Genetica medica

ADI-1genetica online e clinica

barbara.pasini@unito.itDip. di Genetica Biologia e Biochimica

Genetica medica oncologica

ASO S. Giovanni Battista - Torino

IRCC - Candiolo

Le malattie genetiche :

Malattie causate in modo esclusivo o

parziale da un difetto del patrimonio

ereditario:• difetto nel numero o struttura dei cromosomi

-> malattie cromosomiche

• difetto nella struttura o funzione di un gene

-> malattie geniche (monogeniche)

(mutazioni del DNA nucleare e mitocondriale)

• coinvolgimento di una serie di geni localizzati in

una stessa regione genomica (riarrangiamento)

-> malattie genomiche

Le malattie genetiche :

• effetto di modificazioni chimiche e strutturali del

DNA in grado di alterare l’espressione di un gene o

di un gruppo di geni

-> malattie epigenetiche

(difetti di imprinting)

• effetto dell’interazione tra geni e ambiente

-> malattie multifattoriali o complesse

March 20, 2005

+ 179

March 24, 2004

+ 186

March 24, 2004March 20, 2005April 19, 2006

21/03/2005

44 Feocromocitoma 43Feocromocitoma 43

14 11

31Angioma 31 1

21

65 71

81 82

2

78

22

76Sede ignota 76

80

21/03/2005

48

18Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13

13Feocromocitoma 13

46 1 2 1

74 35

51 53

77 73

Perché occuparci di questi casi da un punto di vista genetico ?

• tumori giovanili, multipli, bilaterali fanno sospettare una predisposizione

• i soggetti già malati potrebbero sviluppare altri tumori

• altri membri della famiglia potrebbero ammalarsi

• parenti sani ma preoccupati di potersi ammalare in futuro potrebbero non avere ereditato il difetto genetico

• la “causa” genetica (biochimica) di una malattia potrà in futuro essere corretta ?!

diagnosi

correttagestione clinica

identificazionedei portatori

identificazionedei non portatori

ricerca

Ricerca basata sul “sintomo”

Feocromocitoma famigliare

Feocromocitoma + angioma midollare• National Center for Biotechnology Information

NCBI : http://www.ncbi.nlm.nih.gov– Pubmed , OMIM– > VHL, RET, SDH-B, SDH-C, SDH-D

• Gene Test http://www.geneclinics.org/

– > Gene Review

• Cancer Prone Diseaseshttp://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/

parathyroidhyperplasia

pheochromocytoma

medullarythyroid carcinoma

neuroendocrinepancreatic tumors

MEN2

pituitary adenomaduodenal gastrinomascarcinoids exc.

MEN1

retinal angiomasCNS haemangioblastomasrenal cell carcinomas

VHL

para-ganglioma

SDH genes

Predisposizioni ereditarie allo sviluppo delfeocromocitoma

e paragangliomi extra-surrenalici

Casi di feocromocitomaisolato , non-sindromico (surrenalico , extra-surrenalico)

– 11% VHL (per lo più mutazioni missenso)– 5% RET (per lo più mutazioni esoni 11 e 13)– 4.5% SDHB– 4% SDHD

Tot 24% (70% <10 yr, 51% < 20 yr; 39% < 30 yr, 27% < 40 yr, 18% < 50 yr)

(80% se multifocale)

21/03/2005

44 Feocromocitoma 43Feocromocitoma 43

14 11

31Angioma 31 1

21

65 71

81 82

2

78

22

76Sede ignota 76

80

Paziente di anni 43.- a 42 anni: feocromocitoma bilaterale- non altre manifestazioni cliniche di VHL(fondo oculare negativo,RM encefalo e midollo negativa,TC addome negativa)Genitori deceduti:-  madre a 71 anni per emorragia cerebrale-  padre a 65 anni per coma diabeticoUna sorella deceduta a 31 anniper complicanze post-operatorie di interventoneuro-chirurgico per “angioma midollare”.

Impostazione del test genetico

• Ricerca di mutazioni e delezioni gene VHL• Se negativo,

– analisi RET e SDH-B, SDH-C, SDH-D

Acquisizione della sequenza genomica del gene VHL

(Entrez Gene, Ensemble: www.ensembl.org)

- ricerca di mutazioni puntiformi: PCR e sequenza- ricerca di delezioni genomiche

Denaturazione 95°C

Appaiamento inneschi

Sintesi del DNA 72 °C (Taq polimerasi)

Ciclo 1 Appaiamentoinneschi

Ciclo 2

Sintesi del DNA

PCR

N° cicli

1

3

10

15

20

25

30

N° sequenze bersaglio

0

2

256

8192

262.144

8.388.608

268.435.456

PCR : Reazione a Catena della Polimerasi

Per l’analisi di una digestione con enzimi di restrizione tale da poter essere visibile in elettroforesi occorre ~1g di DNA. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un esone (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.

Sequenziamento del DNA (1):strutture dei nucleotidi

Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger

Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide

* Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta

Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger

pozzetti

autoradiogramma

Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (estremità 5’) mentre il nucleotide T è all’estremità 3’.

