galleria mellonella

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Utilización de un extracto alcohólico de Neem (Azadirachta indica A. Juss.) para el control de Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Pyralidae). Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero Agrónomo

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Utilización de un extracto alcohólico de Neem (Azadirachta indica A. Juss.) para el control de Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Pyralidae).

Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero Agrónomo

Luisa Contreras Núñez Valdivia – Chile

2009

Page 2: Galleria Mellonella

PROFESOR PATROCINANTE:

____________________________________

Maritza Reyes C.

Ing. Agrónomo, M. Sc. Dr. Cs. Agr.

Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

PROFESORES INFORMANTES:

____________________________________

Miguel Neira C.

Ing. Agrónomo.

Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

___________________________________

Laura Böhm S.

Ing. Agrónomo.

Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

Page 3: Galleria Mellonella

i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN

SUMARY

1 INTRODUCCIÓN 1

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3

2.1 Galleria mellonella L. 3

2.1.1 Morfología 3

2.1.2 Ciclo biológico 4

2.1.3 Daño causado por Galleria mellonella 6

2.2 Formas de control 6

2.2.1 Control aplicado 7

2.2.2 Control natural 8

2.3 Azadirachta indica A. Juss. 9

2.3.1 Características morfológicas 10

2.3.2 Propiedades y utilización 11

2.4 Extracto alcohólico de Neem 12

2.4.1 Elaboración 12

2.4.2 Modo de acción 13

3 MATERIAL Y MÉTODO 15

3.1 Lugar del ensayo 15

3.2 Material biológico 15

3.3 Material de laboratorio 15

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ii

3.4 Dieta 16

3.5 Metodología 16

3.5.1 Diseño experimental 18

3.5.2

4

Análisis de resultados

BIBLIOGRAFÍA

19

19

Page 5: Galleria Mellonella

iii

Page 6: Galleria Mellonella

1

1 INTRODUCCIÓN

La sanidad es uno de los factores más importantes para el logro de una buena

producción en cualquier actividad agropecuaria. La apicultura no escapa a esta regla,

ya que son numerosas las enfermedades que afectan a las abejas en sus diferentes

estados, debilitando las poblaciones en las colmenas. Es fundamental conocer la

enfermedad y al agente causal de ésta, con el fin de evitarla o controlarla utilizando

medidas de manejo que aseguren colmenas sanas y por lo tanto una buena

producción.

Se denominan enemigos o antagonistas de las abejas, a aquellos organismos que en

asociación con éstas ocasionan daños en los panales, como la polilla mayor de la cera

(Galleria mellonella L.), o alteran el comportamiento de las abejas, como el piojo de las

abejas (Braula coeca Nitzch).

La polilla mayor de la cera es considerada uno de los mayores antagonistas de las

abejas, ya que en su fase larvaria destruye de forma significativa los panales y se

encuentra distribuida en todas las regiones de mundo donde se practica la apicultura.

El control de la polilla mayor de la cera esta enfocado, básicamente en la prevención

del establecimiento en las colmenas, aunque existen numerosos productos químicos o

naturales que son efectivos en el control del insecto, como lo son las aplicaciones de

concentrados bacterianos y los extractos naturales de plantas o árboles, que poseen

cualidades insecticidas.

El árbol de Neem (Azadirachta indica A.Juss.) ha sido materia de numerosos estudios

científicos que conciernen su utilización en la medicina, la industria y la agricultura.

Hasta ahora distintas formulaciones de extractos de este árbol han sido evaluados

contra más de 500 especies de insectos y ha sido utilizado como pesticida en casi

todos los cultivos del mundo.

Page 7: Galleria Mellonella

2

Debido a la buena eficacia mostrada por los derivados de este árbol, su aplicación en

el control de Galleria mellonella es una interesante manera de avalar su utilización

como bioinsecticida.

En esta investigación se plantea la hipótesis que el extracto alcohólico de Neem posee

cualidades insecticidas, inhibidoras del crecimiento, anti alimentarias y causa efectos

sub letales en la polilla mayor de la cera.

Como objetivo general se plantea evaluar la acción del extracto de Neem sobre la

alimentación, desarrollo y mortalidad de Galleria mellonella L.

