1

GENETIKA MIKROORGANIZAMA Mikroorganizmi su dali važan doprinos genetici. Mi u svetu živimo zajedno sa bezbrojnim mikroorganizmima. Neki kao Mycobacterium tuberculosis, su štetni; drugi kao bekterije koje mi koristimo da napravimo jogurt, ili kvasci koje koristimo prilikom pravljenja hleba, su korisni. Mikroorganizmi igraju važnu ulogu u zemaljskim ekosistemima. Oni vrše eroziju stena, sakupljaju energiju iz materijala iz njihove okoline, fiksiraju atmosferski azot u jedinjenja koja drugi organizmi mogu koristiti, razlaži tela organizama koji su umrli. Ukoliko mikroorganizmi nebi vršili ove funkcije, život kakav mi znamo nebi bio moguć. Mikroorganizmi omogućavaju da prežive veliki vešećelijski organizmima kao što smo mi. Genetičari počinju da izučavaju mikroorganizme sredinom dvadesetog veka, godinama pošto su Mendelovi principi i hromozomska teorija nasleđivanja bili čvrsto prihvaćeni. Prvim mikrobijalnim genetičarima, je izgledalo da ovi sićušni organizmi mogu omogućiti proširenje genetičkih analiza do dubljeg biohenijskog nivoa, do molekula koji grade gene i hromozome. Kao što ćemo videti, taj uzbuđujuća mogućnost je realizovana. Genetička analiza mikroorganizama je omogućila istraživačima da ispitaju hemijsku prirodu gena i njihovih proizvoda. Svemu onome što se sada naziva molekularna biologija udareni su temelji prilikom istraživanja mikroorganizama. Za eksperimentatora, mikroorganizmi imaju nekoliko prednosti u poređenju sa stvorenjima kao što su kukuruz ili Drosophila. Prvo, oni su mali, razmnožavaju se brzo i formiraju velike populacije u roku od samo nekoliko dana. Jedan eksperimentator može da uzgaji 1010 bakterija u samo jednoj epruveti za uzgoj; 1010 Drosophyla, kao kontrast, bi zahtevalo značajno više laboratorijskog prostora. Drugo, mikroorganizmi mogu biti gajeni na definisanom medijumu za kultivisanje. Zato što komponente medijuma za kulturu mogu biti menjane po želji, jedan istraživač može identifikovati hemijske potrebe organizma i ispitivati kako on obrađuje ove hamikalije u toku njegovog metabolizma. Lekovi kao što su antibiotici mogu takođe biti dodati medijumu da ubija mikroorganizme selektivno. Ovaj tip tretmana dozvoljava istraživaču da identifikuje rezistentne i senzitivne sojeve mikroorganizama - na primer, da utvrdi da li je M. tuberculosis kultivisan od jednog pacijenta rezistentan na određeni antibiotik. Treće, mikroorganizmi, imaju relativno jednostavnu strukturu i fiziologiju. Oni su znači idealni za studiranje fundamentalnih bioloških procesa. Na kraju, genetičku varijabilnost je lako detektovati među mikroorganizmima. Ako mi ispitujemo bakterije, gljive, viruse, mi skoro uvek utvrđujemo da oni manifestuju različite fenotipove i da ove razlike su nasledne. Na primer, neki sojevi bakterijskih vrsta mogu rasti na biohemijski definisan medijum koji sadrži šećer laktozu, dok drugi sojevi ne mogu. Sojevi koji nisu u stanju da rastu na ovaj tip medijuma su mutanti u odnosu na metabolizam laktoze. Mogućnost da se dobiju mutirani sojevi mikroorganizama je omogućila genetičarima da izvrše disekciju kompleksnih fenomena kao što su energetska mobilizacija, proteinska sinteza i ćelijska deoba na molekularnom nivou. Napredak u oblasti molekularne biologije za vreme poslednjih nekoliko dekada je proizveo obilje informacija u vezi genoma mnogih mikroorganizama. Danas, mi znamo kompletne nukleotidne sekvence genoma velikog broja virusa, bakterija, protozoa i gljiva. Ove sekvence su obezbedile detaljne informacije u vezi genetičke kontrole metabolizma kod različitih mikroorganizama i posebno u vezi njihovih evolucionih odnosa.

2

U ovom poglavlju mi ćemo se koncentrovati na nekoliko mikroorganizama koji su igrali glavnu ulogu u genetičkim analizama. Ovi mikroorganizmi uključuju bakteriju Escherichia coli, viruse koji je inficiraju, kao i dve gljive, Saccharomyces cerevisiae (pekarski kvasac) i Neurospora crassa (hlebna buđ svetlo roze boje). E. coli je prokariot; S. cerevisiae i N. crassa su eukarioti. Mi ćemo početi naše izučavanje sa najjednostavnijim mikroorganizmima – virusima koji inficiraju bekterije kao što je E. coli.

GENETIKA VIRUSA

Virusi se mogu reprodukovati samo u živim ćelijama koje su inficirali. Bakteriofazi su virusi koji inficiraju bakterije. Nekoliko važnih gentičkih koncepata je bilo otkriveno kroz istaživanja bakteriofaga.

Virusi se kolebaju oko linije između živog i neživog. Razmotrimo, na primer, jedan virus koji izaziva gubitak boje na lišću duvana, odnosno jedno stanje koje se naziva mozaična bolest duvana. Virus mozaične bolesti duvana može biti kristalizovan i biti čuvan na polici godinama. U ovom stanju on ne pokazuje ni jednu od osobina koja je normalno vezana sa živim sistemima; on se ne replicira; on ne raste, niti se razvija; on ne iskorištava energije; on ne odgovara na stimuluse iz okoline. Ipak, ako se jedna tečna suspenzija koja sadrži virus mozaičke bolesti duvana stavi na list duvana, virusi u suspenziji će inficirati ćelije, reprodukovaće se, iskorištavaće energiju koju obezbeđuje biljna ćelija i odgovaraće na signale iz okoline. Jasno, oni pokazuju osobine živih sistema.

