujets non infectés de l'infection, l'im-munisation intracellulaire confère une protection contre un virus à l'échelon cellulairechez des sujets infectés. Le principe est simple : il s'agit de modifier la structure gé-nétique des cellules cibles du VIH (les lymphocytes CD4) afin que celles-ci soient

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protégées du virus. Plusieurs techniques sont utilisées. La cellules modifiée se metalors à produire des mutants « transdominants » de protéines virales, des « leurresARN » qui miment l’ARN viral, des « molécules antisens » de séquences nucléotidi-ques. Tous ces éléments générés par la biotechnologie peuvent tromper le VIH ou lebloquer ou alors rivaliser avec lui dans la recherche des substrats. L'intérêt de l'im-munisation intracellulaire est qu'elle bloque bien la réplication du virus à l'intérieurde la cellule.

b - La destruction sélective des cellules infectées :Une autre approche de la thérapie génique de l'infection par le VIH vise à dé-

truire spécifiquement les cellules infectées à l'aide d'un gène codant pour unetoxine. Un gène « suicide » est placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteurLTR du VIH afin d'entraîner la destruction cellulaire au moment de la synthèse de lamolécule tat, produite lors de la réplication du VIH (Caruso M et al. 1992). Cettestratégie est difficile à mettre au point et n'apporte aucun avantage sélectif aux cellu-les transduites, car les lymphocytes sont détruits dès qu'ils sont infectés.

c- La sécrétion de protéines inhibitrices :

Certaines protéines sécrétées naturellement par les lymphocytes ont des pro-priétés anti-VIH. L'opération consiste à introduire dans l'organisme un gène qui vaproduire une quantité élevée de ces protéines. Ce gène peut être implanté de ma-nière ectopique dans les hépatocytes, via un virus modifié qui est capable d'implan-ter le transgène. Les chercheurs peuvent aussi utiliser d’autres méthodes comme"cultiver" des cellules modifiées génétiquement, des fibroblastes de souris, les en-tourer d'une membrane inerte de collagène pour qu'elles soient "invisibles" par lesystème de défense immunitaire du patient, puis les transférer chez le patient atteintpar le VIH. Ces cellules enveloppées et protégées se mettent alors à produire lesprotéines anti-VIH (Moullier P, et al. 1993).

d - La pharmacomodulation génétique :

Les médicaments antiviraux actuels agissent pour la plupart à l'intérieur de lacellule infectée au niveau de laquelle ils pénètrent. C’est ainsi que l’action de la zi-dovudine est limitée du fait de ses effets toxiques et de l'apparition de souches mu-tantes résistantes. Le mécanisme cellulaire qui permet de rendre ces médicamentsactifs n'a pas toujours un rendement idéal puisqu’une partie du médicament est éli-miné de la cellule avant d'avoir été rendu actif. Le principe de la "pharmacomodula-tion génétique" est d'introduire un gène qui va accélérer l'activation de l'antiviral àl'intérieur de la cellule. Cette méthode est très intéressante, car elle permettrait ain-si, à dose d'antiviral identique, d'avoir une efficacité 3 à 10 fois plus importante. Ellepeut également être appliquée pour diminuer les effets indésirables d'autres antivi-raux qui sont mal tolérés, et dont on pourrait diminuer les doses pour le patient (Ca-ruso M et al. 1994).

e - L'immunothérapie génétique :

L'immunothérapie génétique correspond à l'utilisation, à des fins thérapeuti-ques, de cellules immunocompétentes génétiquement modifiées (Lemoine FM et al.1999). En effet, cette dernière voie de recherche, en plein essor, consiste en l'intro-

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duction dans l'organisme de cellules génétiquement modifiées, des cellules dendriti-ques (DC) ou autres qui sont capables de "mimer" le virus du SIDA pour activer uneréponse du système de défense immunitaire de l'organisme. En effet, les DC sontcapables d'apprêter les protéines sous forme de peptides antigéniques et de les pré-senter soit aux lymphocytes T CD4+ par le complexe majeur d'histocompatibilité declasse II (CMH II), soit aux lymphocytes T CD8+ via le CMH I (Lemoine FM et al.1999). Lors de l'infection par le VIH, l'organisme n'est pas capable de se défendretout seul car le virus n'est pas reconnaissable suffisamment longtemps pour que desanticorps efficaces puissent être produits. L'immunothérapie génétique permet deprésenter aux lymphocytes des "morceaux du virus" facilement reconnaissables pourque, en s'attaquant à ces "morceaux", les lymphocytes détruisent les virus. Il s'agitlà, bel et bien, d'une sorte de "vaccination" avec des cellules génétiquement modi-fiées.

3 . Recherche sur un vaccin contre le VIH/SIDAProcessus et défi de la conception et de la sélection des épitopes: Qu’est-ce qu’unépitope ?Comment pouvons-nous induire dans toutes les personnes une réponse immunitairespécifique contre un grand nombres d’épitopes VIH peptides des Lymphocytes TCytotoxiques (CTL) et des lymphocyte T helper ?

Immunogénétique Reverse

Nous avons :- la génétique directe:du phénotype, à partir de la configuration de la protéine, on remonte au gène qui aspécifiée cette séquence peptidique.- la génétique reverse:De l’ADN, du gènes spécifique on cherche à découvrir la protéine codée, synthéti-sée.

