fisiologia_bacteriana_ (pruebas_bioquimicas)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICOMEXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES “ZARAGOZA”“ZARAGOZA”

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIALABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA 14:PRACTICA 14:FISIOLOGIA BACTERIANA (PRUEBAS FISIOLOGIA BACTERIANA (PRUEBAS

BIOQUIMICAS)BIOQUIMICAS)ALUMNOSALUMNOS: **Castañeda Piña Juan Carlos: **Castañeda Piña Juan Carlos

**Escobar Blanco Luís**Escobar Blanco Luís **Ordóñez Piña Imelda**Ordóñez Piña Imelda

Importancia de la fisiología Importancia de la fisiología bacteriana (Pruebas bioquímicas)bacteriana (Pruebas bioquímicas)

GeneralidadesGeneralidades

**La mayoría de las Rx bioquímicas metabólicas **La mayoría de las Rx bioquímicas metabólicas de microorganismos es controladas por de microorganismos es controladas por medio de enzimas.medio de enzimas.

**Es esencial conocer el metabolismo de los **Es esencial conocer el metabolismo de los M.O. para comprender las relaciones M.O. para comprender las relaciones hospedero- patógeno y patógeno-medio.hospedero- patógeno y patógeno-medio.

**La determinación de las características **La determinación de las características bioquímicas es el paso primordial para la bioquímicas es el paso primordial para la identificación de la gran mayoría de MO.identificación de la gran mayoría de MO.

**Se debe verificar efectos y cambios que **Se debe verificar efectos y cambios que sufre un medio de cultivo.sufre un medio de cultivo.

A B C

Al realizar este tipo de determinaciones Al realizar este tipo de determinaciones deben tomarse en cuenta algunos factores deben tomarse en cuenta algunos factores que influyen directamente en el que influyen directamente en el metabolismo bacteriano como:metabolismo bacteriano como:

*Temperatura*Temperatura*pH óptimo de crecimiento*pH óptimo de crecimiento

*Concentración de oxigeno y CO*Concentración de oxigeno y CO2 2

*Tipo de medio de cultivo*Tipo de medio de cultivo*Tipo de esterilización *Tipo de esterilización *Tipo de microorganismo*Tipo de microorganismo

CALDO ROJO DE FENOL

OBJETIVO:OBJETIVO:

Determinar la capacidad de que un M.O. Determinar la capacidad de que un M.O. fermente un CHO especifico y producir un fermente un CHO especifico y producir un HH++ o un H o un H++ con gas. con gas.El estudio de algunas especies como:El estudio de algunas especies como:

*Lactobacilos *Shigella Sp*Lactobacilos *Shigella Sp*Bacillus sp *Proteus Sp*Bacillus sp *Proteus Sp*Streptococcus sp *Klebsiella Sp*Streptococcus sp *Klebsiella Sp*Enterobacter *Clostridium Sp*Enterobacter *Clostridium Sp*Sallmonella Sp*Sallmonella Sp

Fermentadores de glucosa: todos los Fermentadores de glucosa: todos los miembros de las miembros de las Enterobacteriaceae.Enterobacteriaceae.

Fermentadores de Glucosa y lactosaFermentadores de Glucosa y lactosa

E.ColiE.Coli

Klepsiella Sp.Klepsiella Sp.

Enterobacter Sp.Enterobacter Sp.

FUNDAMENTOFUNDAMENTO

El rojo de fenol es el indicador de pH mas El rojo de fenol es el indicador de pH mas frecuentemente utilizado para demostrar frecuentemente utilizado para demostrar la fermentación de un CHO.la fermentación de un CHO.Con el rojo de fenol, el cambio de color Con el rojo de fenol, el cambio de color ocurre cerca del pH original del medio.ocurre cerca del pH original del medio.Determinar la capacidad de un Determinar la capacidad de un microorganismo un CHO especifico microorganismo un CHO especifico incorporado a un medio básico, incorporado a un medio básico, produciendo un ácido o un ácido con un produciendo un ácido o un ácido con un gas visible.gas visible.