Zaista, jednostavnost virusa je ono što njih čini idealnim istraživačkim alatom za genetičke analize. Pitanja na koja je bilo teško da se odgovori koristeći komplikovanije eukariotske sisteme često su dobila odgovor primenom virusa. U ovom poglavlju mi ćemo se fokusirati na viruse koji inficiraju bakterije: opsudićemo organizaciju njihovih genoma i metode koje su genetičari razvili da ih analiziraju.

Bakteriofazi T4 i lambda

Virusi koji inficiraju bakterije se nazivaju bakteriofazi (od grčke reči ’’ jede bakterije’’) ili skraćeno fazi. Među mnogim bakteriofazima koji su identifikovani, dva su igrali posebno važnu ulogu u razjašnjavanju genetičkih koncepata. Oba ova virusa inficiraju bakterije Escherichia coli koje žšve u debelom crevu ljudi i životinja. Bakteriofazi mogu biti kategorizovani u dva tipa – virulentni i umereni – u zavisnoti od njihovog životnog stila u inficiranim ćelijama. Bakteriofazi T4 (fag T4) je virulentni fag; on koristi metaboličku mašineriju ćelije domaćina da proizvede viruse potomke i ubije domaćina u tom procesu. Bakteriofag lambda (λ) koji je umereni fag, je još jedan kolifag (bakteriofag koji inficira E. coli); ipak, ovaj fag može da ubije ćeliju domaćina, kao što to radi fag T4 ili može da uđe u specijalnu zajednicu sa domaćinom i replicira svoj genom zajedno sa ćelijskim genomom domaćina za vreme svake ćelijske duplikacije. Rezultati

3

istraživanja koja su vršena na bakteriofazima T4 i lambda su uspostavili genetičke obrazce koji su relevantni da se razumeju drugi tipovi virusa, kao što su ljudski virus imunodeficijencije HIV.

Bakteriofag T4 Bakteriofag T4 je jedan veliki virus koji skladišti svoju genetičku informaciju u jednom

dvolančanom molekulu DNK koji je upakovan u proteinakoj glavi (slika 8-1). Virusi su sastavljeni skoro kompletno od proteina i DNK – približno po pola od svake od ove dve komponente (slika 8-2). Hromozom bakteriofaga T4 je dugačak približno 169800 baznih parova i sadrži približno 150 okarakterisanih gena i približno još toliko neokarakterisanih sekvenci za koje se smatra da su geni. Rep ovog virusa sadrži nekoliko važnih komponenti. Njegova centralna šuplja srž sadrži kanal kroz koji DNK faga je ubrizgana u bakteriju. Kora repa funkcioniše kao jedan mali mišić koji se kontrahuje i gura srž repa kroz bakterijski ćelijski zid. Šest repnih vlakana su korišteni da lociraju receptore na ćeliji domaćina, a onda repni šiljci na baznoj ploči se vezuju čvrsto za ove raceptore. Sve ove komponente moraju da funkcionišu korektno da bi fag inficirao ćeliju E. coli uspešno.

Bakteriofag T4 je litički fag; kada on inficira bakteriju, on se replicira i ubija domaćina proizvodeći oko 300 virusa potomaka po inficiranoj ćeliji (slika 8-3). Pošto DNK bakteriofaga je ubačena u bakteriju koja predstavlja domćina, ona brzo (u roku od 2 minuta) usmerava sintezu proteina da prekrati transkripciju, translaciju i replikaciju bakterijskih gena, dozvoljavajući virusu da preuzme kontrolu metaboličke mašinerije domaćina. Neki od gena faga kodiraju nukleaze koje degradiraju DNK domaćina. Drugi proteini faga iniciraju replikaciju DNK faga. Nešto kasnije, dolazi do ekspresije (izražajnosti) gena koji kodiraju strukturne komponente virusa. Kasnije, montaža potomaka faga počinje; infektivni potomci faga počinju da se nakupljaju u ćeliji domaćina na oko 17 minuta posle infekcije. Na oko 25 minuta posle infekcije jedan enzim, koji je kodiran od strane bakteriofaga, koji se naziva lizozim, degradira bakterijski ćelijski zid i razara bakteriju domaćina, oslobađajući oko 300 faga potomaka po inficiranoj ćeliji.

Kao što je već napomenuto, T4 kodira nukleaze koje degradiraju DNK domaćina. Degradirani proizvodi su zatim korišteni u sintezi DNK faga. Ali kako ovi enzimi degradiraju DNK domaćina, a da ne unište DNK virusa? Odgovor je da T4 DNK sadrži neobičnu bazu 5-hidroksimetilcitozin (HMC; citozin sa CH2OH grupom vezanom za jedan od atoma u citozinskom molekulu) umesto citozina. Pored tog, derivati glukoznih molekula su vezani za HMC. Ove modifikacije štite T4 DNK od degradacije nukleazama koje se koriste da degradiraju DNK ćelije domaćina.

Bakteriofag lambda

Bakteriofazi lambda (λ) je još jedan kolifag koji je dao veliki doprinos genetici. Lambda je manji od T4; ipak životni ciklus mu je kompleksniji. Lambda genom sadrži oko 50 gena u dvolančanom molekulu DNK koji je dugačak 48502 bazna para. Ovaj linearni molekul DNK je

4

pakovan u glavu λ faga (slika 8-4). Uskoro pošto je injektovan u ćeliju E. coli, λ DNK molekul je konvertovan u cirkularnu formu, koja učestvuje u svim kasnijim intracelularnim događajima.

