Genové inženýrstvía

Geneticky modifikovanéorganizmy

Definice GMO biologická

Pojem GMO zahrnuje takové organizmy, jejichžgenetický základ byl úmysln pozm n vnesením i

vyjmutím n jakého genu (gen ).

Definice GMO legislativní

GMO je organizmus, krom lov ka, jehoždi ný materiál byl zm n genetickou

modifikací.

Genetická modifikace = každá zm na DNA

irozená um lá

Genetické modifikace vyvolané:

- zá ením- šlecht ním- k ížením

vedou ke vzniku odr d, plemen,kultivar apod.

- p ímou a zám rnou manipulací s DNA

vedou ke vzniku GMO

Genové inženýrství (GI)Genové inženýrství (GI)

= techniky vedoucí k um lé tvorb geneticky pozm nýchbun k nebo celých organizm zásahem do jejich DNA

výsledkem

vznik nových modifikovaných genom , transgenníchorganizm , které by se za normálních okolností

v p írod nemohly vyskytnout

CílemCílem jsou v podstat dva procesy:

- vložení cizího DNA segmentu (genu, konstruktu) doDNA p íjemce

- vy azení nežádoucího genu z funkce, tzv. genovýknock-out

Techniky GITechniky GI

- identifikace a izolace gen ,získání genového konstruktu

- volba p íjemce pro p enosgenového konstruktu

- volba metody pro p enosgenového konstruktu

KonstrukceKonstrukce transgenutransgenu

- modifikace izolovaného genu

podmínka pro úsp šnou integraci a expresi genu

Sekvence promotoru - idána k transgenu z d vodu správnéexprese genu (tzn. p eklad do proteinového

produktu)

Termina ní sekvence - signalizuje bu ce zakon ení sekvence genu

Marker gen - p idán z d vodu identifikace úsp šného v len nítransgenu

TvorbaTvorba rekombinantnírekombinantní DNA (DNA (rDNArDNA))

rDNA je um levytvo ená DNA.DNA z n kolika

zdroj je v len nado jedné

rekombinantnímolekuly DNA.

Namnožení molekuly DNANamnožení molekuly DNA

získání identických kopií cílového transgenu nebo rDNA

Molekulární klonování

Molekulární klonování in vitro- procesem polymerázové et zové reakce (PCR)

Molekulární klonování in vivo- pomocí prokaryot (bakterie, nap . E. coli),- pomocí eukaryot (kvasinky),- pomocí bun k savc rostoucích v tká ových kulturách.

PolymerázováPolymerázová et zová reakce (PCR)et zová reakce (PCR)

= enzymatické namnožení (amplifikace) DNAsyntézou mnoha kopiií vybrané sekvence DNA

- cyklická reakce o t ech teplotních fázích:

Denaturace: dvouvláknová DNA denaturována na dvjednovláknové templátové molekuly DNA

Annealing: nasedání oligonukleotidových sond (primer )na obou stranách cílové DNA

Elongace: syntéza nových vláken pomocí termostabilníDNA polymerázy od 5´konce ke 3´konciza ínající od primer

Molekulární klonování in vitroMolekulární klonování in vitro

Schéma PCRSchéma PCR

v každém cyklu se množstvíDNA zdvojnásobí

exponenciální amplifikace

z každé molekuly p vodníhotemplátu bude vytvo eno 2n

kopií, kde n je po et cykl

30 cykl = 1010 násobnénamnožení DNA

Molekulární klonování inMolekulární klonování in vivovivo

vektor = molekula, která obsahuje všechny sekvencepot ebné ke vstupu, p ežití a množení v ur itéhostitelské bu ce

klonovací vektor = slouží nejen k p enesení do bu ky,ale i k zajišt ní jejího klonování v bu ce

(plazmidy, fasmidy, kosmidy, bakteriofágy…)

= namnožení ur itých fragment DNA pomocí vektor

Klonování DNA pomocí bakteriálníhoKlonování DNA pomocí bakteriálního plazmiduplazmidu

