FACULTATEA DE MEDICIN I FARMACIE

SPECIALIZAREA - MEDICIN DENTAR

FIZIOLOGIE

LUCRARI PRACTICE

FIZIOLOGIA SNGELUI

I. EXPLORAREA SERIEI ERITROCITARE

1. Numararea eritrocitelor

2. Dozarea hemoglobinei sangvine. Metoda Drabkin

3. Determinarea hematocritului

4. Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor

5. Indicii eritrocitari

II. EXPLORAREA SERIEI LEUCOCITARE

Formula leucocitarTransfuzia: grupele sangvine

sistemul Rh

Hemostaza fiziologic

I. EXPLORAREA SERIEI ERITROCITARE
1. Numararea eritrocitelor

Definitie: Eritocitele(hematiile), sunt celule anucleate de forma unor discuri biconcave, fara ribozomi si fara mitocondrii. Au rol in homeostazia gazelor respiratorii si contribuie la mentinerea echilibrului acido-bazic.Principiu:

numararea la microscop a eritrocitelor aflate intr-un volum determinat de lichid, diluat in proportie cunoscuta

dilutia are rolul de a face posibila numararea elementelor care sunt in nr foarte mare si de a impiedica coagularea

in functie de dilutie se calculeaza nr. de hematii /mm

Materiale necesare:

lichid de dilutie :izoton ptr a impiedica hemoliza (sol. Hayem, sol. Withby, sol Na Cl 9)

pipeta Potain(tub capilar gradat si o bula de dilutie cu o perla mobila)

camera de numarat (Burker-Turk)

microscop

lamele

vata, alcool medicinal 96C, ace de seringa de unica folosinta

Principiu de lucru :

Metoda manuala

se numara direct la microscop ( in camera de numarat), eritrocitele dintr-un volum cunoscut de sange, diluat intr-o proportie cunoscuta

Metoda automata principiu impedantei electrice

o suspensie de eritrocite intr-un volum cunoscut de reactiv trece printr-un orificiu ( fanta) prevazut cu electrozi intre care se aplica un curent constant.

trecerea prin orificiu a fiecarui eritrocit, nonconductor, va determina o scadere brusca de tensiune denumita puls.

pulsurile sunt numarate electronic si exprimate ca numar de eritrocite.

Valori normale:

RBC (red blood cells)

4-5,5 mil/mm sau 4-5,5 x 10/l

( valoare medie);

barbati = 4,9 0,7 mil/mm; femei = 4,3 0,6 mil/mm

2. Dozarea hemoglobinei (Hb) sangvine
Metoda Drabkin

Definitie : Hemoglobina reprezinta 95% din masa proteica eritrocitara si ocupa aproximativ 35 % din volumul eritrocitar.Principiu: Hb in prezenta unei solutii de cianura de potasiu si fericianura de potasiu se transforma in cianmethemoglobina de culoare brun-roscata. Intensitatea culorii este proportionala cu concetratia de Hb ce se determina spectrofotometric Materiale necesare :

- reactiv Drabkin ( contine cianura si fericianura de potasiu);

sange proaspat sa recoltat pe anticoagulant (Na2 EDTA);

spectrofometru.

Tehnica :

- in doua eprubete se introduc:

In eprubeta martor : reactiv Drabkin 5ml

In eprubeta proba : reactiv Drabkin 5ml + sange 20 ( l)

se omogenizeaza continutul eprubetei proba;

se lasa in repaus la temperatura camerei 20 minute;

se citeste extinctia probei fata de martor la 540 nm;

concentratia de Hb , corespunzatoare extinctiei, se determina din tabele.

Valori normale:

- barbati: 15 2g/ dl;

- femei: 14 2 g / dl.

3. Determinarea Hematocritului

Definitie: Hematocritul (Ht), volumul procentual eritrocitar, reprezinta concentratia eritrocitelor in 100ml sange integral, dupa centrifugare.Principiu :

se recolteaza sange pe, care se separa prin centrifugare, in sangele recoltat pe anticoagulant, eritrocitele din plasma si se determina raportul volumelor lor

recoltarea se face din:

vena si sange capilar micrometoda microHt

vena macrometoda Wintrobe

Materiale necesare

vata, alcool medicinal 96C

materiale necesare recoltarii sangelui prin punctie venoasa : garou, seringa si ac de unica folosinta

anticoagulant:Na2EDTA, amestec de oxalati Wintrobe sau heparina

tuburi de Ht

pipete Pasteur

centrifuga 4000rot/min

Tehnica de lucru

a)Macrometoda

se recolteaza 3-5ml sange prin punctie venoasa pe subst. anticoagulanta

se pune cu pipeta Pasteur in tubul de hematocrit pana la diviziunea 100

se centrifugheaza tuburile 20min la 4000rot/min, sau 30 min la 3000rot/min

b) Micrometoda

se incarca tubul capilar heparinat prin capilaritate cu sange

se centrifugheaza20min la 4000rot/min, sau 30 min la 3000rot/min

Citirea rezultatelor

Dupa centrifugare se masoara :