Unutar ćelije, cirkularni λ hromozom može ući u bilo koju od dve putanje (slika 8-5). On može ući u jedan litički ciklus, za vreme kojeg on reprodukuje i kodira enzime koji vrše lizu ćelije domaćina, baš kao što to radi fag T4. Ili, on može da uđe u lizogenu putanju, tokom koje je insertovan u hromozom bakterije domaćina i da se zatim replicira zajedno sa tim hromozomom. U ovom integrisanom stanju, λ hromozom se naziva profag. Da bi se ovo stanje nastavilo, geni profaga koji kodiraju proizvod uključen u litičku putanju – na primer enzimi koji su uključeni u replikaciju DNK faga, strukturni proteini koji su potrebni za morfogenezu faga i lizozimi koji katalizuju lizu ćelije – ne smeju imati ekspresiju.

Integracija λ hromozoma dešava se rekombinacionim događajem na specifičnom mestu izmešu cirkularne λ DNK i cirkularnog hromozoma E. coli (slika 8-6). Ova rekombinacija se dešava na specifičnim mestima vezivanja – attP na λ hromozomu i attB na bakterijskom hromozomu – i podstaknuta je λ integrazom, koja je proizvod λ int gena. Ona kovalentno insertuje λ DNK u hromozom ćelije domaćina. Ova mesto-spacifična rekombinacija događa se u centralnom regionu mesta vezivanja gde oba attP i attB imaju iste sekvence od 15 nukleotidnih parova:

CGTTTTTTATAGTAA GCAAAAAATATGATT

Sa izuzetkom ovih sržnih sekvenci, attP i attB imaju baš različite sekvence. Zato što se rekombinacija događa u okviru ovih sržnih sekvenci za vreme integracije. Rezultujuća attB/P i attP/B mesta koja se nalaze sa krajevima integrisanog profaga takođe sa oba sadrže sekvencu od 15 nukleotidnih parova. Ove strukture su važne zato što one podržavaju eksciziju (izlazak) profaga sa vrlo sličnim rekombinacionim događajem koji je mesto specifičan. Približno jednom u svakih 105 ćelijskih deoba, λ profag spontano izlazi iz hromozoma

domaćina i ulazi u litičku putanju. Ovaj fenomen je razlog zbog čega se kaže da je profag u

lizogenom stanju, da je sposoban da izazove lizu, mada ne tako frekventno. Ekscizija λ profaga

takođe može biti indukovana, kao na primer zračenjem sa ultravioletnim svetlom. Proces

ekscizije je obično precizan, sa sajt-specifičnom rekombinacijom između stržnih sekvenci attB/P

i attP/B. On stvara jedan autonomni λ hromozom koji ima originalni preintegracioni oblik.

Ekscizija zahteva λ integrazu i proizvod λ xis gena - λ ekscisazu. Ova dva enzima podstiču jedan

mesto-specifični rekombinacioni događaj koji je praktično suprotan od integracionog događaja.

Ponekada, ekscizija se događa sa anomalijom, i bakterijska DNK izlazi sa DNK faga. Kada se

ovo desi, takav vitus može izvršiti transfer bakterijskih gena iz jedne bakterije domaćina u drugu.

Istraživanja na fagu λ su mnogo doprinela našem razumevanju genetičkih fenomena.

Otkriće λ profaga (za koje je Andre Lwoff imao udeo u Nobelovoj nagradi 1965 godine) stvorilo

je obrazac za provirusno stanje imunodeficijentnog virusa (HIV) i raznih RNK tumorskih virusa.

5

Mapiranje gena kod bakteriofaga

Geni hromozoma bakteriofaga mogu biti mapirani koristeći rekombinacione frekvencije,

baš kao kod eukariota. Ipak, zato što virusi imaju jedan hromozom koji ne prolazi kroz mejozu,

procedura mapiranja je nešto drugačija od one koja se koristi za organizam kao što je

Drosophila. Ukrštanja se vrše istovremenim inficiranjem bakterije domaćina sa dva različita tipa

faga i onda skriningom potomaka faga radi pretrage za rekombinantnim genotipovima. Distance

na mapi u centimorganima su onda izračunavaju kao srednji broj krosingovera koji se dešavaju

između genetičkih markera. Za mala rastojanja, distance na mapi su približno jednake procentu

rekombinantnih hromozoma među potomcima.

Postoji mnogo različitih vrsta mutantnih alela kod faga. Temperaturno senzitivne

mutacije (ts) su najkorisnije. Divlji tip kolifaga može da raste na temperaturama u opsegu od oko

25˚C do preko 42 ˚C, dok temperaturno senzitivni mutanti mogu da rastu na 25˚C, ali ne na

42˚C. Dakle, ts mutant može biti razlikovan od divljeg tipa faga kultivacijom faga na niskim i

visokim temeperaturama. Sada možemo izučiti neke druge tipove mutantnih faga.

Ako razmažete ćelije E. coli po površini polutvrdog hranjivog medijuma (koji sadrži

agar) u sterilnoj Petrijevoj šolji i inkubirate posudu na 37˚C preko noći, ćelije će rasti, deliti se i

proizvešće jednobrazan sloj bakterija na površini medijuma. Ako dodate jedan T4 fag na

površinski sloj bakterija, on će inficirati jednu baktriju, izvršiće njenu lizu i osloboditi oko 300

potomaka oko 25 minuta kasnije. Svaki od ovih 300 potomaka virusa će inficirati bakterije i

ponoviti litički ciklus. Pošto se ovaj ciklus ponovi mnogo puta, sve bakterije u blizini originalne

partikule faga biće lizirane, čime će se stvoriti jedna bistra (providnija) tačka, ili rupa, u sloju

bakterija. Ova bistra zona, nastala liziranjem bakterija, naziva se plaka. U slučaja bakteriofaga

T4, ili njegovog bliskog rođaka T2, svaka plaka koja se stvori preko noći će sadržati približno

108 virusa.

