La diversidad y la especificidad simbiótica del Rhizobium asociado con fréjol (Phaseolus vulgaris L.) en los centros de origen del cultivo: Ecuador y México.

BosquejoBosquejo

* Importancia del frejol (Phaseolus vulgaris)

* Centros de origen

* Diseminacion del cultivo y su Rhizobium

* Objetivos de la investigacion

* Diversidad del Rhizobium asociado con P. vulgaris en Ecuador y comparaciones con el Rhizobium de Mexico.

* Filogenia del Rhizobium asociado con el frejol en Minnesota como area secundaria de produccion frejolera. * Conclusiones

* Agradecimientos

El frejol (P. vulgaris) es la leguminosa mas inportanteen el mundo (www.CIAT.CGIAR.ORG).

“Alimento perfecto” : proteina, fibra, carbohidratos,vitaminas, minerales.

En paises en vias de desarrollo: alimentacion prioritaria. Los rendimientos son bajos (~ 0.50 ton/ha)

Causas: Abastecimiento de agua inadecuado, enfermedades, condiciones pobres del suelo (ej. bajo N).

Centros de origen de P. vulgaris

Mesoamerica

Andes (South America)4400BP

2500BP

Diseminación del fréjol

2000 BP

700 BP 500 BP

Transporte del frejol desde los centros de origen a otrasregiones del mundo.

Rhizobium transportado como contaminante de semilla.

Rhizobium sobrevive en la semilla de tres a cinco anos despues de la cosecha. (Perez-Ramirez et al. 1998).

En su nuevo hábitat el Rhizobium habría sido expuesto a diferentes condiciones ambientales.

Efectos “founder”.

Posibilidad de otros Rhizobium de asociarse con Phaseolus.

A parte de implicaciones de la diversidad de Rhizobium loscambios en microsimbionte podría impactar la eficiencia dela interacción hospedero-Rhizobium, nodulación y la fijación de nitrógeno.

Esta investigación examinó:

- Diferencias en la biodiversidad del Rhizobium asociado con frejol en Ecuador y Mesoamerica.

- La contribucion de otros “rhizobios” infectivos en frejol a la nodulacion y fijacion del N2 .

- Las consecuencias del transporte del hospedero y su Rhizobium sobre la simbiosis con P. vulgaris en Minnesota como region secundaria de produccion de frejol.

Diversidad del rhizobio asociado con Phaseolus vulgaris L.en Ecuador, y comparaciones con el rhizobio.de México.

Loja-Ecuador Photo CIAT

Diferencias entre los acervos geneticos de frejol Andino y Mesoamericano

- Morfologicas y agronomicas (Singh et al. 1991)

- Moleculares (phaseolin) (Gepts and Bliss, 1996; Koenig et al. 1990)

- Geneticas (Koinage and Gepts, 1992)

Debilidad del Hibrido F1

genotipos (phaseolin) “S” x “T” or “C”

Crecimiento reducido Chlorosis en la hoja Raices adventicias

Letalidad

*

- Topografía:

Ambientes unicos y aislados

Aislamiento geografico y genetico

- Co-evolution Frejol-Rhizobium

- Diferencias en la diversidad de Rhizobium

Rhizobium nodulando Phaseolus:

* Rhizobium etli: asociado con frejol en los centros de origen (Souza et al. 1994).

* R. tropici* R. leguminosarum bv. phaseoli* R. giardinii* R. gallicum* Bradyrhizobium spp.* Dalea sp. Rhizobium

Estudios sobre la diversidad de Rhizobium asociado con fréjol

* Enfasis en R. etli y R. tropici

* Rhizobium del centro de origen Mesoamericano Diversidad genetica alta (Pinero et al., 1988; Souza et al., 1994).

Inclusion del Rhizobium de Dalea ?

Dalea spp. son nativas de esta region. (Barneby, 1981, 1988, 1990)

Rhizobium de Dalea nodula y fija N2 con frejol. (Graham et al., 1999)

É s t e e s t u d i o:

1. Contrasta Rhizobium de los Andes (Ecuador) y Mesoamerica usando métodos fenotípicos y filogenéticos.

2. Examina diferencias en el número y diversidad del Rhizobium de fréjol aislados del suelo usando germoplasma Andino (Ecuador) y Mesoamericano como hospederos.

Materiales y Métodos

Cepas (103) : Ecuador, Mexico, Peru, Argentina. Cepas control.