Inaltimea H a coloanei totale de sange

Inaltimea h a coloanei de eritrocite

Rezultatele sunt exprimate procentual conform formulei:

Ht(100%)=h/H x 100

Valori normale( normocitemie):

barbati : 457% (0,38 0,52 l/l); raport eritro-plasmatic = 45/55

femei : 425% (0,37-0,47 l/l); raport eritro-plasmatic= 40/60

nou-nascuti : 56%

copii : 35 45%

Ht arterial si cel capilar Ht venosHt somatic = 0,91x Ht venos

Variatii patologice

- valori crescute ale Ht definesc policitemia (poliglobulie , deshidratarea etc.)

- valori scazute ale Ht definesc oligocitemia (anemii, hiperhidratare, etc.)

Pentru apreciere corecta, reultatele obtinute la determinarea Ht, se coreleaza cu cele ale volemiei:

normovolemie

- normocitemie - starea fiziologica

- oligocitemie anemii

- policitemie poliglobulie fiziologica de altitudine

poliglobulie patologica : boli cardiace si pulmonare

hipovolemie

- normocitemie - hemoragii acute

- oligocitemie anemii grave(Biermer), casexie

- policitemie - deshidratare extracelulara

hipervolemie

- normocitemie fiziologica : de la gravide in trimestrul III

patologica : hipertensiunea arteriala

- oligocitemie dupa perfuzii cu plasma, in ciroze

- policitemie - HTA cu insuficienta respiratorie)

4. Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor (VSH)

Principiu :

in sangele recoltat pe anticoagulant, lasat in repaus , se produce separarea plasmei de elementele figurate ce sedimenteaza, in virtutea gravitatiei.

in sangele circulant elementele figurate se gasesc in suspensie dispersate in plasma.

Materiale necesare

vata, alcool medicinal 96C;

materiale necesare recoltarii sangelui prin punctie venoasa : garou, seringa si ac de unica folosinta;

eprubete de hemoliza;

pipete Westergreen cu diviziuni mm de la 0-200, gradatia incepand de sus, cu stativul corespunzator ;

anticoagulant : citrat de sodiu 3,8 % , solutie sterila;

pipete gradate de 1 si 2 ml

Tehnica de lucru

intr-o eprubeta de hemoliza se introduc 0,4 ml citrat de Na 3,8% cu ajutorul unei pipete gradate de 1ml

Intr-o eprubeta curata de pune o cant de 2-3ml de sange recolatat prin punctie venoasa fara aplicare de garou daca este posibil

Se aspira 1,6 ml sange cu ajutorul unei pipete de 2 ml si se adauga in eprubeta de hemoliza

Se omogenizeaza prin cateva miscari de rasturnare

Se aspira sange in eprubeta Westergreen pana la diviziunea 0

Extremitatea inferioara pipetei W. se fixeaza pe dopul de cauciuc de la partea inferioara a suportului

Estremitatea superioara a pipetei W. se fixeaza cu ajutorul clemei de resort

Pozitia pipetei in stativ trebuie sa fie perfect verticala

Se noteaza ora fixarii in stativ a tubului

Citirea rezultatelor

Citirea rezultatelor se face dupa 1, 2 si 24 oreRezultatele - se exprima in mmValori normale ale VSH:

Barbat : 2 - 7mm/ora si

7 - 15 mm/2 ore

Femeie: 4 - 9mm/ora si

12 - 17mm/2 ore

In timpul sarcinii: 35mm/ora (valoare medie)

Nou-nascut : 0,5mm/ora

Copii mici si sugar : 9-12mm/ora

Valori crescute ale VSH:

Boli infectioase sau inflamatoare

Leucoze,reticuloze

Mielom

Boala Hodgkin

Nefroze

Infarct miocardic

Macroglobulinemia Waldenstrom

Valori scazute ale VSH:

Hepatita epidemica

Stari alergice

Variatii fiziologice:
- in timpul menstruatiei la femei creste V.S.H-ul
- in sarcina (mai ales in ultimile luni)
- la copii, comparativ cu un adult

Pentru a evita rezultatele eronate , trebuie respectate urmatoarele conditii:

- sangele se recolteaza dimineata pe nemancate ;

- determinarea se face dupa imediat dupa recoltare (in primele 2-3 ore)

- conservarea sangelui creste V.S.H-ul

- se utilizeaza ca anticoagulant citratul de sodiu, deoarece oxalatul de sodiu creste V.S.H-ul

- pozitia pipetei trebuie sa fie perfect verticala, inclinarea acesteia crescand V.S.H-ul

- temperatura camerei trebuie sa fie cuprinsa intre 20-27 C deoarece temperaturii creste V.S.H-ul

- sa se evite hemoliza

5. Indici Eritrocitari

Valorile Hb , Ht si ale numarului de eritrocite stau la baza calcularii indicilor eritrocitari , utili pentru studiul eritrocitelor in functie de marime si continutul in Hb si pentru diagnosticul morfologic al anemiei

A. Volumul eritrocitar mediu

(VEM, MCV mean corpuscular volume)

Definitie : indica volumul mediu al unui eritrocit.