Neki od prvih mutantnih faga koji su bili izučavani pokazivao je promenjenu morfologiju

plaka. Rapid lizis (rapid lysis) (r) mutanti faga T4 koji su najviše izučavani među fazima koji

predstavljaju mutante sa mutacijama koja menjaju morfologiju plaka. Oni proizvode plake sa

oštrim ivicama, koje se razlikuju od malih plaka sa zamućenim marginama koje su proizvedena

sa divljim tipom T4 (slika 8-7). Kada se jedan T4 fag veže za jednu ćeliju E. coli koja je već

inficirana sa divljim tipom T4, to pokreće sintezu novog materijala ćelijskog zida i odlaže lizu za

2 sata. Ovaj fenomen koji se naziva inhibicija lize je odgovoran za stvaranje nejasnih ivica kod

plaka divljeg tipa. One sadrže smesu liziranih ćelija i ćelija kod kojih je nastupila inhibicija lize.

Inhibicija lize se ne dešava kod bakterija inficiranih sa r mutantima; dakle, ćelije inficiranje sa r

mutantima liziraju brzo, stvarajući plake sa oštrim, jasno definisanim ivicama.

Još jedan tip mutanata koji je korišten u ranim studijama promenio je sposobnost faga da

inficira razlišite sojeve domaćina. Takvi fazi se nazivaju host rejndž (host range) mutanti. Na

primer, ćelije E. coli soj B mogu biti inficirane sa svim bakteriofazima koji su T-parni (T2, T4 i

T6), Ipak E. coli soj B/2, jedan mutirani derivat E. coli B, je rezistentan na infekciju faga T2.

Ćelije E. coli B/2 imaju jednu mutaciju koja menja T2 receptor faga na bakterijskoj površini tako

da T2 fag nemože da se veže za njega. Ipak, mutantni soj T2, T2h, nosi jednu host rejndž

mutaciju (h), koja dozvoljava virusu da inficira E.coli B i Ecoli B/2. Ova promena rezistencije i

osetljivosti može se nastaviti sa bakterijskim mutacijama koje čine E. coli rezistentnom na oba

T2 i T2h, a može se nastaviti i sa virusnim mutacijama koje dozvoljavaju infekciju novih

6

rezistentnih sojeva. Slične host rejndž mutacije događaju se i kod drugih bakterijskih virusa koji

su bili izučavani.

T2 divlji tip i T2h mutanti mogu biti razlikovani tako što se zaseju na mešani sloj ćelija

E. coli B i E. coli B/2 (slika 8-8). Mutanti h proizvode bistre plake zato što oni inficiraju i vrše

lizu svih ćelija domaćina, bez obzira jesu li B ili B/2. Divlji tip virusa inficira samo B ćelije, ali

ne B/2 ćelije i zato proizvodi mutne plake. B/2 ćelije koje su rezistentne na fag nastavljaju da

rastu unutar plaka, izazivajući mutnoću.

Alfred Herši i Maks Delbruk nezavisno su istražili genetičku rekombinaciju kod

bakteriofaga 1946 godine. Ubrzo su prva ukrštanja između host rejndž i rapid lizis mutanata bila

izvršena od strane Heršija i Rakel Rotman. Ovi istraživači su simultano inficirali E. coli B ćelije

sa dva različita soja bakteriofaga T2 – jedan genotip h+r i drugi genotip hr+ (slika 8-9). Potomci

faga proizvedenih u ćelijama koje su inficirane sa dva virusa su onda zasijani na sloju koji sadrži

obe B i B/2 ćelije. Na ovaj mešani sloj, svaki od četiri moguća genotipa proizvodi plaku sa

prepoznatljivim fenotipom (slika 8-10). Parentalni fag proizvodi mutne plake sa oštrim ivicama

(h+r) ili bistre plake sa nejasnim ivicama (hr+). Rekombinantni potomci proizvodili su plake koje

su bile mutne sa nejasnim ivicama (h+r+) ili bistre sa oštrim ivicama (hr). Kada je veliki broj

potomaka bio analiziran, oko 2 % je imalo rekombinantne fenotipove. Na osnovu ovih rezultata,

rastojanje između f i h je bilo procenjeno da je 2 cM. Rezultati takođe ukazuju da rekombinacija

faga je recipročan proces, zato što su dva rekombinantna genotipa (h+r+ i hr) bili prisutni među

potomcima sa približno istom frekvencijom.

Jedna od glavnih prednosti u izučavanju rekombinacije kod bakteriofaga je da veliki broj

potomaka može biti relativno lako analiziran, dozvoljavjući istraživačima da otkriju i izučavaju

retke slučajeve.

Bakteriofag T4: linearni hromozom i cirkularna genetička mapa

Sve genetičke informacije o fagu T4 su smeštene u linearni molekul DNK (slika 8-2).

Dakle, za rekombinacionu mapu T4 se očakuje da bude linearna (u vidu niti sa dva kraja). Ipak,

rezultati ranih genetičkih ukrštanja pokazali su neke neočekivane, ali ponovljive, nedoslednosti.

Rezultati ukrštanja sa dva faktora (u dve tačke) pokazuju da mutacije h42, ac41 (akridin-

rezistentna mutacija 41) i r67 su vezane po redosledu h42 – ac41 – r67. Ali rezultati ukrštanja sa

tri faktora (u tri tačke) su kontradiktorni sa rezultatima dobijenim ukrštanjem sa dva faktora,

ukazujuči da je redosled ac41 – h42 – r67. Ova kontradiktornost može biti rešena praveći

cirkularnu (u vidu kruga) genetičku mapu faga T4 (slika 8-11). Sa cirkularnom mapom, h42, se

ucrtava na mapi između ac41 i r67 počinjući sa ac41 i krećući se u smeru kazaljke na satu. Ipak,

navedena genetička mapa i kretanje u smeru kazaljke na satu počinjući od h42 daje sekvencu h42

– ac41 – r67. Dakle, cirkularna genetička mapa razrešava navedeni paradoks. Ali kako može biti

genetička mapa cirkularna, ako znamo da je hromozom linearan?