* Sélection des peptides à travers la technique de l’immunogénétique Reverse.Fondement: rechercher les gènes qui spécifient les protéines du système immuni-taire.A partir de la technique de l’immunogénétique reverse: trouver des peptides desallèles des classes HLA I et II capable de couvrir plus de 90% des haplotypes HLAde diverses populations ciblées.A partir de la technique de l’immunogénétique reverse: Acquérir une grande in-formation sur les séquences des acides aminés des protéines du VIH de divers cla-des du VIH.

* Les défis d’élaboration des épitopes CTL du VIH spécifique par la technique del’immunogénétique reverse: - variabilité génétique du VIH,- polymorphismes alléliques des populations ciblées,

Défis d’élaboration des épitopes CTL du VIH spécifique Nécessité d’informationssur:

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1) La variabilité génétique du VIH,2) La base génétique humaine de la distribution des allèles du système HLA de lapopulation ciblée

Nous trouvons des donnés sur la variabilité génétiques et la distribution des allèlesdu systèmes HLA des populations de l’Afrique de l’Ouest dans le dépôt du GeneBank. Connaissance des fréquences des allèles du système HLA de classe I et declasse II au sein des populations ciblées ( Burkina Faso).

Utilisation des épitopes promiscuous du système HLA de la classe I et II pour la po-pulation ciblée. Concevoir les épitopes peptidiques par la technique del’Immunogénétique Reverse.Tester les épitopes du VIH sélectionnés pour établir la capacité d’être identifié parun Lymphocyte T Cytotoxique (CTL) VIH-spécifique et pour recueillir la réponse dulymphocyte T helper. Figure VIII.7

CHAPITRE XI : PHARMACOGÉNÉTIQUE ET PHARMACOGÉNOMIE

I - GÉNÉRALITÉ : PHARMACOGÉNÉTIQUE ET PHARMACOGÉNOMIE

A - Historique :En 1902 Archibald Garrod, médecin anglais appliquait pour la première fois

les lois de Grégoire Mendel à la transmission des maladies héréditaires de l’homme.Il émit comme hypothèse selon laquelle les facteurs héréditaires (les gènes) contrô-leraient certaines réactions métaboliques. Successivement il théorisait la nature in-dividuelle (due à la variabilité et à la spécificité chimique des processusmétaboliques) de toutes les réponses de l’organisme au regard des élémentsétrangers, les agents pathologiques, les aliments ou les médicaments.

Au moment où les recherches fondamentales explicitaient les mécanismesbiochimiques et genetico-moléculaires associés aux pathologies héréditaires, LinusPauling en 1949 démontrait que l’anémie falciforme, la drépanocytose, « sick cell »est une maladie due à une anomalie structurale de la molécule de l’hémoglobine.Par la suite les chercheurs démontrèrent que cette anomalie structurelle protéiquecorrespondait à une altération de l’information génétique codée dans l’ADN. C’est àce moment qu’ils découvrirent aussi les premiers exemples d’hérédité de certainesréactions anormales aux médicaments. Le premier exemple est la réaction d’anémiehémolytique inattendue des soldats américains d’origine africaine, après la prise dela primaquine, un médicament antimalarique. L’étude moléculaire permit de décou-vrir chez les personnes qui ne tolèrent pas la primaquine le déficit enzymatique de laG6PD (Glucose 6 phosphate déshydrogénase). L’étude fondamentale génétique de

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la susceptibilité individuelle à réagir de manière anormale avec des conséquencesdestructives après l’absorption de médicaments, fut appelée, en 1959, pharmacogé-nétique.

A partir des années 70, les études de pharmacogénétique commencèrent àmontrer que la variabilité individuelle dans le métabolisme des médicaments peutdépendre non seulement de variations d’un seul gène avec ses allèles mais ausside l’interaction de plusieurs gènes mutés dans l’organisme. C’est ainsi qu’à partirdes année 90, les chercheurs émirent le concept de pharmacogénomique pour ex-pliquer la variabilité individuelle dans la réponse aux médicaments utilisant destechniques qui permettent d’évaluer l’expression et l’action de plusieurs gènes.

B - Qu'est-ce que la pharmacogénétique ?La pharmacogénétique est définie comme l’étude des variations génétique-

ment contrôlées de la réponse à un médicament. Elle étudie les mécanismes defonctionnement utilisés par la cellule-cible ou la cellule de détoxication, vis-à-visd'un médicament administré. La pharmacogénétique a connu un grand développe-ment en ces dernières années grâce à l’utilisation des techniques de biologie molé-culaire comme l’analyse des polymorphismes de restriction (RFLP), SSTR,l’amplification en chaîne par la polymérase (PCR), les méthodes de transfection et ledéveloppement des chips.

