flavor ote in

7/29/2019 Flavor Ote In

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XCIX. ISOLATION AND PROPERTIESOF A FLAVOPROTEIN FROMHEART MUSCLE TISSUE

BY FERENC BRUNO STRAUBFrom t h e M o l t e n o I n d s t i t u t e , U n i v e r s i t y o f C a m b r i d g e

( R e c e i v e d 3 0 M a r c h 1 9 3 9 )S r N c E W a r b u r g & C h r i s t i a n [ 1 9 3 2 ] i s o l a t e d t h e f i r s t f l a v o p r o t e i n f r o m y e a s t( f l a v i n p h o s p h o r i c a c i d a s i t s p r o s t h e t i c g r o u p ) a n d B a n g a & S z e n t - G y o r g y i[ 1 9 3 2 ] o b s e r v e d t h e p r e s e n c e o f f l a v i n i n m u s c l e t i s s u e , t h e r e h a s b e e n muchs p e c u l a t i o n o n t h e p o s s i b l e r o l e o f a f l a v o p r o t e i n i n t h e m e c h a n i s m o f o x i d a t i o n si n a n i m a l t i s s u e s . A s y e t , h o w e v e r , t h e r e i s n o i n f o r m a t i o n o n t h e s t a t e a n df un ct i o n o f f l a v o p r o t e i n i n a n i m a l t i s s u e s .I h a v e p u r i f i e d f r o m h e a r t m u s c l e t i s s u e a f l a v i n c o m p o u n d , t h e c o e n z y m eo f t h e d - a m i n o - a c i d o x i d a s e , w h i c h i s n e i t h e r f r e e f l a v i n , n o r f l a v i n p h o s p h o r i ca c i d [ S t r a u b , 1 9 3 8 ] . W a r b u r g & C h r i s t i a n [ 1 9 3 8 , 1 ] a t t h e s a m e t i m e i s o l a t e d t h es a m e compound a n d l a t e r [ W a r b u r g & C h r i s t i a n , 1 9 3 8 , 2 , 3 ] d e s c r i b e d i t a s af l a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e . I h a v e p o i n t e d o u t t h a t i n m u s c l e t i s s u e t h e d i -n u c l e o t i d e i s a t t a c h e d t o s o m e o t h e r p r o t e i n t h a n t h a t o f d - a m i n o - a c i d o x i d a s e .I n t h e p r e s e n t w o r k I s h a l l d e s c r i b e t h e i s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a f l a v o p r o t e i nf r o m h e a r t m u s c l e t i s s u e , ' w h i c h h a s t h i s f l a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e a s i t sp r o s t h e t i c g r o u p . I n a p r e l i m i n a r y n o t e i t h a s b e e n a l r e a d y r e p o r t e d t h a t t h i sf l a v o p r o t e i n i s t h e p h y s i o l o g i c a l a g e n t f o r t h e o x i d a t i o n o f c o z y m a s e i n a n i m a lt i s s u e s ; i t i s i n f a c t i d e n t i c a l w i t h t h e s o - c a l l e d d i a p h o r a s e o r c o e n z y m e f a c t o r[ S t r a u b e t a l . 1 9 3 9 ] . C a t a l y t i c t e s t

T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e f l a v o p r o t e i n d u r i n g t h e p r o c e s s o f p u r i f i c a t i o n w a sf o l l o w e d w i t h t h e h e l p o f t h e d - a m i n o - a c i d o x i d a s e t e s t . T h e 0 2 u p t a ke wasm e a s u r e d i n B a r c r o f t m a n o m e t e r s c o n t a i n i n g c o e n z y m e - f r e e d - a m i n o - a c i do x i d a s e [ S t r a u b , 1 9 3 8 ] a n d d l - a l a n i n e , a t 3 8 0 i n p h o s p h a t e b u f f e r o f p H 7 - 4 .When f l a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e i s a d d e d t o t h i s m i x t u r e , i t w i l l c o m b i n e w i t ht h e p r o t e i n t o f o r m d - a m i n o - a c i d o x i d a s e , t h u s o x i d i z i n g t h e a l a n i n e . T h e v e l o c i t yo f t h e o x i d a t i o n i s p r o p o r t i o n a l t o t h e amount o f d i n u c l e o t i d e a d d e d .I f , i n s t e a d o f d i n u c l e o t i d e , a f l a v o p r o t e i n , w h i c h h a s t h e d i n u c l e o t i d e a s i t sp r o s t h e t i c g r o u p , i s a d d e d t o t h e t e s t , n o 0 2 u p t a k e i s o b s e r v e d . I f t h e f l a v o -p r o t e i n s o l u t i o n i s f i r s t h e a t e d i n a b o i l i n g w a t e r b a t h f o r 3 m i n . , t h e p r o t e i nb e c o m e s d e n a t u r e d , t h u s l i b e r a t i n g f r e e d i n u c l e o t i d e . I f t h i s " b o i l e d " s o l u t i o ni s a d d e d t o t h e t e s t , t h e 0 2 u p t a k e w i l l i n d i c a t e t h e amount o f d i n u c l e o t i d e , i . e .t h e amount o f f l a v o p r o t e i n w h i c h was p r e s e n t i n t h e s o l u t i o n .T h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n 0 2 u p t a k e a n d c o n c e n t r a t i o n o f d i n u c l e o t i d e i n t h et e s t s o l u t i o n h a s b e e n s t u d i e d b y W a r b u r g & C h r i s t i a n [ 1 9 3 8 , 3 ] . T h e y f i n d t h a tc = k . X,8-X