Sredinom 1960-ih, Džordž Streisindžer je predložio je rešenje po kojem je hromozom T4

terminalno redundantan i cirkularno permutovan. U početku, genetičari i virusolozi su bili

skeptični ovom pretpostavkom. Međutim, za obe komponente ove hipoteze se uskoro pokazalo

da su tačne.

Terminalno redundantni molekuli DNK sadrže iste nukleotidne sekvence na oba kraja

jenog linearnog molekula, kao što je u sekvenci

7

AAGGCCTTGACTA..............TACGTAAGGCCTT. Ovaj lanac DNK je terminalno

redundantan; sekvenca AAGGCCTT je prisutna na oba kraja.

Cirkularno permutovane sekvence su dobijene prekidanjem jedne cirkularne strukture

koja sadrži jednu linearnu sekvencu (sa povezanim krajevima) slučajnih markera, tako da se

dobija jedna kolekcija linearnih struktura, kao što je pokazano na slici 8-12.

Krajevi jednog hromozoma T4 sadrže iste gene po istom redosledu; što znači da su

terminalno redundantni (abcdefg.............wxyzabc). Treba obratiti pažnju da terminalno

redundantne nukleotidne sekvence hromozoma bakteriofaga su skrćeno označene kao abc. Ipak,

krajevi svakog hromozoma su različiti; znači da jedan hromozom može imati sekvence

abcdef...........xyzabc, dok drugi može imat defghi...........xyzabcdef, a treći će imati sekvencu

ghijk...........xyzabcdefghi. Dakle, jedna populacija T4 hromozoma sastoji se od jednog kompleta

permutovanih molekula DNK, koji su takođe i teminalno redundantni. Ponekada segment d je u

okviru terminalno redundantnih krajeva molekula, a ponekada to je u sredini DNK molekula.

Kombinacija ove dve osobine – cirkularna permutacija i terminalna redundancija –

rezultira u cirkularnim genetičkim mapama od jedne populacije linearnih hromozoma. Ali kako

jedna populacija cirkularno permutovanih, terminalno redundantnih hromozoma faga potomaka

može biti generisana u jednoj ćeliji inficiranoj sa jednim T4 virusnom partikulom? Drugim

rečima, kako može jedan parentalni fag koji je redundantan za abc na svojim krajevima

proizvesti potomke koji su redundantni za: cde, def, efg itd.. Ključni odgovor je način kako se T4

DNK replicira (umnožava svojim kopiranjem) i pakuje u glave faga. Za vreme replikacije

molekula DNK faga T4, rekombinacija se dešava između terminalno redundantnih krajeva ovih

molekula i generiše dugačke molekule DNK koji se zovu konkatameri (slika 8-13). Svaki

konkatamer sadrži mnogo kopija faga T4 koji su međusobno vezani svojim krajevima.

Za vreme formiranja potomaka virusa, proteini glave faga T4 kondenzuju se oko ovih

konkatamerskih molekula DNK sve dok se glava ne napuni. Količina DNK koja je potrebna da

se glava napuni je malo veća od jednog kompleta gena faga T4, obično simbolizovanog

abc........xyz. Zato što još uvek ostalo prostora u glavi pošto se napuni jedan komplet gena, još

nekoliko dodatnih gena će biti uneto, što će rezultirati da glava faga sadrži sekvence

abc.........xyzabc. Glava je sada puna i DNK je prerezana. Ovaj navedeni virus je redundanatan za

gene a, b, c. Sledeća virusna partikula počinje dodavanje DNK počevši sa d i kompletan

hromozom će biti upakovan kada se dostigne c, a onda se dodaje redundantni region def. Sledeći

po redu virus počinje pakovanje od g i redundantan je za ghi segment, i tako dalje. Ovaj način

pakovanja DNK je nazvan hedful mehanizam (headful mechanism); on proizvodi T4 hromozome

koji su istovremeno terminalno redundantni i cirkularno permutovani (slika 8-14). Ipak, potomci

hromozoma su redundantni za različite gene. Fag T4 nije jedinstven za pakovanje DNK sa hedful

mehanizmom. Mnogi bakteriofazi, uključujuči T2, T6 i P1 koriste hedful mehanizam za

pakovanje DNK.

Cirkularno permutovan homozom faga T4 će dati cirkularnu genetičku mapu, čak i ako

fag sadrži linearni molekul DNK. Rastojanje na mapi je bazirano na srednjim rekmbinacionim

frekvencijama, koje su populacioni parametri. Mada dva blisko vezana gena mogu biti locirani

na suprotnim (terminalno redundantnim) krajevima jednog individualnog hromozoma, oni će biti

blizu jedan drugog u internom neredundantnom regionu većine hromozoma kod većine

potomaka T4 populacije.

8

GENETIKA BAKTERIJA

Genetička informacija kod većine bakterija je smeštena u jedan glavni hromozom koji nosi više

stotina gena i jedan promenjiv broj mini hromozoma koji se nazivaju plazmidi i epizomi.

Plazmidi su autonomno replicirajući, cirkularni molekuli DNK koji nose nose od tri gena do

nekoliko stotina gena. Neke bakterije pored glavnog hromozoma mogu sadržati čak i 11

različitih plazmida. Epizomi su slični plazmidima, ali epizomi se mogu replicirati autonomno ili

kao deo glavnog hromozoma – u jednom integrisanom stanju, kao naprimer λ profag.

Bakterije se reprodukuju bespolno prostom deobom, tako što svaka ćerka ćelija dobija

jednu kopiju hromozoma. One su monoploidne, ali multinukleoidne, što znači da ćelije sadrže

dve ili više kopija hromozoma. Hromozomi bakterija ne prolaze kroz mitotički i mejotički ciklus

kondenzacije koji se događa za vreme ćelijske deobe i gametogeneze kod eukariota. Znači,

rekombinacioni događaji – nezavisno kombinovanje i mejotički krosingover – koji se događaju

za vreme polne reprodukcije kod eukariota se ne događaju kod bakterija.

