Genetiki inenjering-tehnologija rekombinantne DNK

OSNOVE MOLEKULARNE GENETIKEGeni sadre instrukcijeza stvaranje proteina

elijahromozomigenigenomProteini deluju pojedinano ili udrueno u kompleksu u obavljanju razliitih elijuskih funkcijaproteiniDNK

Nove tehnologijeGenetiko inenjerstvo (tehnologija rekombinovane DNK)Predstavlja sintezu molekularne genetike, biohemije i mikrobiologije.Rekombinovana DNK predstavlja mol DNK iji se delovi dobijeni iz razliitih organizama vetaki spajaju. Na taj nain dobijaju se hibridni organizmi koji se nikada ne bi pronali u prirodi.

Nove tehnologijeTehnologija rekombinantne DNK obuhvata vei broj tehnika:

Upotreba restrikcionih endonukleaza (enzima)Kloniranje DNK (PCR)Hibridizacija nukleinskih kiselinaSekvencioniranje nukleotidaGenetiko inenjerstvo

Restrikcioni enzimiRestrikcioni enzimi deluju kao molekulske makazePrvi restrikcioni enzimi otkriveni su kod bakterija i imali su ulogu da pobede viruse seckajui njihove gene.

Nizovi nukleotida koji prepoznaju enzimi (restrikciona mesta) su najee PALINDROMI.To su dvostruko simetrini nizovi nukleotida u dvolanoj DNK .Danas je komercijalno dostupno oko 200 restrikcionih enzima.

Restrikcioni enzimi

Tehnike koje se koriste za izolovanje pojedinih gena iz hromozoma i njihovo ugraivanje u mol DNK, koji se mogu uneti u eliju u kojoj e se autonomno replikovati umnoavajui ispitivani gen, poznate su kao KLONIRANJE

Kloniranje DNK

Kloniranje Kloniranje podrazumeva umnoavanje-dobijanje velikog broja gotovo istovetnih kopija

Donedavno ovaj termin je podrazumevao proceduru u kojoj se reprodukcijom jedne elije izolovane iz populacije elija, dobijao klon, odnosno skup gotovo identinih elija.

KloniranjeKloniranje jednog segmenta DNK obuhvata sledei niz postupaka:Isecanje eljenog fragmenta DNK iz molekula DNK uz pomo enzima (restrikcione endonukleaze) koji e presei mol DNK na tano odreenom mestu.Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim mol DNK koji ima sposobnost autonomne replikacije (vektori za kloniranje-plazmidi ili virusne DNK). Spajanje fragmenata DNK sa vektorom postie se pomou enzima DNK ligaze.Unoenje rekombinovanog mol DNK u eliju domaina iji e enzimi obezbediti njihovu replikaciju umnoavanje.Indentifikacija elije domaina u kojoj se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.

Transfer i kloniranje (umnoavanje) insulin genaKloniranje gena- izdvajanje gena DNK davaoca, njegovo umetanje u vektore (prenosioce) i ugraivanje u organizam domaina pomou metoda genetskog inenjeringa.Gen davaoca moe da se umnou u velikom broju kopija u organizmu domaina.Kloniranje gena omoguava proizvodnju neograniene koliine proteina.

Tehnike direktnog unoenja DNKElektroporacija- stvaranje privremenih pora u plazmalemi korienjem elektrinih impulsa. Fragmenti DNK (geni) kroz pore u plazmalemi ulaze u eliju domaina. Genetiki pitolj- Male estice plemenitih metala prekrivaju se odabranim genom i pomou genetikog pitolja unose se u dublje slojeve elije ili tkiva.

Mikroinjektiranje uz pomo mikropipeta vrlo malog prenika (0.05-0.10 m) unose se geni u jedro elije.

KloniranjeKloniranje animalnih elija danas je gotovo rutinaOvakav vid kloniranja omoguio je: perspektive za terapiju i leenje naslednih bolestiispitivanje funkcije pojedinih genaindentifikaciju regulatornih regiona koji kontroliu ekspresiju genaproizvodnju proteina koji se koriste u biotehnolokoj industriji i farmacijidobijanje transgenih ivotinja

Kloniranje danas

Reproduktivna tehnologija za produkciju genetiki indentinih individua.

Klonalne linije: Populacije individua koje su genetiki ekvivalentne.