w h e r e k i s a c o n s t a n t , x i s t h e 0 2 u p t a k e i n 1 0 m i n . i n a t e s t c o n t a i n i n g c m o l .d i n u c l e o t i d e p e r l i t r e a n d s i s t h e 0 2 u p t a k e i n 1 0 m i n . i n a t e s t , w h i c h c o n t a i n sP r e l i m i n a r y n o t e [ S t r a u b , 1 9 3 9 ] .( 7 8 7 )


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7 8 8 F . B . STRAUBt h e s a m e a m o u n t o f d - a m i n o - a c i d o x i d a s e a s t h e f o r m e r a n d a n e x c e s s o f d i -n u c l e o t i d e . A s t h i s f o r m u l a i s v a l i d o n l y f o r o n e p a r t i c u l a r c o n c e n t r a t i o n o fd - a m i n o - a c i d o x i d a s e , I h a v e u s e d i t i n a d i f f e r e n t f o r m :

8-X 8c=k. . 10w h e r e c , s a n d x h a v e t h e s a m e m e a n i n g s a s b e f o r e . T h e f a c t o r 1 0 0 i s i n t r o d u c e do n l y t o g i v e k a p r a c t i c a b l e v a l u e , n a m e l y , t h e c o n c e n t r a t i o n o f d i n u c l e o t i d e i nt h e t e s t s o l u t i o n ( m o l . / l . ) w h i c h g i v e s 5 0 u l . 0 2 u p t a ke i n 1 0 m i n . , when t h es a m e a m o u n t o f e n z y m e w i t h a n e x c e s s o f d i n uc l e o t i d e g i v e s 1 0 0 , u l . 0 2 a b s o r p t i o ni n 1 0 m i n . T h e m o d i f i e d f o r m u l a g i v e s t h e s a m e v a l u e o f k f o r d i f f e r e n t v a l ue s o fs , i . e . f o r d i f f e r e n t a m o u n t s o f d - a m i n o - a c i d o x i d a s e , w i t h i n r e a s o n a b l e l i m i t s .T h e v a l u e o f s i n t h e p r e s e n t w o r k w a s u s u a l l y 1 0 0 - 1 5 0 , u l . 0 2 i n 1 0 m i n . T h ev a l u e o f k i n t h i s f o r m u l a w a s f o u n d t o b e 2 - 3 7 x 1 0 - 7 u n d e r t h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s m e n t i o n e d a b o v e , a n d w i t h a i r i n t h e g a s s p a c e o f t h e m a n o m e t e r s .T a b l e I g i v e s t h e r e s u l t s o f o n e s u c h t e s t .

T a b l e IM a n o m e t e r n o . . . . 1 2 3

C o e n z y m e - f r e e d - a m i n o - a c i d o x i d a s e ( m l . ) 1 . 0 1 . 0 1 . 0P u r i f i e d d i n u c l e o t i d e s o l u t i o n ( 5 0 p g . l a c t o - 1 . 0f l a v i n / m l . )H e a t e d f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n ( 0 ' 0 4 7 m g . - 15p r o t e i n / m l . )4-5% d l - a l a n i n e s o l u t i o n 0 - 3 0 - 3 0 - 3P h o s p h a t e b u f f e r 2 - 0 0 - 5 1 . 04 . 0 2 u p t a k e i n 1 0 m i n . a t 3 8 0 0 6 7 . 3 1 3 9, u g . l a c t o f l a v i n i n f o r m o f d i n u c l e o t i d e 0 3 9% l a c t o f l a v i n i n f l a v o p r o t e i n 0 - 5 7S p e ct r o p ho t o m et r i ca l l y f o u n d : 0 . 5 4 % l a c t o f l a v i n .