Caracterizacion fenotipica:

- Fuentes de C and N- Antibioticos- Metales pesados- Vitaminas- Tolerancia a NaCl- Crecimiento en pH: 4.5, 5.0 and 8.5- TY-Ca and LB

Crecimiento (28C): 7 days

Phaseolus

Macroptilium

Leucaena

Dalea

Coronilla

OnobrychisNodulacion evaluada a los 21 dias

Indices de similaridad: NTSYSpc,UPGMA.Analisis de “clusters”

Rango hospedero

Elementos repetitivos (BOX) conservados

Amplificación de las regiones Genómicas usando el primer BOX

Génoma bacteriano

T

Time35 ciclos PCR

1. 2. 3.

Principio del “fingerprint” genómico BOX-PCR

Source: Rademaker et al., 1997

Comparar cepas de Ecuador y Mexico (celulas enteras). Estudiar biodiversidad del Rhizobium aislado del nodulo.

BoxA1R- PCR Versalovic et al. 1994

2036

220

1636

1018

506

1 Kb DNA ladder (bp)

Análisis asistido por computadoraAnálisis asistido por computadora

“Fingerprint”Captura de la imagenConversionNormalizacionCurva densitometricaCorrelacion Pearson’s UPGMAAnalisis de “clusters”Dendograma

Courtesy: Dr. Mike Sadowsky

Diversidad Genética (DG):

Shannon-Weaver index (Goodwin et al., 1995; Mahuku et al., 1998; Coutinho et al., 1999)

H = - Σ pi x ln pi H = DG pi = frequencia of aislamientos pertenecientes a cada clase de bandas. ln = log natural

aislamientos

Número más probable (Fundas de crecimiento):

Para determinar la influencia del origen del cultivar de fréjol en el número (cells/g soil) y diversidad de Rhizobium.

Suelos: Poconichim (Chiapas - Mexico)

Cotacachi, Caňicapac, Mater (Ecuador).

Cultivares: Puebla 152 (Mexico)

Bolones: 6, Caňicapac, y Mater (Ecuador).

Dalea aurea y D. leporina

- Cuatro reps por cada dilucion 10X del suelo

- Crecimiento de plantas en camaras de crecimiento

(14h fotoperiodo y 25/18 C dia/noche T).

- Cosecha: 5 semanas despues de inoculacion

- NMP (cells /g soil): MPNES (NifTAL,HI)

- Nodulos usados para estudios de diversidad.

Resultados:

Relaciones fenotípicas Dos principales clusters:

1. Todos los aislamientos de México pero incluyo cepas nodulando Dalea leporina y/o Macroptilium and Leucaena, a mas de P. vulgaris.

1

2

2. Rhizobium de losAndes - Algunos “subclusters” - Alta diversidad - Nodulación: P. vulgaris

D

M

SCepas de:

M = MexicoD = DaleaC = Region Central (Ecuador)N = Region Norte (Ecuador)S = Region Sur (Ecuador)

P1

P2

N and C

D

M

M

(BOXA1R-PCR) Relaciones genéticas entre aislamientos de Ecuador y México

Suelo / Hospedero NMP D.G. (cells/g soil)

Poconichim/ Puebla 152 6.09 x 105 3.29

Poconichim/ Bolon 6 3.59 x 105 3.50 ***

Poconichim / Dalea 28

Cotacachi / Puebla 152 3.59 x 103 2.56

Cotacachi / Bolon 6 3.36 x 103 2.59

1.

2.

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]BOXA1R

100

95908580757065

BOXA1R

B22

B4

B24

B1

P14

6917

B3

P22

P24

P13

P16

B11

B17

P4

P21

B21

P7

1632

1899

D14

D2

D4

D11

D24

D16

D15

D23

6815

Suelo: Poconichim (Chiapas) Hosp: Puebla (local) Bolon 6 (no local) Dalea

Dalea rhizobia

Phaseolus rhizobia

UMR1632 (R. etli)

Limitada contribucion del Rhizobium de Dalea

- Baja población en el suelo- Limitada competitividad

Suelo / cultivar NMP D.G.

Mangucusana / Cargabello 2.30 x 105 3.30

Mangucusana / Bolon (local) 2.30 x 105 3.30 NS

Mater / Imbabello 7.81 x 105 2.68

Mater / Machete (local) 3.75 x 106 2.81***

Canicapac / Imbabello 3.59 x 105 3.35

Canicapac / Bolon (local) 5.46 x 105 3.54***

Comparación del Rhizobium aislado de sitios en el Sur del Ecuador

1.

2.

3.