La pharmacogénétique qui permet d’établir un lien entre le polymorphisme dela structure génique et la variabilité de la réponse à l’effet d’un médicament acomme objectifs :

1 - Rechercher les gènes qui codent pour les enzymes de transformation des médi-caments.2 - Élaborer des tests qui montrent que le patient qui doit prendre tel médicamentpossède les enzymes de transformation nécessaires.3 - Tester directement l'activité des enzymes de transformation des médicaments :des tests devraient se développer de plus en plus pour étudier, à l'avance, la façondont chaque individu va transformer puis éliminer tel ou tel médicament.4 - Déterminer les doses de médicaments à utiliser chez les enfants ou les person-nes âgées. En effet, la synthèse des enzymes de transformation des médicaments etleur activité évoluent en fonction de l'âge. Certaines de ces enzymes ne sont pasencore "matures" chez des enfants ; par contre, chez les personnes âgées, certai-nes enzymes peuvent avoir une activité réduite.5 - Identifier pour tous les nouveaux médicaments, les enzymes de transformationimpliquées. La pharmacogénétique représente donc aujourd'hui une composanteimportante dans le développement d'un nouveau médicament.

La pharmacogénomie ou la pharmacogénomique est plus difficile à définir. Ils'agit d'étudier simultanément les modulations, positives ou négatives, de l'expres-sion des gènes, induites par les composés pharmacologiques analysés. Quelle mo-dification de l'expression d'un ou de plusieurs gènes induit une molécule donnée?Autrement dit, à côté de l'effet thérapeutique principal recherché, quelles autres mo-difications du génome ou du protéome (dans le cadre de ce qu'il est convenu d'ap-peler la protéomique) peut-on observer, et quelles conséquences directes ou indi-rectes faut-il en déduire, pour le développement d'une molécule a priori sélectionnéepour devenir un médicament?

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C - Pharmacogénétique : Les liens entre les enzymes de transformationdes médicaments et les cancers ?

Les enzymes ont des conséquences multiples dépendant :* de leur fonction ;* de la vitesse à laquelle ils agissent ;* des vertus pharmacologiques de la substance qu'ils détruisent ;* des propriétés toxicologiques de la substance qu'ils créent.

- Rendre les médicaments efficaces.Pour qu'un médicament soit efficace, il faut plusieurs conditions : avoir des enzymesqui transforment le médicament en une substance active (parfois les médicamentssont directement actifs et n’ont pas besoin de cette étape d'activation), et d'autresenzymes qui ne dégradent pas trop rapidement cette substance active (pour que lemédicament reste efficace plus longtemps). A l'inverse, les personnes qui n'ont pasd'enzymes adéquates ne pourront pas utiliser un médicament donné et donc ne tire-ront pas le bénéfice thérapeutique attendu. L'efficacité d'un traitement dépend doncdirectement de la présence et du fonctionnement de certaines enzymes.- Éliminer les toxiques.Les enzymes agissent d'une autre façon : certains créent des produits toxiques,d'autres permettent d'éliminer ces agents toxiques. Ainsi, certaines personnes vontfabriquer plus de molécules toxiques que d'autres sujets suite à la prise d'un médi-cament donné. Ces personnes risquent alors de développer plus d'effets indésira-bles (effets secondaires). Inversement, certaines personnes éliminent plus rapide-ment ou plus efficacement certains produits toxiques. Ce caractère leur permetd'être protégées contre l'action de ces toxiques. Ainsi, on sait que certains fumeursrisquent, plus que d'autres, de développer un cancer du poumon après activationdes produits contenus dans la fumée de tabac par leur transformation enzymatiqueen produits cancérigènes.

Afin de mieux combiner les médicaments les uns avec les autres, les personnessous traitement peuvent prendre plusieurs médicaments en même temps, pour trai-ter différentes maladies. Parfois, certaines enzymes de transformation modifient plu-sieurs médicaments et il peut alors se poser des problèmes de compétition,d’inhibition ou d’interaction médicamenteuse. Il est important de connaître quels sontles médicaments qui interagissent les uns avec les autres pour éviter de les combi-ner.

- Quelques exemples pratiques.* Une personne sur 300 ne possède par une enzyme nécessaire pour la dégradationdu 5-fluoro-uracile, un médicament utilisé pour le traitement du cancer du côlon. Laconséquence de cette absence est que la personne ne pourra pas éliminer le médi-cament, qui va alors s'accumuler dans le corps et créer des effets toxiques. D'ores etdéjà, des tests sont disponibles pour vérifier la présence de cette enzyme et pourmesurer son activité avant de débuter un traitement.* De même, une personne sur 300 possède une enzyme de transformation de cer-tains médicaments (l'AZT, le mercaptopurine et la thioguanine) trop performante :elle modifie trop rapidement ces médicaments qui ne pourront alors pas agir sur les

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cellules cibles.* On peut encore citer des enzymes de détoxication (appelées transférases) qui sontprésentes en quantité variable d'une personne à l'autre. Elles agissent principale-ment en rendant solubles certaines substances chimiques pour qu'elles soient en-suite éliminées par le foie et/ou les reins.

D – L’épidémiologie des réponses idiosyncrasiques

L’idiosyncrasie idios (ιδιος) en grec = particulier ; sunkrasis (συνκρασις)= mélange).C’est la manière d’être particulière à chaque individu, qui l’amène à avoir des réac-tions, des comportements qui lui sont propres.

Les réponses idiosyncrasiques ont une corrélation, au sein de la population, avecles mutations génétiques et les facteurs variés comme le sexe, l’âge, l’aire géogra-phique et le groupe ethnique. La pathologie transmise par les chromosomes sexuels peuvent toucher unsexe plus que l’autre.- Une altération transmise en mode récessif avec le chromosome X se manifeste

chez les sujets de sexe masculin, en tant que hémizygote.