Uprkos navedenom, rekombinacija je bila važna u evoluciji bakterija, isto kao što je bila

važna u evoluciji eukariota. I zaista, procesi koji su slični polnoj reprodukciji – parapolni procesi

– događaju se kod bakterija. Mi ćemo uzeti razmotriti ove procese pošto prodiskutujemo neke od

tipova mutanata koji se koriste u bakterijskoj genetici i unidirekcionu (jednosmernu) prirodu

transfera između bakterija.

Mutantni geni kodbakterija

Bakterije će rasti u tečnom medijumu, često zahtevajući aeraciju, ili na površini

polutvrdog medijuma koji sadrži agar. Ako rastu na polutvrdom medijumu, svaka bakterija će se

deliti i rasti eksponencijalno, proizvodeći vidljivu kolonije na površini medijuma. Broj kolonija

koje se pojavljuju na posudi u kojima se gaje može se koristiti za procenu broja bakterija koje su

originalno bile prisutne u suspenziji koja je nanesena na posudu.

Svaka bakterijska vrsta proizvodi kolonije sa specifičnom bojom i morfologijom.

Serratia marcesens, na primer, proizvodi jedan crveni pigment što rezultira u prepoznatljivim

crvenim kolonijama (slika 8-15). Mutacije kod bakterija mogu da promene boju i morfologiju

kolonija. Isto tako, svaka mutacija koja uspori brzinu rasta bakterija će proizvesti male (petite)

kolonije. Neke mutacije menjaju morfologiju bakterija bez promena morfologije kolonija. Pored

ovih mutanata u odnosu na boju i morfologiju, drugi tipovi mutanata su bili korisni u genetičkim

istraživanjima bakterija.

Mutanti blokirani u njihovoj sposobnosti da koriste specifične energetske

izvore

Divlji tip E. coli može koristiti bilo koji šećer kao jedan izvor energije. Ipak, neki mutanti

ne mogu da rastu na mlečnom šećeru laktozi. One rastu dobro na drugim šećerima ali ne mogu

rasti na medijumu koji sadrži laktozu kao jedini izvor energije. Drugi mutanti nisu sposobni da

rastu na galaktozi, a opet, neki drugi ne mogu rasti na arabinozi. Standarna nomenklatura za opis

ovih tipova mutanata kod bakterija je upotreba tri slova za pisanje skraćenih naziva sa

9

prikladnim eksponentom. Za fenotipove, prvo slovo je veliko; za genotipove, sva tri slova su

mala i pisana italikom. Znači, divlji tip E. coli je fenotipski Lac+ (sposoban da koristi laktozu kao

energetski izvor) i genotipski lac+. Mutanti koji nisu u stanju da koriste laktozu kao izvor

energije su fenotipski Lac– i genotipski lac– (ili ponekada samo lac).

Mutanti koji nisu u stanju da sintetišu esencijalne metabolite

Divlji tip E. coli može da raste na medijumu koji sadrži kao energetski izvor samo neorganske soli (minimalni medijum). Ove ćelije mogu da sintetišu sve metabolite – aminokiseline, vitamine, purine, pirimidine itd. – koje njima trebaju od ovih substanci. Ovi divlji tipovi bakterija se nazivaju prototrofi. Kada se desi jedna mutacija na genu koji kodira neki enzim koji je potreban za sintezu nekog esencijalnog metabolita, bakterija koja nosi takvu mutaciju će imati novi zahtev za rast. Ona će rasti ako je taj metabolit dodat u medijum, a neće rasti u odsustvu tog metabolita. Takvi mutanti se nazivaju auksotrofi; oni zahtevaju dodatne hranjive materije za rast. Kao jedan primer, divlji tip E. coli može sintetisati triptofan de novo; ove ćelije su fenotipski Trp+ a genotipski trp+. Triptofanski auksotrofi su Trp– i trp–.

Mutanti rezistentni na lekove i antibiotike

Ćelije divljeg tipa E. coli mogu biti ubijene antibioticima kao što je ampicilin i tetraciklin. Fenotipski one su Amps i Tets. Mutantni aleli koji čine E. coli rezistentnim na ove antibiotike su označeni kao ampr i tetr. Bakterije koje sadrže ove mutantne alele mogu da rastu na medijumu koji sadrži antibiotike, bakterije divljeg tipa ne mogu. Dakle, antibiotici mogu biti korišteni za selekciju bakterija koje nose gene za rezistenciju. Geni koji daju rezistenciju funkcionišu kao dominantni markeri selekcije. Bakterije se dele brzo i proizvode velike populacije ćelija za genetička istraživanja. Medijumi koji koji se koriste za selekciju specifičnih bakterijskih genotipova (selektivni medijumi) se relativno lako pripremaju. Kao rezultat, bakterije su bile korištene za izučavanje retkih događaja kao što su mutacije u okviru gena i rekombinacija između blisko vezanih gena.

Unidirekcioni genski transfer kod bakterija

Rekombinacioni događaji koji se događaju kod bakterija uključuju transfer gena sa jedne

bakterije na drugu, a ne recipročnu razmenu gena koja se događa kod eukariota. Dakle, genski transfer je unidirekcioni (jednosmarni), a ne bidirekcioni (dvosmerni). Rekombinacioni događaji kod bakterija se obično dešavaju između jednog fragmenta hromozoma (sa donorske ćelije) i kompletnog hromozoma (u recipientskoj ćeliji), a ne između dva cela hromozoma kao to je slučaj kod eukariota. Sa retkim izuzecima, recipientske ćelije postaju parcijalni diploidi, koji sadrže jedan linearni komad donorskog hromozoma i jedan kompletan cirkularni recipientov hromozom. Kao rezultat, krosingover može da se desi u parovima i mora da insertuje jedan

10

segment donorskog hromozoma u recipientov hromozom. (slika 8-16 a). Ako jedan krosingover ili bilo koji neparan broj krosingovera) se desi, on će narušiti integritet recipientovog hromozoma, proizvodeći linearni molekul DNK koji nije vijabilan (nije sposoban da preživi) (slika 8-16b).