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]BOXA1R

100

908070605040302010BOXA1R

1899

6815

CB1-6

CB1-13

CB1-23

6917

CB1-11

CI-13

CI-18

CI-23

CI-16

CI-19

CI-5

CI-20

CB1-10

CB1-22

CB1-12

CB1-18

CB1-8

CI-8

CI-10

CI-17

CB1-5

CB1-14

CB1-2

CB1-15

CB1-19

CB1-4

CI-12

CI-2

CB1-1

CI-24

CI-21

CI-15

CI-11

CI-22

CI-1

CI-6

1632

CB1-9

CB1-20

CB1-7

CB1-25

CB1-24

CB1-3

CB1-17

CB1-16

CI-3

CI-25

CI-7

BOX A1R-PCR

Suelo: Caňicapac (C )

- Bolon local (B1)- Imbabello (I)

CB1

CB1

CB1

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]BOXA1R

100

95908580757065605550454035302520

6917

MMA-14

MMA-15

MMA-21

MMA-18

MMA-25

MMA-16

MMA-1

MMA-5

MMA-7

MMA-10

MMA-8

MMA-2

MMA-13

MMA-6

MMA-17

MMA-24

MMA-11

MMA-19

MMA-22

MMA-12

MMA-3

MMA-4

MMA-20

MI-15

MI-20

MI-13

MI-10

MI-5

MI-3

MI-16

MI-25

MI-19

MI-7

MI-17

MI-22

MI-14

MI-6

MI-23

MI-2

MI-4

MI-18

MI-8

MI-12

MI-11

MI-9

MI-24

MI-21

MMA-23

1632

MMA-9

6815

1899

Cultivar Machete (MA)

Cultivar Imbabello (I)

Suelo Mater (M)BOXA1R-PCR

Similaridad con la cepa UMR1632 (R. etli).

Ningun aislamiento se agrupo con otrascepas “referencia”.

LOCAL

Aislamientos de los Andes:

- La mayoría perteneció a R. etli

- Rango hospedero limitado

- Característica de la reiteración del “gene nifH”

Bernal, 1993

Hemos demostrado:

1) Separacion fenotipica y filogenetica significante.

2) Cultivar puede influenciar la diversidad genetic de las cepas.

3) Otros rhizobios a mas de R. etli pueden jugar un rol en la nodulacion del frejol en Mesoamerica.

- Co-evolucion Frejol-Rhizobium

- Especificidad

- Factores que contribuyen con las diferencias en la respuesta simbiotica (Andes). - Implicaciones en el campo.

- El frejol: deficiente en nodulacion y fijacion del N2

Filogenia del Rhizobium asociado con frejol en Minnesota como una region secundaria de produccion .

Restos de semillas de fréjol:

* Mogollons (New Mexico) 300 BC* Hohokam ( Sur de Arizona) 500 AD* Anasazi (Norte de Arizona) 500 AD* Gran Planicies (1070 AD)* Norte-Noreste (1300 A D)

- Minnesota: 5th en la produccion de frejol en los U.S.

- 80000 ha son cultivadas anualmente en MN.

- Simbiosis podria haber resultado del Rhizobium:

* contaminante de la semilla * Rhizobium de pradera: Dalea spp.

- Dalea y otras leguminosas de pradera han existido en Minnesota por casi 7000 anos.

- Desde 1800’s han sido restringidas a pequenas areas rodeadas por campos agricolas.

Fréjol en Minnesota es raramente inoculado

- R. etli ? - Rhizobium (Dalea spp.) ?

Objetivos:

- Examinar el Rhizobium asociado con fréjol en Minnesota.

- Determinar si efectos “founder” en R. etli o la introgresion de otros micro-symbionts de leguminosas de pradera podrian estar afectando la nodulacion y la fijacion del N2 en frejol.

Suelos:

- Staples (S)

- Verndale (V)

- Park Rapids (PR)Areno-arcillosos (Udic- Argiborolls)

77.3%, 92.7% and 89.4% arena, respectivamente.

Materiales y Métodos

Cepas “ referencia ”:

UMR 1632 ( R. etli ) UMR 1899 ( R. tropici ) UMR 6917 ( R. giardini ) UMR 6918 ( R. gallicum ) UMR 6815 ( Dalea Rhizobium )

Cepas “referencia” adicionales:

Simbiontes de: - Oxytropis, Astragalus (Laguerre et al., 1997)

- Medicago (Eardly et al., 1992)

Representantes de:

- R. etli - R. spp. (Dalea) - R. gallicum - R. giardinii - R. leguminosarum

- Número Más Probable (cells/g soil): Bean cultivar : Montcalm

- Análisis de “fingerprints” BOX A1R-PCR (Nodules from plants used in MPN) - Análisis cuantitativo (Bio-Numerics)

- Diversidad Genética (DG)

Cepas representativas: S34, S20, S3, V34, V33, PR30, PR7.