Los objetivos específicos de éste estudio son, aplicar distintas concentraciones del

extracto sobre las larvas de la polilla mayor de la cera, criadas en dieta artificial.

Analizar los efectos producidos en los estados larvales de G. mellonella, observando

alimentación, desarrollo y mortalidad de éstas y por ultimo analizar los efectos sub

letales en el estado adulto de la polilla mayor de la cera, a través del análisis de

fecundidad de los adultos emergidos de los distintos tratamientos.

Page 8: Galleria Mellonella

3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Galleria mellonella L

Estas polillas pertenecen al orden Lepidoptera, familia de los Pyralidae y se distinguen

dos especies, Achroia grisella polilla menor o tiña verdadera y G. mellonella, polilla

mayor o falsa tiña. Las hembras son mariposas de hábitos nocturnos, de color gris,

longitud comprendida entre 8 y 17 mm y una envergadura alar que varía entre 14 y 38

mm. Las hembras de la polilla menor son más pequeñas que G. mellonella y su

envergadura alar no sobrepasa los 23 mm y su longitud es de aproximadamente 10

mm (LLORENTE, 2004).

Según WILLIAMS (1990), la polilla mayor de la cera es considerada un insecto útil, ya

que sus larvas son comercializadas en Estados Unidos y Europa para la alimentación

de peces, además de ser utilizadas en estudios de fisiología, toxicología, patología y

como huésped artificial para la propagación masiva de parásitos de dípteros e

himenópteros.

Sin embargo, la polilla mayor de la cera es por lejos la mayor peste de productos

apícolas, causando pérdidas mayores a los apicultores cada año. Infecta colonias de

Apis cerana F., A. dorsata F., y A. mellifera L. (Morse y Laigo ,1968; Shimanuki ,1981 y

Sigha ,1982 citado por WILLIAMS, 1990).

2.1.1 Morfología. WILLIAMS (1990), señala que los huevos por lo general son

blancos y lisos, algunos están cubiertos con fecas oscuras y excrementos, usualmente

miden de 12 a 20 mm de longitud y cerca de 5 a 7 mm de diámetro.

Una larva recién salida del huevo tiene un cuerpo de color blanco cremoso que se

vuelve gris a gris oscuro en la parte dorsal y lateral a medida que avanza en sus

estadíos, puede alcanzar hasta 28 mm de longitud y pesar sobre 240 mg (Hase ,1926

citado por WILLIAMS, 1990).

Page 9: Galleria Mellonella

4

Según NEIRA (2006), las larvas de los estadíos siguientes presentan una coloración

amarillo grisáceo, con dos manchas en el primer anillo del tórax. La cabeza es de color

rojizo.

Durante el último estado larval, el insecto procede a inmovilizarse dentro de un capullo

de color blanco de unos 2,5 cm de longitud y se denomina estado de pupa, en el cual,

permanece por unos 20 días. La larva, previo a su ubicación definitiva, se ancla entre

los cuadros y el alza de la colmena, lo que produce un debilitamiento de los materiales

del marco (NEIRA y MANQUIAN, 2008).

Los adultos son de contextura pesada y bastante pequeños. Las hembras alcanzan

una longitud de 20 mm y pueden pesar como mucho 169 mg. Los machos son

consideradamente más pequeños, las polillas macho también pueden ser distinguidas

de las hembras por su color más ligero y su claro margen apical dentado de sus alas

delanteras. También, los palpos labiales de las hembras se extiende hacia adelante

dándole a la cabeza una apariencia puntiaguda. Las dos terceras partes de las alas

delanteras de los adultos de ambos sexos son más bien uniformemente oscuras, pero

las posteriores tienen aéreas claras y oscuras intercaladas irregularmente con

manchas desiguales. Dorsalmente, el tórax y cabeza son de color claro. Sin embargo,

el tamaño y color de ambos sexos disienten considerablemente a merced de la dieta

de las larvas. Los adultos de G. mellonella pueden ser más pequeños que algunas

polillas menores de la cera sí las larvas se han desarrollado lentamente como resultado

de una escasa alimentación y bajas temperaturas (WILLIAMS, 1990).

