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Flusso delle informazioni biologiche
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In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene:
•46 cromosomi (20.000 geni)
•10-15.000 mRNA diversi
DNA RNA Proteine
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Fegato Corteccia cerebrale
Muscolo liscio
Hanno tutte lo stesso genoma, perché queste cellule sono così diverse in morfologia e funzione?
Perché esprimono geni diversi
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ESPRESSIONE GENICA
E’ un processo molto complesso e finemente regolato che permette ad
una cellula di rispondere dinamicamente sia agli stimoli ambientali che alle sue stesse
necessità di cambiamento
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Misurare l’espressione di un gene significa....
Dare una valutazione quantitativa della
presenza dei trascritti (molecole di mRNA) o
delle proteine codificate da quel gene nelle
cellule in esame
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I microarray possono misurare l’espressione di tutti i geni noti in poche ore
Misurare il trascrittoma
Rapidi miglioramenti nella misurazione dell’espressione dei geni
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Trascrittoma
L'insieme di RNA messaggeri espressi da ogni cellula
Proteoma
L'insieme di proteine espresse da ogni cellula
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Espressione genica differenziale: valuta le differenze nell’espressione genica tra due trascrittomi
cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate
un tessuto tumorale a confronto con uno sano
Composto esogeno
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Tecnologia dei microarraySfrutta la capacità di una data molecola
di mRNA di ibridizzare con il DNA stampo da cui è stata generata
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Campione 1 Campione 2
cDNA Cy3Cy5
RNA
+
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Acquisizione dell’immagine mediante scanner
Cy5Cy3
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L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla quantità di molecola target nella soluzione e, quindi, costituisce una stima della quantità di RNA per ciascun gene espresso dalla cellula.
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Tipico esperimento Microarray
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Fonti di confondimento in un esperimento microarray
• Qualità dell’RNA estratto• Retrotrascrizione• Marcatura• Deposizione delle sequenze sul vetrino• Disomogeneità della superficie del vetrino• Ibridazione• Lavaggi• Acquisizione dell’immagine
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REPLICHE SPERIMENTALI
REPLICHE BIOLOGICHE
Stesso RNA testato su due vetrini distinti
RNA proveniente da campioni simili ma distinti
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Analisi computazionale dei dati
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L’espressione differenziale dei geni “più interessanti” viene confermata
con una metodica alternativa
Validazione del risultato mediante Real-Time PCR