T h e f a c t t h a t p u r i f i e d f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n s , when a d d e d t o t h e t e s t , d o n o tg i v e r i s e t o a n y 0 2 a b s o r p t i o n , means t ha t t he d i n u c l e o t i d e h a s a much g r e a t e ra f f i n i t y t o w a r d s t h e p r o t e i n o f t h e f l a v o p r o t e i n t h a n t o w a r d s t h e p r o t e i n o f t h ed - a m i n o - a c i d o x i d a s e . I f i n t h e t e s t a d - a m i n o - a c i d o x i d a s e i s u s e d w h i c h i s n o tc o m p l e t e l y f r e e f r o m i t s c o e n z y m e a n d c o n s e q u e n t l y s t i l l s h o w s some 0 2a b s o r p t i o n w i t h o u t a n y a d d i t i o n o f d i n u c l e o t i d e , t h i s 0 2 u p t a k e w i l l d i m i n i s ho n a d d i t i o n o f a p u r i f i e d f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n . T h u s i t a p p e a r s t h a t a s m a l lf r a c t i o n ( 0 - 5 - 1 % ) o f t h e f l a v o p r o t e i n h a s l o s t i t s p r o s t h e t i c g r o u p d u r i n g t h ep u r i f i c a t i o n a n d t h i s f r e e p r o t e i n i s a b l e t o b i n d f l a v i n d i n u c l e o t i d e a t t h ee x p e n s e o f t h e d - a m i n o - a c i d o x i d a s e .When t h e f l a v o p r o t e i n i s h e a t e d d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n , p a r t o f i t b e c o m e sd e n a t u r e d , a n d t h e s o l u t i o n w i l l t h e r e f o r e c o n t a i n f r e e d i n u c l e o t i d e a s w e l l a sf l a v o p r o t e i n ( b o u n d d i n u c l e o t i d e ) . F o r t h i s r e a s o n a c o n t r o l e x p e r i m e n t wasc a r r i e d o u t o n e a c h o c c a s i o n , a d d i n g i n o n e t e s t t h e f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n b e f o r e ,a n d i n t he o t h e r a f t e r , b o i l i n g . T h e f i r s t r e s u l t g i v e s t h e amount o f f r e e d i n u -c l e o t i d e , t h e s e c o n d t h e s u m o f f r e e a n d b o u n d f o r m s ; t h e d i f f e r e n c e r e p r e s e n t st h e amount o f u n d e n a t u r e d f l a v o p r o t e i n .From t h e n a t u r e o f t h e t e s t i t a p p e a r s t h a t a n y p r o t e i n w h i c h h a s t h e d i n u-c l e o t i d e a s i t s p r o s t h e t i c g r o u p w o u l d b e i n c l u d e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n . T h ep u r i f i c a t i o n h o w e v e r y i e l d s o n l y o n e f l a v o p r o t e i n , w h i c h b e h a v e s u n i f o r m l y .T h e r e i s n o i n d i c a t i o n t h a t a n y o t h e r s i m i l a r f l a v o p r o t e i n e x c e p t t ha t d e s c r i b e di s p r e s e n t i n t h e s o l u t i o n s o b t a i n e d .


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FLAVOPROTEIN FROM HEART MUSCLEP u r i f i c a t i o n