V.E.M.(fl) = [Ht (l/l) x 1000 ] / E(10/l) sau

V.E.M(l) = [Ht (%) x 10] / E(mil/mm)

Valori normale : - 80- 100 fl ( femtolitri) sau m - normocite

Valori patologice: - sub 80 fl microcite

- peste 100 fl macrocite

B. Concentratia medie de Hb eritrocitara
( CHEM, MCHC mean corpuscular hemoglobin concentration)

Definitie : reprezinta concentratia medie de Hb / 100 ml eritrocite.

C.H.E.M. = [Hb(g/dl) x 100] / Ht(%)

Valori normale: 32- 36 g Hb/100ml eritrocite.

C. Hemoglobina eritrocitara medie

(HEM , MCH mean corpuscular hemoglobin)

Definitie : reprezinta cantitatea de Hb/eritrocit.

H.E.M. = [ Hb (g /dl) x 10 ] / E(mil / mm)

Valori normale : 27 32 pg

D. Indicele de distributie eritrocitar
( RDW red cell distribution width)

Definitie : reprezinta deviatia standard a mediei

volumelor eritrocitare rapoarte la V.E.M si se determina

cu ajutorul histogramelor curbe de distributie % a

marimii celulelor.

se utilizeaza la aprecierea anizocitozei valabilitatea crescuta a volumului eritrocitelor

cu cat anizocitoza este mai marcata , cu atat RDW va fi mai mare.

Valori normale: 11,5- 14,5 %.

DIAGNOSTICUL DIFERENTIAL AL ANEMIILOR

Frotiu sange periferic :

- anizocitoza (variatii de volum)

- anizocromie ( variatii de incarcare cu Hb )

- poichilocitoza ( variatii de forma)

suspiciune clinica confirmare anemie tip morfologic punctie biopsie

Dozare: nr.E medulara

Hb

Ht

INDICI ERITROCITARI

Anemie hipocroma microcitara - anemia feripriva (deficit de Fe)

- V.E.M.

C.H.E.M.

H.E.M.

Anemie normocroma normocitara - anemia aplastica ( insuficienta maduvei osoase hematogene)

- V.E.M. N

C.H.E.M. N

H.E.M. N

Anemie normocroma macrocitara anemia megaloblastica (deficit de B12 si acid folic)

- V.E.M.

- C.H.E.M. N

H.E.M. N

II. EXPLORAREA SERIEI LEUCOCITARE

Maduva hematogena contine celule stem pluripotente,care se diferentiaza de celulele progenitoare angajate ,ce vor da nastere diferitelor tipuri de celule sangvine. Se descriu

- celulele progenitoare mieloide : din care diferentiem eritrocitele, o parte de leucocite (granulocitele neutrofile, eozinofile, bazofile si monocitele) si trombocitele

- celule progenitoare limfoide : din care rezulta limfocitele B si T.

Celulele adulte apartinand seriei leucocite vor actiona impreuna in vederea apararii organismului impotriva agresivitatii infectioase (virale,bacteriene sau parazitare).

Principiu de lucru :

Metoda manuala :

numaratoarea directa la microscop a leucocitelor din volumul cunoscut de sange ,diluat intr-o proportie cunoscuta.

celulele se numara in dispozitive speciale numite hemacitometre (camere de numarat).

Metoda automata (metoda de impedanta electrica)

o suspensie de leucocite dintr-un volum cunoscut de sange,trec printr-un orificiu;

un curent electric constant este aplicat de electrozii de platina aflati de-o parte si de alta a orificiului;

deoarece fiecare celula este nonconducatoare ea va produce la trecerea prin orificiu o modificare brusca de tensiune = un plus;

aceste pulsuri vor fi numarate electronic.

Valoarea normala(V.N.) : 5000 9000 leucocite/mm
Variatii ale numarului de leucocite:

Leucocitoza = cresterea numarului leucocitelor in sangele periferic care poate fi:

fiziologica (temporara) la sugari, in sarcina, dupa un efort fizic, perioadele postprandiale, la altitudine, stres emotional,etc.;

patologica in boli infectioase ,leucemii,alergii,etc.

Leucopenia = scaderea numarului de leucocite in sangele periferic care poate fi:

fiziologica la varstnici, in somn, la surmenati fizic;

patologica in distrugeri ale maduvei hematoformatoare dupa tratamente cu radiatii ionizante, medicamente citostatice, etc.