MEHANIZMI GENETIČKIH RAZMENA KOD BAKTERIJA

Tri različita parapolna procesa (u stručnoj literaturi ponekada se bakterijski parapolni proces naziva bakterijski polni proces) se događaju kod bakterija. Najočiglednija razlika između ovih tri procesa je mehanizam kojim se vrši transfer DNK iz jedne u drugu ćeliju (slika 8-17). Transformacija podrazumeva unos slobodnih molekula DNK, koje je oslobodila jedna bakterija (ćelija donor), od strane druge bakterije (ćelije recipijenta). Konjugacija podrazumeva direktan transfer DNK iz ćelije donora u ćeliju recipijenta. Transdukcija se dešava kada bakteriofag prenosi bakterijske gene iz ćelije donora u ćeliju recipijenta. Tri parapolna procesa genskog transfera – transformacija, konjugacija i transdukcija - kod bakterija mogu biti razlikovani pomoću dva jednostavna kriterijuma (slika 8-18). (1) Da li proces zahteva ćelijski kontakt? (2) Da li je proces senzitivan na dezoksiribonukleaze (DNaze), odnosno enzime koji degradiraju DNK? Ova dva kriterijuma mogu biti testirana eksperimentalno vrlo lako. Osetljivost na DNaze se lako određuje dodavanjem enzima u medijum u kojem rastu bakterije. Ako se genski transfer ne vrši dalje, onda proces koji obavlja ovaj transfer je transformacija. Proteinski omotač bakteriofaga, zidovi i membrane bakterijskih ćelija štite donorsku DNK od degradacije od strane DNaza za vreme transdukcije i konjugacije. Jedan eksperiment može determinisati da li je ćelijski kontakt potreban za bakterijski transfer gena. U ovom eksperimentu, bakterije sa raznim genotipovima su smeštene u različitim kracima cevi za kulturu koja ima oblik slova U. Ta dva kraka su odvojena staklenim filtrom koji ima pore dovoljno velike da dozvole DNK molekulima i virusima, ali ne i bakterijama, da prođu kroz njega. Ako se genski transfer događa između bakterija koje rastu u suprotnim kracima U cevi, proces ne može biti konjugacija, koja zahteva direktni kontakt između donorske i recipijentske ćelije. Ako se registrovani genski transfer dešava u prisustvu DNaze i u odsustvu ćelijskog kontakta, genski transfer je obavljen transdukcijom. Sva tri parapolna procesa se ne dogašaju kod svih bakterijskih vrsta; transdukcija je verovatno jedini proces koji se događa kod svih bakterija. Da li se transformacija ili konjugacija događaju ili ne događaju kod neke vrste, zavisi da li potrebni geni i metabolička mašinerija su uključeni kod te vrste. E. coli na primer, ne sadrži gene koji kodiraju proteine koji su potrebni da uzmu slobodnu DNK. Dakle, transformacija se ne događa kod E. coli koje rastu u prirodnim uslovima. Kod ćelija E. coli koje rastu u prirodnom staništu događaju se samo konjugacija i transdukcija. Ipak, naučnici su otkrili kako da transformišu ćelije E. coli u laboratoriji koristeći hemijske ili fizičke tretmane da se one učine permeabilnim (propustljivim) za DNK.

11

Transformacija

Frederik Grifit je otkrio transformaciju kod Streptococcus pneumoniae (pneumokokus)

1929. godine. S. pneumoniae, kao i svi drugi živi organizmi, pokazuje genetičku varijabilnost koja se odražava u postojanju različitih fenotipova (slika 8-20). Dve važne fenotipske karakteristike kod Grifitove demostracije transformacije su (1) prisustvo ili odsustvo polisaharidne (kompleksnog polimera šećera) kapsule koja okružuje bakterijske ćelije, (2) tip kapsule – specifična molekulska kompozicija polisaharida prisutnih u kapsuli. Kada raste na medijumu od krvnog agara u Petrijevim šoljama, pneumokokusi sa kapsulama formiraju velike, glatke kolonije (slika 8-21), koje su označene kao tip S. Pneumokokusi sa kapsulom su virulentni (patogeni), uzrokuju pneumoniju kod sisara kao što su miševi i ljudi. Virulentni tip S pneumokokusa mutira u nevirulentnu (nepatogenu) formu nez polisaharidne kapsule frekvencijom od oko jedan u 107 ćelija. Kada raste na medijumu od krvnog agara, takav avirulentni pneumokokus, bez kasule, stvara kolonije sa hrapavim ivicama (8-21), koje su obeležene sa slovom R. Polisaharidna kapsula je potrebna za patogenost zato što štiti bakterijske ćelije od destrukcije od strane belih krvnih ćelija. Kada je kapsula prisutna, ona može imati nekoliko različitih tipova (tip I, II, III itd.), u zavisnosti od specifičnog molekulskog sastava polisaharida, kao i određenog genotipa ćelije.

Različiti tipovi kapsule mogu biti identifikovani imunološki. Ako ćelije tipa II su ubrizgane u krvotok zeca, imuni sistem zeca će proizvesti antitela koja reaguju spacifično sa ćelijama tipa II. Takva antitela tipa II će aglutinisati pneumokokuse tipa II, ali ne i pneumokokuse tipa I ili tipa III.

