fingerprinting genomes using pcr with arbitrary primers

8/8/2019 Fingerprinting Genomes Using PCR With Arbitrary Primers

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 2 4 7 2 1 3

F i n g e r p r i n t i n g genomes u s i n g PCR w i t h a r b i t r a r y p r i m e r s *J o h n W e l s h a n d M i c h a e l M c C l e l l a n dC a l i f o r n i a I n s t i t u t e o f B i o l o g i c a l R e s e a r c h , 1 1 0 9 9 N o r t h T o r r e y P i n e s R o a d , L a J o l l a , CA 9 2 0 3 7 , USAR e c e i v e d J u l y 2 7 , 1 9 9 0 ; R e v i s e d a n d A c c e p t e d A u g u s t 3 0 , 1 9 9 0

ABSTRACTS i m p l e a n d r e p r o d u c i b l e f i n g e r p r i n t s o f c o m p l e xgenomes can b e g e n e r a t e d u s i n g s i n g l e a r b i t r a r i l yc h o s e n p r i m e r s a n d t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n( P C R ) . No p r i o r sequence i n f o r m a t i o n i s r e q u i r e d . Th em e t h o d , a r b i t r a r i l y p r i m e d PCR ( A P - P C R ) , i n v o l v e s twoc y c l e s o f l o w s t r i n g e n c y a m p l i f i c a t i o n f o l l o w e d b y PCRa t h i g h e r s t r i n g e n c y . We show t h a t s t r a i n s can b ed i s t i n g u i s h e d b y c o m p a r i n g p o l y m o r p h i s m s i n g e n o m i cf i n g e r p r i n t s . The g e n e r a l i t y o f t h e method i sd e m o n s t r a t e d b y a p p l i c a t i o n t o t w e n t y f o u r s t r a i n s f r o mf i v e s p e c i e s o f S t a p h y l o c o c c u s , e l e v e n s t r a i n s o fS t r e p t o c o c c u s pyogenes a n d t h r e e v a r i e t i e s o f O r y z as a t i v a ( r i c e ) .INTRODUCTIONI t i s i m p o r t a n t i n e p i d e m i o l o g y a n d e c o l o g y t o b e a b l e t o i d e n t i f yb a c t e r i a l s p e c i e s a n d s t r a i n s a c c u r a t e l y . R a p i d i d e n t i f i c a t i o n a n dc l a s s i f i c a t i o n o f b a c t e r i a i s n o r m a l l y c a r r i e d o u t b y m o r p h o l o g y ,n u t r i t i o n a l r e q u i r e m e n t s , a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e , i s o e n z y m ec o m p a r i s o n s , p h a g e s e n s i t i v i t y ( 1 , 2 , 3 , 4 ) a n d , m ore r e c e n t l y ,DNA b a s e d m e t h o d s , p a r t i c u l a r l y rRNA sequences ( 5 ) , s t r a i n -s p e c i f i c f l u o r e s c e n t o l i g o n u c l e o t i d e s ( 6 , 7 ) a n d t h e p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( 8 , 9 , 1 0 ) . E a c h o f t h e s e m e t h o d s h a s s p e c i f i ca p p l i c a t i o n s a n d a d v a n t a g e s . We d e m o n s t r a t e h e r e ac o m p l e m e n t a r y m e t h o d t h a t i s s i m p l e a n d f a s t , a n d can b e a p p l i e dt o an y s p e c i e s f o r w h i c h DNA can b e p r e p a r e d . T h i s m e t h o d ,w h i c h we c a l l A r b i t r a r i l y P r i m e d P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n( A P - P C R ) ' f i n g e r p r i n t i n g ' h a s t h e f u r t h e r m e r i t o f r e q u i r i n g l i t t l ek n o w l e d g e o f t h e b i o c h e m i s t r y or m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e s p e c i e sb e i n g s t u d i e d .A s a f i r s t a p p l i c a t i o n , a n d t o d e m o n s t r a t e t h e ease a n d u t i l i t yo f t h i s m e t h o d , we t e s t e d s t r a i n s f r o m f i v e s p e c i e s o fS t a p h y l o c o c c u s , t h e r e l a t i o n s h i p s f o r w h i c h h a d b e e n d e t e r m i n e db y DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n ( 1 1 , 1 2 , 1 3 , 1 4 ) , e l e v e n s t r a i n s o f t h eh u m a n p a t h o g e n S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s , a n d t h r e e v a r i e t i e s o fr i c e , an a g r i c u l t u r a l l y i m p o r t a n t p l a n t .METHODSS t r a i n sS . a u r e u s , I S P - 8 , i s o l a t e d f r o m h u m a n . ATCC 8 4 3 2 , from b i r d .ATCC 1 5 5 6 4 , f r o m h u m a n . ATCC 6 5 3 8 , f r o m h u m a n . S a u 3 A ,f r o m h u m a n . ATCC 1 2 6 0 0 , f r o m h u m a n .

S . c o h n i i , J L 1 4 3 , f r o m h u m a n . CM 8 9 , f r o m h u m a n . S S 5 2 1 ,f r o m S q u i r r e l m o n k e y .S t a p h y l o c o c c u s h a e m o l y t i c u s , C 1 2 J 2 , i s o l a t e d f r o mM a n g a b e y . PAY 9 F 2 , f r o m C h i m p a n z e e . AW 2 6 3 , f r o m h u m a n .MI D 5 6 3 , f r o m Mouse l e m u r . ATCC 2 9 9 7 0 , f r o m h u m a n .S . h o m i n i s , ATCC 2 7 8 4 4 , f r o m h u m a n . ATCC 2 7 8 4 6 , f r o mh u m a n . F u l , q u e s t i o n a b l e o r i g i n .S . warneri, CPB 1 0 E 2 , i s o l a t e d f r o m C e r c o p i t h e c u s . GAD4 7 3 , f r o m B u s h - b a b y . MCY 3 E 6 , f r o m R h e s u s m o n k e y . PBNZP4 D 3 , f r o m L a n g u r . LED 3 5 5 , f r o m L e m u r .A l l S t a p h y l o c o c c u s s t r a i n s were k i n d l y p r o v i d e d b y W . E . K l o o so f N o r t h C a r o l i n a S t a t e U n i v . e x c e p t I S P - 8 f r o m P e t e r P a t t e e ,I o w a S t a t e , F u l , a n d t h o s e f r o m t h e A m e r i c a n Type C u l t u r eC o l l e c t i o n .S t r e p t o c o c c u s pyogenes. DNAs f r o m t h e human p a t h o g e n i cs t r a i n s D 4 7 1 , T I / 1 9 5 / 2 , 4 0 R S 1 5 , 5 2 R S 1 5 , 4 7 R S 1 5 , 5 5 R S 1 5 ,1 / E 9 , T 2 8 / 5 1 / 4 , K 5 8 H g , S M 6 , UAB 0 9 2 a n d E n t e r o c o c c u sf a e c a l i s , OGI X , were a l l k i n d l y s u p p l i e d b y S u s a n H o l l i n g s h e a d( U n i v . o f A l a b a m a , B i r m i n g h a m , A L ) .O r y z a s a t i v a , ( R i c e ) . G e n o m i c DNAs f r o m s s p . i n d i c a I R 5 4 ,