Postupak kloniranja sisara

KLONIRANJE KRAVA

Postupak transplantacije jedra

U jajnu eliju sisara naslonjenu na tupu pipetu (levo) unosi se genetiki materijal (jedro) diploidne elije tankom pipetom (desno)jedro

Dolly kotska ovca klonirana iz tkiva mlene lezde odrasle individue.Pre nego to je nastala, naunici su verovali da klonovi mogu biti produkovani samo iz nediferenciranog embronalnog tkiva.Nastala je iz 276 pokuaja kloniranja

Dolly, prva klonirana ovca

`` Polly``Istraivacki tim koji je stvorio ovcu Dolly objavio je rodjenje druge klonirane ovce Polly koja je u svojoj genetskoj ifri imala prilagodjeni humani gen koji je ugradjen u fetus ovce u labaratorijskim uslovima.

Cookies and Cream, su dve klonirane krave Holstein rase. Dobile su zdrave potomke mukog i enskog pola na privatnoj farmi Infigen u SAD. To je farma sa najveim brojem (165) kloniranih krava i ovaca.

Kloniranje flourescentne make (2007)Nauni tim sa junokorejskog Univerziteta Gjeongsang promenio je gen odgovoran za boju koe maaka. Zbog flourescentnog proteina u njihovim elijama koe, make s tom modifikacijom pod UV svetlom izgledaju crvenkasto.

Lanana reakcija polimeraze (PCR)Metod za kloniranje (umnoavanje) DNK

K. Mullis 1983.

Osnovni princip PCR amplifikacije eljenog segmenta DNK je oponaanje procesa DNK replikacije.

PCRZa primenu PCR neophodni su:DNK matrica (jednolana DNK denaturisani dupleks DNK)Prajmer kratke sekvence DNK sastavljene od 20-tak nukleotida koje slue za odreivanje poetka umnoavanja fragmenta DNK koga elimo da izolujemo. Na taj nain poinje proces polimerizacije na tano odreenoj sekvenci DNK odreenoj sa 2 prajmera, na svakom kraju po jedan (3 i 5). Nukleotidi gradivni blokoviEnzim DNK polimeraza koristi DNK matricu za sintezu komplementarnog DNK lanca

PCR- DNA xeroxingMatricaPrajmeriNukleotidiDNK polimeraza

PCRPCR- faze Denaturacija (90-95C)Raskidanje vodoninih veza izmeu dva komplementarna lanca DNK pod uticajem temperatureHibridizacija (45-65C)Uspostavljanje vodoninih veza i vezivanje prajmera za razdvojene lance DNKElongacija (ampifikacija) prajmera (72-75C)Dobijanje velikog broja kopija eljenog fragmenta pod dejstvom enzima DNK polimeraze.

Denaturacija

Hibridizacija i ekstenzija

Hibridizacija nukleinskih kiselinadenaturacijahibridizacijadetekcija

PCR analiza

DNK polimerazaTaq polimeraza Termostabilana DNK polimeraza, dobijena iz termofilnih bakterija, ne razgrauje se na visokoj temperaturi.Taq polimeraza omoguila je automatizaciju procesa PCR u posebnim aparatima (Thermal cycler). Ciklus polimerizacije ponavlja se 25-45 puta.Na ovaj nain dobija se eljena sekvenca DNK u velikom broju primeraka (priblino 228, preko milijardu kopija) koja se dalje analizira da bi se odredila primarna struktura gena.

PCR je ciklina reakcija u kojoj se ponavljaju tri koraka: denaturacija, hibridizacija i elongacija. Na kraju treeg ciklusa eljena sekvenca je umnoena 8 puta.

PCRUspenost PCR reakcije proverava se elekroforezomElekroforeza predstavlja metod u kojem se na posebnim gelovima od skroba, agara ili poliakrilamida uz pomo struje konstantnog intenziteta (5V/cm) vri razdvajanje i vizuelizacija kretanja nukleinskih kiselina i proteina. Slika 1. Odreivanje varijanti A i B u genu za -kazein primenom PCR-RFLP metode

PCR

PCRU odreenim sluajevima za analizu amplifikovanog segmenta neophodno je uraditi i dodatne procedure kao to su: HIBRIDIZACIJA (Souther blot)DIGESTIJA RESTRIKCIONIM ENZIMIMASEKVENCIONIRANJE

SEKVENCIONIRANJEMetod relativno jednostavnog i brzog odreivanja redosleda nukleotida u DNK (primarna struktura) uz pomo posebnog i vrlo skupog aparata-SEKVENCER

Princip rada DNK sekvenatora

DNK bibliotekaDNK biblioteka predstavlja kompletan genom nekog organizma u vidu fragmenata razliitih duina dobijenih u postupku kloniranja.DNK BIBLIOTEKA-GENOMSKA BIBLIOTEKA u idealnom sluaju sadri sve delove genoma jednog organizma.Da bi se skratio postupak kloniranja nekog gena danas se konstruiu biblioteke u kojoj su zastupljeni samo geni i delovi gena koji kodiraju proteine. Ovakav nain kloniranja podrazumeva da se iz ispitivanog tkiva izoluju ukupne iRNK koje e posluiti za sintezu komplementarnih DNK (cDNK).