L’âge joue dans la pathogenèse dans la mesure où certaines altérations génétiques

peuvent se manifester non à la naissance, mais en âge juvénile ou adulte.

- L’aire géographique est importante quand l’environnement exerce une pres-sion sélective et favorise l’affirmation d’un profil génétique déterminant. Parexemple, la présence du gène pour la variante A- de l’enzyme G6PD. LaG6PD tend à se manifester surtout dans les zones endémiques du paludisme.

- Les différences génétiques entre les diverses ethnies sont responsables de lavariation dans la réponse aux médicaments. L’incidence de l’anémie hémoly-tique induite par les médicaments est mineure chez les caucasiens par rap-port aux autres populations, tandis que le gène muté qui code une enzymepseudo-cholinestérase s’exprime plus chez les européens avec une fré-quence de 2%.

E - Les critères d’étude en pharmacogénétique

En face d’une réponse pharmacologique atypique, il faudrait suspecter unebase génétique. Mais pour que cela soit accepté, il faudrait des recherches docu-mentées, appropriées. L’examen clinique est de par soi-même insuffisant, cependant le cadre clini-que symptomatique est parfois évident et suggestif, comme dans le cas d’une ap-née prolongée par suite de l’absorption d’un médicament. L’information plus certaine est l’étude des familles et des groupes de ju-meaux. Les études familiales ont permis d’établir , par exemple, que la bio-transformation de certains médicaments, comme la dicoumarole et la phénylbuta-zone, dépend des enzymes qui, du point de vue génétique, s’expriment d’une ma-nière polygénique. Les effets de plusieurs produits comme l’isoniazide, la phénylbu-tazone et l’halothane, sont évalués en utilisant les jumeaux homozygotes.

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Les études au niveau des jumeaux comparent les réactions à l’intérieur desgroupes de jumeaux homozygotes et des jumeaux hétérozygotes. Les jumeaux ho-mozygotes tendent à avoir un profil pharmacogénétique très similaires par rapport àun type de médicament ; tandis que les jumeaux hétérozygotes présentent des va-riations énormes comparables aux individus consanguins. Au niveau des jumeaux,le paramètre qui détermine la pharmacocinétique d’un médicament déterminé, lademie-vie plasmatique et la contribution de l’hérédité est le coefficient de l’Héréditéqui s’exprime par l’équation :

h2 = (Vd-Vm) ----------- Vd

h = Coefficient d’hérédité ; Vd = variance calculée à l’intérieur de jumeaux hétérozy-gotes et Vm est la variance calculé à l’intérieur des jumeaux homozygotes.

La valeur de h peut varier entre 0 (dans le cas où la contribution génétique est insuf-fisante ou nulle) à un (dans le cas où l’influence génétique est déterminante).Dans le cas de la dicoumarole, la phénylbutazone, l’halothane et la nortriptyline, lecoefficient d’hérédité varie entre 0,88 et 0,98.Exemples de désordres pharmacogénétiques :

Tableau IX.I : Désordres pharmacogénétiques

Altération génétique Médicament Manifestation pathologique

Désordres pharmacogénétiques avec apparition de phénomènes toxiques ouimprévisibles

G6PD Antimalariques, sulfami-des, nitrofuranes

Anémie hémolytique

NADH-méta-hémoglobineréductase

Nitrite, sulfonamides Méta-hémoglobinémie

Pseudo-cholinestérase Succinylcholine ApnéePolymorphisme de laN-acetyltransferase

Isoniazide, procaïnamide,clonazepam

Apparaît la toxicité du mé-dicament

Transferrine Fer hémochromatoseDésordres pharmacogénétiques avec absence d’effet pharmacologique atten-

du (résistance à l’action des médicaments) Altération génétique Médicament Effet thérapeutique attenduAbsence du facteur intrin-sèque

Vit. B12 AbsenceActivité antianémique

Réduction des récepteursbeta2 adrénergique

Beta2 stimulants AbsenceActivité antiasthmatique

Altération des récepteurs Insuline Absence

98

de l’insuline Activité antidiabétiqueRéduction de la synthèsedu HGPRT

6-mercaptopurine azathio-prine

AbsenceActivité antitumoraleActivité immunosupressive

II - LES DÉSORDRES PHARMACOGÉNÉTIQUES

Les désordres pharmacogénétiques peuvent être classés selon la base des caracté-ristiques cliniques des réponses idiosyncrasiques et aux altérations génétiques quisont à leur origine. Selon ce critère, les réactions idiosyncrasiques peuvent consis-ter dans l’apparition des effets toxiques ou imprévisibles, ou alors en un manqued’effet thérapeutique attendu.

