Földigiliszta Földigiliszta reproduktivitási tesztreproduktivitási tesztOECD 222OECD 222

Csató Henrietta Enikő 2010.12. 06.

A teszt típusaA teszt típusaLaboratóriumiEgy fajt alkalmazó

+ Könnyen elvégezhető laboratóriumban

+ Nem igényel drága műszereket- Kicsi a környezeti realizmusuk

Állati Krónikus (reproduktivitási)

◦ Hosszú idejű vizsgálat◦ Koncentráció–hatás görbe alapján

grafikusan vagy statisztikai módszerekkel meghatározott értékeket szokták megadni (NOEC, NOEL, NOAEC, NOAEL, LOEC, LOEL, MATC)

A tesztorganizmus A tesztorganizmus ((Eisenia fetida – Eisenia fetida – trágyagilisztatrágyagiliszta)) Gyűrűsférgek törzsébe tartozik (nyeregképzők

osztálya) Testük gyűrűzött, hengeres, csupasz, nyálkás bőr

fedi Bőrük élettani funkciói:

◦ Légzés◦ Fényérzékelés◦ Védekezés◦ Mozgás (összenőtt az izomzattal)◦ Bőrtömlőjéből alakítja ki szaporító szervét –

váladékából a petéit tartó gubót képzi A talajban lévő növényi anyagokat trágyává

alakítják át, mellyel javítják a talaj minőségét. A földigiliszták jelenléte a talaj egészségét jelzi. Táplálkozásukkor a humuszos talaj egésze

áthalad a bélcsatornájukon innen az „ecosystem engineers” elnevezés

A tesztmódszer A tesztmódszer A vegyi anyagok toxicitásának mérése a

földigiliszták szaporodásgátlásán alapszikA vizsgálat során felnőtt

földigilisztákat tesznek ki a vizsgálandóanyag különböző koncentrációinak◦ melyet a talajba, vagy annak

felszínére raknak Az eljárás specifikusan alkalmazható a teszt céljától

függően A tesztben alkalmazott koncentrációsort aszerint kell

beállítani, hogy az szubletális és letális hatást is okozzon egy nyolchetes periódus elmúltával. A halálozásra és növekedésre kifejtett hatásokat a felnőtt egyedek esetén négyhétnyi expozíciós idő után meghatározzák.

A tesztmódszerA tesztmódszerA felnőtt gilisztákat ezután eltávolítják a

talajról, hogy meghatározható legyen a szaporodás, melyet újabb négy hét eltelte után a talajban jelenlévő sarjadékok számával jellemeznek

A szennyezőanyagnak és a kontroll környezetnek kitett giliszták szaporodásának összehasonlításával meghatározhatóvá válik az a koncentráció, melynek nincs megfigyelhető hatása (NOEC) és amely adott mértékű gátlást okoz (vagyis ECx-ek) ◦ Regressziós modellt használnak annak becslésére,

hogy adott koncentráció mekkora százalékú szaporodás-csökkenést okoz.

A tesztmódszerA tesztmódszerAz illékony vegyi anyagokon kívül

alkalmazható az összes vegyianyag-fajta toxicitásának meghatározására

A teszt nem veszi figyelembe a vegyianyag csökkenését a teszt ideje alatt, emiatt a vegyianyag koncentrációjára nem kapunk valós kezdeti értékeket Szükséges lehet egy analitikai meghatározás

A tesztnek ki kell elégíteni a validálási kritériumokat ◦ ehhez referencia mérést kell végezni (1x 1 évben)

Szükséges felszerelésSzükséges felszerelés1–2 literes üveg vagy más

vegyileg közömbös edény Keresztmetszete

hozzávetőlegesen 200 cm2 Az edény teteje gáz- és fényáteresztő

(a giliszták ne tudjanak abból megszökni!)

Normál laboratóriumi felszerelés

szárítószekrény, sztereomikroszkóp, pH- és fotométer pontos mérleg, vízfürdő, hőmérők, páratartalom mérésére alkalmas eszközök, inkubátor, csipeszek, tűk

A mesterséges talaj A mesterséges talaj előkészítéseelőkészítéseA tesztben alkalmazott mesterséges

talaj összetevői:◦ 10% moha tőzeg◦ 20% kaolin agyag◦ 0,3–1,0% CaCO3, az optimális, 5,0–6,0 pH

fenntartásához◦ 70%-osan száraz kvarc homok, túlnyomó

részben finom homok (50–200 mikrométer)A talaj száraz alkotóit homogenizáljukA talajt megnedvesítjük desztillált

vízzel◦ úgy hogy az hozzávetőlegesen a fele legyen a végleges

víztartalomnak, ami a 40–60%-a a maximális víztartó kapacitásnak

A tesztállatok A tesztállatok kiválasztása és kiválasztása és előkészítéseelőkészítéseEisenia fetida vagy Eisenia andrei fajok

használhatóak10 db kerül egy edénybe2 hónapnál idősebb, de 1 évnél fiatalabbAzonos korstruktúrával jellemezhető

tenyészetből kell kiválasztaniEgy csoporton belül az egyedek korbeli

különbsége max. 4 hét lehetLe kell mérni a tömegüket

◦ Előtte le kell őket mosni, és a felesleges vizet szűrőpapírral eltávolítani

A tesztelendő A tesztelendő koncentrációk koncentrációk előkészítéseelőkészítéseA szennyezőanyag talajhoz adása

kétféleképpen történhet: Talajba keverés Felületre adagolás

Azt, hogy melyiket használjuk, a tesztelés célja dönti el, de általában a belekeveréses módszer a javasolt. Oldhatóságtól függően:

Ha az anyag oldódik vízben, akkor desztillált vízben kell oldani a teszt kezdetekor

Ha nem oldódik egy kis mennyiségű szerves oldószerben oldjuk fel, amit ezután hozzáadunk egy kis mennyiségű finom kvarc homokhoz. Az oldószert ezután elpárologtatjuk, majd a homokot az előnedvesített talajhoz adjuk.