2.1.2 Ciclo biológico. El comportamiento reproductivo de G. mellonella no es el típico

de lepidópteros, sino que la hembra busca al macho. El macho libera una feromona de

dos componentes (nonanal:undecanal, 7:3) y cortos pulsos ultrasónicos para atraer a

las hembras (WILLIAMS,1990).

El insecto pasa por los estados de huevo, larva, pupa y adulto. Su ciclo biológico es

variable, en óptimas condiciones de temperatura (26-38ºC) puede durar entre 39 a 60

días y hasta cinco meses con temperaturas más bajas (NEIRA, 2006).

Page 10: Galleria Mellonella

5

WILLIAMS (1990), señala que la hembra comienza a poner huevos aproximadamente

cuatro a diez días después de haber emergido. Puede poner hasta 1.500 huevos en su

corta vida de siete a quince días (NEIRA, 2006).

Los huevos se desarrollan rápidamente con una temperatura cálida y sostenida (29-

30ºC) y comienzan a incubar tres a cinco días después de la oviposición. La incubación

de los huevos puede extenderse hasta 30 días a 18ºC. Cortas exposiciones a

temperaturas extremas (46ºC por 70 minutos, o a bajo 0ºC por 270 minutos) causarán

100% de mortalidad de huevos (WILLIAMS, 1990). La etapa larval puede extenderse

desde un mes hasta un máximo de cinco meses, dependiendo de la temperatura

ambiente, concluido este periodo, la polilla inicia es estadio de pupa, en el que

permanece alrededor de una semana, inmóvil dentro de un capullo (el que ha

confeccionado en su estado larval), y que es de un definido color blanco (NEIRA,

2006).

FIGURA 1 Ciclo biológico de G. mellonella.

FUENTE: adaptado de NEIRA, 2006.

Incubación 8 – 10 días(29º - 30ºC)

30 días a 18ºCAlimentación de larvas y galerías en los panales

Adulto pone entre 400 a 1800 huevos

7 – 28 días inmóvil en el capulloFecundación

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6

2.1.3 Daño causado por G. mellonella L. Estos Lepidópteros causan todos los años

grandes estragos, al dañar los panales de las colmenas. La hembra adulta entra a la

colmena y oviposita en lugares inaccesibles a las abejas. Las lavas emergen y hacen

túneles en los panales al alimentarse de polen, néctar, miel o cera (NEIRA, 2006). Las

dos especies de polillas de la cera (estado adulto) no participan en la destrucción de

los panales, pues se lo impiden sus mandíbulas que están atrofiadas (LLORENTE,

2004).

Según Nilsen y Brister (1977), citado por WILLIAMS (1990), durante los meses mas

cálidos del año, cuando las poblaciones de G.mellonella son más grandes,

comúnmente se observa una aparente normal emergencia de las obreras y zánganos

de los panales en el núcleo de fecundación. Después de que se han liberado de la

celda operculada, las abejas quedan atrapadas en ellas por hilos de seda y que han

sido fabricados por las larvas de las polillas y puestos en la base de las celdillas. Esta

condición es llamada galeriosis.

La mayor proporción de los daños causados por las polillas de la cera ocurre en aquel

material que hallándose fuera de uso, ha sido guardado sin tener en cuenta las

precauciones necesarias, tendientes a preservarlo del ataque de la polilla. Según el

grado de intensidad de la invasión, variarán los daños experimentados por la colonia,

pudiendo llegar, en circunstancias extremas, al abandono de la colmena por parte de

las abejas (NEIRA, 2006).

LLORENTE (2004), señala que existen signos evidentes que corroboran la presencia

de estos enemigos de las abejas como la presencia de polillas adultas, larvas en

distinto estado de desarrollo, ninfas, deyecciones y cuadros destruidos. El diagnóstico

relativo a distinguir una u otra polilla, se realiza por el tamaño de los adultos y por la

disposición, galerías rectas y cría tubular, de los daños ocasionados, siendo mucho

más frecuente y más peligrosa G. mellonella que A. grisella.