Análisis del gene 16S RNA (van Berkum and Fuhrmann, 2000, USDA-Beltsville )

Fatty Acid-methyl ester (FAME) (Jarvis and Tighe, 1994). Analytical Service Laboratory (VT-USA)

Comparison fenotípica

Crecimiento en medio BYMA con:- Nalidixate de sodio (40 ugmL-1)- Streptomicina (3-5-10-25-50-100 ugmL-1)- Spectinomicina (5 ugmL-1)- Rifamicina (10 ugmL-1)

- LB- PY-Ca- TY-Ca- Medio TY pH 4.5 y 8.5- Eritritol como fuente de C- Produccion de melanina

Rango hospedero

Phaseolus vulgaris (cv Montcalm)Dalea leporinaOnobrychis viciifolia (sanfoin)Medicago sativa (cv Saranac)Macroptilium atropurpureum (siratro)Coronilla varia (crownvetch)Leucaena leucocephala

Zona de pelosradicularesmaduros

Zona de pelosradiculares endesarrollo

Zona sin pelos radiculares(celulasinfectibles)

Marca del apice radicular

Source: Bhuvaneswari et al., 1981

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]BOXA1

100

95908580757065605550

PR13

PR12

PR17

PR7

PR9

PR18

PR22

PR29

PR35

6815 (Dalea)

S25

V24

PR32.

V25

V36

V32

V23

V33

V26

6917(H152)R.giardinii

PR30

PR31

V27

S14

V35

V30

S21

S6

S16

S3

S7

S29

S31

S11

S27

S2

S20

S33

S1

6002Rleguminosarum

6918(R602)R.gallicum

PR3

PR19

V34

V21

V19

V28

V20

V31.

1632 (R.etli)

1899(R.tropici)

S34

S24.

Rhizobium sp.(Dalea)

R. giardinii

R. leguminosarum

R. gallicum

R. etliR. tropici

Relación filogenética entre aislamientos del nódulo.Sitios: Staples, Verndale, y Park Rapids (MN).

Resultados

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]BOXA1

100

95908580757065605550

3121(O.riparia)

USDA1002(S.meliloti)

6815 (Dalea)

6871(Dalea)

PhF29 (R.gallicum)

PhP222 (R. gallicum)

PhI21(R. gallicum)

6918(R602)R.gallicum

6002Rleguminosarum

PR30

PR31

V27

S14

V35

V30

S21

S6

S16

S3

S7

S29

S31

S11

S27

S2

S20

S33

S1

V25

V36

V40

V32

V23

V33

1580 R.etli (M)

V26

1057 R. etli (M)

PhF28 (R. giardinii)

Ro17 (R. giardinii)

H241(R. giardinii)

6917(H152)R.giardinii

Ro68 (R. giardinii)

S25

V24

PR3

PR19

V34

V21

V19

V28

V20

1577 R. etli (M)

1632 R. etli (M)

PR13

PR12

PR17

PR7

PR9

PR18

PR22

PR29

PR35

1899(R.tropici)

3135(A.sinicus)

3119 (O. riparia)

S34

3348(A.alpinus)

6803(Dalea)

1

2

34

5

6

7

Siete clusters mayores fueron generados.

V23, V32, V26 (Verndale) se agruparon con las cepas de R. etli UMR1057 y UMR1580.

El resto de cepas (42) no fueron similares a cualquier otra especie de Rhizobium usadas como referencias.

Relación filogenética entre rizobios del nódulo.Representativos de Staples, Verndale, y Park Rapids,y cepas de referencia adicionales.

Cepas Fatty acid PR30 S3 S20 V33 V34 PR7 S34 (acidos grasos) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 15:0 2OH 0.98 1.05 1.17 1.02 1.08 nd 1.07 16:0 2.22 2.10 2.68 2.69 2.55 6.49 4.86 16:0 3OH 0.85 1.09 0.97 0.88 1.06 3.57 0.80 17:0 0.44 0.36 0.81 1.23 0.81 1.44 nd 18:0 9.53 9.09 10.20 7.87 8.03 3.61 11.47 19:0 cyclo w8c 6.79 11.04 13.72 6.90 10.79 34.94 7.25 20:3 w6,9,12c 0.95 1.73 1.44 1.31 1.37 1.45 1.18 Unknown 14.952 0.83 nd 0.64 1.06 0.61 0.45 0.91 Unknown 18.080 1.88 1.95 5.83 nd 4.81 0.62 5.14 Sum. feature 3 5.97 5.73 5.51 6.29 5.37 1.25 6.67 Sum. feature 4 0.57 0.44 0.45 nd 0.59 0.31 0.83 Sum. feature 7 68.97 64.84 54.97 70.09 62.56 39.42 59.83