s s p . j a p o n i c a C a l s o r s e 7 6 a n d 0 . s a t i v a cv . ' L e m o n t ' were k i n d l yp r o v i d e d b y T h o m a s H o d g e s ( P u r d u e U n i v . , W e s t L a f a y e t t e , I N )a n d T i m o t h y C r o u g h a n ( L o u i s i a n a S t a t e U . , R i c e E x p t . S t a t i o n ,C r o w l e y , L A ) .S t a p h y l o c o c c u s g e n o m i c DNA p r e p a r a t i o nS t a p h y l o c o c c u s s t r a i n s were grown o v e r n i g h t a t 3 7 C i n 2-5mi o f b r a i n h e a r t i n f u s i o n m e d i a . T h e c e l l s were p e l l e t e d ,r e s u s p e n d e d i n 0 . 2 m l o f 1 x T E . w i t h 0 . 2 m g / m l l y s o s t a p h i na n d i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r one h o u r . 0 . 2 m l p r o t e i n a s e K s o l u t i o n( 0 . 5 m g / m l p r o t e i n a s e K , 1 % s a r k o s y l , 2 0 0 mM EDTA, 1 mMc a l c i u m c h l o r i d e ) w as a d d e d t o e a c h , f o l l o w e d b y d i g e s t i o n a t5 0 C f o r 1 h r . T h e c l e a r e d l y s a t e s were e x t r a c t e d w i t h p h e n o l ,t h e n c h l o r o f o r m , t h e n e t h a n o l p r e c i p i t a t e d . T h e DNA wasd i s s o l v e d i n T E , a n d t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n w as e s t i m a t e d b yagarose g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d e t h i d i u m s t a i n i n g .P r i m e r sT h e p r i m e r K p n - R (CCAAGTCGACATGGCACRTGTATA-CATAYGTAAC), a n d t h e p B S reverse s e q u e n c i n g p r i m e r ( G G -AAACAGCTATGACCATGA), d e s i g n e d f o r o t h e r p u r p o s e s a n dc h o s e n a r b i t r a r i l y f o r t h e s e e x p e r i m e n t s , were o b t a i n e d f r o mG e n o s y s , H o u s t o n , TX .

* P u b l i c a t i o n o f t h i s p a p e r was d e l a y e d b y t h e a u t h o r s t o a l l o w s i m u l t a n e o u s p u b l i c a t i o n w i t h a p a p e r s u b m i t t e d l a t e r b y a n o t h e r g r o u p . N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h r e g r e t st h a t d u e t o a d m i n i s t r a t i v e e r r o r s t h e o t h e r p a p e r , b y W i l l i a m s e t a l . , w as p u b l i s h e d on p a g e s 6 5 3 1 - 6 5 3 5 o f i s s u e 2 2 . B o t h s e t s o f a u th o r s a g r e e t h a t t h e t w o p a p e r ss h o u l d b e c o n s i d e r e d a s p u b l i s h e d s i m u l t a n e o u s l y a n d s h o u l d b e r e f e r r e d t o t o g e t h e r .

. = ) 1 9 9 0 O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s


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7 2 1 4 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 2 4AP-PCR a m p l i f i c a t i o n1 0 A l r e a c t i o n s w e r e p r e p a r e d u s i n g 0 . 0 2 5 U T a q p o l a n d 1 xb u f f e r ( S t r a t a g e n e ) a d j u s t e d t o 4 mM w i t h M g C l 2 , 0 . 2 mM o fe a c h d N T P , 1 0 i t M K p n - R p r i m e r a n d D N A a t v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s a s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e l e g e n d s . A h i g h M g 2 +c o n c e n t r a t i o n w a s s e l e c t e d t o e n h a n c e t h e s t a b i l i t y o fp r i m e r / t e m p l a t e i n t e r a c t i o n s . T h e r e a c t i o n w a s o v e r l a i d w i t h o i la n d c y c l e d t h r o u g h t h e f o l l o w i n g t e m p e r a t u r e p r o f i l e : 9 4 C f o r5 m i n . t o d e n a t u r e , 4 0 C f o r 5 m i n . f o r l o w s t r i n g e n c y a n n e a l i n go f p r i m e r a n d 7 2 C f o r 5 m i n . f o r e x t e n s i o n f o r t w o c y c l e s . T h i st e m p e r a t u r e p r o f i l e w a s f o ll o w e d b y t e n h i g h s t r i n g e n c y c y c l e s :9 4 C f o r 1 m i n . , 6 0 C f o r 1 m i n . a n d 7 2 C f o r 2 m i n . f o r 1 0c y c l e s . A t t h e e n d o f t h i s r e a c t i o n , 9 0 t l o f a s o l u t i o n c o n t a i n i n g2 . 2 5 U T a q p o l i n 1 x b u f f e r , 0 . 2 mM d N T P s a n d 5 0 , t C ia e - [ 3 2 P ] dCTP w a s a d d e d a n d t h e h i g h s t r i n g e n c y c y c l e s w e r ec o n t i n u e d f o r a n a d d i t i o n a l 2 0 o r 3 0 r o u n d s . T h i s p r o t o c o l w a sd e s i g n e d t o a l l o w f o r h i g h p r i m e r c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e l o ws t r i n g e n c y s t e p s .

6 V . + XA t -+

2 3 1 3 0 -9416-6 5 5 1 -4 3 6 1 -

2322-2027-

RESULTSWe o b s e r v e d t h a t b y u s i n g a s i n g l e p r i m e r a n d t w o c y c l e s o fl o w s t r i n g e n c y PCR f o l l o w e d b y m a n y c y c l e s o f h i g h s t r i n g e n c yPCR we w e r e a b l e t o p r o d u c e a d i s c r e t e a n d r e p r o d u c i b l e s e to f p r o d u c t s c h a r a c t e r i s t i c o f g e n o m e s . We h a v e f o u n d t h a tb e t w e e n t h r e e a n d t w e n t y p r o d u c t s p r e d o m i n a t e f r o m m o s tb a c t e r i a l a n d e u k a r y o t i c g e n o m e s . T h e f i n g e r p r i n t s we h a v ep r o d u c e d a r e r e m i n i s c e n t o f t h o s e p r o d u c e d b y s p e c i f i c p r i m i n ga t t h e A l u r e p e a t i n h u m a n g e n o m i c D N A ( 1 5 ) , e x c e p t t h a t A P -PCR d o e s n o t r e l y o n h i g h h o m o l o g y t o a b u n d a n t d i s p e r s e dr e p e a t s .O u r r a t i o n a l e f o r t h e p h e n o m e n o n o f AP-PCR i s a s f o l l o w s :A t a s u f f i c i e n t l y l o w t e m p e r a t u r e , p r i m e r s c a n b e e x p e c t e d t oa n n e a l t o m a n y s e q u e n c e s w i t h a v a r i e t y o f m i s m a t c h e s . S o m eo f t h e s e w i l l b e w i t h i n a f e w h u n d r e d b a s e p a i r s o f e a c h o t h e ra n d o n o p p o s i t e s t r a n d s . S e q u e n c e s b e t w e e n t h e s e p o s i t i o n s w i l lb e PCR a m p l i f i a b l e . T h e e x t e n t t o w h i c h s e q u e n c e s a m p l i f y w i l ld e p e n d o n t h e e f f i c i e n c y o f p r i m i n g a t e a c h p a i r o f p r i m e ra n n e a l i n g s i t e s a n d t h e e f f i c i e n c y o f e x t e n s i o n . A t e a r l y c y c l e s ,t h o s e t h a t p r i m e m o s t e f f i c i e n t l y w i l l p r e d o m i n a t e . A t l a t e r t i m e s ,t h o s e t h a t a m p l i f y m o s t e f f i c i e n t l y w i l l p r e d o m i n a t e .We i n v e s t i g a t e d t h e p a r a m e t e r s t h a t a f f e c t e d t h e p r o d u c t i o no f r e p r o d u c i b l e , s p e c i e s - a n d s t r a i n - s p e c i f i c , AP-PCRf i n g e r p r i n t s . T h e n u m b e r , r e p r o d u c i b i l i t y a n d i n t e n s i t y o f b a n d si n a f i n g e r p r i n t s h o u l d b e a f u n c t i o n o f s e v e r a l p a r a m e t e r s ,