2.2 Formas de control

Según NEIRA y MANQUIAN (2008), estos insectos no causan daño económico cuando

la población de abejas es la normal, ya que éstas se encargan de removerlas del

Page 12: Galleria Mellonella

7

colmenar, sacándolas del panal, tirándolas al piso y desde allí al exterior a través de la

piquera.

Estos insectos están bien adaptados para sobrevivir alrededor de las colonias, por lo

cual los apicultores no son capaces de combatirlas en un 100 %, es necesario estar

alerta para evitar que su ataque sea severo (MAAREC, 2000).

FAO (2006), señala que para prevenir o controlar la infestación de estos lepidópteros

en los panales almacenados o productos de la colmena que sean vulnerables, se

pueden tomar varias medidas. Existen métodos técnicos, físicos, biológicos y químicos

(Burges, 1978; Charriere y Imodorf, 1997; Feldlaufer et al, 1998 y Kochansky, 2002

citados por NEIRA, 2006).

2.2.1 Control aplicado. Según la Agencia de Protección del Medio Ambiente

estadounidense, para el control de productos de la colmena que son consumidos por

los humanos, están aprobadas las fumigaciones con dióxido de carbono, aplicaciones

de calor y congelación (WILLIAMS, 1990).

LLORENTE (2004) señala que para proteger los materiales a utilizar en la próxima

temporada pueden ser desinfectados con productos químicos tales como:

- El dibromuro de metilo, es uno de los compuestos más utilizados, aunque es

toxico para el hombre y no posee cualidades ovicidas.

- Sulfuro de carbono, que es un producto eficaz, pero no destruye los huevos de

la polilla. Su uso es restrictivo, ya que, en su estado líquido es inflamable y el

gas que produce es explosivo y sus emanaciones son toxicas para el hombre.

- Anhídrido sulfuroso, es un gas que se desprende de la combustión del azufre,

no es ovicida pero se destruyen larvas y adultos. Posee el inconveniente de ser

corrosivo para los materiales metálicos de la colmena.

Otro compuesto utilizado es el paradiclorobenzol, el cual libera vapores lentamente por

un largo período y es de sencilla aplicación. No es tóxico para las abejas y en el

hombre tiene una baja toxicidad, aunque si se pone en contacto con la cera ésta se

destruye (NEIRA, 2006).

Page 13: Galleria Mellonella

8

Sin importar el producto a utilizar, es necesario airear los materiales por lo menos por

48 horas antes de ser introducidos en la colmena. Además ninguno de los estadíos de

estas polillas sobreviven a temperaturas superiores a 46 ºC por 80 minutos, por lo cual

se pueden utilizar tratamientos que no incluyen químicos (LLORENTE, 2004).

2.2.2 Control natural. Hasta ahora no se ha desarrollado una trampa efectiva contra

la polilla de la cera, ya que los machos no sólo se guían por las feromonas de las

hembras sino que, también usan el ultrasonido. Además se han encontrado

componentes de las hormonas femeninas en las ceras de abejas, lo que podría

explicar cómo encuentran la cera para oviponer (MAAREC, 2000).

Según FAO (2006), una vez que la infestación en las colonias se concreta, no existen

medidas quimioterapéuticas fáciles o económicas. Una solución es la utilización de una

solución acuosa de Bacillus thuringiensis L. la cual es asperjada en los panales y

permanece por varias semanas.

La utilización de un producto natural como el propóleo, que es una sustancia resinosa

colectada por las abejas y mezclada con cera y secreciones de las glándulas salivales,

los distintos componentes de los propóleos, son producidos por las plantas para evitar

infecciones en heridas en diferentes partes de las plantas y para ayudar a controlar

insectos o ácaros parásitos. Las abejas lo utilizan como un pegamento multiuso y para

proteger la colmena de infecciones. Concentraciones de un 4 % de propóleo son

letales para las etapas más tempranas y aborta el desarrollo pupal en las etapas más

tardías (GAREDEW et al., 2004).