361G>ACaso indice: sequenza “senso” (forward)

Caso indice: sequenza “anti-senso” (reverse)

541 CACAGCTACCGAGGTCACCTTTGGCTCTTCAGAGATGCAGGGACACACGATGGGCTTCTG110 -H--S--Y--R--G--H--L--W--L--F--R--D--A--G--T--H--D--G--L--L-

codifica mutazione c.365G>A (p.D121N)

GAT>AAT: Asp121AsnAcido Aspartico -> Asparaginaaa acido aa polare

DB SNPs:Segnalato in precedenza SNPD121G senza info

DB mutazioni:The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html-> report 1994 D121G in un paz. con feocromocitoma

COOH |

2HN -- CH |

CH2 |

COOH

COOH |

2HN -- CH |

CH2 |

CO--NH2

VHL proteinbeta-domain7 stranded sandwich:aa 63-154(HIF1 binding: aa 67-117)H4: aa 193-204

polar interfacebetween and domains

Linker: aa 154-156

alpha-domainaa 155-192H1 – H2 – H3

Linker: aa 189-194

Stebbins CE et al Science 1999

VHL – interface

Stebbins CE et al Science 1999

Polar interface between alpha and beta domainHydrogen bonds involving: amino acids: H3 Asp187, Leu188H1 Glu160, Arg161, Gln164, Arg167 amino acids:L6 Asp121, Thr124, Asp126L2 Arg82

21/03/2005

48

18Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13

13Feocromocitoma 13

46 1 2 1

74 35

51 53

77 73

Feocromocitoma non sindromico giovanile in due fratelli

Programma:- ricerca di mutazioni RET e SDH- se negativo: analisi VHL

21/03/2005

50 Feocromocitoma 49Feocromocitoma 50Angiomi retinici 50

20 Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13

15 Feocromocitoma 13

48 1 2 1

74 35

5355

79 73

21/03/2005

48

18Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13

13Feocromocitoma 13

46 1 2 1

74 35

51 53

77 73

467A>CCaso indice

Madre

661 AATATCACACTGCCAGTGTATACTCTGAAAGAGCGATGCCTCCAGGTTGTCCGGAGCCTA150 -N--I--T--L--P--V--Y--T--L--K--E--R--C--L--Q--V--V--R--S--L-

DB SNPs:NON segnalati SNPs in 156

DB mutazioni:The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html-> 3 report anche recenti di mutazioni: Y156D, Y156N, Y156C

codifica mutazione c.467A>C (p.Y156S)

TAT>TCT: Tyr156SerTirosina -> Serinaaa idrofobico aromatico aa polare “sottile”polare COOH

|

2HN -- CH |

CH2--OH

COOH |

2HN -- CH |

CH2 |

|

OH

VHL - Elongin C interface

Most relevant contact: Leu158 – Cys162 – Arg161Hydrogen bonds: Arg82 – Arg161 – Lys159

Stebbins CE et al Science 1999

Effetto delle mutazioni missenso

• cambiamento aminoacidico +- conservativo• frequenza nella popolazione generale• segregazione nell’ambito della famiglia• effetto prevedibile sulla struttura/funzione

della proteina (modeling)• conservazione nell’evoluzione• test funzionale (ev. second hit)

SIFTSorting Intollerant From Tollerant

http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html

D121N con nematodi 0.13senza nematodi 0.00

Y156S con nematodi 0.26senza nematodi 0.22

Y156D con nematodi 0.13senza nematodi 0.11

Y156N con nematodi 0.20senza nematodi 0.17

Y156C con nematodi 0.11senza nematodi 0.09

Geni RECESSIVI

entrambi gli alleli inattivati :

• delezioni o riarrangiamenti

cromosomici• mutazioni puntiformi• iper - metilazione

2 mutazioni somatiche tumore sporadico1 costituzionale + 1 somatica tumore ereditario

Inattivazione di geni onco - soppressori :perdita di funzione

Gene onco-soppressore Rb

18/04/2004

Rb

18/04/2004

Rb

Rb Rb

Rb

Alleli Rb normalimutazione somatica

mutazione somatica

Retinoblastoma unicomono-laterale

Mutazione germinale

mutazione somatica

Retinoblastomi multipli bilaterali ad insorgenza precoce

Inattivazione di geni onco - soppressoricon perdita di eterozigosità (LOH)

Prima mutazione:puntiforme

seconda mutazione:delezione

Allele

158

Allele

236

Allele

158

Allele

236

Allele

8

Allele

236

Inattivazione di geni onco - soppressoricon perdita di eterozigosità (LOH)

Allele3158

Allele3236

Allele

8

Allele3236

Loci studiati: 1 2 3 4Caso 1 ni - - +Caso 2 + - - +Caso 3 + + - ni

Allele1468

Allele3236

Allele1

8

Allele3236

Allele5346

Allele3236

Allele53

Allele3236

Sede del gene onco-soppressore

Tessutosano

Tessutotumorale