REACCION REACCION GENERALGENERAL

Indicador pH+ CHO´s COIndicador pH+ CHO´s CO22+H+H22++

( Aldehídos,( Aldehídos,

Ácidos, Ácidos,

Alcoholes,Alcoholes,

Cetonas,Cetonas,

Cambio de color.Cambio de color.

bacteriaglucólisis

**Inicialmente los ChO´s son degradados a **Inicialmente los ChO´s son degradados a monosacáridos para entrar a la célula monosacáridos para entrar a la célula bacteriana y ser degradados.bacteriana y ser degradados.

*La fermentación es un proceso es un *La fermentación es un proceso es un proceso metabólico de oxido-reducción proceso metabólico de oxido-reducción anaeróbico.anaeróbico.

Los productos finales característicos de la Los productos finales característicos de la fermentación bacteriana son:fermentación bacteriana son:

1)Ácido Láctico1)Ácido Láctico

2)Ácidos acético y fórmico2)Ácidos acético y fórmico

3)Ácido láctico y alcohol etílico3)Ácido láctico y alcohol etílico

4) Acetilmetilcarbinol (acetoina) y CO4) Acetilmetilcarbinol (acetoina) y CO22

5)Acido succínico5)Acido succínico

6)CO6)CO22, acetona y alcohol isopropilico, acetona y alcohol isopropilico

7) Alcohol butílico. 7) Alcohol butílico.

Fermentación alcohólicaFermentación alcohólica

Glucosa 2 Etanol + CO2Glucosa 2 Etanol + CO2

*Las bacterias alcohólicas degradan a la *Las bacterias alcohólicas degradan a la glucosa en Ác. Pirúvico (intermediario clave) glucosa en Ác. Pirúvico (intermediario clave) siguiendo el ciclo de Embden – Meyerhof.siguiendo el ciclo de Embden – Meyerhof.

**Proceso llevado a cabo por levaduras**Proceso llevado a cabo por levaduras

Saccharomyces Sp.Saccharomyces Sp.

Fermentación del ácido lácticoFermentación del ácido láctico

HomolácticasHomolácticas HeterolácticasHeterolácticas

Embden -Meyerhof Embden MeyerhofShunt de las pentosas

Entner-Duodoroff

Ac. lácticoAc. Láctico **EtanolÁc. Acético **Co2Ác. Fórmico **Glicerol

*Lactobacillus*Lactobacillus

*Bacillus Sp*Bacillus Sp

*Streptococcus*Streptococcus

*Leuconostoc*Leuconostoc

Fermentación formicaFermentación formica

Fermentación Fermentación Fermentación Fermentación

Ácido mixta ButilenglicolicaÁcido mixta Butilenglicolica

Ácido Fórmico, acético, fórmico, láctico,

Etanol.

Mismos Productos en Menor cantidad y

2-3 butenglicol (butanediol)

FERMENTACION PROPIÓNICAFERMENTACION PROPIÓNICA

**El principal producto final del ácido **El principal producto final del ácido Pirúvico es el ácido propiónico y COPirúvico es el ácido propiónico y CO22 a a

través del ácido succínico.través del ácido succínico.

*También se puede producir ácido *También se puede producir ácido acético.acético.

**Propionibacterium**Propionibacterium

**Clostridium propionicum**Clostridium propionicum

**Corinebacterium diphtheriae**Corinebacterium diphtheriae

Fermentación butíricaFermentación butírica**La fermentación del alcohol **La fermentación del alcohol

butílico es llevada a cabo por butílico es llevada a cabo por bacterias anaerobias como el bacterias anaerobias como el clostridiumclostridium..

*Formación de Ac. Acético, ácido *Formación de Ac. Acético, ácido fórmico, etanol, ácido butírico, fórmico, etanol, ácido butírico, alcohol butílico, acetona, alcohol butílico, acetona, alcohol isopropilico.alcohol isopropilico.