J A.

s 4 4 - NWI I -},". _ . e ,

564

F i g u r e 1 . V a r i a t i o n o f t e m p e r a t u r e i n f i r s t two s t e p s : D i s c r e t e AP-PCR p r o d u c t sare p r o d u c e d over a w i d e range o f t e m p e r a t u r e s . PC R was p r e f o r m e d u s i n g 1ng o f S . aureus I S P 8 DNA w i t h t h e K p n - R p r i m e r a n d t h e s t a n d a r d p r o t o c o l( m e t h o d s ) e x c e p t t h e two i n i t i a l l o w t e m p e r a t u r e s t e p s were v a r i e d . DNA wase l e c t r o p h o r e s e d i n 1% agarose 1 x TB E g e l a n d v i s u a l i z e d b y e t h i d i u m s t a i n i n g .T h e l o w s t r i n g e n c y a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e was 3 6 0 ( l a n e 2 ) , 4 0 0 ( l a n e 3 ) , 4 4 0( l a n e 4 ) , 4 8 0 ( l a n e 5 ) a n d 5 2 0 ( l a n e 6 ) . I n l a n e 1 , t h e l o w s t r i n g e n c y s t e p was6 0 w h i c h i s t y p i c a l f o r c o n v e n t i o n a l P C R . L a n e M i s H i n d l I l - d i g e s t e db a c t e r i o p h a g e l a m b d a DNA.

F i g u r e 2 . T e m p l a t e t i t r a t i o n : T h e p a t t e r n o f AP-PCR p r o d u c t s d e p e n d s o n t h et e m p l a t e D N A c o n c e n t r a t i o n . AP-PCR w a s p e r f o r m e d u s i n g S . a u r eu s I S P 8 DNAw i t h t h e K p n - R p r i m e r a n d t h e s t a n d a r d p r o t o c o l ( m e t h o d s ) e x c e p t t h e t e m p l a t ec o n c e n t r a t i o n w a s v a r i e d . E a c h s e r i e s o f n i n e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s w a s f r o mt h r e e i n d e p e n d e n t d i l u t i o n s ( a m o u n t o f t e m p l a t e p e r r e a c t i o n i s s h o w n a b o v e e a c hs e t o f t h r e e l a n e s . S i z e m a r k e r s a r e t h e 1 k b l a d d e r f r o m B R L / G i b c o . T h e DNAw a s s e p a r a t e d o n a 5% a c r y l a m i d e , 50 % u r e a 1 x TB E g e l a n d v i s u a l i z e d b ya u t o r a d i o g r a p h y .

- ~~_...~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~S..


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 2 4 7 2 1 5i n c l u d i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f s a l t s , p r i m e r a n n e a l i n gt e m p e r a t u r e , t e m p l a t e c o n c e n t r a t i o n , p r i m e r l e n g t h a n d p r i m e rs e q u e n c e .T e m p e r a t u r eI n i t i a l l y , w e d e t e r m i n e d t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n AP-PCRu s i n g t h e g e n o m e o f t h e b a c t e r i a S t a p h y l o c o c c u s a s a t e m p l a t e .I f t h e s t r i n g e n c y i s k e p t h i g h ( a t l e a s t 6 0 C ) t h r o u g h o u t t h et h e r m o - c y c l i n g r e a c t i o n a n d t h e p r i m e r i s s u f f i c i e n t l y d i f f e r e n tf r o m a n y s e q u e n c e i n t h e t e m p l a t e , n o s p e c i f i c p r o d u c t w i l l b eo b s e r v e d ( l a n e 1 , F i g u r e 1 ) . C y c l i n g a t l o w e r t e m p e r a t u r e s f o rt w o c y c l e s ( a n n e a l i n g a t 3 5 - 5 0 ' C ) f o l l o w e d b y 4 0 c y c l e s o fs t a n d a r d PCR i s s u f f i c i e n t t o g e n e r a t e a p a t t e r n o f b a n d s w h i c hi s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e s p e c i e s f r o m w h i c h t h e t e m p l a t e i s d e r i v e d( l a n e s 2 - 5 , F i g u r e 1 ) . T h e p a t t e r n o f b a n d s c h a n g e s o n l y s l i g h t l ya s t h e t e m p e r a t u r e i s r a i s e d , u n t i l , a t s o m e p o i n t , t h e t e m p e r a t u r ei s t o o h i g h f o r t h i s s e t o f m a t c h e s t o p r e d o m i n a t e ( l a n e 6 , F i g u r e1 ) . We c o n c l u d e t h a t c o n s i s t e n t AP-PCR c a n b e a c h i e v e d o v e ra f a i r l y b r o a d r a n g e o f t e m p e r a t u r e s . O t h e r p r i m e r s , r a n g i n g i ns i z e f r o m 2 0 t o 3 4 b a s e s , g i v e a d i f f e r e n t p a t t e r n b u t h a v e s i m i l a rt e m p e r a t u r e d e p e n d e n t c h a r a c t e r i s t i c s ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r ,t h e t e m p e r a t u r e t h a t r e s u l t s i n r e p r o d u c i b l e PCR p r o d u c t s m a yn e e d t o b e a d j u s t e d i f v e r y l a r g e g e n o m e s o r m u c h s h o r t e r o rm u c h l o n g e r p r i m e r s a r e e m p l o y e d . I n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t sw e h a v e r e c e n t l y p e r f o r m e d w i t h p r i m e r s t h a t h a v e c o n s i d e r a b l es e q u e n c e r e d u n d a n c y , v e r y l o w t e m p e r a t u r e s f o r t h e i n i t i a l t w os t e p s w e r e n o t r e q u i r e d , p r e s u m a b l y b e c a u s e s o m e o f t h es e q u e n c e s i n t h e m i x t u r e i n e v i t a b l y a n n e a l q u i t e w e l l t o a n yc o m p l e x g e n o m e ( d a t a n o t s h o w n ) .T e m p l a t e c o n c e n t r a t i o nF i g u r e 2 s h o w s t h e e f f e c t o f v a r y i n g t e m p l a t e c o n c e n t r a t i o n o nAP-PCR p a t t e r n s . S . a u r e u s I S P 8 g e n o m i c D N A w a s v a r i e d