Sum. feat.3: 12:0 ALDE and unknown 10.928Sum. feat.4: 16:1w7c/15 iso 2OH and 15:0 ISO 2OH/16:1w7cSum. feat.7: 18:1 w7c/w9t/w12t and 18:1 w9c/w12t/w7c

Principal Component 1

Prin

cipa

l Com

pone

nt 2

R. leguminosarumR. gallicum

R. etli

R. giardinii

S20

V34S3

S34

PR30

V33

*

20

* *

**

*

* **

* * ***

***

**

**

**

*

1 *

-11.759 3.471 18.701 33.930 49.160 64.390

10.317

15.448

20.578

25.708

30.839

35.969

41.100

46.230

*2

3 4

5

67

9

10

11

12

13

14

15

16

23

24

25 26

27

*21

22

18

19

17

8

PR7

R. tropici

FAME(ácidos grasos)

Cepa BOX-PCR N0 Cepa de refer. FAME 16S rRNA Grupo cepas mas similar

PR30 1 3 Ninguna R. gallicum R. leguminosarum

S3 2 11 Ninguna R. etli R. leguminosarum

S20 3 3 Ninguna R. leguminosarum R. leguminosarum

V33 4 4 Ninguna R. gallicum R. etli

V34 5 7 R. etli R. etli R. leguminosarum

PR7 6 6 Ninguna R. rhizogenes R. tropici

S34 7 1 Rhizobium sp. R. leguminosarum R. leguminosarum (Dalea)

Un numero significante de “rizobios” deStaples, Verndale y Park Rapids presentan un considerable “overlap”.

R. leguminosarum

R. etli R. gallicum

Se justifica un analisis mas detallado de sus diferencias y semejanzas.

Suelo / Hospedero NMP D.G (cells/g soil)

Staples / Montcalm 2.30 x 105 2.96

Verndale / Montcalm 3.59 x 105 2.99NS

Park Rapids / Montcalm 6.13 x 104 2.98

Mexico: 3.39 Ecuador: 3.01

Ni

R. etli ni Rhizobium (Dalea) son contribuyentes mayores a la diversidad de Rhizobium en Staples, Verndale y Park Rapids en Minnesota

30

35

40

45

50

55

60

65

3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5

U M N ( mm )

P R

N (

% )

6815

6917 S3

S25

V34 S34

PR7S20

PR30

6918 1899

V33

PR29

PR9

1632

Rhizobium sp. (Dalea)

R. giardinii

Velocidadad deNodulación.

Baja población de R. etli ?

- Uso persistente de streptomicina en la semilla.

- Las cepas PR30, S20, PR7, S34 fueron tolerantes a 5 –10 ug/mL streptomicina. [Ninguna cepa “referencia” creció en 5 ug/mL, excepto Ro17 (R. giardini) and UMR1899 (R. tropici)].

- Analogía a la tolerancia de metales en suelos contaminados. (Giller,1998)

Actividades actuales:

- Fincas comerciales de frejol (adicionales)

- Areas “virgenes” en “villas” de Nativos Americanos.

- Fincas “organicas”.

Origen de la semilla en la region?

Conclusiones

Significante separación fenotípica y filogenética. Efecto del cultivar local o introducido (implicaciones en el

campo).

Otros “rizobios” diferentes a R. etli pueden jugar un rol en la nodulación del fréjol en Mesoamerica.

Diferencias marcadas de las cepas de MN comparadas con las cepas de Mesoamerica y Andes.

“Overlap” : R. etli, R. leguminosarum, R. gallicum.

Ni Rhizobium. giardinii ni R. de Dalea son competitivos in nodular fréjol.

Efecto de las prácticas agrícolas en la diversidad

Agradecimientos

Peter Graham (Advisor) Iris Charvat (Thesis reviewer)

Michaell Russellee (Thesis reviewer)

Terry Cooper

Carroll Vance

Christopher Bingham

Phillippe Seguin Catherine Brown Johanna Keyes

Rhizobium Research Lab.

PeterIreneBeckyJulie

- Microbial Ecology Lab.

- E. coli Lab.

- Crop Physiology Lab.

- FUNDACYT (Ecuador) - NSF Biocomplexity

- CRSP

Amazon Region-Ecuador