Seria leucocitara cuprinde 3 linii celulare:

1. SERIA GRANULOCITARA cuprinde elemente polinucleare granulatii : neutrofile, acidofile, bazofile.

Granulocitul nesegmentat = granulocitul tanar

are nucleul in forma de potcoava,datorita condensarii cromatinei nucleare;

citoplasma este acidofila si contine granulatii diferentiate neutrofile, eozinofile, bazofile.

Granulocitul segmentat = granulocitul adult

are nucleul segmentat;

cu cat celula este mai matura,cu atat are mai multe segmente.

Granulocitul segmentat neutrofil

are citoplasma slab acidofila (roz-palid), cu granulatii neutrofile specifice, mici, punctiforme si numeroase;

nucleul este segmentat in 2-5 lobi legati intre ei prin punti fine

are rol in apararea antimicrobiana prin microfagocitoza

are rol secretor : interleukina l (substanta pirogena) enzime lizozomale.

b)Granulocitul segmentat eozinofil:

are in citoplasma granule mari, egale, eozinofile, portocalii;

nucleul prezinta 2 segmente;

are rol in fagocitoza bacteriilor, fungilor, complexelor antigen-anticorp,etc;

are rol in apararea parazitara;

are rol in bolile alergice.

c) Granulocitul segmentat bazofil

contine granulatii caracteristice bazofile care ocupa toata citoplasma,uneori suprapunandu-se peste nucleu;

nucleul este complet segmentat;

are rol in procesele inflamatorii (capacitate de fagocitoza mai redusa).

2. SERIA LIMFOCITARA

dupa marime limfocitele pot fi : mici,medii si mari;

forma limfocitelor este rotunda sau usor ovala, cu diametrul de 2 m;

nucleul este mare si ocupa cea mai mare parte a celulei fiind intens colorat;

citoplasma este slab bazofila (albastru-deschis);

are rol in raspunsul imun, declansat de patrunderea in organism a unor straine sau a unor macromolecule proteice;

acest raspuns este caracterizat prin productia de :

anticorpi (imunitate umorala) de catre limfocitele B

produsii celulari citotoxici (imunitate celulara) limfocitele T.

3. SERIA MONOCITARA

- monocitele sunt cele mai mari celule din seria leucocitara (10 25 m);

nucleul este nesegmentat,reniform si nu prezinta nucleoli;

citoplasma este abundenta, intens bazofila (albastru inchis);

are rol in macrofagocitoza particulelor coloidale, a celulelor degenerate;

are rol in raspunsul imun ca celule accesorii (prezentatoare de antigen)

FORMULA LEUCOCITARA

Definitie : reprezinta distributia procentuala a diferitelor tipuri de leucocite pe un frotiu de sange periferic, dupa numararea a cel putin 200 de elemente.

Materiale necesare:

- vata, alcool medicinal 96C, ace de seringa de unica folosinta

- microscop

lamele

coloratie May Grunwald - Giemsa

Principiu de lucru :

Metoda manuala

se realizeaza un frotiu din sangele periferic proaspat recoltat si se coloreaza cu May-Grnwald-Giemsa

peste frotiu se pune o picatura de ulei de cedru pentru fixare

limfocitele au tendinta de a se grupa in centru, iar PMN neutrofilele si monocitele se disperseaza spre margini in franjuri

- se vor obtine urmatoarele coloratii:

granulocitele neutrofile : granulatii brune

granulocitele eozinofile : granulatii portocalii

granulocitele bazofile : granulatii albastru inchis-negru

nucleii: violaceu

citoplasma : PMN neutrofilelor roz

limfocitelor, monocitelor albastra

hematiilor - roz-rosiatic

se priveste la microscop, folosind obiectivul cu imersie;

se numara la microscopul optic 200 de leucocite de pe un frotiu;

se indentifica tipurile de leucocite pe baza criteriilor morfologice (aspectul nucleului,granulatii citoplasmatice);

se determina raportul procentual intre acestea.

Metoda automata :

se izoleaza si se efectueaza automat raportul procentual dintre tipurile de leucocite din sangele periferic, in functie de volum, prezenta granulatiilor citoplasmatice si complexitatea segmentarii nucleului, cu obtinerea histogramelor.

Valorile normale ale formulei leucocitare determinate prin metoda automata sunt :

Segmentate neutrofile : adult 52-74%copil 25-40%

eozinofile : adult 0-4%copil 1-4%

bazofile : adult 0-1%copil 0-1%

Limfocite adult 25-35%copil 50-70%

Monocite adult 1-8%copil 1-8%

La copiii mici, valorile lor se egaleaza in jurul varstei de 5-6 ani, apoi se inverseaza, ajungand treptat la valorile adultului.