t h r o u g h n i n e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e r a n g e ( 7 . 5 n g t o 0 . 1 2p g ) . When r u n o n a h i g h r e s o l u t i o n p o l y a c r y l a m i d e g e l , t h ep a t t e r n g e n e r a t e d b y AP-PCR w i t h t h e 3 4 b a s e K p n - R p r i m e ri s v e r y c o n s i s t e n t f o r t e m p l a t e c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 7 . 5 n g a n d3 0 p g . B e l o w t h i s l e v e l t h e PCR i s more s p o r a d i c . H o w e v e r ,t h e p r o d u c t s p r o d u c e d a r e a l s o a l m o s t a l l r e p r e s e n t e d a t h i g h e rt e m p l a t e c o n c e n t r a t i o n s . I n o t h e r e x p e r i m e n t s 1 0 p g h a s b e e nt h e l o w e r l i m i t o f r e l i a b l e AP-PCR f o r g e n o m e s o f t h i s s i z e( a p p r o x 3 x 1 0 6 b p ) ( 1 6 ) . T e n p g o f t e m p l a t e DNA e q u a l sa p p r o x i m a t e l y 3 0 0 0 m o l e c u l e s . O n e i n t e r p r e t a t i o n o f t h i s d a t ai s t h a t e v e n t h e b e s t p r i m i n g e v e n t s a r e q u i t e i n e f f i c i e n t a n d , a tt h i s l o w t e m p l a t e c o n c e n t r a t i o n , t h e p r o b a b i l i t y o f i n i t i a t i n g e a c hAP-PCR e v e n t d u r i n g e a c h o f t h e t w o l o w t e m p e r a t u r e c y c l e si s a b o u t o n e i n 5 5 ( s q r o o t o f 3 0 0 0 ) . We e x p e c t t h a t t h e e f f i c i e n c yo f p r i m i n g c a n b e i m p r o v e d b y a l t e r i n g o u r p r e s e n t p r o t o c o l .I n t r a - s p e c i f i c p a t t e r n s o f AP-PCR p r o d u c t s i n S . a u r e u sWe c o m p a r e d t h e p a t t e r n o f AP-PCR p r o d u c t s f r o m s i x S . a u r e u ss t r a i n s o v e r a c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 7 . 5 n g t o 3 0 p g o f g e n o m i cD N A ( F i g u r e 3 ) . I n t h i s r a n g e t h e p a t t e r n s a r e h i g h l y r e p r o d u c i b l ea n d a l s o v e r y s i m i l a r b e t w e e n s t r a i n s . T h e d i f f e r e n c e s b e t w e e ns t r a i n s s h o u l d b e d i a g n o s t i c o f s p e c i f i c s t r a i n s a n d t h e i rr e l a t e d n e s s . E a c h p r i m e r o f s i m i l a r l e n g t h b u t o f d i f f e r e n ts e q u e n c e g i v e s a d i f f e r e n t s e t o f p a t t e r n s , a s e x p e c t e d s i n c e t h et e m p l a t e / p r i m e r i n t e r a c t i o n s a r e d i f f e r e n t . I n t r a - s p e c i f i c v a r i a t i o ni n t h e p a t t e r n i s o b s e r v e d f o r e a c h p r i m e r ( d a t a n o t s h o w n ) . S u c hd a t a s h o u l d b e o f v a l u e i n t h e c o n s t r u c t i o n o f p h y l o g e n e t i c t r e e s .S p e c i e s s p e c i f i c AP-PCR p r o d u c t sG e n o m i c D N A o f s t r a i n s f r o m f i v e d i f f e r e n t s p e c i e s o fS t a p h y l o c o c c u s w e r e e a c h a m p l i f i e d a t t w o d i f f e r e n t DNAc o n c e n t r a t i o n s ( F i g u r e 4 ) . I n g e n e r a l , t h e r e i s a s p e c i e s - s p e c i f i cp a t t e r n o f PCR p r o d u c t s , f o r i n s t a n c e , t h e S . w a r n e r i s t r a i n s ( l a n e s

A B C D E F12 345 12345 12345 12345 1234 123451636-c p w V 9 9 S1018-* . . . . . . . . . . ~ ~ ~ ~ . . .: . : . ' : v:.:.:..: . . . . . .

5 0 6 / 5 1 7 -

3 9 6 - .....t.... : : : , 4 -. _ mm..3 4 4_-*i_...9 8 -

22 0 -2 0 1 -

F i g u r e 3 . G e n o m i c f i n g e r p r i n t s o f s i x s t r a i n s o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s : AP-PCR p a t t e r n s a r e s i m i l a r b e t w e e n s t r a i n s o f t h e s a m e s p e c i e s . S i x s t r a i n s o f S . a u r e u sw e r e f i n g e r p r i n t e d b y AP-PCR w i t h t h e K p n - R p r i m e r a n d t h e s t a n d a r d p r o t o c o l a n d f i v e d i f f e r e n t amounts o f t e m p l a t e ; 7 . 5 n g , 1 . 9 n g , 4 7 0 p g , 1 2 0 p g a n d 3 0p g p e r r e a c t i o n . T h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n o n t h e l e f t f o r e a c h s t r a i n . L a n e s 1 , I S P 8 ; l a n e s 2 , ATCC 8 4 3 2 ; l a n e s 3 , ATCC 1 5 5 6 4 ; l a n e s 4 , ATCC6 5 3 8 ; l a n e s 5 , S a u 3 A ; l a n e s 6 , ATCC 1 2 6 0 0 . T h e r e s u l t i n g a m p l i f i e d m a t e r i a l w as r e s o l v e d b y e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h 5% p o l y a c r y l a m i d e c o n t a i n i n g 50% u r e aa n d 1 x TB E a n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y . S i z e m a r k e r s a r e t h e 1 k b l a d d e r f r o m B R L / G i b c o .

SVW


4/6

7 2 1 6 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 2 4

*" a I

.. . ..