íprava GM rostliníprava GM rostlin

íprava GM živo ichíprava GM živo ich

íprava GMO

=

logické pokra ování klasických zp sob šlecht ní

zrychlení a zjednodušení tradi ních postup

Schéma tvorby GM rostlinSchéma tvorby GM rostlin

- výb r genu( ) pro dosažení požadované vlastnosti- izolace vhodného genu( ) a klonování genu v baktérii- úpravy genu( )- transformace genu( ) do genomu rostliny- selekce transformovaných rostlin- sledování projevu transgenu- testy v uzav ených prostorách laborato í a skleník- vyhodnocení biologické bezpe nosti- polní zkoušky transgenních rostlin- hodnocení biologické bezpe nosti- registra ní zkoušky GM odr dy

íprava GM rostliníprava GM rostlin

Existuje ada metod, kterými je docílena transformacetransgenní DNA do rostlinných bun k.

Nej ast ji využívanými:

Metody transformaceMetody transformace transgenutransgenu

- transformaces využitím bakterií

- p ímá transformace

PP ííprava GM rostlinprava GM rostlin s vyus využžititíím bakterim bakteriíí

PP ííprava GM rostlin pprava GM rostlin p íímoumoutransformactransformacíí

TransgenníTransgenní rýžerýže

„Zlatá“ rýže. Tato transgenní rýže obsahuje beta-karoten, který je zdrojemvitamínu A. Tato rýže pomáhá odstranit nedostatek vitamínu A u polovinysv tové populace – která je závislá na rýži jako hlavní potravin . Vsou asnosti trpí 70% d tí stá í do p ti let v jihovýchodní Asii nedostatkemvitamínu A. Jako vektor byl užit Ti plasmid.

„Normální“ rýže

íprava GM zví atíprava GM zví at

Cílem p enosu genového konstruktu:

asné stadium vývinu embrya na úrovni 1 bu ky(zygoty) p ed splynutím prvojader

linie pluripotentních bun k

íprava GM zví at metodouíprava GM zví at metodou mikroinjekcemikroinjekce

superovulace a oplození

izolace bun k (zygot)

mikroinjekce transgenu

transfer vají ekdo náhradnic

Transformace embryonálních kmenovýchTransformace embryonálních kmenovýchbun kbun k

Výsledný jedinec jechimérou.

Testace potomstva naítomnost vloženého genu.

Pá ení heterozygotníchjedinc s cílem získat

homozygotní transgenní linii.

KlonovKlonováánníí organizmorganizm

- technika používaná k vytvo ení identických organizm

Reproduk ní klonování- vytvo ení duplikátu( ) existujícího jedince

Terapeutické klonování- strategie bun né terapie

Reproduk ní klonováníReproduk ní klonování

- dv techniky:

enos jádra zárode né bu ky

enos jádra somatické bu ky

CíleCíle živo išného reproduk ního klonování:

- produkce hospodá ských zví at (zlepšení kvality zví ati jejich produkt )

- produkce GM laboratorních zví at (studium lidských chorob,testace nových lék )

- produkce GM hospodá ských zví at (produkce vysoceterapeutických protein )

- pokus záchrany ohrožených i vyhynulých druh

- zlepšení klonovaných domácích zví at

- produkce živo ich vhodných pro xenotransplantace

SchémaSchémaenosu jádraenosu jádra

zárode nézárode nébu kybu ky

OvceOvce DollyDolly

- í 5. ervence 1996- Ü 14. února 2003 utracena z d vodu plicní infekce

jádro oocytu nahrazeno jádrem somatické bu kys dosp lé ovce

vytvo ena genetická kopie p vodní dosp lé dárkyn

- vyvinuta kolektivem vedeným Ianem Wilmutem(Roslin Institute, Skotsko) reproduk ním klonováním

⇓

Vytvo ení ovceVytvo ení ovce DollyDolly

TransgenníTransgenní myšmyš

V roce 1982 Ralph Brinster a RichardPalmiter vytvo ili „transgenní“ myši –do myších embryí byl vložen krysígen pro r stový hormon.