E l e v e n p i g s ' h e a r t s a r e f r e e d f r o m c o n n e c t i v e t i s s u e a n d f a t a n d t h e n m i n c e d .T h e m u s c l e t i s s u e i s w a s h e d 3 t i m e s w i t h 1 5 - 2 0 v o l . t a p w a t e r f o r 2 0 m i n . e a c h t i m ew i t h v i g o r o u s m e c h a n i c a l s t i r r i n g . T h e w a t e r i s p r e s s e d o u t t h r o u g h a t h i n c l o t h .1 6 6 0 g . o f t h e w a s h e d m i n c e a r e g r o u n d w i t h 2 - 5 1 . M/50 Na2HP04 s o l u t i o na n d a b o u t 5 0 0 g . s a n d i n a m e c h a n i c a l m o r t a r f o r 1 - 1 - h r . 1 T h e p u l p i s t h e nt h o r o u g h l y m i x e d w i t h 2 - 5 1 . d i s t i l l e d w a t e r a n d c e n t r i f u g e d .T h e 4 - 7 1 . o f s u p e r n a t a n t s u s p e n s i o n ( A ) a r e m i x e d w i t h 1 1 8 m l . M a c e t a t eb u f f e r ( p H 4 . 6 ) a n d c e n t r i f u g e d . T h e p r e c i p i t a t e i s s u s p e n d e d i n 1 6 6 0 m l . d i s -t i l l e d w a t e r t o w h i c h 3 3 g . ( N H 4 ) 2 S 0 4 a n d 5 0 m l . e t h y l a l c o h o l a r e a d d e d a n d t h em i x t u r e i s h e a t e d o n a w a t e r b a t h t o 4 3 0 f o r 1 0 - 1 5 m i n . T h e i n s o l u b l e m u s c l ep r o t e i n s a r e t h u s d e n a t u r e d a n d a t t h e s a m e t i m e t h e f l a v o p r o t e i n b e c o m e sd i s s o l v e d . When c e n t r i f u g e d , 1 3 7 0 m l . o f a s o m e w h a t o p a l e s c e n t s t r o n g y e l l o ws o l u t i o n c o n t a i n i n g t h e e n z y m e ( B ) a r e o b t a i n e d .T h e s o l u t i o n i s c o o l e d down a n d t h e n m i x e d w i t h 4 5 m l . o f a n a l u m i n i u mh y d r o x i d e ( C y ) g e l . ( 1 0 g . A 1 2 0 3 ) . A f t e r 1 h r . t h e a l u m i n a i s c e n t r i f u g e d d o w n .T h e s o l u t i o n i s t h e n m i x e d w i t h a f u r t h e r 2 2 m l . a l u m i n a a n d a g a i n c e n t r i -f u g e d . T h e e n z y m e i s a b s o r b e d o n t h e a l u m i n a a n d i t c a n b e e l u t e d w i t h a l k a l i n ep h o s p h a t e . W i t h s u c c e s s i v e l o t s o f 5 0 m l . M / 5 N a 2 H P O 4 s o l u t i o n t h e e l u t i o n i sc a r r i e d o n u n t i l t h e e l u a t e a p p e a r s t o b e c o l o u r l e s s . T h e e l u a t e s a r e c o m b i n e d ,m a k i n g a l t o g e t h e r 2 4 0 m l . , a n d d i a l y s e d a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r u n t i l s a l t - f r e e ( C ) .T h e p r e c i p i t a t e , w h i c h i s f o r m e d d u r i n g t h e d i a l y s i s , i s n o t r e m o v e d b u t i tw i l l r e d i s s o l v e o n a d d i t i o n o f 2 - 8 g . ( N H 4 ) 2 S O 4 t o t h e 2 8 0 m l . d i a l y s a t e . T h es o l u t i o n i s n o w h e a t e d o n a w a t e r b a t h f o r 5 m i n . t o 6 0 0 a n d c e n t r i f u g e d a f t e ri t h a s c o o l e d d o w n . T h e p r e c i p i t a t e i s d i s c a r d e d a n d 7 6 g . s o l i d ( N H 4 ) 2 S O 4 i sa d d e d t o t h e s o l u t i o n ( 0 . 4 5 s a t . ) . A f t e r s t a n d i n g i n t h e i c e c h e s t f o r 1 h r . , t h ep r e c i p i t a t e i s f i l t e r e d o f f 2 a n d t h e s o l u t i o n ( 2 8 5 m l . ) i s m i x e d w i t h 7 1 g . ( N H 4 ) 2 S O 4