? ' , w t E : # F W I I } ~ ~ ~ 2 M

4m U U . . . 4

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F i g u r e 4 . G e n o m i c f i n g e r p r i n t s o f s e v e r a l s t r a i n s f r o m f i v e s p e c i e s o fS t a p h y l o c o c c u s : AP-PCR p a t t e r n s are c h a r a c t e r i s t i c o f t h e s p e c i e s . F i n g e r p r i n t so f s e v e n t e e n i s o l a t e s r e p r e s e n t i n g f o u r d i f f e r e n t s p e c i e s o f S t a p h y l o c o c c u s weref i n g e r p r i n t e d b y AP-PCR w i t h t h e K p n - R p r i m e r a n d t h e s t a n d a r d p r o t o c o l w i t h1 6 ng o f t e m p l a t e p e r r e a c t i o n . T h e r e s u l t i n g a m p l i f i e d m a t e r i a l w as r e s o l v e db y e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h 5% p o l y a c r y l a m i d e c o n t a i n i n g 50% urea a n d 1 x TBEa n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y . S i z e m a r k e r s are t h e 1 k b l a d d e r f r o mB R L / G i b c o . T h e s p e c i e s f i n g e r p r i n t e d were l a n e 1 , S . h a e m o l y t i c u s CC 1 2 J 2 ;l a n e 2 , PAY 9 F 2 ; l a n e 3 , AW 2 6 3 ; l a n e 4 , MI D 5 6 3 ; l a n e 5 , ATCC 2 9 9 7 0 ;l a n e 6 , S . w a r n e r i CP B l O E 2 ; l a n e 7 , GAD 4 7 3 ; l a n e 8 , MCY 3 E 6 ; l a n e 9 ,PBNZP 4 D 3 ; l a n e 1 0 , LE D 3 5 5 ; l a n e 11 , S . h o m i n i s ATCC 2 7 8 4 4 ; l a n e 1 2 ,ATCC 2 7 8 4 6 ; l a n e 1 3 , F u l ; l a n e 1 4 , S . c o h n i i J L 1 4 3 ; l a n e 1 5 , CM 8 9 ; l a n e1 6 , S S 5 2 1 ; l a n e 1 7 , S . aureus I S P - 8 ; l a n e 1 8 , ATCC 8 4 3 2 ; l a n e 1 9 , ATCC1 5 5 6 4 ; l a n e 2 0 , ATCC 6 5 3 8 ; l a n e 2 1 , S a u 3 A ; l a n e 2 2 , ATCC 1 2 6 0 0 . S i z em a r k e r s are t h e 1 k b l a d d e r f r o m B R L / G i b c o .6 - 1 0 ) g i v e an a l m o s t i d e n t i c a l p a t t e r n o f AP-PCR p r o d u c t s .H o w e v e r , t h e S . h a e m o l y t i c u s group c o n s i s t s o f two d i s t i n c tp a t t e r n s t h a t s h a r e o n l y one AP-PCR p r o d u c t a n d h a v e a t l e a s tt h r e e p r o m i n e n t p r o d u c t s t h a t are n o t s h a r e d ( l a n e s 1 - 5 ) . T h ed i f f e r e n c e s i n p r o d u c t s were d r a m a t i c a n d are p r e s u m a b l y t h er e s u l t o f a l a r g e amount o f sequence d i f f e r e n c e b e t w e e n s t r a i n s .T h e most l i k e l y p o s s i b i l i t y seems t o b e t h a t t h e S . h a e m o l y t i c u ss p e c i e s h a s two d i s t i n c t ' s u b - s p e c i e s ' . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a to ne ' s u b - s p e c i e s ' AP-PCR p a t t e r n i s p r o d u c e d b y S . h a e m o l y t i c u ss t r a i n s (AW 2 6 3 , ATCC 2 9 9 7 0 a n d PAY 9 F 2 ) t h a t l i v e on t h ec l o s e l y r e l a t e d p r i m a t e s p e c i e s h u m a n a n d c h i m p a n z e e , t h e o t h e rs t r a i n s o f S . h a e m o l y t i c u s (MID 5 6 3 a n d CC 1 2 J 2 ) are f r o mM a n g a b e y a n d L e m u r ( K l o o s , u n p u b l i s h e d ) .

T h e u t i l i t y o f t h e m e t h o d w a s f u r t h e r d e m o n s t r a t e d w h e n A P -PCR r e v e a l e d t h e i n c o r r e c t c l a s s i f i c a t i o n o f a s t r a i n . U s i n g A P -P C R , s t r a i n s t h a t a r e m i s a s s i g n e d a r e v e r y r a p i d l y u n c o v e r e d .T h e AP-PCR p r o d u c t s a r e s p e c i e s o r s u b - s p e c i e s s p e c i f i c a n dn o t c o n s e r v e d e v e n b e t w e e n r e l a t i v e l y c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s ,s u c h a s S . h a e m o l y t i c u s , S . w a r n e r i , a n d S . h o m i n i s .N e v e r t h e l e s s , a f e w AP-PCR p r o d u c t s m a y b e s h a r e d b e t w e e ns p e c i e s . F o r i n s t a n c e , t h e p r o d u c t a t a b o u t 4 0 0 b a s e p a i r s i n S .w a r n e r i m a y b e t h e s a m e a s i n t h e S . h a e m o l y t i c u s s t r a i n sP A Y 9 F 2 , AW263 a n d A T C C 2 9 9 7 0 , h o w e v e r , we c a n n o t e x c l u d et h e p o s s i b i l i t y o f c o i n c i d e n t m i g r a t i o n .

I t s h o u l d b e n o t e d t h a t o c c a s i o n a l l y a p l a s m i d m a y c o n t r i b u t eo n e o f t h e p r o m i n e n t AP-PCR p r o d u c t s . T h e r e a r e s m a l l p l a s m i d si n s o m e o f t h e S t a p h y l o c o c c u s s t r a i n s . T h e b e s t w a y t o a v o i db e i n g c o n f u s e d b y t h e l a t e r a l t r a n s f e r o f p l a s m i d s b e t w e e nu n r e l a t e d s t r a i n s i s t o p e r f o r m s e p a r a t e AP-PCR r e a c t i o n s w i t ha f e w d i f f e r e n t p r i m e r s ( d a t a n o t s h o w n ) . S m a l l p l a s m i d s , b e c a u s eo f t h e i r l o w s e q u e n c e c o m p l e x i t y , a r e e x t r e m e l y u n l i k e l y t oc o n t r i b u t e t o t h e AP-PCR p a t t e r n s o f m o s t a r b i t r a r y s e l e c t e dp r i m e r s .