La pharmacogénétique est la discipline qui décrit les réponses inusuelles auxmédicaments (idiosyncrasie) sur la base de mécanismes héréditaires. Les variationsinterindividuelles de la réponse aux médicaments sont d'observation fréquente, cer-tains malades ne répondant pas à des doses habituelles, voire élevées, de médica-ments, tandis que d'autres présentent des accidents de surdosage. De nombreuxfacteurs sont connus pour retentir sur la susceptibilité individuelle ; sans compter del'observance et des variations liées à l'observateur, ils peuvent être en rapport avecle malade lui-même (facteurs intrinsèques) : âge, pathologie(s), statut hormonal,compétence immunologique, génotype, enzymes, ou dépendre de conditions exté-rieures (facteurs extrinsèques) : variations nycthémérales, facteurs environnemen-taux, état nutritionnel, consommation d'alcool ou de tabac, stress, activité physique,en représentent des exemples. Enfin lors d'administrations concomitantes, les inte-ractions médicamenteuses constituent un dernier volet. La connaissance de ces fac-teurs de variation peut aider à corriger un schéma posologique pour l'adapter à cha-que sujet afin d’éviter les phénomènes toxiques et imprévisibles.

A. Variations d'ordre pharmacocinétique

1 - Au niveau de la résorption

Les patients atteints d'anémie pernicieuse juvénile souffrent d'une malabsorp-tion de la vitamine B12 d'origine génétique. Il existe également une perturbationcongénitale de la résorption de l'acide folique accompagnée de modifications de sonmétabolisme qui conduisent à des réponses atypiques en cas d'administration defolates ou d'analogues tel le méthotrexate.

2 - Au niveau de la métabolisation

Le polymorphisme d'acétylation. L'exemple le plus connu concerne l'iso-niazide (Rimifon®). Sa biotransformation est catalysée par une N-acétyl transféraseà localisation hépatique préférentielle. Dans une population, il existe une répartitionbimodale de la capacité d'acétylation définissant les acétylateurs rapides (demi-vied'environ 2 h) et les acétylateurs lents (demi-vie d'environ 6 h) (figure 5). La réparti-tion varie selon les ethnies. Environ 45% des Européens sont acétylateurs rapidescontre 80-90% des Asiatiques et la quasi totalité des Esquimaux. Ils ne sont parcontre que 17% parmi les Égyptiens. Le caractère acétylateur lent se transmet selon

99

le mode autosomique récessif. Pour une posologie standard les risques d'apparitiond'effets indésirables par surdosage, en particulier neurologiques, sont plus élevéschez les acétylateurs lents ; mais en revanche chez les acétylateurs rapides la pro-duction plus importante, in situ, d'un métabolite hépatotoxique majorerait le risqued'hépatite.

L'adaptation posologique chez le sujet à risque, et en particulier chez l'enfant,peut se faire à partir de l'administration d'une dose test et du dosage de l'isoniazideplasmatique 3 h après. L'application de la formule ci-dessous permet de déterminerl'indice d'acétylation:

Isoniazidémie à la 3è H + 0,6--------------------------------------Dose administrée (mg/kg/j)

Fréq. 24

20

16

12

8

4

0

Rapides (R/R ou R/r)

Leats (r/r)

100

Concentrations plasmatiques de l isoniazide mesurées 6 heures aprèsadministration d une dose moyenne de 9,8 mg/kg à 267 membres de 53 familles

(d après Evans)

En dehors de l'isoniazide, des tests basés sur l'acétylation d'autres moléculesont également été standardisés : procaïnamide et son métabolite acétylé le NAPAou métabolites de la caféine entre autre. L'avantage du test à la caféine est qu'ilpeut être réalisé après la simple prise d'un café, sans ingestion de molécule médi-camenteuse.

L'intérêt du phénotypage d'acétylation dépasse l'adaptation posologique del'isoniazide puisqu'il permet également de prévoir le comportement vis-à-vis d'autresmédicaments qui suivent cette voie de métabolisation (hydralazine, procaïnamide,dapsone, certains sulfamides, aminogluthétimide, caféine, nitrazépam, par exemple).

Le lupus érythémateux induit par l'hydralazine ou la procaïnamide se ren-contre préférentiellement chez les acétylateurs lents, encore que d'autres facteursde prédisposition (typage HLA-DR4 par exemple) soient connus. Enfin, le phénotyped'acétylation détermine également le métabolisme des amines aromatiques cancéri-gènes ; ainsi le cancer de la vessie provoqué par les amines est plus fréquent chezles acétylateurs lents exposés. D'autres pathologies associées au polymorphismed'acétylation sont également suspectées.

Le polymorphisme d'oxydation. L'oxydation est impliquée dans la métabolisationd'un grand nombre de médicaments. Ils suivent la voie des mono-oxygénases hépa-tiques sous la dépendance d'isoenzymes des cytochromes P450. Ce polymorphismea primitivement été mis en évidence avec la débrisoquine, une molécule antihyper-tensive. Les fortes variations de sa posologie nécessaire pour contrôler l'hyperten-sion a conduit à la mise en évidence d'un déficit en débrisoquine 4-hydroxylase chezcertains patients. C'est le cytochrome P450 II D6 qui est responsable de ce déficitqui concerne 5-10% de la population de race blanche mais varie selon les ethnies ;il se transmet sur le mode autosomique dominant. Pour dépister les métabolisateurslents, un test dit à la débrisoquine s'est diffusé. Après administration d'une dose testde 10 mg, la molécule mère et son métabolite sont dosés dans les urines recueilliespendant 8 heures. On calcule alors un quotient métabolique qui est compris entre0,01 et 10 chez les métaboliseurs rapides mais entre 20 et 200 pour les métaboli-seurs lents. Une vingtaine de médicaments sont métabolisés par le cytochrome