( 0 . 8 s a t . ) . T h e p r e c i p i t a t e i s f i l t e r e d o f f a n d t h e s o l u t i o n d i s c a r d e d . T h e y e l l o wp r e c i p i t a t e i s w a s h e d f r o m t h e f i l t e r p a p e r w i t h d i s t i l l e d w a t e r i n a b o u t 3 0 m l .a n d d i a l y s e d o v e r n i g h t a g a i n s t 1 - 5 1 . d i s t i l l e d w a t e r . T h e p r e c i p i t a t e t h u s f o r m e dc o n t a i n s n o e n z y m e , i t i s c e n t r i f u g e d o f f a n d d i s c a r d e d . T h e s o l u t i o n i s t h e nf u r t h e r d i a l y s e d a g a i n s t f r e s h d i s t i l l e d w a t e r . T h e p r e c i p i t a t e w h i c h i s n owf o r m e d i s u s u a l l y y e l l o w a n d c o n t a i n s some e n z y m e . I t i s n o t r e m o v e d , b u t t h ed i a l y s i s c o n t i n u e d u n t i l t h e s o l u t i o n i s s a l t - f r e e ( D ) .0 - 1 % NH3 i s a d d e d d r o p b y d r o p t o t h e d i a l y s a t e u n t i l t h e p r e c i p i t a t ed i s s o l v e s . T h e s o l u t i o n i s n o w h e a t e d f o r 5 m i n . t o 6 0 - 6 2 w i t h o u t a n y s a l ta d d i t i o n a n d t h e p r e c i p i t a t e c e n t r i f u g e d o f f . 1 0 9 g . ( N H 4 ) 2 S O 4 a r e a d d e d t o t h e3 5 m l . s o l u t i o n ( 0 . 5 s a t . ) a n d t h e p r e c i p i t a t e f i l t e r e d o f f a n d d i s c a r d e d . From t h e4 0 m l . f i l t r a t e t h e e n z y m e i s p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g 4 g . ( N H 4 ) 2 S O 4 ( 0 . 6 5 s a t . ) .T h e y e l l o w p r e c i p i t a t e i s f i l t e r e d o f f a n d w a s h e d f r o m t h e f i l t e r w i t h d i s t i l l e dw a t e r . T h e s o l u t i o n t h u s o b t a i n e d ( 1 5 m l . ) i s d i a l y s e d t h o r o u g h l y a g a i n s t d i s -t i l l e d w a t e r . A s m a l l y e l l o w p r e c i p i t a t e i s f o r m e d , w h i c h i s c e n t r i f u g e d o f f ,l e a v i n g 2 0 m l . o f t h e f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n ( E ) . I t i s a d v i s a b l e t o a d d a f e wd r o p s o f d i l u t e a l k a l i o r p h o s p h a t e , when i t w i l l r e m a i n c l e a r .1 T h e t i m e o f g r i n d i n g d e p e n d s o n t h e t y p e o f t h e m o r t a r a n d c a n n o t t h e r e f o r e b e d e f i n i t e l ys t a t e d . I t i s c a r r i e d o n u n t i l a s m a l l s a m p l e s h o w s , a f t e r c e n t r i f u g i n g , o n l y a t h i n l a y e r o f m y o s i n

a b o v e t h e l a y e r s o f s a n d a n d h e a v i e r m u s c l e t i s s u e l u m p s . I f t h e g r i n d i n g i s c o n t i n u e d u n t i l t h ew h o l e m ass b e c o m e s a u n i f o r m p a s t e , t o o much m y o s i n i s e x t r a c t e d w h i c h c a n n o t p r o p e r l y b ec e n t r i f u g e d d o w n , s o t ha t t he s u p e r n a t a n t s u s p e n s i o n w i l l b e o n l y h a l f t h e v o l u m e o f t he a d d e ds o l u t i o n s , t h u s r e d u c i n g t h e y i e l d .

2 A l l t h e f i l t r a t i o n s h a v e b e e n d o n e w i t h W h at m a n n o . 1 f i l t e r s . No s u c t i o n c a n b e a p p l i e d .

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F . B . STRAUBT a b l e I I . Y i e l d a n d f l a v i n c o n t e n t d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n

m g . l a c t o f l a v i n Y i e l d o fP r o t e i n d r y p r e s e n t a s b o u n d L a c t o -w e i g h t p r o t e i n - b o u n d d i n u c l e o t i d e f l a v i ng . d i n u c l e o t i d e % %1 6 6 0 g . w a s h e d m u s c l e 3 2 0 6 - 9 ( 1 0 0 ) 0 - 0 0 2 2( A ) P h o s p h a t e e x t r a c t 3 9 2 - 8 4 2 0 - 0 0 7( B ) A l c o h o l - ( N H 4 ) 2 S O s o l u t i o n 0 - 9 7 1 4( C ) A l u m i n a e l u a t e 1 - 0 5 0 - 6 5 9 - 4 0 - 0 6 2( D ) F i r s t ( N H 4 ) 2 S O 4 f r a c t i o n a t i o n 0 - 2 7 0 - 5 6 8 - 1 0 - 2 1( E ) S e c o n d ( N H j ) , S O 4 f r a c t i o n a t i o n 0 - 0 9 8 0 - 5 3 7 - 6 0 . 5 4 ** S p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y d e t e r m i n e d .