T h e AP-PCR m e t h o d c a n , i n p r i n c i p l e , b e a p p l i e d t o d e t e c tp o l y m o r p h i s m s i n a w i d e v a r i e t y o f o r g a n i s m s u s i n g a v a r i e t yo f d i f f e r e n t p r i m e r s . To i l l u s t r a t e t h i s , w e e x a m i n e d s e v e r a lS t r e p t o c o c c u s s t r a i n s a n d a p l a n t , r i c e , b y a m p l i f i c a t i o n u s i n gt h e t w e n t y b a s e p B S r e v e r s e s e q u e n c i n g p r i m e r a n d g e n o m i cDNA. F i g u r e 5 s h o w s t h e p o l y m o r p h i c f i n g e r p r i n t s t h a t a r ep r o d u c e d f o r t h e s e o r g a n i s m s . F o r i n s t a n c e , S t r e p t o c o c c u sp y o g e n e s s t r a i n s ( g e n o m e s i z e 2 -3 m e g a b a s e s ) h a v e s o m e A P -PCR p r o d u c t s i n c o m m o n , w h e r e a s , o t h e r s a r e s h a r e d b y o n l ys o m e s t r a i n s a n d y e t o t h e r s a r e u n i q u e t o t h e s t r a i n . C o n s i s t e n tw i t h o u r r e s u l t s i n S t a p h y l o c o c c u s , t h e o n e s t r a i n f r o m a n o t h e rs p e c i e s , E . f a e c a l i s , ( F i g u r e 5 , l a n e b I 1 ) s h a r e s n o common PCRp r o d u c t s w i t h S . p y o g e n e s s t r a i n s . We a r e c u r r e n t l y c o n s t r u c t i n ga p h y l o g e n e t i c t r e e f o r S . p y o g e n e s u s i n g d a t a a c c u m u l a t e d f r o mAP-PCR w i t h t h r e e s e p a r a t e p r i m e r s ( m a n u s c r i p t i n p r e p . ) .R i c e , d e s p i t e h a v i n g a g e n o m e s i z e o f a b o u t 7 0 0 - 1 0 0 0m e g a b a s e s ( 1 7 , 1 8 , 1 9 ) , g a v e a s i m p l e AP-PCR p a t t e r n ( w i t h a4 8 C l o w s t r i n g e n c y s t e p ) w h i c h i n c l u d e d a m i x o f s p e c i e s -s p e c i f i c a n d s t r a i n - s p e c i f i c p r o d u c t s . S t r a i n s p e c i f i cp o l y m o r p h i s m s c a n , i n p r i n c i p l e , b e u s e d a s m a r k e r s f o r g e n e t i cm a p p i n g . E xp e r i m e n t s w i t h a n a s s o r t m e n t o f p r i m e r s a n d w i t ht h e m a i z e a n d h u m a n ( e a c h a b o u t 3 , 0 0 0 m e g a b a s e s ) g e n o m e s( d a t a n o t s h o w n ) i n d i c a t e t h a t AP-PCR w i l l w o r k w i t h m o s ts p e c i e s a n d m o s t p r i m e r s .S e l e c t i o n o f p r i m e r sA P - P C R f o r s p e c i e s l e v e l i d e n t i f i c a t i o n o f s t r a i n s d o e s n o t r e q u i r ea n y p a r t i c u l a r p r i m e r s e q u e n c e . I n v e s t i g a t o r s m a y w i s h t o c h o o s ea s t a n d a r d s e t o f p r i m e r s s o t h a t d a t a c a n b e c o m p a r e d b e t w e e nl a b s . P r i m e r s t h a t a r e a l r e a d y i n e x t e n s i v e u s e s e e m t o b e t h el o g i c a l c h o i c e . We p r o p o s e t h e 2 0 b a s e p a i r s e q u e n c i n g p r i m e r s ,TTATGTAAAACGACGGCCAGT ( U n i v e r s a l M1 3 - 2 0 ) , GG-AAACAGCTATGACCATG, (M 1 3 r e v e r s e s e q u e n c i n g ) ,GTAATACGACTCACTATAG ( T 7 ) , a n d GCAATTAACCC-TCACTAAAG ( T 3 ) . T h e s e p r i m e r s h a v e b e e n v e r y s u c c e s s f u li n o u r s u b s e q u e n t AP-PCR s t u d i e s . T h e s e p r i m e r s w i l l a l s o h a v eo t h e r u n r e l a t e d u s e s i n m o s t l a b s ; f o r s e q u e n c i n g p r o j e c t s a n df o r t h e s p e c i f i c PCR o f c l o n e s a s l a b e l l e d p r o b e s f o r S o u t h e r nb l o t s .L y s i s b y b o i l i n gF o r b a c t e r i a , t h e d a t a p r e s e n t e d h e r e i n v o l v e d t h e p u r i f i c a t i o no f DNA b y c e l l w a l l l y s i s , p r o t e i n a s e K d i g e s t i o n a n d p h e n o l

. . . :w. . . .r.


5/6

N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 2 4 7 2 1 7

1 2 3 b 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

_D _ * . . . X

.11.. . . . . . .4-

Ul o i Um P":..:

4 1 p M

F i g u r e 5 . G e n o m i c f i n g e r p r i n t s o f r i c e a n d S t r e p t o c o c c u s s t r a i n s : AP-PCR p a t t e r n s can b e g e n e r a t e d f o r an y s p e c i e s . F i n g e r p r i n t s o f t h r e e i n b r e d s t r a i n s o f r i c ea n d e l e v e n s t r a i n s o f S t r e p t o c o c c u s were f i n g e r p r i n t e d b y AP-PCR w i t h t h e s t a n d a r d p r o t o c o l a n d t h e p B S reverse s e q u e n c i n g p r i m e r . T h e l o w s t r i n g e n c y a n n e a l i n gs t e p w as p e r f o r m e d a t 4 8 C f o r r i c e a n d a t 4 0 C f o r S t r e p t o c o c c u s . I n t h e case o f r i c e a s e r i a l d i l u t i o n o f 5 1 ng, 1 2 ng, 3 ng a n d 0 . 8 ng o f g e n o m i c t e m p l a t eDNA i s p r e s e n t e d f o r e a c h s t r a i n . I n t h e case o f S t r e p t o c o c c u s , 1 9 ng a n d 5 ng o f g e n o m i c t e m p l a t e were u s e d . T h e r e s u l t i n g a m p l i f i e d m a t e r i a l was r e s o l v e d b ye l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h 5% p o l y a c r y l a m i d e c o n t a i n i n g 50 % urea a n d 1 x TB E a n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y . S i z e m a r k e r s are t h e 1 k b l a d d e r f r o m B R L / G i b c o .T h e s t r a i n s f i n g e r p r i n t e d were: L a n e s a l , 0. s a t i v a s s p . i n d i c a I R 5 4 ; l a n e s a 2 , s s p . j a p o n i c a C a l s o r s e 7 6 ; l a n e s a 3 , L e m o n t . L a n e s b l , S . pyogenes D 4 7 1 ; l a n e sb 2 , T I / 1 9 5 / 2 ; l a n e s b 3 , 4 0 R S 1 5 ; l a n e s b4 , 5 2 R S 1 5 ; l a n e s b 5 , 4 7 R S 1 5 ; l a n e s b 6 , 5 5 R S 1 5 ; l a n e s b 7 , l / E 9 ; l a n e s b 8 T 2 8 / 5 1 / 4 ; l a n e s b 9 , K58 H g ; l a n e s b l O , SM6,l a n e s b i 1, E . f a e c a l i s OGI X ; l a n e s b 1 2 , S . p y o g e n e s UAB 0 9 2 . S i z e m a r k e r s a r e t h e k b l a d d e r f r o m B R L / G i b c o .

e x t r a c t i o n . We h a v e f o u n d t h a t e q u i v a l e n t d a t a can b e g e n e r a t e db y a much s i m p l e r DNA p r e p a r a t i o n i n w h i c h t h e c e l l s f r o m ac o l o n y on a p e t r i d i s h are s i m p l y b o i l e d , t h e d e b r i s p e l l e t e d a n dt h e s u p e r n a t a n t d i l u t e d f o r AP-PCR ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s a l l o w st h e t i m e f r o m p e t r i d i s h t o s t r a i n i d e n t i f i c a t i o n t o b e r e d u c e d t o3 6 h o u r s .DISCUSSIONT h e c l a s s i f i c a t i o n o f b a c t e r i a l s p e c i e s or s t r a i n s i s an area o f a c t i v er e s e a r c h i n p o p u l a t i o n b i o l o g y a n d m e d i c i n e . R e c e n t p r o g r e s sh a s i n c l u d e d t h e use o f o l i g o n u c l e o t i d e s f o r t h e d i r e c t s t a i n i n go f c e l l s u s i n g f l u o r e s c e n t p r o b e s t o s p e c i e s or s t r a i n s p e c i f i c g e n e s( e g 6 , 7 ) a n d t h e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ( P C R ) ( 8 ) . T h i s l a t t e rm e t h o d may r e v o l u t i o n i z e e p i d e m i o l o g y a n d p o p u l a t i o n b i o l o g y .S p e c i f i c PCR p r i m e r p a i r s can b e u s e d t o i d e n t i f y g e n e sc h a r a c t e r i s t i c o f a p a r t i c u l a r s p e c i e s or even s t r a i n . PCR a l s oo b v i a t e s t h e n e e d f o r c l o n i n g i n o r d e r t o compare t h e s e q u e n c e s