0 2 4 6 8 10 12

Concentration plasmatique de l’isoniazide µg/ml

101

P450 II D6 ; en particulier ce polymorphisme est observé pour les bêta-bloquants,les antiarythmiques, les neuroleptiques, la plupart des antidépresseurs tricycliqueset les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine. Ce test a servi dans de nombreu-ses études visant à rechercher une susceptibilité particulière à des médicaments oudes toxiques pouvant servir de support à l'apparition d'effets indésirables ou de cer-taines pathologies d'étiologie mal connues. Différents autres tests se sont dévelop-pés, tests au dextrométhorphan, à la sparteïne, à la caféine pour explorer cettemême voie métabolique. Mais il existe également d'autres polymorphismes d'oxyda-tion indépendants de la voie suivie par la débrisoquine.

Les butyrylcholinestérases atypiques. Certains sujets (1 % de la population eu-ropéenne) présentent une curarisation prolongée après administration desuccinylcholine. Chez ces personnes l'hydrolyse de la succinylcholine par lespseudo-cholinestérases plasmatiques et hépatiques se fait très lentement, l'affinitépour le substrat étant très diminuée par rapport à des sujets normaux. Les sujetshypersensibles sont homozygotes pour le gène anormal, la fréquence étant évaluéeà 1/2 500. Il existe un moyen, le test à la dibucaïne, pour dépister les patientsporteurs. Cet anesthésique local inhibe in vitro les pseudocholinestérases normales,alors qu'il n'a que peu d'effet sur les enzymes atypiques. Il est défini un DibucaïneNumber (DN) qui est de l'ordre de 80 (correspondant à 80% d'inhibition) chez lessujets sains, mais seulement de 20 chez les sujets porteurs de l'anomalie. Lesbutyrylcholinestérases sont également impliquées dans l'inactivation d'autresmédicaments et drogues sans que les conséquences cliniques d'un déficit soienttrès claires. En revanche, il existe des sujets qui hydrolysent la succinylcholine plusrapidement que les personnes normales et qui, de ce fait sont résistantes à cettesubstance. Beaucoup plus rare que l'hypersensibilité, cette anomalie porte le nomde Cynthiana, du nom de la ville Américaine où furent caractérisés les premiers cas.

L'hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT). Chez les pa-tients souffrant d'un déficit en hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase(maladie de Lesch-Nyhan), les analogues des bases puriques (6-mercaptopurine :Purinéthol®), azathioprine : Imurel®) utilisés comme anticancéreux ou immuno-suppresseurs ne sont pas métabolisés. Ces molécules étant en fait des prodroguesdevant être transformées en nucléotides pour être actives, l'absence de métabolisa-tion les rend inefficaces chez ces malades.

L'uridine diphosphate glucuronosyl transférase. La maladie de Gilbert (5 % de lapopulation Française) comme la maladie de Crigler-Najjar sont liées à un déficit del'uridine diphosphate glucuronosyl transférase. Ce défaut du mécanisme de la glucu-roconjugaison induit une hyperbilirubinémie mais provoque également une sensibili-té particulière à des médicaments qui suivent cette voie de métabolisation (paracé-tamol, salicylés, hydrate de chloral, menthol, morphines, oxazépam, corticostéroïdespar exemple).

Les enzymes de S- et 0-méthylation. Des déficits des thiopurines méthyltransféra-ses et thiol méthyltransférases, enzymes respectivement impliquées dans le métabo-lisme de la 6-mercaptopurine et de l'azathioprine et dans la S-méthylation du capto-pril (Lopril®) et de la D-pénicillamine (Trolovol®), ont été rapportés. Il existe unecorrélation entre l'activité de la thiopurine méthyltransférase érythrocytaire et laconcentration en 6-thioguanine. Le niveau d'activité de la catéchol-O-méthyl transfé-rase (COMT) est également contrôlé par le polymorphisme génétique. Où cette acti-

102

vité est impliquée dans le métabolisme de la l-dopa et de l'α-méthyldopa. Des inhibi-teurs de la COMT sont à l'étude dans le traitement de la maladie de Parkinson.

Les glutathion-S-transférases (GST). Les GST représentent une famille d'enzy-mes catalysant la conjugaison entre le glutathion réduit et une variété de moléculesélectrophiles, y compris des carcinogènes. Elles sont fortement exprimées chezl'homme dans les hépatocytes. Quatre isoformes sont décrites chez l'homme, l'ex-pression des GST µ et θ étant soumises à un polymorphisme génétique. Un déficiten GST µ semble lié à une fréquence accrue de cancers. La sensibilité àl’hépatotoxicité de la tacrine (Cognex®) des patients souffrant de la maladie d'Alz-heimer pourrait être liée à l'absence d'expression de GST empêchant la détoxifica-tion de métabolites réactifs. Ce métabolisme interroge l'activité du cytochrome P4501A2 qui peut être exploré, là encore, par un test à la caféine.