COMPOSICIONCOMPOSICION

Extracto de Carne………………….…1gExtracto de Carne………………….…1g

Peptona proteasa ………………….10 gPeptona proteasa ………………….10 g

Cloruro Sódico…………………….….5gCloruro Sódico…………………….….5g

Rojo de fenol soln al 5%..............1.8mLRojo de fenol soln al 5%..............1.8mL

Agua Destilada………………….1000mLAgua Destilada………………….1000mL

*A esta base agregar 5g del CHO deseado.*A esta base agregar 5g del CHO deseado.

*Ajustar el pH a 7.4*Ajustar el pH a 7.4

*Poner tubos de Durham invertidos*Poner tubos de Durham invertidos

*Pasar por la autoclave a 115ºC por 10 min.*Pasar por la autoclave a 115ºC por 10 min.

Se debe de inocular por difusión en cada uno Se debe de inocular por difusión en cada uno de los caldos con el microorganismo.de los caldos con el microorganismo.

*La inoculación debe de hacerse con un *La inoculación debe de hacerse con un inoculo denso.inoculo denso.

*Incubar el tubo a 35ºC durante 18 a 24 *Incubar el tubo a 35ºC durante 18 a 24 horas.horas.

*Realizar las observaciones correspondientes *Realizar las observaciones correspondientes e interpretar los resultados.e interpretar los resultados.

Microorganismos que se Microorganismos que se utilizan como control positivo utilizan como control positivo y negativos en el laboratorio.y negativos en el laboratorio.

Precauciones:Precauciones:

Cuando se utiliza un tubo de Durham se Cuando se utiliza un tubo de Durham se debe de colocar de manera invertida.debe de colocar de manera invertida.

Esto debido al estudio de producción de Esto debido al estudio de producción de gases en algunas familias de bacterias gases en algunas familias de bacterias fermentativas y distinguir de entre las que fermentativas y distinguir de entre las que no producen este producto residual de la no producen este producto residual de la fermentación. fermentación.

*El caldo no presente trazas de NO*El caldo no presente trazas de NO332-2- . .

*El medio con CHO´S cuando se retira de la *El medio con CHO´S cuando se retira de la autoclave posee un color anaranjado suave autoclave posee un color anaranjado suave que cambia al naranja-rojo cuando se enfría.que cambia al naranja-rojo cuando se enfría.

*Se debe de tener cuidado cuando se *Se debe de tener cuidado cuando se interpretan las pruebas ya que el color que interpretan las pruebas ya que el color que denota la fermentación varia de acuerdo al denota la fermentación varia de acuerdo al indicador de pH utilizado.indicador de pH utilizado.

*La adición de CHO´S en el medio puede *La adición de CHO´S en el medio puede producir una condición acida. producir una condición acida.

Caldo nitrato Caldo nitrato

OBJETIVOS: OBJETIVOS:

-Determinar la capacidad de un -Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos a microorganismo de reducir los nitratos a

nitritos o gas nitrógeno librenitritos o gas nitrógeno libre

- Diferenciación de especies- Diferenciación de especies

- Diferenciación de géneros- Diferenciación de géneros

FundamentoFundamento

La reducción de nitrato (NOLa reducción de nitrato (NO33--) a nitrito ) a nitrito (NO(NO22) y a nitrógeno gaseoso (N) y a nitrógeno gaseoso (N22) por lo ) por lo común se produce en condiciones de común se produce en condiciones de anaerobiosis.anaerobiosis.