SANKAR et al. (2009), señalan en su estudio una serie de controladores biológicos

testeados bajo laboratorio, contra la polilla mayor de la cera como el nemátodo

Heterorhabditis indica, tres patógenos fúngicos comerciales (Metarhizum anisopliae,

Beauveria bassiana y Trichoderma viride), una bacteria antagonista (Pseudomonas

fluorescence) y dos biopesticidas basados en el árbol Azadirachta indica (Neem y

Nimor). Los resultados se pueden apreciar en la figura 2, en la cual se indica que la

aplicación de el nemátodo sólo logro un 100 % de mortalidad y la combinación del

nemátodo con los otros biopesticidas varió, siendo las más altas las con los extractos

de A. indica (90 % con Neem, 92 % con Nimor), un 90 % de mortalidad con P.

Page 14: Galleria Mellonella

9

fluorescence y los resultados más bajos se observaron con los hongos (T. viride 84 %,

M. anisopliae 76 % y un 60 % con B. bassiana).

FIGURA 2 porcentajes de mortalidad larval bajo la influencia individual de

biopesticidas tratados en combinación con H. indica sobre Galleria mellonella.

FUENTE: SANKAR et al. (2009).

La acción individual de los distintos biopesticidas fue de un 40 % con B. bassiana, 24

% con M. anisopliae, 16 % con T. viride, 10 % con P. fluorescence y Neem, y sólo un 8

% con Nimor. (SANKAR et al., 2009).

2.3 Azadirachta indica A. Juss

El origen de este árbol no es claro, según Gamble (1902) citado por KOUL y WAHAB

(2004), el árbol de Neem de la familia Meliaceae, puede haberse originado en los

bosques de Karnataka en el sur de la India o en los bosque Myanmar (Birmania).

Las plantas han sido largamente estudiadas a nivel científico, lo que ha permitido su

utilización en la industria, medicina y agricultura, el árbol de Neem no escapa a estos

estudios. Hasta ahora preparados de Neem han sido evaluados contra más de 500

Page 15: Galleria Mellonella

10

especies de insectos y más de 400 centenares son susceptibles en concentraciones

diferentes. En el mundo están disponibles mucha formulaciones comerciales y este

árbol ha empezado a ser conocido como un modelo biopesticida botánico y que ha sido

utilizado como pesticida prácticamente en casi todos los cultivos, además de ser eficaz

en el control de ectoparásitos en la crianza animal (KOUL y WAHAB, 2004).

2.3.1 Características morfológicas. Es un árbol siempreverde de tamaño mediano a

grande, con un fuste corto y recto, corteza arrugada de color marrón oscuro a gris, de

copa densa y redondeada con hojas pinadas. Las flores se presentan en panículas

estrechas y ramificadas de 5 a 15 cm de largo, las flores individualmente están

compuestas de un cáliz de cinco lóbulos redondeados y de color verde pálido, cinco

pétalos redondeados, oblongos y blancos de 0,5 cm de largo y 10 estambres unidos en

un tubo y un pistilo con un ovario redondeado y un estilo delgado. En su área de

distribución natural florece entre marzo y mayo (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994).

Las frutas son drupas en forma de aceitunas de 1,0 a 2,0 cm de largo, lisas de un color

amarillo verdoso a amarillo en la madurez (junio a agosto en Asia), por lo general,

poseen una sola semilla elíptica rodeada de una pulpa dulce con un fuerte olor

semejante al ajo. La producción de frutas comienza cuando los árboles tienen entre

tres a cinco años de edad y alcanzan su máxima producción a los 10 años. Lo usual

es encontrar entre 4,000 y 5,000 semillas por kilogramos de fruta y son diseminadas

principalmente por las aves (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994).

La germinación es epigea y no requiere de escarificación, aunque limpiando la semilla

se pueden lograr porcentajes de germinación de entre un 60 a 85 % y su viabilidad no

supera los dos meses. Su propagación vegetativa se logra por medio de estacas de

ramas y se obtienen mejores resultados cuando las estacas son tratadas con ácido

indolbutírico (PERROTTA y CHATURVEDI, 1994).

Page 16: Galleria Mellonella

11

FIGURA 3 Follaje y fruto de Azadirachta indica A. Juss.

FUENTE: PARROTTA y CHATURVEDI (1994).

2.3.2 Propiedades y utilización. El parecido que poseen los componentes del los

distintos extractos de Neem con las hormonas naturales de los insectos, hacen que

estos los absorban como si fueran las hormonas reales, afectando el normal

funcionamiento del insecto, bloqueando su sistema endocrino (RAMOS, s/f).