Alcool et aldéhyde déshydrogénases. L'alcool déshydrogénase (ADH) représentela principale voie oxydative du métabolisme de l'éthanol ; elle catalyse la réactionréversible des alcools primaire et secondaire en aldéhyde et cétone. Elle est égale-ment impliquée dans l'interconversion rétinol-rétinal, le métabolisme des stéroïdes etdes acides biliaires mais aussi des composés digitaliques. Trois grandes classesd'ADH sont connues ainsi qu'une forme atypique retrouvée chez seulement 5 à 10 %des Anglais mais 85 % des Chinois et des Japonais. Les différences entre les for-mes polymorphiques de l'ADH peuvent contribuer à expliquer les variations interin-dividuelles de vitesse d'élimination de l'alcool. La compétition entre l'alcool et lesglycosides cardiaques pour l'ADH peut augmenter notablement leurs concentrations.Les formes d'ADH à forte activité catalytique produisent de plus fortes concentra-tions sanguines d'acétaldéhyde à l'origine des symptômes d'intolérance à l'alcool.Mais un lien entre alcoolisme et génotype des isoenzymes d'ADH n'a pu être mis enévidence. La détoxification de l'acétaldéhyde est sous la dépendance de l'aldéhydedéshydrogénase (ALDH). Au moins quatre isoenzymes sont décrites. Un polymor-phisme génétique a été mis en évidence pour l'isoenzyme mitochondriale hépatiqueALDH2. 50% des Chinois, des Japonais, des Indiens Sud Américains et des popula-tions d'origine mongole présentent un déficit d'ALDH2 alors qu'il est totalement ab-sent des populations de race blanche et noire. Il existe une corrélation positive entredéficit en ALDH2, taux sanguin d'acétaldéhyde et hypersensibilité à l'alcool. Unefaible incidence de ce déficit est retrouvée chez les alcooliques. Plusieurs enzymesde cette famille sont inhibées par le disulfiram (Espéral®) ou ses métabolites, expli-quant son effet antabuse.

B. Variations d'ordre pharmacodynamique

1 - Au niveau d'une protéine

Un déficit ou une hyper-production enzymatique, une modification de la struc-ture d'une protéine peuvent être responsables de l'apparition d'effets médicamen-teux inconnus dans la population normale ou au contraire de l'absence de l'actionhabituellement observée.

La glucose-6-phosphate-déshydrogénase (G6PD). La G6PD représente la prin-cipale voie de production du NADPH du globule rouge, cofacteur indispensable aucycle du glutathion. Le déficit du G6PD est une maladie génétique héréditaire liéeau sexe car le gène qui code cette enzyme se trouve sur le chromosome X. En ab-

103

sence du G6PD et en présence d'un oxydant, l'hémoglobine est dénaturée et préci-pite sous la forme de corps de Heinz. Les hématies fragilisées sont exposées au

risque de crise hémolytique. Les deux principaux variants (G6PDA- et G6PDA+) af-fectent les Noirs Américains, les populations Méditerranéennes et les africains oùl'hémolyse est la plus sévère. Il est à noter que l'activité de la G6PD est toujoursfaible chez le nouveau-né, le rendant sensible au risque hémolytique. Ce déficit nes'exprime qu'en présence d'un xéno biotique oxydant qui peut être un aliment (fève)ou un médicament. La transmission est liée au sexe.

Les porteurs hétérozygotes sont plus résistants à l'infection par Plasmodium falcipa-rum, ce qui expliquerait la conservation du gène dans la population.

De nombreux médicaments provoquent des accidents hémolytiques en particulierparmi les antipaludéens, les antalgiques et les anti-infectieux (Tableau).

Tableau IX.II: Quelques médicaments pouvant déclencher une hémolyse chez unsujet atteint de déficit érythrocytaire en G6PD

Médicaments qui provoquent une anémie hémolytique cliniquement significativechez les sujets avec déficit en G6PD

Antimalariques :PamaquinePrimaquine, mepacrine

Analgésiques :Acide acetylsalicylique, phenacétineAcetanilide, aminophenazone

Nitofuranes :nitrofurantoinenitrofurasone

Sulfones:diaminodimetylsulfonethiazolsulfone

Sulfamides:sulfacetamide,

Autres:bleu de méthylène

104

sulfamotoxazolesulfanilamide, sulfapiridine

acide ascorbiquephenylhydrazineprobénécide

Par ailleurs, dans certaines hémoglobinopathies, l'hémoglobine est également ins-table, facilement dénaturée en corps de Heinz et associée à des crises hémolytiquesinduites par des médicaments.

La methémoglobinémie. Plusieurs modifications structurelles de l'hémoglobine oude la methémoglobine réductase peuvent être responsables de la methémoglobiné-mie congénitale. Chez les patients atteints, les substances connues pour être à l'ori-gine de la formation de methémoglobine doivent être evitées (oxydants directs : ni-trates, nitrites, chlorates, quinines ou indirects : aniline...) ainsi que tous les médi-caments contre-indiqués dans le déficit en G6PD.