METODOMETODOINOCULALAR POR INOCULALAR POR DIFUSION EL CALDO DIFUSION EL CALDO NITRATO CON EL NITRATO CON EL MICROORGANISMOMICROORGANISMO

INCUBAR EL INCUBAR EL TUBO A 35 C TUBO A 35 C DURANTE 24- 48 DURANTE 24- 48 HORASHORAS

Agregar 5 gotas de Alfa- Naftilamina y 5 gotas de ácido sulfanilico

Color rojo

Agregar zinc

NONO

Fin de la prueba

ReaccionesReacciones

NO3- + 2e

- + 2H NO2 + H2O

Caldo NitratoCaldo Nitrato

ComposiciónComposición::

Peptona......................5 grPeptona......................5 gr

Extracto de carne......... 3 grExtracto de carne......... 3 gr

Nitrato potásico........... 1 grNitrato potásico........... 1 gr

Agua destilada........... 1000 mlAgua destilada........... 1000 ml

Disolver los ingredientes y ajustar el pH a Disolver los ingredientes y ajustar el pH a 7 y distribuir 5 ml en cada tubo.7 y distribuir 5 ml en cada tubo.

Microorganismos utilizados Microorganismos utilizados como controlcomo control

Positivo (+)Positivo (+)

Escherichia coliEscherichia coli

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

Negativo (-)Negativo (-)

Acinetobacter IwoffiAcinetobacter Iwoffi

INTERPRETACIONINTERPRETACIONResultadosResultados

Fase IFase I

Resultado positivo (+)Resultado positivo (+)

- Color rojo oscuro en 1-2 min- Color rojo oscuro en 1-2 min

Resultado negativoResultado negativo

-Falta de desarrollo de color-Falta de desarrollo de color

• Fase 2: Prueba de reducción de CincFase 2: Prueba de reducción de Cinc

Resultado positivo Resultado positivo

-Ausencia de desarrollo de color -Ausencia de desarrollo de color

Resultado negativoResultado negativo

a) Color rosa a rojo oscuro en 5-10 mina) Color rosa a rojo oscuro en 5-10 min

c) Nitrato presente; no reducido por el c) Nitrato presente; no reducido por el microorganismomicroorganismo

PRECAUCIONESPRECAUCIONES

Realizar la interpretación de los Realizar la interpretación de los resultados inmediatamente.resultados inmediatamente.

AGAR ALMIDONAGAR ALMIDON

• Objetivos:Objetivos:

Determinar la capacidad de un Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón microorganismo de hidrolizar el almidón

• Diferenciación de especies Diferenciación de especies

FundamentoFundamento•La observación de hidrólisis enzimática por parte de la -amilasa o endoamilasa excretada por bacterias. • Moléculas de Yodo atrapadas en las hélices de unidades de glucosa.

HidrolisisHidrolisis

MEDIOS UTILIZADOSMEDIOS UTILIZADOS

Peptona 5gPeptona 5gExtracto de carne 3gExtracto de carne 3gCloruro de sodio 5gCloruro de sodio 5gAgar 20gAgar 20gAgua destilada 1.000mL Agua destilada 1.000mL

Agar Almidón

Método Método

Inocular la placa Inocular la placa con el con el microorganismomicroorganismo

INCUBAR A 35 c DURANTE 24- 48 HORAS

Cubrir la placa Cubrir la placa con solución de con solución de

lugollugol

MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS COMO CONTROLUTILIZADOS COMO CONTROL

ANAEROBIOS POSITIVO (+)

ANAEROBIOS NEGATIVO (-)

AEROBIOS POSITIVO (+)

AEROBIOS NEGATIVO (-)

Bacteroides fragilis

Clostridium bifermentans

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Clostridium perfringens

InterpretaciónInterpretaciónResultadosResultados

- Positivo (+)- Positivo (+)

Medio de color Medio de color púrpura-azul con un púrpura-azul con un área incolora. área incolora.

-Negativo (-) -Negativo (-)

Medio de color Medio de color púrpura-azul en el púrpura-azul en el crecimiento. crecimiento.

PrecaucionesPrecauciones

Registrar los resultados inmediatamente Registrar los resultados inmediatamente después de agregar el reactivo de yodo ya después de agregar el reactivo de yodo ya que el color azul formado puede aclararse, que el color azul formado puede aclararse, lo que da un resultado falso positivo en lo que da un resultado falso positivo en ausencia del almidón.ausencia del almidón.