De las diferentes partes de Azadirachta indica se han asilado e identificado cerca de

100 compuestos, de los cuales 70 de ellos de origen triterpénico destacan por su

actividad insecticida y en especial la azadiractina (Koul et al., 1990. citado por

BURBALLA et al., 1995).

La azadiractina es el principal componente biológicamente activo del árbol de Neem y

es extraída de las semillas maduras del árbol, posee una potente acción anti

alimentaria y propiedades reguladoras del crecimiento (MORDUE, 1997).

Según RAMOS s/f, el efecto de los extractos de Neem sobre varios insectos es bien

conocido, actuando de diferentes maneras, así puede generar destrucción e inhibición

en el desarrollo de huevos, larvas o crisálidas; bloquear la metamorfosis de larvas o

ninfas; desarticular el apareamiento y comunicación sexual; repeler a larvas y adultos;

impide la postura de huevos; esteriliza a adultos; impide la alimentación; inhibe la

formación de quitina; impide que se realicen las mudas, necesarias para entrar en la

siguiente etapa de desarrollo, por lo que actúa como regulador de crecimiento de los

insectos.

Page 17: Galleria Mellonella

12

2.4 Extracto alcohólico de Neem

Debido a la complejidad estructural de la azadiractina, las formulaciones naturales

están basadas en extractos alcohólicos, acuosos y en aceites extraídos de las semillas

del árbol, lo que hace variar considerablemente las formulaciones comerciales

existentes, por ejemplo, en Estados Unidos existen formulaciones enriquecidas con

azadiractina registradas por la Agencia de Protección del Medioambiente (Ascher,

1993. citado por BURBALLA et al., 1995).

2.4.1 Elaboración. Las hojas y en especial los granos de la semilla del árbol de Neem

y sus extractos, han sido utilizados para el control de varios insectos plaga en India, sin

embargo existe la necesidad de estandarizar los productos naturales. La comunidad

internacional ha denominado al ingrediente activo de los extractos de Neem como

azadiractina, existiendo varios tipos, la más común es la de tipo A y el contenido de

esta y de otros tipos varia según la calidad de la semilla y en especial con el tipo de

extracción realizada para obtener la formulación final (KLEEBERG, 2004).

Basándose en los tres procesos básicos de extracción, todo ellos generan la aparición

de ciertas materias activas que varían según el proceso de extracción que se realice

(RAMOS s/f). En el cuadro 1 se puede observar la cantidad de azadiractina obtenida

utilizando diferentes solventes

CUADRO 1 Cantidad de azadiractina obtenida utilizando distintos solventes.

Solvente usado Azadiractina encontrada Unidad

Etanol (95 %) 2,80 µg/10µl

Metanol / Agua (85:15) 2,60 µg/10µl

Metanol 2,19 µg/10µl

Acetona 0,74 µg/10µl

Etil - eter 1,28 µg/10µl

FUENTE: adaptado de RAMOS s/f.

Según KLEEBERG (2004), debido a que existen diversas formulaciones no registradas

comercialmente, la FAO ha documentado especificaciones para los productos del

Page 18: Galleria Mellonella

13

Neem dividiéndolos en dos grupos, aquellos que están hechos a base de aceites y los

que son ricos en azadiractina libres de aceite. Estas especificaciones fueron creadas

para que las autoridades de cualquier país tomen las medidas necesarias en cuanto a

calidad y demanda de pesticidas.

2.4.2 Modo de acción. La azadiractina actúa interfiriendo en el sistema

neuroendocrino, afectando la producción de la hormona juvenil y de ecdisona. Además

tiene efectos en la conducta alimenticia, oviposición, fecundidad y desarrollo de los

insectos (Remblod, 1989 y Schmutterer, 1985, 1988, 1990. citados por BURBALLA et

al., 1995).