La delta aminolévulinique synthétase (ALA-synthétase). Les porphyries sont ca-ractérisées par une anomalie de la régulation de la synthèse de l'hème due à undéficit enzymatique. Ce déficit entraîne une dérégulation de l'ALA synthétase etconduit à l'accumulation de grandes quantités de précurseurs de l'hème. Selon lesite primaire d'expression de l'anomalie génétique, différents précurseurs vont s'ac-cumuler correspondant à des formes différentes de la maladie. Le lien entre l'accu-mulation de ces précurseurs et les symptômes de la maladie est encore mal appré-hendé. Les précurseurs sont éliminés dans les urines où ils sont transformés enporphyrines. Ces maladies se transmettent selon le mode autosomique dominant.Chez les malades porteurs de cette anomalie, des crises, parfois mortelles, sont dé-clenchées par les médicaments inducteurs enzymatiques qui, en augmentant encorel'activité de l'ALA-synthétase, majorent les conséquences de sa dysrégulation. Parmiles principaux, figurent les barbituriques, la phénytoïne, l'alcool mais aussi la chlo-roquine, les sulfamides, l'amidopyrine, la griséofulvine, les oestrogènes, liste nonlimitative. Les malades porteurs de cette affection doivent être précisément informésdes médicaments et autres substances qui leur sont contre-indiqués.

Certains produits particulièrement puissants, comme par exemple un fongicidel'hexachlorobenzène, peuvent déclencher des porphyries, d'origine toxique, mêmechez des personnes non porteuses d'anomalies héréditaires.

Tableau IX.III: fréquences zygotiques du HbS, HbC, Alpha-3.7 Thal et G6PDA-

au Burkina FasoGroupe Ethnique Fréquences genotypiques

HbS HbC Alpha-3.7 Thal G6PDA-Mossi (M) 0.024 (8/334) 0.117 (39/334) 0.227 (25/110) 0.195 (51/262)Rimaibé (R) 0.030 (7/236) 0.127 (30/236) 0.134 (15/112) 0.185 (25/135)M+R 0.026 (15/570) 0.121 (69/570) 0.180 (40/222) 0.191 (76/397)Fulani (F) 0.022 (3/136) 0.059 (8/136) 0.103 (12/116) 0.069 (7/101)

2 - Au niveau d'un récepteur

105

Des modifications de l'affinité d'un récepteur peuvent également expliquerune variabilité de l'action de certaines molécules et en particulier rendre compte dela résistance à un médicament.

La résistance à la warfarine. Chez quelques rares malades l'administration, mêmeà forte dose, de warfarine ne s'accompagne pas de modifications du taux de pro-thrombine. Les anticoagulants coumariniques inhibent la coagulation en bloquant lasynthèse hépatique vitamine K dépendante de quatre protéines impliquées dans leprocessus (facteurs II, VII, IX et X). Ils bloquent le cycle de régénération de la vita-mine K. L'exploration des patients résistants a montré l'absence de modificationspharmacocinétiques de la warfarine. Il s'agirait en fait d'une modification génétiquedu récepteur hépatique.

La résistance aux hormones stéroïdes. La résistance se manifeste à la fois pourles hormones endogènes et exogènes. Différents syndromes de résistance aux an-drogènes sont connus. Ils sont liés au chromosome X et correspondent à une modi-fication de récepteurs intracytoplasmiques. Certains types de résistance à la vita-mine D sont également reliés à un dysfonctionnement du récepteur tissulaire.

Autres syndromes. Les patients souffrant de mucoviscidose présentent des répon-ses anormales aux molécules à propriété α-adrénergique, β-adrénergique et choli-nergique. La trisomie 21 s'accompagne d'une hypersensibilité à l'atropine et aux β-adrénergiques. La dysautonomie familiale est associée à une hypersensibilité à lanoradrénaline. L'insensibilité à l'amertume de la phénylthiourée ou à l'odeur de cya-nure sont dues à une anomalie héréditaire des récepteurs sensoriels correspon-dants.

3 - Variations de mécanisme mal déterminé

L'hypertension oculaire aux corticoïdes. L'administration de collyre aux corticoï-des provoque dans 5% de la population un glaucome aigu par augmentation de lapression intra-oculaire. Cette réponse, dont l'éthiopathogénie n'est pas connue, setransmet selon le mode autosomique récessif.

L'hyperthermie maligne déclenchée par une anesthésie générale. L'incidenceen serait de 1 pour 15 000 anesthésies chez l'enfant et de 1 pour 50 000 à 100 000chez l'adulte. Le syndrome comprend une très forte hyperthermie, qui peut atteindre43°, une tachycardie, des arythmies et une rigidité musculaire. L'évolution est le plussouvent mortelle. Le caractère familial est établi et cette susceptibilité particulièrepourrait être liée à une augmentation idiopathique du calcium sarcoplasmique.L'anomalie peut être détectée de façon préventive sur une biopsie musculaire, lemuscle des personnes concernées présentant une réponse contractile anormalequand il est exposé à la caféine ou à l'halothane.

L'anémie aplasique au chloramphénicol. En dehors de l'aplasie réversible dose-dépendante, dans quelques rares cas, le chloramphénicol peut déclencher une apla-sie irréversible dose-indépendante chez des sujets génétiquement prédisposés.

Nous venons de passer en revue les principaux facteurs de variation de l'acti-vité des médicaments. On en retiendra que ces connaissances méritent d'être hié-rarchisées : certaines relèvent surtout d'une recherche fondamentale tandis qued'autres présentent une pertinence clinique. Le monitoring médicamenteux comme

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les différents tests de phénotypages disponsibles représentent une aide spécialiséeà la thérapeutique. Ces notions s'intègrent au développement du médicament ; lesessais cliniques de phase I et II s'efforcent de maîtriser ces facteurs de variation.

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