Pruebas de Pruebas de ROJO DE METILO –ROJO DE METILO –

VOGES PROSKAUER VOGES PROSKAUER

ROJO ROJO

DE DE

METILOMETILO

ROJO DE METILOROJO DE METILO

OBJETIVOSOBJETIVOS

Identificación de especies bacterianas queIdentificación de especies bacterianas queproducen ácidos fuertes a partir de producen ácidos fuertes a partir de glucosa.glucosa.

Diferenciar entre géneros y especies Diferenciar entre géneros y especies dentro de un género de la familia dentro de un género de la familia EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae..


FUNDAMENTOFUNDAMENTO

Es una prueba cuantitativa basada en Es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de pH, rojo de el uso de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la metilo, para determinar la concentración de ión hidrógeno cuando concentración de ión hidrógeno cuando un microorganismo fermenta la un microorganismo fermenta la glucosa.glucosa.


Los MR + ác. estables: Los MR + ác. estables: láctico, acético, láctico, acético, fórmico, succínico fórmico, succínico //[ H ] máx.[ H ] máx.

Los MR - Los MR - ACETOÍNAACETOÍNA

[ H ] [ H ] neutralidad /neutralidad /

COCO2 2 yy OO2.2.


Metabolismo gral. De Metabolismo gral. De E. coliE. coli 2 ac. Láctico + ac. Acético +2 ac. Láctico + ac. Acético +

2 2 EtOH + 2 CO EtOH + 2 CO22 + 2 H+ 2 H22

metabolismo de metabolismo de Klebsiella – EnterobacterKlebsiella – Enterobacter

+ ½ O+ ½ O2 2 2,3 – butanodiol + H2,3 – butanodiol + H22O O + 2 CO+ 2 CO22

ACETOÍNAACETOÍNA


Fórmula de Clark y Lubs a pH 6,9Fórmula de Clark y Lubs a pH 6,9

Peptonas 7.0 g

Glucosa (dextrosa)

5.0 g

Buffer fosfato dipotásico

5.0 g

Agua destilada 1,000 mL


ΔΔ solución suavemente

fraccionar fraccionar 5 mL por tubo5 mL por tubo

Esterilizar121º, 15 lb, 15’.

Pesar la cantidad exacta y

rehidratar con agua

inóculo liviano debajo de la superficie del medio,

tapas flojas.ojas.IncubarIncubar mín:

35º, 48 h

recom: 30º,

3 -5 días. Agregar Agregar indicadorindicador

InterpretarResultado:

+ ó -


Microorganismos utilizados para el Microorganismos utilizados para el control de calidadcontrol de calidad

Bacteria MR +/- VP +/ -

E. coli + -

Enterobacter aerogenes

- +


INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSINTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

MR + Cultivo suficientemente ácido para permanecer el color rojo (pH 4,4), en la superficie del medio.

MR - Color amarillo (pH 6,0), en la superficie del

medio.

Rx tardía Color naranja rojizo por menos producción de

ácido a partir del sustrato de prueba, incubación a 4 días.

VOGES- VOGES- PROSKAUERPROSKAUER

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUEROBJETIVOSOBJETIVOS

Determinar la capacidad de algunos Determinar la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final microorganismos para producir un producto final neutro (acetilmetilcarbinol AMC, acetoína), a neutro (acetilmetilcarbinol AMC, acetoína), a partir de fermentación de glucosa .partir de fermentación de glucosa .

Diferenciar entre géneros y especies dentro de Diferenciar entre géneros y especies dentro de un género de la familia un género de la familia EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae..

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUERFUNDAMENTOFUNDAMENTO

Es una prueba basada en la Es una prueba basada en la detección de acetoína. La producción detección de acetoína. La producción de acetoína es una de las vías de acetoína es una de las vías metabólicas de la glucosa en metabólicas de la glucosa en bacterias.bacterias.