Variatiile formulei leucocitare

NEUTROFILE

Neutrofilia

cresterea numarului de neutrofile peste valoarea normala ;

prezenta elementelor neutrofile tinere in sange periferic fiind dovada unei activitati medulare intense sau a citolizei accentuate;

fiziologica: eforturi fizice mari, graviditate, stres;

patologica: infectiile acute, intoxicatii endogene (uremie) si exogene leucemia mieloida cronica, actiunea agentilor fizici (traumatisme, arsuri)

Neutropenia

scaderea numarului neutrofilelor sub limita normala;

apare dupa actiunea unor medicamente ( citostatice, tranchilizante antiinflamatoare, antibiotice), radiatii, agenti chimici toxici (benzen).

EOZINOFILE

Eozinofilia

cresterea numarului de eozinofile;

se intalneste in: alergii , parazitoze, afectiuni dermatologice.

Eozinopenia

scaderea numarului de eozinofile;

apare in stari de hiperactivitate adrenocorticoida.

BAZOFILE

Bazofilie

cresterea numarului de granulocite;

apare in boli contagioase, leucemia mieloida cronica.

LIMFOCITE

Limfocitoza

cresterea numarului de limfocite;

fiziologica la copii ;

patologica in afectiuni virale acute, mononucleoza infectioasa, leucemia limfatica cronica.

Limfopenie

in limfopoeza insuficienta , infectii virale, SIDA

MONOCITE

Monocitoza

- apare in mononucleoza infectioasa , infectii bacteriene (endocardita, TBC), afectiuni virale ( hepatita , gripa , rujeola), convalescenta infectiilor bacteriene si virale.

TransfuziaGrupele sanguine Hemostaza fiziologic

DETERMINAREA GRUPELOR SANGVINE

Eritrocitele (E) umane au un nr mare de antigene - Ag pe suprafata lor. Ag sunt grupatemin peste 17 sisteme ce definesc grupele sangvine, dintre care cele mai importante sunt ABO si Rh.

SISTEMUL ABO

Landsteiner - 1901

Antigene/aglutinogene (Ag) : A si B - exprimate pe eritrocite

- apar in aIII-a luna de viata intrauterina

- ating expresia imunologica completa la 6-12 luni

- sunt glicoproteine

- au precursor comun subst. H

Anticorpi/aglutinine (Ac) : - si aflati in plasma

- apar in plasma la cateva luni de la nastere

- sunt de tip Ig M, si nutrec bariera materno-placentara

REGULA LUI LANDSTEINER

Niciodata in sangele unui individ nu se vor gasi concomitent Ac impotriva Ag proprii.

Hemaglutinarea repr. adunarea eritrocitelor in gramezi vizibile cu ochiul liber

Hemoliza repr reactia de distrugere a eritrocitelor cu eliberarea Hb.

Grupa sangvinaAg (pe E)Ac (in plasma)FrecventaO / I- si 36%A / IIA 41%B / IIIB16%AB / IVAB-7%

Metode de determinare a grupelor sangvine

Metoda Beth-Vincent-Tzank

Principiu: - se pune in contact pe lama ser hemotest, care contine Ag cunoscute, cu sange de grup necunoscut

- aparitia hemagutinizarii in picatura de ser cu Ac cunoscuti indica prezenta Ag corespunzator

Materiale necesare: - ser hemotest O/I(contine Ac si ) sau anti AB

- ser hemotest A/II(contine Ac ) sau anti B

- ser hemotest B/III(contine Ac ) sau anti A

- 2 lame de sticla, pipete, ac steril, vata, alcool

Tehnica : - se folosesc 2 lame curate si uscate

- pe prima lama se pune :- la stanga o picatura de ser hemotest O/I

- la mijloc o picatura de ser hemotest A/II

- la dreapta o picatura de ser hemotest B/III

- se recolteaza sange: - se dezinfecteaza pulpa degetului cu alcool

- se punctioneaza cu acul steril

- sangele care apare se recolteaza pe cele 4 colturi ale celeilalte lame

se omogenizeaza fiecare picatura de ser cu cate un colt al lamelei

raportul volumetric sange/ser 1/10; 1/20

lama se roteste usor 2-4 min ptr a se amesteca serul cu sangele

rezultatele se citesc in urmatoarele 3 min, max in 10 min

se observa absenta sau prezenta hemaglutinarii

CARACTERIZAREA SISTEMULUI Rh

Sistemul Rh este un mozaic antigenic, cuprinzand trei perechi de antigene : Cc , Dd , Ee .Antigenitatea cea mai mare o are antigenul D 85% din populatia de rasa alba au antigenul Rh (D) = Rh+Anticorpii anti Rh nu se gasesc normal in plasma , apar la persoanele cu Rh (D)- dupa contactul cu antigenul D prin izoimunizare:

- transfuzii cu sange Rh (D)+;

- mame Rh(D)- cu sarcina cu fat Rh (D)+

Acesti anticorpi , numiti si imuni , sunt de tip IgG Ac anti Rh strabat bariera materno-placentara determind hemoliza eritrocitelor fetale Rh (D)+.