P r o p e r t i e s o f t h e f l a v o p r o t e i nT h e c o l o u r o f t h e f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n i s y e l l o w , a l t h o u g h i t a p p e a r s g r e e n i s hb e c a u s e o f t h e s t r o n g g r e e n i s h f l u o r e s c e n c e . T h e s p e c t r u m o f t h e f l a v o p r o t e i n 1i s r e p r o d u c e d i n F i g s . 1 a n d 2 . I t s h o w s maxima a t 2 7 4 , 3 5 9 a n d 4 5 1 m , u a n d

m i n i m a a t 2 5 0 , 3 1 6 a n d 3 9 8 m , . When e x a m i n e d u n d e r t h e l o w - d i s p e r s i o nm i c r o s p e c t r o s c o p e , t w o d i s t i n c t b a n d s a r e s e e n i n t h e v i s i b l e r e g i o n o f t h es p e c t r u m , o n e a t 4 8 0 - 4 9 0 m t k , t h e o t h e r a t 4 4 0 - 4 6 0 m , u . T h e e x i s t e n c e o f t h e s eb a n d s i n m u s c l e e x t r a c t s h a s b e e n p r e v i o u s l y o b s e r v e d b y K e i l i n & H a r t r e e[ 1 9 3 9 ] .From t h e a b s o r p t i o n a t 4 5 1 m , u t h e l a c t o f l a v i n c o n t e n t o f t h e p u r i f i e d p r e -p a r a t i o n s h a s b e e n d e t e r m i n e d , b y a s s u m i n g t ha t t he v a l u e f o r t h i s m a x i m u mi s t h e s a m e a s i n a n y o t h e r f l a v o p r o t e i n , i . e . f B 5 4 1 = 2 - 4 x 1 0 7 . T h e f l a v i n c o n t e n tt h u s f o u n d i n t h e p u r e s t p r e p a r a t i o n s i s 0 - 5 4 + 0 - 0 2 % l a c t o f l a v i n . ( E x p r e s s e da s l a c t o f l a v i n p h o s p h a t e 0 - 6 6 % . ) T h e m o l e c u l a r w e i g h t c a l c u l a t e d f r o m t h ef l a v i n c o n t e n t i s 0 5 3 7 6 = 7 0 , 0 0 0 .

T h a t t h e f l a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e i s t h e p r o s t h e t i c g r o u p o f t h e f l a v o -p r o t e i n i s s h o w n b y t h e f a c t t h a t i t c a n q u a n t i t a t i v e l y r e p l a c e t h e c o e n z y m e o ft h e d - a m i n o - a c i d o x i d a s e . No a t t e m p t h a s b e e n made t o i s o l a t e t h e p r o s t h e t h i cg r o u p f r o m t h e p u r i f i e d e n z y m e .T h e f l a v o p r o t e i n i s r e d u c e d t o t h e l e u c o c o m p o u n d b y N a 2 S 2 0 4 a n d i t i sr e o x i d i z e d when s h a k e n w i t h a i r . I t i s a l s o r e d u c e d t o t h e l e u c o f o r m b y d i h y d r o -c o z y m a s e .T h e f l u o r e s c e n c e o f t h e f l a v o p r o t e i n s o l u t i o n s i s j u s t a s s t r o n g a s t h a t o f t h ef r e e f l a v i n . I t i s n o t d u e t o t h e p r e s e n c e o f f r e e f l a v i n a n d i t i s c o m p l e t e l ye x t i n g u i s h e d o n t h e a d d i t i o n o f r e d u c e d c o z y m a s e . T h e o l d y e l l o w e n z y m e o fW a r b u r g & C h r i s t i a n d o e s n o t s h o w a n y f l u o r e s c e n c e . T h e d i f f e r e n c e m i g h t b ee x p l a i n e d i f t h e a l l o x a z i n r i n g i s n o t b o u n d t o t h e p r o t e i n i n t h e c a s e o f t h eh e a r t f l a v o p r o t e i n a s i t i s i n t h e c a s e o f t h e o l d y e l l o w e n z y m e [ K u h n & B o u l a n g e r ,1 9 3 6 ] . T h i s s u p p o s i t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t t h e a b s o r p t i o n b a n d o f t h ef l a v o p r o t e i n c o i n c i d e s w i t h t h e b a n d s o f t he f r e e f l a v i n .T h e f l a v o p r o t e i n i s i n a n i n s o l u b l e s t a t e i n t h e t i s s u e , b u t t h i s i s n o t a ni n t r i n s i c p r o p e r t y o f t h e e n z y m e . D u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n , when h e a t e d w i t h3 % a l c o h o l , t h e e n z y m e i s d e t a c h e d f r o m t h e i n s o l u b l e m u s c l e p r o t e i n s a n db e c o m e s s o l u b l e i n s a l t s o l u t i o n . A f t e r r e m o v i n g i m p u r i t i e s i t i s s o l u b l e e v e n i ns a l t - f r e e s o l u t i o n s .T h e N c o n t e n t o f t h e p u r i f i e d f l a v o p r o t e i n w a s f o u n d t o b e 1 5 - 7 % .