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER Metabolismo generalMetabolismo general

2 2

acetoínaacetoína

+ + COCO22

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUERFórmula de Clark y Lubs a pH 6,9Fórmula de Clark y Lubs a pH 6,9

Peptonas 7.0 g

Glucosa (dextrosa)

5.0 g

Buffer fosfato dipotásico

5.0 g

Agua destilada

1,000 mL

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUERΔ solución

suavementefraccionar

5 mL por tubo

EsterilizarEsterilizar121º, 15 lb, 15’.121º, 15 lb, 15’.

Pesar la cantidad Pesar la cantidad exacta y exacta y

rehidratar con aguarehidratar con agua

inóculo liviano inóculo liviano debajo de la debajo de la superficie superficie del medio, del medio, tapas flojas.tapas flojas.

Incubar

mín: 35º,

18-24 h

recom:

30º, 3 -5 días. Agregar Agregar

Reactivos Reactivos VPVP

InterpretarResultado:

+ ó -

VOGES – PROSKAUERVOGES – PROSKAUER® Reactivos VP de Barritt® Reactivos VP de Barritt

A

α- naftol al 5% en EtOH

absoluto

B KOH al 40%

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER® Reactivos VP de CoblentzReactivos VP de Coblentz

A

α- naftol al 5% en EtOH al 95%

B

Creatina al 0.3% en KOH al 40%. Creatina N-metil-N-guanilglicina; NH:C(NH2N(CH3)CH2COOH.

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER® Reactivos VP único de O’Meara (modificado)Reactivos VP único de O’Meara (modificado)

Creatina al 0.3% en KOH al 40%

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER®Método de utilizaciónMétodo de utilización

1.1. Retirar una alícuota Retirar una alícuota para la prueba V-Ppara la prueba V-P

a.a. Barritt: 2.5 mLBarritt: 2.5 mL

b.b. Coblentz: 2.0 mLCoblentz: 2.0 mL

c.c. O’Meara: 1.0 mLO’Meara: 1.0 mL

2.2. Agregar los reactivos V-PAgregar los reactivos V-P

I.I. Reactivos de Barritt o Reactivos de Barritt o CoblentzCoblentz

a.a. 0.6 mL del reactivo A0.6 mL del reactivo A

b.b. 0.2 mL del reactivo B0.2 mL del reactivo B

II.II. Reactivo de O’MearaReactivo de O’Meara

a.a. Agregar 1 mL del Agregar 1 mL del reactivoreactivo

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER®Método de utilizaciónMétodo de utilización

3.3. Dejar reposar los tubos antes Dejar reposar los tubos antes de interpretar el resultado.de interpretar el resultado.

a.a. Tubos con Barritt: 10 – 15’.Tubos con Barritt: 10 – 15’.

b.b. Tubos con Coblentz: 10 – 20’.Tubos con Coblentz: 10 – 20’.

c.c. Tubos con O’Meara: 35º ó Tubos con O’Meara: 35º ó

22-25ºC, leer a las 4h. 22-25ºC, leer a las 4h.

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER® Acción del reactivoAcción del reactivo

Glucosa Glucosa AcetoínaAcetoína

AcetoínaAcetoína + + αα-naftol -naftol Diacetilo Diacetilo + + 2 H2 H22OO

DiacetiloDiacetilo + + Núcleos de guanidina Núcleos de guanidina color rosado-rojocolor rosado-rojo

de la peptona de la peptona

condensacióncondensación

fermentaciónfermentación

KOH 4KOH 40%0%

oo22

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER

® Microorganismos utilizados para el Microorganismos utilizados para el control de calidadcontrol de calidad

Bacteria VP +/ -

E. coli -

Enterobacter cloacae

+

VOGES - PROSKAUERVOGES - PROSKAUER

® INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSINTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

VP+color rosado-rojo, en la

superficie del medio (acetoína presente).

VP -Color amarillo en la

superficie del medio; color cobrizo se debe a los reactivos cuando se

mezclan.

fisiologia_bacteriana_ (pruebas_bioquimicas)

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