DETERMINAREA FACTORULUI Rh

Principiu: se pun in contact Ac antiRh (D) cu sangele de cercetat.

Materiale necesare: -ser antiRh (D):

-hematii Rh (D)+

-hematii Rh (D)- in suspensie in ser propiu , sangele fiind recoltat fara anticoagulant:

-cutii Petri , lame de sticla , pipete:

-material necesar pentru recoltarea sangelui prin intepare:

-termostat.

Tehnica:

- sangele de cercetat se obtine prin punctionarea pulpei degetului, in conditii sterile

- se recolteaza 0,5-1ml sange,care se introduce in eprubeta de hemoliza .

- dupa coagulare ,cheagul se sparge si se obtine o suspensie de hematii in serul

propriu.

- la mijlocul unei lame de sticla se pune o picatura de ser anti Rh , in care se

amesteca o picatura de sangele de cercetat (raportul volumeric intre picatura de

sange si picatura de ser trebuie sa fie 1/10-1/20).

- pe a doua lama , martor , se pune o picatura de ser anti-Rh la mijloc si alta, la

capatul din dreapta.

- in picatura din mijloc se pune si se amesteca o picatura hematii Rh (D)+ , iar

in cea din dreapta o picatura hematii Rh(D)-

- lamele se aseaza in cutia Petri , tapetata cu hirtie de filtru umezita si se

introduc in termostat (37C).

- rezultatul se citeste dupa 6 min , citirea se va repeta la 30 si 60 min.

Interpretare:

- daca hematiile de pe prima lama sunt aglutinate , exista antigenD =>

grupa Rh (D)+;

- daca hematiile de pe prima lama n-au aglutinat , nu exista antigen D=>

grupa Rh (D)-.

Aprecierea rezultatelor se face comparativ cu lama martor.

HEMOSTAZA FIZIOLOGIC

Hemostaza fiziologica reprezinta ansamblul de fenomene la care participa factori celulari , tisulari , vasculari si umorali care asigura oprirea unei hemoragii rezultat in urma lezarii peretelui capilar.Hemostaza fiziologica prezinta doua caracteristici :

- este efectiv numai in vitro

- opreste numai hemoragiile vaselor mici.

Procesul hemostatic prezinta doi timpi:

1. Hemostaza primara sau timpul vasculo-plachetar induce oprirea provizorie a sangerarii , permitand realizarea conditiilor necesare formarii cheagului definitiv .

TIMPUL VASCULAR este primul care intra in actiune , fiind determinat de leziunea peretelui capilar ; consta intr-o vasoconstrictie localizata la nivelul arteriolelor si a sfincterelor precapilare.

TIMPUL PLACHETAR incepe imediat dupa timpul vascular ; se realizeaza prin aderarea si agregarea trombocitelor la locul leziunii peretelui vascular , urmata de procesul de metamorfoza vascoasa care are rezultat formarea trombusului alb trombocitar temporar.

2. Hemostaza secundara sau coagularea

realizeaza hemostaza definitiva ;

poate fi definita ca o modificare a stari fizice a sangelui care trece din stare lichida in stare de gel , transformare care implica o succesiune de reactii enzimatice in cascada

acestea incep cu leziunea peretelui vascular si se termina cu formarea cheagului stabil de fibrina.

Explorarea hemostazei se realizeaza prin :

- teste screening, care se utilizeaza in vederea evidentierii unei afectari a hemostazei

- teste specifice, care se efectueaza in vederea identificarii cu precizie a defectului hemostatic

3.EXPLORAREA SERIEI TROMBOCITARE

Numararea trombocitelor

Metoda manuala

Principiu: - se realizeaza direct in hemocitometru, utilizand sange recoltat intr-o proportie cunoascuta, cu solutie care lizeaza celelalte elemente saturate ( solutie Weed) ( eroare 15-30%).

Metoda automata (metoda impedantei electrice)

Principiu: - o suspensie de trombocite este fortata sa traverseze un orificiu ingust prevazut cu doi electrozi intre care se aplica un curent continuu.

- trecerea fiecarui trombocit determina o scadere brusca de tensiune numita puls , care sunt numarate electronic si redate ca numar de trombocite /mm.

Normal: numarul de trombocite = 150000-350000/mm

Patologic: 350000/mm - trombocitoza

Studiul morfologiei trombocitelor

Principiu: analiza morfologica se realizeaza pe frotiul de sange periferic colorat May-Grnwald-Giemsa.

trombocitele au aspect heterogen :

- zona centrala sau granulomerul continand granulatii azurofile izolate sau aglomerate ,

- zona periferica sau hialomerul fiind omogena si palid colorata in albastru sau violet.