1 T h e s p e c t r u m w a s t a k e n w i t h a H i l g e r " S p e k k e r " a p p a r a t u s . I a m i n d e b t e d t o Mr H . S .C o r r a n f o r c a r r y i n g o u t t h e m e a s u r e m e n t s .

7 9 0


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FLAVOPROTEIN FROM HEART MUSCLET h e h e a t s t a b i l i t y o f t h e f l a v o p r o t e i n i s r e m a r k a b l e , a n d i t i n c r e a s e s d u r i n gt h e p u r i f i c a t i o n . When i t i s a l r e a d y i n a s o l u b l e f o r m , h e a t i n g f o r 5 m i n . t o 6 0 0d o e s n o t c a u s e a n y d e s t r u c t i o n , w h i l e h e a t i n g f o r 5 m i n . t o 7 0 0 o n l y d e s t r o y s

0 - / I u 1

0 n 6 2 5 h IE 0 - 3 7 5

0 1 2 5 _2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 07 X i n m z t

F i g . 1 . A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f a 0 - 0 2 6 5 % s o l u t i o n o f t h e f l a v o p r o t e i n ( d =2 c m . ) .

E

x i n m n ,F i g . 2 . A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f a 0 4 7 % s o l u t i o n o f t h e f l a v o p r o t e i n ( d =2 c m . ) .a b o u t 1 0 % . T h e h e a t s t a b i l i t y o f t h e p u r i f i e d p r e p a r a t i o n w i l l b e d i s c u s s e d i n as u b s e q u e n t p a p e r .

I w i s h t o e x p r e s s m y d e e p g r a t i t u d e t o P r o f . D . K e i l i n f o r h i s c o n s t a n t h e l pa n d i n t e r e s t i n t h i s w o r k .

B i o c h e m . 1 9 3 9 x x x i i i

7 9 1

A- 7 r -A

5 0


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7 9 2 F . B . STRAUB

REFERENCESB a n g a & S z e n t - G y 6 r g y i ( 1 9 3 2 ) . B i o c h e m . Z . 2 4 0 , 2 0 3 .K e i l i n & H a r t r e e ( 1 9 3 9 ) . P r o c . r o y . S o c . B ( i n t h e P r e s s ) .Kuhn & B o u l a n g e r ( 1 9 3 6 ) . B e r . d t 8 c h . c h e m . G e m . 6 9 , 1 5 5 7 .S t r a u b ( 1 9 3 8 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 4 1 , 6 0 3 .- ( 1 9 3 9 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 4 3 , 7 6 .

C o r r a n & G r e e n ( 1 9 3 9 ) . N a t u r e , L o u d . , 1 4 , 3 , 1 1 9 .W a r b u r g & C h r i s t i a n ( 1 9 3 2 ) . N a t u r w i 8 8 e n s c h a f t e n , 2 0 , 6 8 8 .- - ( 1 9 3 8 , 1 ) . B i o c h e m . Z . 2 9 5 , 2 6 1 .- - ( 1 9 3 8 , 2 ) . N a t u r u w i m e n s c h a f t e n , 2 6 , 2 3 5 .( 1 9 3 8 , 3 ) . B i o c h e m . Z . 2 9 8 , 1 5 0 .

flavor ote in

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