o f genes f r o m r e l a t e d o r g a n i s m s ( e g 1 0 ) , a l l o w i n g t h e very r a p i dc o n s t r u c t i o n o f DNA sequence b a s e d p h y l o g e n i e s . F o re p i d e m i o l o g i c a l p u r p o s e s , s p e c i f i c p r i m e r s t o i n f o r m a t i v ep a t h o g e n i c f e a t u r e s can b e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h PCR t o a s s i g ni d e n t i t y .W h i l e f l u o r e s c e n t p r o b e s a n d PCR are b o t h very p o w e r f u lm e t h o d s , c o n v e n t i o n a l p r i m e r s f o r PCR a n d o l i g o s f o r i n s i t uh y b r i d i z a t i o n r e q u i r e sequence i n f o r m a t i o n f r o m t h e r e l e v a n t

genes a n d m u s t b e c u s t o m b u i l t f o r e a c h l o c a t i o n w i t h i n t h egenome o f a s p e c i e s or s t r a i n . We h a v e d e v e l o p e d an a l t e r n a t i v em e t h o d , a r b i t r a r i l y p r i m e d PCR ( A P - P C R ) , w h i c h i s very r a p i da n d s i m p l e a n d g e n e r a t e s a f i n g e r p r i n t o f PCR p r o d u c t s . AP-PCR d o e s n o t r e q u i r e a p a r t i c u l a r s e t o f p r i m e r s . I n s t e a d , t h i sm e t h o d uses p r i m e r s c h o s e n w i t h o u t r e g a r d t o t h e s e q u e n c e o ft h e genome t o b e f i n g e r p r i n t e d . T h u s , AP-PCR r e q u i r e s no p r i o rk n o w l e d g e o f t h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e o r g a n i s m s t o bei n v e s t i g a t e d . E a c h p r i m e r g i v e s a d i f f e r e n t p a t t e r n o f AP-PCRp r o d u c t s , e a c h w i t h t h e p o t e n t i a l o f d e t e c t i n g p o l y m o r p h i s m s

a


6/6

7 2 1 8 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , V o l . 1 8 , N o . 2 4b e t w e e n s t r a i n s . T h u s , t h e d a t a p r o d u c e d a l l o w s t h e d i f f e r e n t i a t i o no f e v e n c l o s e l y r e l a t e d s t r a i n s o f t h e s a m e s p e c i e s . I n t h i s r e s p e c ti t i s s i m i l a r t o i s o z y m e s t u d i e s ( 3 , 4 ) .We h a v e d e f i n e d a w i n d o w o f c o n d i t i o n s f o r AP-PCR w h i c hr e s u l t s i n a r e p r o d u c i b l e a n d e f f e c t i v e m e t h o d f o r p r e l i m i n a r yi d e n t i f i c a t i o n o f a n y s t r a i n . T h i s m e t h o d m a y b e v e r y u s e f u l w h e nt h e p a r t i c u l a r a i m i s t o s u r v e y a l a r g e n u m b e r o f i n d i v i d u a l s i na p o p u l a t i o n , f o r e p i d e m i o l o g i c a l o r p o p u l a t i o n s t u d i e s , f o re x a m p l e . A s a f i r s t a p p l i c a t i o n o f t h e m e t h o d we c o m p a r e d s t r a i n sf r o m v a r i o u s s p e c i e s o f S t a p h y l o c o c c u s , S t r e p t o c o c c u s , a n d r i c e .We w e r e a b l e t o g e n e r a t e s p e c i f i c p a t t e r n s o f PCR p r o d u c t s f o re a c h s t r a i n a n d t h e s e w e r e g e n e r a l l y q u i t e s i m i l a r w i t h i n s p e c i e s .H o w e v e r , t h e t h r e e S . c o h n i i s t r a i n s w e r e q u i t e d i v e r g e n t , b u tr e c o g n i z a b l y r e l a t e d , c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s d a t a f r o m D N Ar e n a t u r a t i o n ( 1 1 , 1 2 , 1 3 , 1 4 ) . F u r t h e r , f i v e S . h a e n o l y t i c u s i s o l a t e sc o u l d b e g r o u p e d i n t o t w o d i s t i n c t AP-PCR p a t t e r n s , i n d i c a t i n gt h a t t h i s s p e c i e s h a s a d i s t i n c t p o p u l a t i o n s t r u c t u r e o f t w o d i s t a n t l yr e l a t e d s u b - s p e c i e s o r p e r h a p s e v e n s p e c i e s .I t i s p o s s i b l e t o e x t e n d t h e m e t h o d t o o t h e r s p e c i e s . U s i n gs i m i l a r c o n d i t i o n s a n d v a r i o u s p r i m e r s , we h a v e g e n e r a t e dd i s c r e t e f i n g e r p r i n t s f r o m g e n o m e s 5 0 , 0 0 0 t o 3 , 0 0 0 , 0 0 0 , 0 0 0 b a s ep a i r s i n s i z e , i n c l u d i n g t h e g e n o m e s o f v i r u s e s , h u m a n s a n d p l a n t s( i n c l u d i n g t h e r i c e r e s u l t s s h o w n ) . We b e l i e v e a c h a r a c t e r i s t i cp a t t e r n c o u l d b e o b t a i n e d f o r a n y g e n o m e . T h e m e t h o d w o u l dt h e n b e u s e f u l i n b r e e d i n g p r o g r a m s , g e n e t i c m a p p i n g , p o p u l a t i o ng e n e t i c s o r e p i d e m i o l o g y .I t w a s i n i t i a l l y s u r p r i s i n g t o u s t h a t a r b i t r a r y p r i m e r s w o u l dg i v e d i s c r e t e p a t t e r n s i n l o w s t r i n g e n c y P C R . H o w e v e r , i t s h o u l db e n o t e d t h a t w h e n W e s l e y e t a l . , d i s s e c t e d p o l y t e n ec h r o m o s o m e s o f d r o s o p h i l a a n d a m p l i f i e d w i t h a p r i m e r t h a t h a da s t r i n g o f r e d u n d a n t b a s e s a t t h e 3 ' e n d ( 2 0 ) , t h e y u n e x p e c t e d l yo b s e r v e d d i s c r e t e DNA p r o d u c t s r a t h e r t h a n a m p l i f i c a t i o n o f t h ew h o l e f r a g m e n t . O u r i n i t i a l o b s e r v a t i o n s , p r e s e n t e d h e r e , i n d i c a t et h a t a d e g e n e r a t e p r i m e r i s u n n e c e s s a r y f o r t h e p r o d u c t i o n o fm u l t i p l e d i s c r e t e p r o d u c t s i n P C R .I n t h e W e s l e y e t a l . s t u d y ( 2 0 ) , PCR p r o d u c t s c o u l d b e r e m o v e df r o m t h e g e l a n d u s e d t o h y b r i d i z e b a c k t o g e n o m i c d i g e s t s , c l o n e so r c h r o m o s o m e s . S i n c e p o l y m o r p h i c A P - P C R b a n d s c a n b e u s e da s p r o b e s , a l i n k b e t w e e n t h e g e n e t i c a n d p h y s i c a l m a p c a n b ee n v i s i o n e d .F o r r e p r o d u c i b l e A P - P C R , m a n y h u n d r e d s o f t e m p l a t em o l e c u l e s w e r e r e q u i r e d u n d e r o u r p r e s e n t c o n d i t i o n s . We a r ei n v e s t i g a t i n g c o n d i t i o n s t h a t m a y a l l o w m o r e e f f i c i e n t p r i m i n g .I n f u t u r e e x p e r i m e n t s we w o u l d l i k e t o d e f i n e c o n d i t i o n s t h a tg e n e r a t e common p a t t e r n s b e t w e e n c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s b ym a k i n g t h e AP-PCR l e s s s e n s i t i v e t o s e q u e n c e d i v e r g e n c e .C o n v e r s e l y , we a r e a t t e m p t i n g t o d e v e l o p c o n d i t i o n s t h a t w i l li n c r e a s e t h e a b i l i t y o f AP-PCR t o d e t e c t d i f f e r e n c e s i n D N As e q u e n c e a n d , t h e r e b y , d i s t i n g u i s h s t r a i n s w i t h i n a s p e c i e s . Wea r e c u r r e n t l y e x p e r i m e n t i n g w i t h s h o r t e r o l i g o n u c l e o t i d e s a n dd i f f e r e n t PCR c o n d i t i o n s . A m o r e v a r i a b l e AP-PCR p a t t e r nw i t h i n a s p e c i e s w o u l d a l l o w a m o r e d e t a i l e d p i c t u r e o f i n t r a -s p e c i f i c p o p u l a t i o n s t r u c t u r e .W i l l i a m s e t a l . h a v e i n d e p e n d e n t l y s h o w n t h a t a r b i t r a r yp r i m e r s , t e n b a s e s l o n g , c a n b e u s e d t o g e n e r a t e p o l y m o r p h i cg e n o m i c f i n g e r p r i n t s b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( 2 1 ) .