Interpretare: pentru aprecierea orientativa a numarului de trombocite :

- grupe de 15-25 elemente - numar normal de trombocite;

- grupe de 4-6 elemente - trombopenie;

- gupe foarte mari de elemente - trombocitoza.

TESTE DE EXPLORARE A HEMOSTAZEI PRIMARE

1. Testul fragilitatii capilare ( testul Rumpell-Leede)

Principiu: rezistenta sau fragilitatea capilarelor se apreciaza prin numarul de petesii ( hemoragii mici , punctiforme) aparute in zona investigate in conditiile cresterii temporare a presiunii intracapilare .

Materiale necesare: tensiometru

Tehnica: - se aplica manseta tensiometrului la nivelul bratului si se exercita o o presiune egala cu media artimetica dintre tensiunea arterial maxima si minima , timp de 5minute;

- dupa incetarea compresiunii, se numara petesiile aparute pe o suprafata de 2,5 cm2 la nivelul plici cotului, sub marginea inferioara a mansetei tensiometrului.

Interpretare: - normal :40 petesii=test intens pozitiv (++++).

Fragilitatea crescuta apare in:

afectiuni ale peretelui vascular

- vasculopatii congenitale (ex.: purpura vasculara idiopatica )

- dobandite (ex. scorbut, purpura vasculara alergica);

trombocitopenii (scaderea numarului de trombocite

Tehnica: - se dezinfecteaza tegumentele lobului urechii;

- se efectueaza o incizie cu lungime de 1,5-10 mm si profunzime de 3mm;

- picaturile de sange care apar spontan sunt absorbite din 30 in 30 sec. din momentul inciziei, pe o banda de hartie de filtru, pana la oprirea sangerarii.

Interpretare: - TS ( min )=numarul de picaturi de sange de pe hartia de filtru/2

- normal: TS=1,5-4 minute

- patologic: TS > 6 minute ( valorile de 4-6 min necesita o determinare la cealalta ureche)

TESTE DE EXPLORARE A HEMOSTAZEI SECUNDARE

1. Timpul de coagulare global ( TC ) Metoda Lee si White

Principiu: TC exploreaza ambele mecanisme ale coagularii ( intrinsec si extrinsec ), si repr. timpul necesar coagularii sangelui dupa contactul acestuia cu suprafata rugoasa a sticlei.

Materiale necesare: - material steril pentru recoltarea sangelui ;

- eprubete , termostat , cronometru.

Tehnica: - se recolteaza 2-3ml sange venos in conditii sterile intr-o eprubeta de hemoliza si se porneste cronometrul;

- eprubeta cu sange venos se incubeaza la 37C si se examineaza prin inclinare din 30 in 30sec

- cronometrul se opreste in momentul aparitiei cheagului sangvin.

Interpretare : normal : TC in eprubeta - 8-10 minute

patologic: TC scurtat - sindrom de hipercoagulabilitate,

TC prelungit - sindrom de hipocoagulabilitate din:

insuficienta hepatica

hipoprotrombinemie;

hemofilii;

afibrinogenemie, hipofibrinogenemie;

deficit de vitamina K.

Observatie :TC este o metoda de sensibilitate redusa.

2. Timpul Quick( TQ) / Timpul de protrombina

Principiu : TQ exploareaza mecanismul extrinsic al coagularii si repr. timpul de coagulare al plasmei oxalate dupa aditia de troboplastina tisulara.

Materiale necesare: - plasma oxlata;

- tromboplastina tisulara (obtinuta din creier de iepure)=factorul III;

- solutie CaCl2 0,025M;

- eprubete de hemoliza , pipette , termostat , cronometru.

Tehnica: - se pipeteaza intr-o eprubeta plasma oxalata 0,1ml ( se incubeaza 1ml la 37C );

- se adauga 0,1ml tromboplastina si 0,1l solutie CaCl2 incalzita la 37C si se incepe cronometrarea;

- eprubeta se urmareste din doua in doua secunde ;

- cronometrul se opreste la aparitia primelor filamente de fibrina.

- se lucreaza paralel si o proba de la un martor normal.

Interpretare: normal: TQ=12-15 secunde

patologic : TQ scurtat - sindrom de hipercoagulabilitate

TQ prelungit: - insuficienta hepatica;

- deficit de vitamina K

- afibrinogenemie , hipofibrinogenemie;

- hipoprotrombinemie.

TQ este normal in hemofilie.

OBSERVATIE

TQ exploreaza factorii plasmatici ai coagularii dependent de vitamina K sintetizati exclusiv la nivelul ficatului (II,VII,IX,si X).Pentru diferentierea deficitului de vitmina K de insuficienta hepatica se poate utiliza

Testul Koller : - se determina TQ

- se administreaza parenteral timp de doua zile vitamina K (10mg/zi)

- se repeta TQ.