MORDUE (1997), señala que existen dos categorías de efectos anti alimentarios

producidos por la azadiractina, el primero se relaciona con los quimiorreceptores del

gusto en las patas y aparato bucal de los insectos, en donde estimula la disuasión de

células e inhibe la células fagoestimulantes en los receptores. La segunda categoría

(anorexia) dice relación con el efecto fisiológico tóxico producido por la ingestión de la

azadiractina. Las larvas de Lepidópteros son el orden de insectos más

conductualmente sensibles a la azadiractina, los Coleópteros, hemípteros e

himenópteros son moderadamente sensibles y los Ortópteros tienen un amplio rango

de sensibilidad dependiendo de la especie. En el cuadro 2 se representan los rangos

de azadiractina a los cuales los distintos ordenes de insectos son sensibles, expresado

en su DL50 correspondiente.

CUADRO 2 Sensibilidad conductual de los insectos a la azadiractina.

ORDEN DL50 (ppm)

Lepidoptera < 0.001 - 50

Coleoptera 100 – 500

Hemiptera 100 – 500

Hymenoptera 100 – 500

Orthoptera 0.001 -- > 1000

FUENTE: MORDUE (1997).

Page 19: Galleria Mellonella

14

Los efectos fisiológicos producidos por la azadiractina de manera directa se basan en

su acción sobre tejidos en específico y de manera indirecta a través del sistema

endocrino. Estos efectos son más consistentes entre especies con un promedio de

DL50 de aproximadamente 2µg de azadiractina por g de peso corporal (MORDUE,

1997).

Los extractos de Neem, en general no muestran efectos tóxicos para los enemigos

naturales de las plagas u otros organismos benéficos, mamíferos o humanos

(Schmutterer, 1990 y Larson, 1987. citados por BURBALLA et al., 1995).

Page 20: Galleria Mellonella

15

3 MATERIAL Y MÉTODO

3.1 Lugar del ensayo

El ensayo se realizó en las dependencias del Laboratorio de Entomología, el cual

depende del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias

Agrarias de la Universidad Austral de Chile.

3.1 Material biológico

Las 180 larvas de Galleria mellonella que fueron utilizadas para este estudio se

obtubieron gracias a una muestra de huevos, entregadas por el INIA Quilamapu

ubicado en la localidad de Chillan, Chile. La muestra equivale en peso a unos 1,5 g.

El insecticida biológico, corresponde a un formulado comercial llamado Neem-X, que

contiene un 0,4 % de azadiractina como ingrediente activo.

3.2 Material de laboratorio

Para este estudio se utilizó una cámara con ambiente controlado (temperatura,

humedad y fotoperiodo), 180 frascos de 8 cc para cada larva y todos los materiales de

laboratorio básicos necesarios para el correcto funcionamiento del experimento.

3.3 Dieta

La formulación de la dieta es una adaptación de la dieta utilizada en el INIA Quilamapu

para la mantención de larvas de Galleria mellonella, que a su ves es una adaptación de

la formula descrita por SINGH y MOORE (1985). Los ingredientes para su elaboración

se describen en el cuadro 3.

CUADRO 3 Ingredientes para la elaboración de 1 Kg. De dieta para larvas.

COMPONENTES CANTIDAD UNIDAD

Nestum 3 cereales 187 g.

Nestum avena y miel 187 g.

Germen de trigo 120 g.

Azúcar granulada 148 g.

Glicerina líquida 219 mL.

Albúmina-caseína-caseína

Page 21: Galleria Mellonella

16

Jarabe Pantiban 1,2 mL.

Agua destilada 138 mL.

FUENTE: Elaboración propia

La dieta fue elaborada de la siguiente manera: en un recipiente se disolvió azúcar con

agua destilada recién hervida, a la cual se la agregó glicerina y vitaminas en forma de

jarabe, agitando constantemente para lograr una mezcla homogénea. En un recipiente

independiente se mezclaron los dos tipos de Nestum y el germen de trigo; luego se

mezclaron ambos preparados, hasta obtener una mezcla ligada y medianamente dura.

El proceso de elaboración de la dieta se puede obserbar en la figura 4.

FIGURA 4 Elaboración de la dieta utilizada en el ensayo.