S m i t h f o r h e l p f u l c o m m e n t s . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d i n p a r tb y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n , t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d t h e D e p a r t m e n t o f E n e r g y .REFERENCES

1 . A b e r R . C . a n d M a c k e l D . C . ( 1 9 8 1 ) A m . J . M e d . 7 0 , 1 6 1 - 1 6 7 .2 . E i s e n s t e i n B . I . ( 1 9 9 0 ) J . I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 6 1 , 5 9 5 - 6 0 2 .3 . S e l a n d e r R . K . , C a u g a n t D . A . a n d W h i t t a m T . S . ( 1 9 8 7 ) I n ' E s c h e r i c h i a c o l ia n d S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m . ' C e l l u l a r a n d m o l e c u l a r b i o l o g y . N e i d h a r d tF . C . ( E d . i n C h i e f ) ASM. p p l 6 2 5 - 1 6 4 8 .4 . M i l k m a n R . ( 1 9 7 3 ) S c i e n c e 1 8 2 , 1 0 2 4 - 1 0 2 6 .5 . W o e s e C . R . , ( 1 9 8 6 ) I n E v o l u t i o n i n P r o k a r y o t e s , S c h l e i f e r K . H . a n dS t a c k e b r a n d t E . ( e d ) . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n .6 . D e L o n g E . F . , W i c k h a m G . S . a n d P a c e N . R . ( 1 9 8 9 ) S c i e n c e 2 4 3 , 1 3 6 0 - 1 3 6 3 .7 . Amann R . I . , K r u m h l t z L . a n d S t a h l D . A . ( 1 9 9 0 ) J . B a c t . 1 7 2 , 7 6 2 - 7 7 0 .8 . M u l l i s K . B . a n d F a l oo n a F . A . ( 1 9 8 7 ) M e t h o d s E n z y m o l . 1 5 5 , 3 3 5 - 3 5 0 .9 . S m i t h N . H . a n d S e l a n d e r R . K ( 1 9 9 0 ) J . B a c t e r i o l . 1 7 2 , 6 0 3 - 6 0 9 .1 0 . M c C a b e P . C . ( 1 9 9 0 ) PCR P r o t o c o l s : a G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s ,A c a d e m i c P r e s s , p p 7 6 - 8 3 .1 1 . K l o o s W . E . ( 1 9 8 0 ) A n n . R e v . M i c r o b i o l . 3 4 , 5 5 9 - 9 2 .1 2 . K l o o s W . E . a n d W o l f s h o h l J F ( 1 9 7 9 ) C u r r . M i c r o b i o l . 3 , 1 6 7 - 1 7 2 .1 3 . K l o o s W . E . a n d W o l f s h o h l J F ( 1 9 8 3 ) C u r r . M i c r o b i o l . 8 , 1 1 5 - 1 2 1 .1 4 . K l o o s W . E . a n d S c h l e i f e r K . H . ( 1 9 8 1 ) ' T h e g e n u s s t a p h y l o c o c c u s ' . i n ' T h ep r o k a r y o t e s ' : A h a n d b o o k o n h a b i t a t s , i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a ,v o l s . 1 a n d 2 . S t a r r M . P . e t a l . ( e d s . ) . S p r i n g e r - V e r l a g : B e r l i n , G e r m a n y :New Y o r k , N . Y . , U S A . p p l5 4 8 - 1 5 6 9.1 5 . L e d b e t t e r S . A . , N e l s o n D . L . , W a r r e n S . T . a n d L e d b e t t e r D . H . ( 1 9 9 0 )G e n o m i c s 6 , 4 7 5 - 4 8 1 .1 6 . W e i l M . a n d M c C le l la n d M . , ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 6 ,5 1 - 5 5 .1 7 . I y e n g a r G . A . S . a n d K e n S . K . ( 1 9 7 8 ) E n v i r o n . E x p . B o t . 1 8 , 2 1 9 - 2 2 4 .1 8 . B e n n e t t M . D . a n d S m i t h J . B . ( 1 9 7 6 ) P h i l o s . T r a n s . R o y . S o c . L o n . B 2 7 4 ,2 2 7 - 2 7 4 .1 9 . D e s h p a n d e V . G . a n d R a n j e k a r P . K . ( 1 9 8 0 ) H o p p e - S e y l e r ' s Z P h y s i o l . C h e m .3 6 1 , 1 2 2 3 - 1 2 3 3 .2 0 . W e s l e y C . S . , B e n M . , K r e i t m a n M . , H a g a g N . a n d E a n e s W . F . ( 1 9 9 0 )N u c l e i c A c i d s R e s . 1 8 , 5 9 9 - 6 0 3 .2 1 . W i l l i a m s J . G . K . , K u b e l i k A . R . , L i v a k K . J . , R a f a l s k i J . A . a n d T i n g e y S . V .( 1 9 9 0 ) N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h 1 8 , 6 5 3 1 - 6 5 3 5 .

ACKNOWLEDGEMENTSWe t h a n k D r . K l o o s , S u s a n H o l l i n g s h e a d , S a i b a l P o d d a r , B r u n oS o b r a l , D r . H o d g e s a n d D r C r o u g h a n f o r s u p p l y i n g s t r a i n s a n dD N A a n d B r u n o S o b r a l , A l a n G r e e n e r , M a r y S i m c o x a n d C . R .

fingerprinting genomes using pcr with arbitrary primers

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