Interpretare: - daca TQ revine la normal - deficit de vitamina K;

- daca TQ ramane prelungit - insuficienta hepatica.

TQ se utilizeaza la urmarirea tratamentului cu anticoagulante administrate parenteral (dicumarinice antivitamine K )

Pentru a elimina variatiile tehnice ale testarii timpului de protrombina , au fost introduse urmatoarele exprimari:

Rata de protrombina (PR)

PR = TQ pacient(s) / TQ martor normal (s)

INR (international normalized radio)

ISI

INR=PR

ISI - (international sensibility index) este un parametru ce tine cont de sensibilitatea

tromboplastinei folosite in fiecare laborator , in functie de specia de provenienta

- valoarea sa variaza intre 1si 3 , ideal fiind 1.

OBSERVATIE:

INR - permite compararea datelor provenite din labortoare diferite , chiar in alte tari

- permite monitorizarea pacientilor care calatoresc frecvent in diferite regiuni ale

lumii

- precum si o mai eficienta comunicare intre medici.

3.Timpul de tromboplastina partial acivata (APTT)

Principiu : APTTexploareaza mecanismul intrinsec al coagularii.

APTT repr. timpul necesar coagularii plasmei aplachetare in prezenta unui cefalinei (extract cloroformic de tromboplasina tisulara din creier) si a caolinului (activator standardizat al factoruluiXII).

Tehnica: - intr-o eprubeta de hemoliza tinuta la la 37C se pipeteaza:

0,1ml plasma+1ml cefalina+0,1ml solutieCaCl2+ 0,1ml suspensie de caolin

- se porneste cronometrul ;

- cronometrul se opreste la aparitia primelor filamente de fibrina.

Interpretare: - normal : APTT - 20-50 sec ( valorile depind de reactivii folositi in fiecare laborator )

- patologic : APTT prelungit ( mai mare cu 10s decat limita maxima a normalului)

- deficit ai factorului cogularii VIII,IX,XI - hemofilie;

- hipofibrinogenemie;

- hipoprotrombinemie.

OBSERVATIE: APTT normal in deficitul de factor VII.

4. Timpul de trombina (TT)

Principiu: TT exploreza faza finala a coagularii,respectiv transformarea fibrinogenului in fibrina , suprimand primele doua faze ale coagularii prin adaosul de trombina la o plasma aplachetara.

Materiale necesare: - plasma aplachetara de la pacienti;

- solutie proaspata de trombina ;

- eprubeta de hemoliza , pipete , termostat , cronometru.

Tehnica: - intr-o eprubeta de hemoliza tinuta la37 C se pipeteaza :

0,1ml plasma+0,1ml solutie trombina

- se porneste cronometrul;

- cronometrul se opreste la aparitia cheagului.

- se lucreaza in paralel si o proba de martor normal.

Interpretare: - normal : TT - 20-30 sec. (valorile depid de reactivii folositi in fiecare laborator)

- patologic: TT prelungit in: - hipofibrinogenemii, prezenta de anticoagulanti circulanti.

OBSERVATIE

TT se foloseste pentru urmarirea tratamentului cu heparine nefractionate.

6. Determinarea concentratiei de fibrinogen

Se utilizeaza : - tehnici gravimetrice;

- tehnici fotometrice;

- tehnici imunologice (ex.RIA).

Normal : fibrinogenemia=2,5-3,5g/l

Patologic:

3.EXPLORAREA SERIEI TROMBOCITARE

Numaratoarea trombocitelor

METODA MANUALA

Principiu: se realizeaza direct in hemocitometru, utilizand sange recoltat intr-o proportie cunoascuta, cu solutie care lizeaza celalate elemente saturate ( solutie Weed) ( eroare 15-30%).

METODA AUTOMATA(metoda impedantei electrice)

Principiu: o suspensie de trombocite este fortata sa traverseze un orificiu ingust prevazut cu doi electrozi intre care se aplica un curent continuu. Trecerea fiecarui trombocit determina o scadere brusca de tensiune numita puls , care sunt numarate electronic si redate ca numar de trombocite /mm3.

NORMAL:numarul de trombocite=150000-350000/mm3

PATOLOGIC: trombocitopenie

>350000/mm3=>trombocitoza

Sudiul morfologiei tromocitelor

Principu: analiza morfologica se realizeaza pe frotiul de sange periferic colorat May-Grnwald-Giemsa.Trombocitele au aspect heterogen , zona centrala sau granulomerul continand granulatii azurofile izolate sau aglomerate , iar zona periferica sau hialomerul fiind omogena si palid colorata in albastru sau violet.

Interpretare: pentru aprecierea orientativa a numarului de trombocite :

-grupe de 15-25 elemente=>numar normal de trombocite;

-grupe de 4-6 elemente => trombopenie;

-gupe foarte mari de elemente=>trombocitoza.