Page 22: Galleria Mellonella

17

3.4 Metodología

Para evaluar los objetivos propuesto en este experimento se utilizó la siguiente

metodología

Según AFIPA (2006), la dosis recomendada para el producto comercial Neem.X está

en un rango de 2,5 a 5 cc/l de producto comercial, por lo que se considero un promedio

de 3,75 cc/l el cual se expresó en partes por millón para facilitar los procesos de

elaboración de las dosis, es decir la dosis recomendada a utilizar fue de 15 ppm de

azadiractina.

Los distintos tratamientos consistieron en dos dosis más bajas y dos dosis más altas a

partir de la dosis recomendada aumentando o disminuyendo a una razón de dos. Los

distintos tratamientos y dosis se describen en el cuadro 4.

CUADRO 4 Dosis y tratamientos a aplicar del extracto de Nemm sobre G. mellonella.

TRATAMIENTO DOSIS UNIDAD ia.

T0 0 ppm

T1 3,75 ppm

T2 7,5 ppm

T3 15 ppm

T4 30 ppm

T5 60 ppm

FUENTE: Elaboración propia.

Luego de la elaboración de la dieta ésta fue introducida en los 180 frascos de 8 cc que

contendrán, cada uno de ellos 4 cc de la dieta y se procederá a inocular cada frasco

con las distintas dosis para así conformar los distintos tratamientos con sus respectivas

repeticiones.

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La inoculación de las dosis se realizara asperjando la dieta con un roseador de 3 ml

procurando hacer un asperjado parejo y homogéneo en toda la dieta.

Luego de la eclosión de las larvas y en un periodo menor a cuatro horas, para evitar la

deshidratación de estas y procurar una homogeneidad de los posteriores estadios

larvarios, se procederá a introducirlas con una pinza en sus respectivos frascos, los

cuales se sellaran y se ubicarán en una cámara con una temperatura de 28 ºC +/- 2 ºC,

una humedad relativa cercana al 50 % y con un fotoperiodo de 0 horas luz y 24 horas

de oscuridad para simular el ambiente de una colmena natural.

Durante los primeros cinco días desde la puesta en marcha del experimento se

observará diariamente si las larvas se están alimentando, se considerara como

indicador de alimentación la introducción de las larvas en la dieta, posteriormente cada

siete días y por un periodo de 60 días se observarán los distintos objetivos planteados

en este experimento, es decir, mortalidad, efecto anti alimentario y regulador del

crecimiento, para lo cual se asilaran a 4 ºC las larvas que presenten mortalidad para su

posterior análisis.

Para determinar los efectos sub letales se procederá a analizar la postura de huevos

de los adultos que se generen en el periodo experimental, ubicándolos en frascos

medianos con cintas de papel mantequilla y así analizar las diferencias entre la postura

de los distintos tratamientos.

3.4.1 Diseño experimental. Se utilizará un diseño estadístico completamente al azar,

que incluirá cinco tratamientos con distintas dosis del extracto de Neem más un

tratamiento control que contendrá sólo agua destilada, cada tratamiento tendrá tres

repeticiones. La unida experimental consistirá en 10 larvas de G. mellonella por cada

repetición de cada tratamiento, en total 180 larvas.

3.4.2 Análisis de resultados. Los datos obtenidos de la mortalidad de larvas serán

sometidos al factor de corrección de Schneider y Orelli el cual es utilizado en distintos

ensayos con pesticidas (BAKR, 2002). La formula de corrección de mortalidad se

señala a continuación.

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% de mortalidad corregida = (% m ortali d ad trata m iento - % m ortalidad testi g o) X 100

100 - % mortalidad testigo

Luego de obtener los datos de mortalidad corregidos estos serán sometidos a un

análisis de probit (probabitity unit) que es utilizado para evaluar las toxicidades de los

productos utilizados en patologías de insectos, lográndose conocer la dosis con la que

se obtiene el 50 % de los organismos muertos (FRUTOS, 1995).

Para todas las variables en estudio (mortalidad, desarrollo, alimentación y efectos sub

letales) se realizará una prueba de contraste de Bartlett para determinar si presentan

homogeneidad de varianza y su posterior análisis (ANDEVA) y con la finalidad de

detectar diferencias estadísticas significativas se realizará un test de Tukey (LEVIN y

LEVIN, 1999).

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4 BIBLIOGRAFÍA

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