Grifitovo neočekivano otkriće bilo je da ako on ubrizga pneumokokuse koji su ubijeni toplotom (patogeni kada su živi) plus žive tip IIR pneumokokuse (nepatogene) u miša, mnogi miševi su uginuli od pneumonije, a žive ćelije tipa IIIS su bile izolovane iz leševa (slika 8-22). Kada su miševima bili ubrizgani samo pneumokokusi ubijeni toplotom tipa IIIS, nijedan od miševa nije uginuo. Znači, registrovana patogenost nije zbog nekoliko ćelija tipa IIIS koje su možda preživele tretman. Živi patogeni pneumokokusi koji su izovolani iz leševa imali su pneumokokusne kapsule tipa III. Ovi rezultati su važni zato što ćelije bez kapsula tipa R mogu mutirati tako da postanu ponovo ćelije sa kapsulom tipa S. Ipak, kada se takva mutacija desi i ćelijama tipa IIR, te ćelije postaju tip IIS, a ne IIIS. Znači da transformacija nevirulentnih ćelija tipa IIR u virulentne ćelije tipa IIIS se ne mogu objasniti mutacijom. Umesto toga, neke komponente mrtvih ćelija tipa IIIS (transformirajući sastojak) mora da je konvertovao ćelije tipa IIR u tip IIIS.

Eksperimenti koji su potom urađeni od strane Ričarda Sia i Martina Davsona 1931. godine pokazali su da fenomen opisan Grifitom koji je nazvan transformacija, nije bio podstaknut živim domaćinom ninakoji način. Isti fenomen se desio u epruveti kada su žive ćelije tipa IIR gajene u prisustvu toplotom ubijenih ćelija tipa IIIS. Grifitov eksperiment je demonstrirao da je fenotip transformisanih ćelija tipa IIIS prenesen na potomstvo i da je to bilo zbog permanentno nasleđenih promena u genotipu ćelija. Ovo demonstriranje transformacije je bilo povod za determinisanje hemijske osnove nasleđivanja kod pneumokokusa. I stvarno, prvi dokaz da je genetička informacija smeštena u DNK, a ne u proteinima su demonstrirali Osvald Averi, Kolin Meklaud i Meklin Mekkarti, koji su ukazali da DNK je odgovorna za transformaciju kod pneumokoka.

12

Mehanizam transformacije je bio izučavan u značajnim detaljima kod S. pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae i Neisseria gonorrhoeae. Osnovni poces je sličan kod sve četiri vrste; ipak, varijacije u mehanizmu dešavaju se kod svake vrste. S. pneumoniae i B. subtilis će unositi DNK iz bilo kojeg izvora, dok H. influezae i N. gonorrhoeae će unositi samo DNK koja vodi poreklo od bakterija koje pripadaju njihovoj vrsti ili vrstama koje su im bliske. H. influezae i N. gonorrhoeae će unositi DNK koja sadrži jednu specijalnu kratku nukleotidnu sekvencu (dugačku 11 baznih parova kod Hemophilus i 10 baznih parova kod Neisseria) koja je prisutna u po oko 600 kopija u njihovim genomima.

Čak i kod bakterijskih vrasta koje imaju sposobnost da unose DNK iz njihove okoline, neće sve ćelije to raditi. Samo ćelije kod kojih postoji ekspresija gena koji kodiraju proteine potrebne za taj proces su u stanju da unose DNK. Za takve ćelije se kaže da su kompetentne. Bakterije razvijaju kompetenciju za vreme kasne faze njihovog ciklusa rasta – kada ćelijska gustina je visoka, ali pre prestanka ćelijske deobe. Proces koji omogućava ćelijama da postanu kompetentne je najbolje izučen kod B subtilis, čije ćelije luče male peptide koji sa nazivaju feromoni koji se akumuliraju pri visokoj gustini ćelija. Visoka koncentracija feromona indukuje ekspresiju gena koji kodiraju proteine koji su potrebni za transformaciju.

Transformacija kod pneumokokusa je prikazana na slici 8-23. Dvolančana DNK je vezana od strane receptora na površini kompetentne ćelije. Pošto je molekul DNK uvučen u ćeliju, jedan lanac je degradiran, a drugi lanac je zaštićen od degradacije pokrivanjem sa proteinom koji se vezuju za jedan lanac (single-strended-DNA-binding protein ili kako se skraćeno obeležava SSB protein). Uz pomoć važnih proteina koji podstiču rekombinaciju, jedan lanac molekula DNK vrši invaziju hromozoma ćelije recipienta, vezuje se sa komplementarnim lancem DNK i menja ekvivalentni lanac. Zamenjeni recipijentni lanac je onda degradiran. Ako ćelije donora i recipijenta nose različite alele nekog gena, rezultujući rekombinantni dvostruki heliks imaće jedan alel u jednom lancu, a drugi alel u drugom lancu. Dvostruki heliks molekula DNK ovakvog tipa se naziva heterodupleks (heterozigotni dvolančani heliks); on će se odvojiti u dva homodupleksa prilikom replikacije.

DNK molekuli uzeti od strane kompetentnih ćelija za vreme transformacije su obično samo 0,2 i 0,5 procenata kompletnog hromozoma. Dakle, ukoliko dva gena nisu zaista blizu jedan drugom, oni neće nikada biti prisutni na istom molekulu transformišuće DNK. Dvostruki transformanti za dva gena (naprimer a za a+ i b za b+, koristeći a+b+ kao donora i ab kao recipijenta) će zahtevati dva nezavisna transformaciona događaja (unošenje i integracija jednog DNK molekula koji nosi a+ i drugog molekula koji nosi b+). Verovatnoća da se dese dva takva nezavisna događaja zajedno je jednaka proizvodu verovatnoća svakog od njih ponaosob. Međutim, ako su dva gena blisko vezani, oni mogu biti sadržani na jednom molekulu DNK koji vrši transformaciju (transformišuća DNK) i dvostruki transformant može biti formiran sa visokom učestanošću. Frekvencija sa kojom su dva genetička markera kotransformisana može biti korištena za procenu koliko su oni daleko na domaćinovom hromozomu.