Myš, nesoucí tento cizí gen (na obr.vlevo) produkovala velké množství

stového hormonu a vyrostla dodvojnásobné velikosti ve srovnání sesvými sourozenci (vpravo)

Brinster, School of Veterinary Medicine, University ofPennsylvania

Terapeutické klonováníTerapeutické klonování

- strategie bun né terapie

vodní genetický materiál kmenových bun knahrazen genetickým materiálem pacienta

- využívá schopnosti embryonálních kmenových bun kregenerovat orgány i tkán

spušt na jejich diferenciace ve specifické t lní bu ky

transplantace do místa poškozené tkánbez spušt ní imunitní reakce

- postup:

SchémaSchématerapeutickéhoterapeutického

klonováníklonování

Diagnostika GMO v potravinách

kvalitativní kvantitativní(pr kaz p ítomnosti GMO) (pr kaz množství GMO)

> 1% GMO v potravin⇒ povinnost jejího ozna ení

vyplývající ze zákona

PCRítomnost transgenníDNA v potravin

Imunochemické metodyELISA

ítomnost transgenníhoproteinu v potravin

Real-Time PCRna p ístroji Lightcycler

⇓

Význam GMO• farmacie a medicína:

- výroba lé iv (inzulín, lidský r stový hormon, srážlivý faktor atd.)- studium chorob a vývoj lék

• zem lství zem lsko-potraviná ská odv tví:

- zlepšení technologických vlastností (odolnost herbicid m, houbovým avirovým chorobám, šk dc m, zvýšení nutri ní hodnoty)

- produkce farmaceuticky využitelných látek (obsah a kvalita lipida škrobu)

- pr myslové aplikace a zpracování surovin (produkce enzym propotraviná ský a papírenský pr mysl, produkce biodegradovatelnýchpolymer )

• pr mysl:- kvasný, textilní- výroba aminokyselin, bílkovin, škrobu

• životní prost edí:- likvidace ropných havárií a další ....

íklady GMO - efekt• plodiny s rezistencí v i herbicid m (sója, epka, kuku ice, bavlník)• plodiny produkující bakteriální insekticidní toxiny (brambory,kuku ice)• plodiny s upraveným metabolismem cukru (brambory)• plodiny s prodlouženou trvanlivostí (raj ata)

• plodiny produkující biodegradabilní polyestery, bioocel• plodiny s upraveným pom rem látek (raj ata, epka)• bavlník s p írodn zabarveným vláknem• raj ata, cukrovka s vysokým obsahem fruktanu• eviny se sníženým obsahem ligninu pro výrobu papíru

• plodiny se zvýšenou odolností v i stresu chladem i suchem• plodiny se schopností asimilace vzdušného dusíku• rýže produkující betakaroten• peckoviny s odolností k viru šarky

• škodlivý hmyz enášející gen zp sobující neplodnost potomstva• živo ichové s rychlým r stem (losos)

Možnosti rizik GMO· zdraví lidí a zví at (toxicita a kvalita/bezpe nost potravin, alergie, rezistence

k lé iv m)

· životní prost edí (tvorba genu, transgenu nebo transgenních produkt ,náchylnost necílových organizm , rostoucí množství použitíchemikálií v zem lství, nep edpokládaná exprese genua nestabilita transgenu)

· zem lství (rezistence/tolerance cílových organizm , superplevele, zm nanutri ní hodnoty, snížení po tu odr d a ztráta biodiverzity)

· horizontální p enos gen (genetické zne išt ní pomocí pylu neborozptylováním semen, rozptylování transgennebo promotor , p enos cizorodých gen domikroorganizm nebo vznik nových virrekombinací)

· všeobecné rizika (ztráta p íslušnosti v systému, vyšší náklady v zem lství,neplánování polních pokus p i odhadu rizika)