A teszt összeállításaA teszt összeállítása1. A nedves táptalajt a teszt edényekbe

rakjuk2. A megmért gilisztákat a talaj felszínére

helyezzükAz egészséges giliszták azonnal lyukat ásnak a táptalajba és eltűnnek a felszínről, azok a giliszták, amelyek a felszínen maradnak 15 perc elteltével is, nem tekinthetők alkalmasnak a teszthez, így azokat el kell távolítani a talajról. Az eltávolított giliszták helyére berakott új egyedeknek is le kell mérni a tömegét, hogy így a kezdésnél meghatározott legyen a kitett giliszták teljesélő tömege és az edény tömege a gilisztákkal együtt. 

3. A tesztelendő anyag hozzáadásaNem adható a talajhoz a gilisztáktelepítésének félórájában(vagy amíg a giliszták a felszínen vannak), hogy nehogy közvetlenül érintkezzen a tesztanyag a giliszták bőrével. A tesztanyaghozzáadás előtt az edény tetejét le kell venni terelőt kell berakni, hogy a permetezés során beadott tesztanyag ne érje az edény falát.

4. A tesztedényeket fedő nélkül kell hagyni egy óráraAz illékony oldószerekelpárologtatásának céljából.

TesztkörülményekTesztkörülményekHőmérséklet: 20 ± 2°C A fényt speciálisan kell beállítani

A teszt során félsötétben lejátszódó, a fény által kontrollált folyamatok mennek végbe, amihez 400–800 lux megvilágítást kell alkalmazni az edényeken belüli területen.

Az edények nem szellőzhetnek Azonban az edények tetejét úgy kell tervezni, hogy azokból a gáz távozhasson a teszt során.

A táptalaj víztartalmának fenntartása Ehhez az edények tömegét periodikusan meg kell mérni. A csökkenést, ha szükséges, desztillált vízzel pótoljuk. A víztartalom nem növekedhet meg a kezdeti érték 10%-ánál nagyobb mértékben.

A giliszták etetéseA giliszták etetése A giliszták testtömegének fenntartását szolgálja Zabdara, tehén- vagy lótrágya

Trágya esetén meg kell vizsgálni, hogy a ló ill. tehén nem állt-e gyógyszeres kezelés alatt, hogy a trágya toxicitása ne befolyásolja a mérést. A trágyának szárítottnak és pasztőrözöttnek kell lennie.

 Előetetést kell végezni egy nem tesztpopulációvalMindezt azért, hogy a trágya minőségről megbizonyosodjanak.

Az első tápanyag-adagot a teszt indítása után egy nappal kapják meg

Hozzávetőlegesen 5 g eleséget adnak a talajhoz, amihez 5–6 ml desztillált vizet is adnak

Hetente 1x etetik meg a gilisztákat az első 4 hét alatt.

Ha nem ennék meg a beadott táplálékot, akkor csökkenteni kell az adagot

Az utolsó adag eleséget a 28. napon adják a talajhoz, a felnőtt giliszták eltávolítása után

A teszt értékelésA teszt értékelésA 28. napon az élő gilisztákat megvizsgálják

és megszámolják. Minden szokatlan viselkedést (pl. azt, hogy nem képesek a földbe ásni) és alaktani változást (pl. nyílt sebek) fel kell jegyezni.

Ezután az összes felnőtt gilisztát eltávolítják az edényből, megszámlálják és lemérik őket.A gilisztát tartalmazó talaj tálcára helyezése segít abban, hogy megtaláljuk a felnőtt gilisztákat. A gilisztákat mérés előtt megmossák és a felesleges vizet szűrőpapír csíkokkal távolítják el.

Az értékelésnél a meg nem talált gilisztákat elpusztultnak nyilvánítják feltételezve azt, hogy azok már szétbomlottak

A talajt további 4 hétre inkubálják, melynek végén megszámolják az ivadékokat, a kokonokat.

  

A végpontokA végpontok1. Letalitás

Viselkedésbeli és alaktani változásokat a jelenlévő ivadékokkal együtt kell feljegyezni. Az LC50 értékeket probit analízissel vagy logisztikus regresszióval határozzák meg (akut toxicitás értékelési módja).

2. Termékenység (ivadékok száma).

Megkapjuk az ECx és NOEC adatokatA krónikus toxicitási tesztek statisztikai értékelésében legfontosabb annak a koncentrációnak a meghatározása, amelynek eredménye szignifikánsan eltér a kezeletlen kontrollétól.

Az értékeléshez az ANOVA statisztikai programot használjákAz ANOVA alkalmazásának célja általában a MATC (a szennyezőanyag maximális, még megengedhető koncentrációja) meghatározása. Az ANOVA variancia-analízis folyamata:◦ Az adatok transzformálása.◦ A kezeletlen kontroll és a vivőanyagot (pl. oldószert) tartalmazó kontroll összevetése, azonosságának

ellenőrzése.◦ A kezelt csoportok variancia-analízise.◦ A kezelt csoportok összehasonlítása annak megállapítására, hogy melyik különbözik a kezeletlen

kontrolltól.

ForrásForráshttp://www.oecdbookshop.org/

oecd/display.asp?K=5LMNG4B4F4S4&DS=Test-No.-222-Earthworm-Reproduction-Test-Eisenia-fetida/Eisenia-andrei

www.wikipedia.hu

Köszönöm a Köszönöm a figyelmet!figyelmet!