Korist i rizici kloniranjaKorist:Poveanje genetske vrednosti individuaPoveanje uniformnosti velikog broja osobinaRizik:Smanjenje genetike varijabilnostiPoveanje inbridingaMogunost da klonovi postanu patogeni i neotporni na stres i uslove okolineKloniranje nije uvek uspeno.

Transgene ivotinjeUnoenje gena (dela DNK) stranog porekla (druge ivotinjske vrste ili oveka) u genom ivotinja u cilju trajne promene genetskog materijala koje e se preneti na potomstvoDobijene su transgene svinje, koze, ovce, ribe, mieviUpotreba u naunim istraivanjima i u komercijalne svrhre (proizvodnja proteina, lekova, organa, tkiva za transplantaciju I veca proizvodnja hrane)

Transgene ivotinje1983. R. Brinster ubizgao je je gene humanog hormona rasta u embrion mia (super mi). 1984. Naunici su spojili elije embriona koze i ovce dobili himeru, to je prvi primer ukrtanja dve razlicite ivotinjske vrste.

Transgene ivotinje 1996. dobijena je transgena koza ``Grace`` sa genom koji je u stanju da proizvodi BR 96 monoklonalno antitelo koje se koristi u humanoj mediciniIsta biotehnoloka kua je napravila transgenu kozu koja proizvodi anti trombin (lek protiv zgruavanja krvi).1997. stvoreno je transgeno tele po imenu `` Rosie`` ono je u stanju da proizvodi mleko sa alfa laktoalbuminom (humani protein kojim se hrane prevremeno rodjena deca) Postoje i transgene svinje koje proizvode humani hemoglobin

Postupak dobijanja transgenih ivotinja

Dobijanje ivotinja sa poboljanim osobinama za proizvodnju hraneU Australiji genetikim inenjeringom su stvorene nove rase svinja i ovaca koje imaju za oko 30% vei prirast i za nekoliko nedelja ranije dospevaju na trzite od tradicionalno gajenih rasa.Genetiki su izmenjene koke koje kvocaju (nose 20% manje jaja). Blokiranjem gena koji proizvodi hormon prolaktin prirodni materinski instinkt kvocanja je nestao a istovremeno je nosivost poveana.

Dobijanje ivotinja sa poboljanim osobinama za proizvodnju hraneIstraivaki timovi rade na dobijanju lososa koji ne bi imao samoubilaki nagon vec bi ostajao na otvorenom moru ime bi se poveala produkcija ove vrste riba.Veina istraivanja sa ribama usmerena je na dobijanje klonova u cilju poveanja proizvodnje (plava revolucija u morskoj biotehnologiji naspram zelene revolucije u proizvodnji biljne hrane).

Primena rekombinovane DNK u farmaceutskoj idustrijiSomatostatin prvi humani horman, proizveden u E.c.Humani hormon rasta E.c.Humani insulin - E.c.Interferon- antivirusna i delimino atikancerogena supstancaRelaksin itd.

Vakcine protiv virusaPostupak proizvodnje vakcina zapoinje gajenjem virusa u organizmu neke pogodne ivotinjske vrste ili u labaratorijskim uslovima.Pre nego to se ubrizgaju u organizam oveka virusi se usmrte ili oslabe. Imunoloki sistem organizma na prisustvo stranih tela odgovara stvaranjem antitela. Njihovo stvaranje traje dugo ali oslabljeni ili umrtvljeni virusi nee naneti tetu organizmu dok imuni sistem bude bio potpuno spreman da odbije ive snane viruse istog tipa pri njihovom kasnijem eventualnom prodoru u organizam.

Vakcine protiv virusaNajvece potekoce su kako i na koji nain dobiti velike koliine odredjenog virusa (npr. H1N1). Virusi su jednostavne gradje (sastoje se iz genetikog materijala uvijenog u protein). Imuni sistem prepoznaje virus samo prema spoljnim karakteristikama, dakle samo prema proteinskom omotacu.Na osnovu ovoga genetiari proizvode vakcine tako sto u bakteriju uvode gen sa kodom za deo proteina iz proteinskog omotaca koji izaziva bolest (grip). Bakterije stvaraju samo virusni protein a ne i cele viruse.